CN114836372A - 小鼠上胚层干细胞向新型多能干细胞转化的培养方法 - Google Patents

小鼠上胚层干细胞向新型多能干细胞转化的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于提高分离的多潜能细胞发育潜能的无血清培养液，所述培养液包含基础培养液和用于提高细胞发育潜能的促进剂。本发明还提供了一种通过所述培养液，从上胚层干细胞制备新型多能干细胞的方法。本发明提供的新型多能干细胞的细胞潜能高，增殖速度快，能够稳定多次传代。

Description

小鼠上胚层干细胞向新型多能干细胞转化的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域。具体地，本发明涉及一种小鼠上胚层干细胞向新型多能干细胞转化的培养方法。
背景技术
小鼠多能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)的类型主要包括：小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、滋养层干细胞(trophoblast stem cells，TSCs)和小鼠上胚层干细胞(epiblast stem cells，EpiSCs)等。
小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是从植入前小鼠囊胚内细胞团(inner cell mass，ICM)中分离获得，保留ICM的一些分子特性被视为一种ICM-like状态，称为
Figure BDA0002927498000000011
多能状态，具有维持无限自我更新和多向分化的能力。
小鼠上胚层干细胞(epiblast stem cells，EpiSCs)由着床后5.5-8.0天epiblast培养在饲养层细胞中，并添加Activin A，FGF2和KSR的条件下获得，与
Figure BDA0002927498000000012
的小鼠ESCs相比，小鼠EpiSCs保持了另一种多能性状态，被称作Primed多能状态。自2007年首次分离获得小鼠EpiSCs后，小鼠EpiSCs被认为对应于植入后epiblast。小鼠EpiSCs与小鼠ESCs的基因表达水平和表观修饰状态不同，在基因表达水平，小鼠EpiSCs能够表达Oct4、Sox2和Nanog等
Figure BDA0002927498000000013
多能性基因，另外，小鼠EpiSCs保持未分化状态，但分化相关因子表达上调。在表观遗传修饰水平，小鼠EpiSCs与
Figure BDA0002927498000000014
小鼠ESCs相比全基因组DNA甲基化水平和组蛋白H3K27me3水平较高。
虽然小鼠ESCs和小鼠EpiSCs在细胞形态、发育潜能、多能性调控网络等方面存在诸多差异，但二者之间可以通过特定的条件进行转化。在Activin A和FGF2持续存在的情况下，小鼠ESCs可以分化产生小鼠EpiSCs，这一过程伴随着多相分化和细胞不断死亡，经过不断传代获得稳定的小鼠EpiSCs。与这一过程相比，小鼠EpiSCs向小鼠ESCs的转化则较为困难，需要细胞进行重编程和基因组去甲基化过程。
因此，为了研究干细胞多能性维持机制和不同类型多能性细胞之间相互转化的基因调控网络，本领域需要开发一种高效、快速地由小鼠EpiSCs向小鼠ESCs转化的培养方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、快速地将小鼠上胚层干细胞向新型多能干细胞转化的培养方法。
本发明的另一个目的是提供了一种化学成分明确的培养体系，将小鼠EpiSCs细胞系诱导培养为一种新型多能性干细胞系。
在本发明的第一方面，提供了一种用于提高分离的多潜能细胞发育潜能的无血清培养液，所述培养液包含基础培养液和用于提高细胞潜能的促进剂；
其中所述的促进剂包括：
(a)GSK抑制剂；较佳地CHIR99021；
(b)Wnt抑制剂；较佳地XAV939；
(c)MAPK抑制剂；较佳地SB203580；
(d)GPCR抑制剂；较佳地(S)-(+)-马来酸二甲茚定；
(e)白血病抑制因子LIF；和
(f)骨形态发生蛋白4。
在另一优选例中，所述的促进剂包括分化抑制剂(组分a、b、c和d)，还包括生物因子。
在另一优选例中，所述的促进剂包括分化抑制剂(组分a、b、c和d)和生物因子(组分e和f)。
在另一优选例中，所述的促进剂由分化抑制剂(组分a、b、c和d)和生物因子(组分e和f)构成。
