CN114835726A - 一类抑制肿瘤细胞干性的化合物及用途 - Google Patents

一类抑制肿瘤细胞干性的化合物及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类抑制肿瘤细胞干性的化合物及用途；该化合物的结构式为
Figure DDA0003563772180000011
其中，R1选自低级直链烷基、低级支链烷基或卤素元素取代的低级烷基，R2选自低级支链烷基或低级环烷基。本发明的化合物可用来抑制肿瘤细胞干性。

Description

一类抑制肿瘤细胞干性的化合物及用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一类抑制肿瘤细胞干性的化合物及用途。
背景技术
前列腺癌是影响男性，尤其是50岁以上男性健康的一个重要因素，是男性中最常被诊断出的癌症。前列腺癌患者发病隐袭，疾病进展中没有明显的临床症状，一旦发现，往往已经发展到进展阶段。常规疗法，如前列腺切除术、放疗和激素治疗，在前列腺癌的起始阶段有效，然而它最终会发展为转移性，药物和去势抵抗性前列腺癌。许多晚期前列腺癌最初对雄激素剥夺治疗有反应，但后来发展为对常规疗法有抵抗的一种侵略性的、不依赖雄激素的表型，并转移至淋巴结和骨骼。骨转移在前列腺癌中很常见，这些患者因为病理骨折，压缩脊髓，高钙血症和骨骼的极度疼痛等症状，生活质量及预后都很差。
传统癌症疗法可以消除大部分肿瘤，消灭大量分化的肿瘤细胞，但肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)可以逃避常规化疗生存下来。它们是存在肿瘤内的一类极少数干样细胞亚群，负责不同恶性肿瘤的起始，复发，转移和抵抗，具有无限增殖、免疫逃逸、自我更新、多向分化潜能和高致瘤性的特点。CSCs能够繁殖成新的肿瘤块并且对常规抗癌疗法具有抵抗性，被认为是癌症进展和复发的驱动力。
随着医疗水平和技术的进步，前列腺癌的发病率和死亡率有所降低，但前列腺癌雄激素抵抗和复发的发生，仍给患者和社会造成了严重的经济和精神负担。多年来，针对前列腺癌的基础研究并没有为治疗和预后带来突破性的进展，需要从新的角度寻找特异性的治疗药物和方法。而如何有效地和特异性地抑制肿瘤细胞干性是当前肿瘤治疗中的一种重要手段，对我们开发靶向治疗抑制剂至关重要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一类抑制肿瘤细胞干性的化合物及用途。本发明运用前列腺癌细胞株，添加化合物后，通过成球、实时定量聚合酶链实验以及细胞迁移实验，观察化合物能否抑制肿瘤细胞干性。
肿瘤转移主要和以下几个因素有关，1.遗传异质性：它是肿瘤细胞逃避免疫监视、产生化疗抗性、形成转移复发的根源，是抗转移治疗中不可忽视的重要环节。2.上皮间充质转化(EMT)，它的发生是一个动态、多步骤的过程，包括细胞间黏附的丧失、肿瘤基底膜和细胞外基质的破坏以及细胞骨架的重构导致细胞运动型增强和迁移的产生。3.失巢凋亡抗性，因细胞与外基质之间失去交互作用而诱导的凋亡形式称为“失巢凋亡”，这一过程体现的是一种胞核机制，避免无赖细胞在正确解剖位置以外的地方建立克隆。因此，转移细胞必须对失巢凋亡以及凋亡本身产生抗性，自身在播散和异位定植的过程中才能得以存活。4.新生血管形成，血管生成能力被认为是肿瘤侵袭性高低的标志。肿瘤细胞及肿瘤基质中的肿瘤相关巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞等都能产生血管生长因子，促进肿瘤生长。5.细胞外基质ECM降解，MMP是参与破坏细胞外基质的一类重要的酶，氨肽酶N可降解细胞外基质，促进血管生成，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。6.细胞黏附分子，细胞黏附包括癌细胞与癌细胞之间的同质性黏附和癌细胞与基质细胞之间的异质性粘附。细胞黏附在恶性肿瘤转移中发挥重要作用，一方面肿瘤细胞间的附着减弱，使肿瘤细胞脱离与周围细胞的附着，另一方面，肿瘤细胞粘附于基质和血管内内皮细胞，并进入血循环造成血行转移。7.免疫逃避，肿瘤细胞免疫逃避的主要机制为呈递抗原机制发生变化，主要是肿瘤细胞膜表面主要组织相容性抗原复合体I类分子表达的下调或不表达，同时肿瘤细胞抑制髓系祖细胞分化成为成熟抗原呈递细胞。
而癌干细胞是肿瘤发生和恶性肿瘤的罪魁祸首。这些细胞是癌细胞的亚群，癌细胞拥有自我更新能力并可区分为由大肿瘤块组成的各种癌细胞。癌干细胞几乎与所有主要类型的癌症独立开来，对现有癌症疗法具有彻底的抵抗性。通过抑制肿瘤干性信号通路(包括STAT3和β-catenin等)从而靶向抑制CSCs及干性肿瘤细胞，来发挥抗肿瘤作用。成球实验在单个细胞的水平上可以对于细胞的自我更新和多项分化潜能进行较为准确的评估，成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法。其判断的是单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力,一般用细胞球形成效率表示。本发明提供了一类具有结构式