在另一优选例中，所述促进剂具有选自下组的一个或多个特征：
(a)所述GSK抑制剂的浓度为0.5～20μmol/L；
(b)所述Wnt抑制剂的浓度为0.2～10μmol/L；
(c)所述MAPK抑制剂的浓度为0.2～20μmol/L；
(d)所述GPCR抑制剂的浓度为0.1～10μmol/L；
(e)所述白血病抑制因子LIF的浓度为500～2000U/mL；
(f)所述骨形态发生蛋白4的浓度为10～100ng/mL；
其中，各浓度按培养液的总体积计。
较佳地，按培养液的总体积计，所述促进剂具有选自下组的特征：
(a)所述GSK抑制剂的浓度为1～10μmol/L；
(b)所述Wnt抑制剂的浓度为0.5～8μmol/L；
(c)所述MAPK抑制剂的浓度为1～15μmol/L；
(d)所述GPCR抑制剂的浓度为0.5～5μmol/L；
(e)所述白血病抑制因子LIF的浓度为800～1500U/mL；
(f)所述骨形态发生蛋白4的浓度为20～80ng/mL。
在另一优选例中，所述培养液中不含血清或血清替代物(如KSR)。
在另一优选例中，所述基础培养液包括：DMEM/F12培养液、Neurobasal培养液、N2替代物、B27替代物或其组合。
在另一优选例中，所述培养液还包括：
0.1～10mmol/Lβ-巯基乙醇；
0.1～5mmol/L L-谷氨酰胺；
20～100mg/L牛血清白蛋白；
5～20mL/L非必需氨基酸；
5～20mL/L青霉素/链霉素。
在本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述提高分离的多潜能细胞发育潜能的无血清培养液的方法，包括步骤：
将基础培养液和用于提高细胞潜能的促进剂进行混合，从而形成本发明第一方面所述的培养液；
其中，所述的促进剂包括：
(a)GSK抑制剂；较佳地CHIR99021；
(b)Wnt抑制剂；较佳地XAV939；
(c)MAPK抑制剂；较佳地SB203580；
(d)GPCR抑制剂；较佳地(S)-(+)-马来酸二甲茚定；
(e)白血病抑制因子LIF；和
(f)骨形态发生蛋白4。
在本发明的第三方面，提供了一种制备多潜能干细胞的方法，包括步骤：
(S1)提供分离的上胚层干细胞(EpiSC)；
(S2)在本发明的第一方面所述的培养液中，诱导培养所述的上胚层干细胞(EpiSC)，从而获得所述的多潜能干细胞。
在另一优选例中，所述的上胚层干细胞来源于胚胎E6天-7天(较佳地约E6.5天)的胚胎细胞。
在另一优选例中，所述的上胚层干细胞来自人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的上胚层干细胞来自啮齿动物，较佳地大鼠或小鼠。
在另一优选例中，所述小鼠上胚层干细胞(EpiSC)来源于小鼠E6.5天的胚胎细胞。
在另一优选例中，步骤(S2)中，EpiSC细胞的接种数量为1×104-8×105个细胞。
在另一优选例中，步骤(S2)中，诱导培养的培养体系不含有血清。
在另一优选例中，步骤(S2)中，诱导培养的培养体系不含有饲养层(feeder)细胞。
在另一优选例中，步骤(S2)中，诱导培养的培养体系不含有血清，也不含有饲养层(feeder)细胞。
在另一优选例中，步骤(S2)中，诱导培养的时间为4-10天；较佳地，5-7天。
在本发明的第四方面，提供了一种多潜能干细胞，所述的干细胞是采用本发明的第三方面所述的方法制备的。
在另一优选例中，所述的干细胞来自人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的干细胞来自啮齿动物，较佳地大鼠或小鼠。
在另一优选例中，所述的小鼠干细胞具有选自下组的一个或多个特征：
(a)多能性基因的表达水平升高，较佳地，所述多能性基因包括Oct4、Sox2、Klf4和Dppa4；
(b)原始内胚层基因的表达水平下降，较佳地，所述原始内胚层基因包括Gata6、Sox17；
(c)中胚层基因的表达水平下降，较佳地，所述中胚层基因包括T；
(d)上胚层干细胞标志基因的表达水平降低，其中所述上胚层干细胞的标志基因包括Fgf5。
在另一优选例中，所述的小鼠干细胞具有选自下组的一个或多个特征：
(m1)相对表达量M1上升的Oct4，较佳地M1≥2，更佳地为2-6；
(m2)相对表达量M2上升的Sox2，较佳地M2≥2，更佳地为2-6；
(m3)相对表达量M3上升的Klf4，较佳地M3≥7，更佳地为7-15；
(m4)相对表达量M4上升的Dppa4，较佳地M4≥50，更佳地为50-80；
其中，所述的相对表达量是与诱导前的小鼠上胚层干细胞(EpiSC)中相对应的多能性基因表达量相比得出的相对表达量(其中，EpiSC的相对表达量定为1)。