Figure BDA0003563772160000021
的化合物；该化合物可用来抑制肿瘤细胞干性。
具体而言，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一类具有如下结构式的化合物：
Figure BDA0003563772160000031
其中，R1选自低级直链烷基、低级支链烷基或卤素元素取代的低级烷基，R2选自低级支链烷基或低级环烷基。
作为本发明的一个实施方案，所述低级支链烷基为C3-8支链烷基，所述低级直链烷基为C1-8直链烷基。所述卤素元素取代的低级烷基为卤素取代的C1-8烷基。所述低级环烷基为C3-8环烷基。
作为本发明的一个实施方案，所述化合物的结构式包括：
Figure BDA0003563772160000032
第二方面，本发明涉及一类本发明的化合物在制备抑制肿瘤细胞干性的药物中的用途。
作为本发明的一个实施方案，所述抑制肿瘤细胞干性的药物中，所述化合物的有效浓度为0.5μM-5μM。
第三方面，本发明涉及一种抑制肿瘤细胞干性的药物组合物，所述药物组合物以本发明的化合物为活性成分。
作为本发明的一个实施方案，所述药物组合物中化合物的总有效浓度为0.5μM- 5μM。
作为本发明的一个实施方案，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
作为本发明的一个实施方案，所述本发明的化合物包括AM-118，AM121和AM-123。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明提供了一类具有结构式
Figure BDA0003563772160000033
的化合物；该化合物可用来抑制肿瘤细胞干性；
2)本发明提供了一种以本发明的化合物为活性成分的抑制肿瘤细胞干性的药物组合物。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1(a)为NJ-78和NJ-95对细胞成球能力的影响示意图；(b)为NJ-78和NJ-95 对细胞成球能力的影响统计图；
图2(a)为AM-118，AM121和AM-123对细胞成球能力的影响示意图；(b)为AM- 118，AM121和AM-123对细胞成球能力的影响统计图；
图3(a)为NJ-78和NJ-95实验组的干细胞标志物Oct4和Bmi1的mRNA转录水平的变化；(b)为AM-118，AM121和AM-123实验组的干细胞标志物Oct4和Bmi1的mRNA 转录水平的变化；
图4(a)为NJ-78对肿瘤细胞迁移的影响图；(b)为NJ-78对肿瘤细胞迁移的影响统计图；
图5(a)为NJ-95对肿瘤细胞迁移的影响图；(b)为NJ-95对肿瘤细胞迁移的影响统计图；
图6(a)为AM-118，AM121和AM-123对肿瘤细胞迁移的影响图；(b)为AM-118， AM121和AM-123对肿瘤细胞迁移的影响统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、化合物AM-118的合成
化合物AM-118的合成路线如下式所示：
Figure RE-GDA0003693553970000051
化合物AM-118的实验步骤和结果：
第一步：合成2-羟基-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯
Figure BDA0003563772160000052
在室温下，往包含(E)-4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮(50.0g，298mmol，1.00eq)和2-氨基甲酰基乙酸乙酯(39.00g，298mmol,1eq)的1.2L甲醇溶液中，搅拌状态下分批加入甲醇钠CH3ONa(20.9g，386mmol，1.3eq)。将所得溶液加热至 70℃并搅拌16h。之后使混合物冷却至室温。再将得到的混合物在真空下浓缩。将残余物溶解在DCM(400mL)中。用水(3×300mL)萃取混合物。用HCl(2M)将水层酸化至
Figure BDA0003563772160000053
将所得混合物再用二氯甲烷(3×500mL)萃取。合并的有机层用浓盐水(1L) 洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩，得到白色固体状的2-羟基-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯(46g，69.94％)。LCMS：(MS，ESI)：222[M+H]+.