在另一优选例中，所述的小鼠干细胞具有选自下组的一个或多个特征：
(f1)相对表达量F1下降的Gata6，较佳地F1≤0.2，更佳地为0.1-0.2；
(f2)相对表达量F2下降的Sox17，较佳地F2≤0.01，更佳地为0.001-0.01；
其中，所述的相对表达量是与诱导前的小鼠上胚层干细胞(EpiSC)中相对应的原始内胚层基因表达量相比得出的相对表达量(其中，EpiSC的相对表达量定为1)。
在另一优选例中，所述的小鼠干细胞具有以下特征：
相对表达量O1下降的T，较佳地T≤0.01，更佳地为0.001-0.01；
其中，所述的相对表达量是与诱导前的小鼠上胚层干细胞(EpiSC)中相对应的中胚层基因表达量相比得出的相对表达量(其中，EpiSC的相对表达量定为1)。
在另一优选例中，所述的小鼠干细胞具有以下特征：
相对表达量N下降的Fgf5，较佳地N≤0.02，更佳地为0.01-0.02；
其中，所述的相对表达量是与诱导前的小鼠上胚层干细胞(EpiSC)中相对应的)上胚层干细胞标志基因表达量相比得出的相对表达量(其中，EpiSC的相对表达量定为1)。
在另一优选例中，在X-L培养条件下，培养A0数量的小鼠多潜能干细胞(X-LSCs细胞)和在AF培养条件下，培养A0数量的EpiSCs细胞，在第N天时，获得X-LSCs细胞数量A1和EpiSCs细胞数量A2，其中，A1/A2≥1.2，更佳地，A1/A2≥1.5；其中N≥5(N为正整数)，其中，所述X-L培养条件为X-L培养液下，37℃，5％CO2培养；AF培养条件为AF培养液下，37℃，5％CO2培养。
在本发明的第五方面，提供了一种促进剂组合，所述的组合包括：
(a)GSK抑制剂；较佳地CHIR99021；
(b)Wnt抑制剂；较佳地XAV939；
(c)MAPK抑制剂；较佳地SB203580；
(d)GPCR抑制剂；较佳地(S)-(+)-马来酸二甲茚定；
(e)白血病抑制因子LIF；和
(f)骨形态发生蛋白4。
在本发明的第六方面，提供了一种如本发明第五方面所述的促进剂的用途，用于制备提高分离的多潜能细胞发育潜能的无血清培养液。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明中小鼠上胚层干细胞系的建立流程图，培养第8天，P4、P14和P24细胞形态图。
图2显示了本发明中小鼠上胚层干细胞(EpiSCs)向X-LSCs新型多能干细胞诱导流程图，在X-L培养液下诱导第5天(D5)，以及P1代、P9代和P17代细胞形态图。
图3显示了本发明中小鼠X-LSCs新型多能干细胞，P24和P43代细胞的碱性磷酸酶(AP)染色结果图。
图4显示了本发明中小鼠X-LSCs新型多能干细胞免疫荧光染色结果图，其中，DAPI为细胞核染色，Oct4、Nanog、Sox2、Gata6为X-LSCs新型多能干细胞中多能性基因的免疫荧光染色，Merge为叠加图。
图5显示了本发明中小鼠X-LSCs新型多能干细胞多能性和分化相关基因表达水平检测图，其中EpiSCs为小鼠上胚层干细胞，X-LSCs为本发明中小鼠X-LSCs新型多能干细胞。
图6显示了本发明中小鼠X-LSCs新型多能干细胞核型分析结果图。
图7显示了本发明中小鼠X-LSCs新型多能干细胞的生长曲线图，其中X-LSCs为本发明中小鼠X-LSCs新型多能干细胞，ESC为小鼠胚胎干细胞，EpiSCs为小鼠上胚层干细胞。
图8显示了本发明中X-LSCs细胞的分化能力检测结果，如图形成直径1.7～2.0cm的畸胎瘤。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量筛选，首次意外开发了一种提高多潜能细胞发育潜能的无血清培养液，所述培养液中含有用于提高细胞潜能的促进剂(包括白血病抑制因子LIF、骨形态发生蛋白4、XAV939、CHIR99021、SB203580、(S)-(+)-马来酸二甲茚定)。具体地，本发明的培养液可以将来源于小鼠胚胎E6天-7天(较佳地约E6.5天)的上胚层干细胞(EpiSC)，高效、快速地转化为多能性显著提高的新型多能干细胞，即X-LSCs。实验证明，本发明获得的新型多能干细胞的细胞潜能高，增殖速度快。在此基础上完成了本发明。
具体地，将小鼠上胚层干细胞转入添加六种生物因子的X-L体系中诱导培养，获得小鼠X-LSCs新型多能干细胞系，并对细胞进行碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、多能性基因表达水平、核型分析等初步检测。在本发明开发的无血清培养液中，细胞生长情况良好，能够维持自我更新的状态，稳定传至30代以上且不出现分化现象。
术语
如本文所用，“X-LSCs新型多能干细胞”、“本发明的多能干细胞X-LSCs”、“X-LSCs细胞”、“本发明的X-LSCs细胞”、“多潜能干细胞(X-LSC)”可互换使用，皆指上胚层干细胞(EpiSC)在本发明提供的培养液和相应方法中获得的细胞发育潜能提高的多能干细胞。
如本文所用，“EpiSC”、“EpiSCs”、“上胚层干细胞”、“分离的上胚层干细胞”可互换使用，皆指本发明中的用于制备新型多能干细胞的上胚层干细胞。
促进剂
本发明提供了一种促进剂，所述的促进剂包括分化抑制剂(组分a、b、c和d)和生物因子(组分e和f)。
其中，所述的促进剂包括：
(a)GSK抑制剂；较佳地CHIR99021；
(b)Wnt抑制剂；较佳地XAV939；
(c)MAPK抑制剂；较佳地SB203580；
(d)GPCR抑制剂；较佳地(S)-(+)-马来酸二甲茚定；
(e)白血病抑制因子LIF；和
(f)骨形态发生蛋白4。
其中，所述促进剂中不同的组分作用如下表所示：
Figure BDA0002927498000000081
小鼠上胚层干细胞(mouse epiblast stem cells，EpiSCs)
小鼠上胚层干细胞(mouse epiblast stem cells，EpiSCs)由着床后5.5-8.0天epiblast培养在feeder中，并添加Activin A、FGF2和KSR的条件下获得，与
Figure BDA0002927498000000091
的ESCs相比，EpiSCs保持了另一种多能性状态，被称作primed多能状态。自2007年首次分离获得EpiSCs后，EpiSCs被认为对应于植入后上胚层(epiblast)。
近年来，经研究发现，除了传统意义上的PSCs外，通过培养体系的优化改进可以获得一种新型的PSCs，这一新型的PSCs被命名为扩展型多能干细胞(extended pluripotentstem cells，EPSCs)。将小鼠8-细胞一个卵裂球或囊胚转入EPSCs诱导培养液中诱导培养获得的EPSCs，与传统的PSCs相比，不仅具有胎儿个体发育的潜能，而且具备发育为胎盘等胚外组织的能力。
与多能性更强的未分化的小鼠8细胞或囊胚中获得的细胞相比，本发明中的小鼠EpiSCs的多能性程度较低。本发明中的小鼠EpiSCs细胞来源于着床后的胚胎(如小鼠胚胎E6天-7天的胚胎细胞)，已经经历了细胞命运决定，虽未发生分化但却表达分化相关基因，因此从Primed状态的EpiSCs向
Figure BDA0002927498000000092
状态的转变则更为困难，需要突破更多的障碍。
特别地，本发明中的小鼠EpiSCs是在没有饲养层细胞和血清的情况下建立的，因此规避掉培养成分不明确的问题。
多潜能干细胞及其性能
本发明提供了由本发明第一方面所述的培养液培养的一种新型的多能干细胞(X-LSCs)。通过比较诱导前后多能性基因和分化相关基因的水平，及小鼠EpiSCs标志基因Fgf5的表达水平，发现诱导后的X-LSCs中Fgf5几乎不表达，同时多能性基因的表达水平显著上调，分化相关基因的表达显著下调。由此说明，X-L诱导体系能够提高细胞发育潜能，从而获得发育潜能较高X-LSCs细胞。
与小鼠ESCs和EpiSCs细胞相比，本发明的X-LSCs细胞在X-L诱导条件下能够快速繁殖，并稳定传代。
本发明的X-LSCs细胞有选自下组的一种或多种特征：
(a)多能性基因的表达水平升高，较佳地，所述多能性基因包括Oct4、Sox2、Klf4和Dppa4；
(b)原始内胚层基因的表达水平下降，较佳地，所述原始内胚层基因包括Gata6、Sox17；
(c)中胚层基因的表达水平下降，较佳地，所述中胚层基因包括T。
(d)上胚层干细胞标志基因的表达水平降低，其中所述上胚层干细胞的标志基因包括Fgf5。
本发明获得的新型多能干细胞的细胞潜能高，增殖速度快，染色体数目和形态正常，且具有体内分化能力。
在特定的培养条件下，本发明获得的新型多能干细胞(X-LSCs)还具有更好的生长性能，能够快速繁殖、稳定传代。特别地，与EpiSCs细胞、ESC细胞相比，本发明获得的新型多能干细胞(X-LSCs)在X-L诱导条件下(X-L培养液，37℃，5％CO2)培养时，具有更优异的生长性能。
具体地，接种A0数量的X-LSCs细胞、ESCs细胞、EpiSCs细胞，分别在X-L培养液、2i/Lif培养液和AF培养液中，37℃，5％CO2条件下培养，培养至第6天(D6)时，X-LSCs的细胞数量A1显著高于EpiSCs的细胞数量A2和ESCs的细胞数量A3。较佳地，A1/A2≥1.2，A1/A3≥5，更佳地，A1/A2≥1.5，A1/A3≥6。