第二步：合成5-溴-2-羟基-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯
Figure BDA0003563772160000061
在室温下，将2-羟基-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯(24.0g，108mmol， 1.00eq)和NBS(23.2g，130mmol，1.2eq)混合在DMF(400mL)中搅拌3h。将反应液缓慢倒入冰/水(500mL)中。过滤收集固体，用水(100mL)洗涤，并在IR灯下干燥，得到白色固体5-溴-2-羟基-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯(16.0g，44％)。
LCMS:(MS,ESI):300,302[M+H]+.
第三步：合成5-溴-2-(三氟甲磺酰氧基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯
Figure BDA0003563772160000062
在氮气保护下，0℃，往搅拌中的包含5-溴-2-羟基-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯(5.00g，16.7mmol，1.00eq)和DIEA(6.46g，49.9mmol，3.00eq)的DCM (100mL)溶液里，逐滴加入Tf2O(9.40g，33.3mmol，2eq)。将得到的混合物在氮气保护下，20℃，搅拌16小时。然后将得到的混合物用浓盐水(2×100mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(5：1)洗脱，得到浅黄色固体5-溴-2-(三氟甲磺酰氧基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯(4.5 g，62％)。
第四步：合成5-溴-2-[(4-溴苯基)硫烷基]-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯
Figure BDA0003563772160000063
在80℃下,5-溴-2-(三氟甲磺酰氧基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯(5.00 g，11.6mmol，1.00eq)，4-溴苯硫醇(2.19g，11.6mmol，1eq)和DIEA(4.49g， 34.7mmol，3.00eq)在DMF(50mL)中搅拌2h。混合物冷却至室温，用EA(250mL) 稀释，再用水(3×250mL)洗涤，之后用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(5∶1)洗脱，得到白色固体5-溴-2-[(4-溴苯基)硫烷基]-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯(5g，91％)。LCMS:(MS, ESI):470,472,474[M+H]+.
第五步：合成5-溴-2-[(4-溴苯基)硫烷基]-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸
Figure BDA0003563772160000071
5-溴-2-[(4-溴苯基)硫烷基]-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸甲酯(4.00g，8.49mmol，1.00eq)溶解在THF(30mL)中，LiOH(2.03g，84.9mmol，10eq)溶解在H2O(30mL)中，用后者加到前溶液中。将得到的混合物在25℃下搅拌4h。然后减压下部分浓缩，并在0℃下用HCl(2M)酸化至
Figure BDA0003563772160000072
过滤收集沉淀的固体，用冰水(2×5mL)洗涤，并在IR灯下干燥，得到浅绿色固体5-溴-2-[(4-溴苯基)硫烷基] -6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸(3.9g，99.49％)。
1HNMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.62–8.57(m,1H),7.57–7.47(m,2H),7.34–7.27(m,2H).
LCMS:(MS,ESI):456,458,460[M+H]+.
第六步：合成3,7-二溴-2-(三氟甲基)硫代色素[2,3-b]吡啶-5-酮
Figure BDA0003563772160000073
5-溴-2-[(4-溴苯基)硫烷基]-6-(三氟甲基)吡啶-3-羧酸(2.00g，4.37 mmol，1.00eq)和DMF(1滴)溶解在DCM(40.0mL)中，然后在0℃下逐滴加入 (COCl)2(5.55g，43.7mmol，10eq)。将混合物在室温搅拌5h，然后在减压下浓缩。将新鲜制备的酰氯重新溶解在DCM(40.0mL)中。在0℃下，向上述混合物中分批加入 AlCl 3(3.50g，26.3mmol，6eq)。将所得混合物在26℃下搅拌过夜。将混合物缓慢倒入冰/水(100mL)中，用HCl(2M)酸化至
Figure BDA0003563772160000074
并用DCM(3×100mL)萃取。合并的有机层用浓盐水(100mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用DCM/EA(3：1)洗脱，得到浅绿色固体3,7-二溴-2-(三氟甲基)硫代色素[2,3-b]吡啶-5-酮(1.65g，85％)。
1HNMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.12(d,J＝0.7Hz,1H),8.72(d,J＝2.2Hz,1H),
7.84(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),7.57(d,J＝8.6Hz,1H).