培养方法
本发明提供了一种小鼠上胚层干细胞向多能干细胞转化的培养方法：
(S1)提供分离的上胚层干细胞(EpiSCs)；
(S2)在本发明第一方面所述的培养液中，诱导培养所述的上胚层干细胞(EpiSCs)，从而获得所述的干细胞。
由于饲养层细胞分泌物质及血清成分不明确，其对干细胞多能性的维持机制较为复杂。而在本发明的步骤(S2)中，诱导培养的培养体系不含有血清，也不含有饲养层(feeder)细胞，培养成分明确。
较佳地，步骤(S1)中，优选使用添加有生长因子的基础培养基培养获得上胚层干细胞(EpiSCs)。更佳地，所述生长因子包括激活素A、碱性成纤维细胞生长因子。在具体实施例中，所述添加有生长因子的基础培养基为AF培养液。
较佳地，步骤(S2)中，优选使用添加有促进剂的基础培养基诱导培养EpiSCs，进而获得本发明的新型多能干细胞(X-LSCs)。更佳地，所述促进剂包括：
(a)GSK抑制剂；较佳地CHIR99021；
(b)Wnt抑制剂；较佳地XAV939；
(c)MAPK抑制剂；较佳地SB203580；
(d)GPCR抑制剂；较佳地(S)-(+)-马来酸二甲茚定；
(e)白血病抑制因子LIF；和
(f)骨形态发生蛋白4。
在另一优选例中，所述添加有促进剂的基础培养基为X-L培养液。特别地，在X-L培养液中培养本发明的新型多能干细胞(X-LSCs)，与在AF培养液中培养的EpiSCs相比，在细胞数量和其他培养条件相同的情况下，具有更优异的生长性能。
在一具体实施例中，包括以下步骤：
(S1)小鼠上胚层干细胞的建立
采集小鼠E6.5天胚胎，放入磷酸缓冲液中清洗三遍，将胎盘锥与胚区切开，胚区分别转入AF培养液，37℃，5％CO2中培养，5-7天后胚胎周围陆续长出克隆，利用玻璃针机械传代3-5次后，便可采用Accutase酶消化传代，所获得小鼠上胚层干细胞细胞形态呈扁平片状，细胞表面光滑边界明显，能够稳定传至30代次以上。
(S2)小鼠上胚层干细胞向多能干细胞诱导
将(S1)中获得的稳定传至P15代以上的1×105个小鼠上胚层干细胞转入化学成分明确的X-L培养液中，37℃，5％CO2条件下诱导培养，获得能够稳定传至30代次以上的新型多能性干细胞，即X-LSCs。
其中，所述AF培养液组成如下(500mL)：
Figure BDA0002927498000000111
Figure BDA0002927498000000121
(S2)中所述X-L培养液组成如下(500mL)：
成分名称 体积
基础培养液DMEM/F12 238.0mL
基础培养液Neurobasal 238.0mL
N2替代物 2.5mL
B27替代物 5.0mL
牛血清白蛋白 25.0mg
非必需氨基酸 5.0mL
L-谷氨酰胺 5.0mL
β-巯基乙醇 1.0mL
青霉素/链霉素 5.0mL
白血病抑制因子LIF 1000U/mL
骨形态发生蛋白4 50.0ng/mL
CHIR99021 3.0μM
XAV939 5.0μM
SB203580 10.0μM
(S)-(+)-马来酸二甲茚定 2.0μM
本发明的主要优点包括
(1)培养成分明确：本发明在不使用饲养层细胞和血清的情况下建立小鼠EpiSCs，利用化学成分明确的小分子化合物进行诱导培养，获得新型多能干细胞，建立Primed向
Figure BDA0002927498000000122
状态转变的新方法。本发明提供的培养液成分明确，重复性好，便于商业应用。
(2)诱导前细胞来源不同：本发明提供了一种从多能性程度较低的EpiSCs细胞向新型多能干细胞转化的方法，获得的新型多能干细胞的细胞发育潜能显著提高。
(3)诱导速率快：本发明中提出的诱导体系只需要5-7天便可将小鼠EpiSCs诱导成形态类似小鼠ESCs的新型多能干细胞。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用步骤
1.小鼠上胚层干细胞的建立
收集E6.5天的胚胎，用镊子将胚胎轻轻剥离出来，用拉好的玻璃针将外胎盘锥和胚区切割开，分离出的胚区呈“U”型，磷酸缓冲液清洗三遍后将其分别转入AF培养液中培养。
培养5-7天后胚胎周围陆续长出outgrowth的细胞，用玻璃针轻轻切割边界较明显的扁平状克隆，切成大小均等的小块后转入新的孔中培养，机械传代5次后，形成的克隆较大且表面光滑(见图1)，便可采用Accutase消化传代进行纯化，获得小鼠上胚层干细胞(简称为“EpiSC”)。
所述AF培养液组成如下(500mL)：
Figure BDA0002927498000000131
Figure BDA0002927498000000141
2.小鼠上胚层干细胞向多能干细胞的诱导
将步骤1中获得的稳定传至P15代以上的1×105个小鼠上胚层干细胞转入化学成分明确的X-L培养液中，37℃，5％CO2条件下诱导培养，每隔24小时进行换液处理，诱导5-7天后，有三维穹顶状克隆出现，并伴随部分细胞发生细胞凋亡现象，用玻璃针将三维穹顶状克隆挑入新的培养皿中培养，如此机械传代不断纯化，最终可以获得表面光滑、折光度高，且克隆边界明显的三维穹顶状新型多能性干细胞(简称为“X-LSC”)，细胞形态见图2。
所述X-L培养液组成如下(500mL)：
Figure BDA0002927498000000142
Figure BDA0002927498000000151
3.小鼠X-LSCs细胞生物学特性检测
(1)AP(碱性磷酸酶)染色，用于检测X-LSCs细胞是否呈碱性磷酸酶阳性。
AP染液配制方法：在1mL碱性磷酸酶缓冲液中加入1μL BCIP溶液和2μL NBT溶液充分混匀，配置成BCIP/NBT工作液避光备用，BCIP/NBT工作液需现用现配。
(2)免疫荧光染色，检测X-LSCs细胞中相关蛋白的定位情况。
免疫荧光染色的具体步骤如下：
1)将X-LSCs细胞接种于八孔板中，培养箱中培养48h；
2)弃掉培养液，加磷酸缓冲液清洗2次，每次5min；
3)加入4％多聚甲醛室温固定30min；磷酸缓冲液清洗3次，每次5min；
3)加入IF buffer(含1％BSA和0.1％TritonX 100的磷酸缓冲液)，室温透膜30min；
4)加入一抗，4℃避光孵育过夜；
5)室温下用IF buffer清洗3次，每次5min；
6)加入二抗，室温避光孵育1h；
7)室温下用IF buffer清洗3次，每次5min；
8)加入稀释好的DAPI复染细胞核，室温避光孵育10min；
9)室温下用IF buffer清洗3次，每次5min；
10)磷酸缓冲液洗1遍；将八孔板拆开，滴入封片剂，将盖玻片缓慢的放下，再用指甲油将四周完整的涂抹，完成封片；用激光共聚焦显微镜下观察并拍照(见图4)。
(3)多能性基因表达水平检测，RT-qPCR用于检测小鼠X-LSCs细胞中多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和Gata6等表达情况，
具体实验步骤如下：
1)RNA提取：利用
Figure BDA0002927498000000152
Super Total RNA Extraction Kit(Promega，LS1040)试剂盒提取样品总RNA，测定RNA浓度。
2)cDNA获得：利用GoScriptTM Reverse Transcription System(Promega，A5001)试剂盒进行反转录实验。提前准备一个冰盒，将所用试剂置于冰上融化。反转录反应体系为20μL，包括两部分分别是5μL和15μL。5μL体系如下：在无酶PCR管中加入RNA(1μg)+Oligo(dT)15Primer 1μL，70℃孵育5min后置于冰盒中至少5min，离心＞10s后再放回到冰盒中待用。15μL体系如下：GoScriptTM 5×缓冲液4μL，氯化镁3μL，dNTP 1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，GoScriptTM反转录酶1μL，无酶水定容至15μL。将5μL体系和15μL体系混合放入PCR仪，反应程序为：25℃5min→42℃1h→70℃15min。
3)RT-qPCR反应：按照
Figure BDA0002927498000000161
qPCR Mater Mix(Promega，A6001)反应体系及程序进行实验，通过2- ΔΔ Ct法对各基因的mRNA相对表达量进行分析(见图5)。
(4)核型分析，用来检测诱导后X-L新型多能干细胞中染色体数目和形态是否正常(见图6)。
具体实验步骤如下：
1)收集细胞：在处于对数生长期的细胞中加入20μg/mL浓度的秋水仙素5μL/mL，处理2小时15分钟后消化细胞，离心后弃上清；
2)低渗处理：向细胞中加入8mL 0.075mol/L KCl，吹打混匀，置37℃恒温水浴锅低渗处理40min。
3)固定：在低渗结束前1min加入1mL固定液对其进行预固定，混匀后1000rpm离心10min，弃上清。
4)固定：加入8mL固定液，轻轻吹打混匀，置37℃恒温水浴锅固定30min后1000rpm离心10min，弃上清(此过程重复两次)。
5)滴片：在固定好的细胞中加入新配置的固定液0.5mL，吹打均匀制成细胞悬液，将细胞悬液高空滴于事先经冰水浸泡过的洁净载玻片上，70℃烘箱烘干1h，室温冷却；将做好的片子置于Giemsa染液中处理10min后用自来水轻轻冲洗背面，自然晾干；显微镜下观察拍照(见图6)。
(5)细胞增殖检测
用已喷洒70％酒精的擦镜纸擦拭血球计数板和24mm×24mm的盖玻片，将盖玻片放置在血球计数板中间计数区。消化待测细胞，终止，离心，弃上清后，加入1mL细胞培养液重悬反复吹打成单细胞。取10μL细胞悬液沿盖玻片边缘滴入计数池，再取10μL细胞悬液从另一侧滴入，此过程应避免产生气泡，引起误差，静置片刻，使细胞沉降到计数板上，按血球计数板使用方法进行细胞计数。为降低误差，一般选取8个方格的细胞进行计数，上方4个方格的细胞数计为A，下方4个方格的细胞数计为B，细胞总数的计算公式为：细胞总数＝1/8(A+B)×1×104个，每次向24孔板接入1×105个细胞，24h后进行计数，连续记录6天，绘制细胞生长曲线。
(6)体内分化能力检测
将X-LSCs接种到6孔板中，待细胞生长密度适中时，选取2孔，细胞数量为1×106个细胞Accutase消化3min后，加入终止液终止消化，离心1300rpm，3min，弃上清，向离心管中加入200μL磷酸缓冲液重悬，用1mL注射器抽取细胞悬液。用酒精棉球擦拭免疫缺陷裸鼠后腿，采用皮下注射的方法将200μL细胞悬液注射到小鼠体内，4周后解剖小鼠腿部取出畸胎瘤，拍照记录。
4.小鼠X-LSCs细胞冷冻保存
24孔培养皿中培养的小鼠X-LSCs细胞用Accutase消化2分钟，加入3倍体积的终止液终止消化；1300rpm离心3分钟，弃掉上清，在细胞沉淀中加入1mL细胞冻存液混匀；做好标记将冻存管放入程序降温盒，转入-80℃低温冰箱静置24小时后，移入液氮中长期保存。
所述终止液组成如下(50mL)：
成分名称 体积
N2B27基础培养液 44.5mL
血清替代物 5.0mL
青霉素/链霉素 0.5mL
所述冻存液组成如下(10mL)：
成分名称 体积
血清替代物 9mL
二甲基亚砜 1mL
实施例1：小鼠上胚层干细胞的建立
采集小鼠E6.5天胚胎，放入磷酸缓冲液中清洗三遍，将胎盘锥与胚区切开，胚区分别转入人纤黏连蛋白包被的24孔培养皿中，AF培养液，37℃，5％CO2培养(AF培养条件)，5-7天后胚胎周围陆续长出克隆，利用玻璃针机械传代3-5次后，便可采用Accutase酶消化传代，所获得小鼠上胚层干细胞细胞(EpiSCs)形态呈扁平片状，细胞表面光滑边界明显，能够稳定传至30代次以上，细胞形态见图1。
实验结果如图1所示，细胞形态呈扁平片状，细胞表面光滑边界明显。
实施例2：小鼠上胚层干细胞向多能干细胞诱导
将实施例1中获得的稳定传至P20代以上的小鼠上胚层干细胞转入化学成分明确的X-L培养液中，37℃，5％CO2条件下诱导培养(X-L培养条件)，24孔培养皿接入细胞数量为每孔1×105，每隔24小时进行换液处理，诱导5-7天后，有三维穹顶状克隆出现，并伴随部分细胞发生细胞凋亡现象，用玻璃针将三维穹顶状克隆吸入新的培养皿中培养，机械传代不断纯化。
实验结果如图2所示。最终获得的X-LSCs细胞形态为三维穹顶状，表面光滑、折光度高，且克隆边界明显。
实施例3：小鼠X-LSCs细胞生物学特性检测
1.小鼠X-LSCs细胞碱性磷酸酶(AP)染色
将小鼠X-LSCs细胞培养在4孔板中，培养至细胞密度达80％时弃掉培养液，用磷酸缓冲液洗掉死细胞和杂质，加入500μL 4％多聚甲醛，室温固定30min；弃掉固定液后加入磷酸缓冲液洗3遍；弃掉磷酸缓冲液加入500μL BCIP/NBT工作液，室温避光孵育30min；弃掉BCIP/NBT工作液，磷酸缓冲液洗1遍后显微镜下观察拍照(见图3)。
结果显示AP染色30min后，X-LSCs细胞呈蓝紫色(见图3)。实验结果表明X-LSCs细胞碱性磷酸酶阳性。
2.小鼠X-LSCs细胞免疫荧光染色
免疫荧光染色，检测X-L新型多能干细胞中相关蛋白的定位情况。检测结果显示，在X-LSCs细胞多能性蛋白Oct4、Sox2和Nanog具有较强的荧光强度，原始内胚层标志蛋白Gata6并未检测到(见图4)，表明X-LSCs细胞与小鼠ESCs细胞具有相似的特征。
3.多能性基因表达水平检测
多能性基因表达水平检测，RT-qPCR用于检测小鼠X-LSCs细胞中多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和分化相关基因Gata6、T等表达情况，
其中RT-PCR的数据处理如下表A所示：
表A.
Figure BDA0002927498000000181
Figure BDA0002927498000000191
结果显示，与诱导前小鼠上胚层细胞相比，多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和Dppa4的表达水平明显升高(分别为2.13倍、2.09倍、7.27倍、50.34倍)。
此外，Primed标志性基因Fgf5、原始内胚层基因Gata6、Sox17、中胚层基因T的表达均显著低于对照组(见表A、图5)，这表明，诱导后获得的X-LSCs细胞与上胚层细胞不同，X-L诱导体系能够提高细胞发育潜能，从而获得发育潜能较高X-LSCs。
4.小鼠X-LSCs细胞核型分析
核型分析，用来检测诱导后X-LSCs细胞中染色体数目和形态是否正常(见图6)。
结果表明，X-L诱导体系不会使细胞中染色体数目和形态发生异常。
5.X-LSCs细胞增殖检测
选取生长状态良好的细胞进行细胞计数，实验组为X-LSCs细胞，对照组为小鼠ESCs和EpiSCs细胞。其中，X-LSCs细胞、EpiSCs细胞、ESCs细胞分别在X-L培养液、AF培养液和2i/Lif培养液中，37℃，5％CO2条件下培养。每组细胞的起始量为1×105个，每次选取1×105个细胞接入24孔板，每隔24h计数一次，连续记录6次，绘制生长曲线(图7)。
结果显示，从D3天开始X-LSCs细胞生长速度开始高于小鼠ESCs细胞，D5天开始高于小鼠EpiSCs。并且由于细胞数量的积累，到D6天时，X-LSCs细胞数量(约为120×106个细胞)显著高于小鼠ESCs(约为20×106个细胞)，约为小鼠ESCs细胞数量的6倍；以及X-LSCs细胞数量显著高于EpiSCs细胞(约为80×106个细胞)，约为EpiSCs细胞数量的1.5倍。
结果说明，X-LSCs在X-L诱导条件下能够快速繁殖，并稳定传代，在生长能力方面高于小鼠ESCs和EpiSCs细胞。
6.X-LSCs体内分化能力检测
为了验证诱导后X-LSCs是否具有体内分化能力，将200μL X-LSCs的细胞悬液(细胞数量为1×106个)注射到免疫缺陷型小鼠的后腿，4周后获得了直径为1.7～2.0cm的畸胎瘤。
结果如图8所示，表明经X-L诱导体系获得的X-LSCs细胞具有体内分化能力。
讨论
本发明利用化学成分明确的培养体系，提高由小鼠上胚层干细胞向多能干细胞的转化速度和效率，探讨待发态(Primed)向始发态
Figure BDA0002927498000000201
转变过程中，“中间态”多能性细胞的分子特性。对研究干细胞多能性维持机制和不同类型多能性细胞之间相互转化的基因调控网络提供参考。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于提高分离的多潜能细胞发育潜能的无血清培养液，其特征在于，所述培养液包含基础培养液和用于提高细胞潜能的促进剂；
其中所述的促进剂包括：
(a)GSK抑制剂；较佳地CHIR99021；
(b)Wnt抑制剂；较佳地XAV939；
(c)MAPK抑制剂；较佳地SB203580；
(d)GPCR抑制剂；较佳地(S)-(+)-马来酸二甲茚定；
(e)白血病抑制因子LIF；和
(f)骨形态发生蛋白4。
2.如权利要求1所述的无血清培养液，其特征在于，所述促进剂包括分化抑制剂(组分a、b、c和d)和生物因子(组分e和f)。
3.如权利要求1所述的无血清培养液，其特征在于，所述促进剂具有选自下组的一个或多个特征：
(a)所述GSK抑制剂的浓度为0.5～20μmol/L；
(b)所述Wnt抑制剂的浓度为0.2～10μmol/L；
(c)所述MAPK抑制剂的浓度为0.2～20μmol/L；
(d)所述GPCR抑制剂的浓度为0.1～10μmol/L；
(e)所述白血病抑制因子LIF的浓度为500～2000U/mL；
(f)所述骨形态发生蛋白4的浓度为10～100ng/mL；
其中，各浓度按培养液的总体积计。
4.一种制备权利要求1所述提高分离的多潜能细胞发育潜能的无血清培养液的方法，其特征在于，包括步骤：
将基础培养液和用于提高细胞潜能的促进剂进行混合，从而形成权利要求1所述的培养液；
其中，所述的促进剂包括：
(a)GSK抑制剂；较佳地CHIR99021；
(b)Wnt抑制剂；较佳地XAV939；
(c)MAPK抑制剂；较佳地SB203580；
(d)GPCR抑制剂；较佳地(S)-(+)-马来酸二甲茚定；
(e)白血病抑制因子LIF；和
(f)骨形态发生蛋白4。
5.一种制备多潜能干细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(S1)提供分离的上胚层干细胞(EpiSC)；
(S2)在权利要求1所述的培养液中，诱导培养所述的上胚层干细胞(EpiSC)，从而获得所述的多潜能干细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的上胚层干细胞来源于胚胎E6天-7天(较佳地约E6.5天)的胚胎细胞。
7.在如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(S2)中，诱导培养的时间为4-10天；较佳地，5-7天。
8.一种多潜能干细胞，其特征在于，所述的干细胞是采用权利要求5所述的方法制备的。
9.如权利要求8所述的多潜能干细胞，其特征在于，在X-L培养条件下，培养A0数量的小鼠多潜能干细胞(X-LSCs细胞)和在AF培养条件下，培养A0数量的EpiSCs细胞，在第N天时，获得X-LSCs细胞数量A1和EpiSCs细胞数量A2，其中，A1/A2≥1.2，更佳地，A1/A2≥1.5；其中N≥5(N为正整数)。
10.一种促进剂组合，其特征在于，所述的组合包括：
(a)GSK抑制剂；较佳地CHIR99021；
(b)Wnt抑制剂；较佳地XAV939；
(c)MAPK抑制剂；较佳地SB203580；
(d)GPCR抑制剂；较佳地(S)-(+)-马来酸二甲茚定；
(e)白血病抑制因子LIF；和
(f)骨形态发生蛋白4。
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