第七步：合成7-溴-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基]硫代色素 [2,3-b]吡啶-5-酮
Figure BDA0003563772160000081
3,7-二溴-2-(三氟甲基)硫代色素[2,3-b]吡啶-5-酮(1.60g，3.64mmol，1.00eq)，3-(三氟甲基)-1H-吡唑(2.48g，18.2mmol，5.00eq)和K2CO3(3.02g， 21.8mmol，6.00eq)溶解在DMF(80mL)中，然后和1，4-二氧六环(80mL)在100℃下搅拌36h。将混合物冷却至室温，用EA(200mL)稀释，用浓盐水(3×100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(5：1) 洗脱，得到浅黄色固体7-溴-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基]硫代色素[2，3-b]吡啶-5-酮(700mg，36％)。
LCMS:(MS,ESI):494,496[M+H]+.
第八步：合成7-(丙-1-烯-2-基)2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基] 硫代色素[2,3-b]吡啶-5-酮
Figure BDA0003563772160000082
7-溴-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基]硫代色素[2,3-b]吡啶-5- 酮的混合物(700mg，1.42mmol，1.00eq)，4,4,5,5-四甲基-2-(丙-1-烯-2-基) -1,3,2-二氧杂硼烷二氧硼戊环(476mg，2.83mmol，2.00eq)，Pd(dppf) Cl2.CH2Cl2(231mg，0.283mmol，0.20eq)和K2CO3(489mg，3.54mmol，2.50eq)溶解在35mL的1,4-二氧六环和9mL H2O中，在100℃下搅拌4h。将混合物冷却至室温，用水(100mL)稀释，并用EA(2×150mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(5∶1)洗脱，得到黄色固体7-(丙-1-烯-2-基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基] 硫代色素[2,3-b]吡啶-5-酮(580mg，86％)。
LCMS:(MS,ESI):456[M+H]+.
第九步：合成7-(丙-1-烯-2-基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1- 基]-5H-硫代色素[2,3-b]吡啶-5-醇
Figure BDA0003563772160000091
7-(丙-1-烯-2-基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基]硫代色素 [2,3-b]吡啶-5-酮(580mg，1.27mmol，1.00eq)溶在THF(20mL)和MeOH(5mL)，在 0℃下，分批加入NaBH4(48mg,1.27mmol,1.00eq)。所得混合物在0℃下搅拌1h，然后在10℃下减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(4∶1)洗脱，得到浅黄色固体7-(丙-1-烯-2-基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基] -5H-硫代色素[2,3-b]吡啶-5-醇(274mg，40％)。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.22(s,1H),7.77(ddt,J＝10.0,1.8,0.9Hz,2H),7.51– 7.44(m,2H),6.77(d,J＝2.6Hz,1H),5.66(d,J＝6.7Hz,1H),5.44(q,J＝0.9Hz,1H),5.16(p, J＝1.4Hz,1H),2.76(d,J＝6.8Hz,1H),2.18(dd,J＝1.5,0.8Hz,3H).
LCMS:(MS,ESI):458[M+H]+.
第十步：合成7-(1-甲基环丙基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1- 基]-5H-硫代色素[2,3-b]吡啶-5-醇
Figure BDA0003563772160000092
在0℃下，1-甲基-1-亚硝基脲(1.61g，15.6mmol，30eq)在Et2O(10mL)中搅拌,KOH(1.75g，31.3mmol，60eq)溶解在H2O(10mL)中，把后者逐滴加入到前者。将混合物在0℃下搅拌10分钟。用分离漏斗分离出水层。有机层经无水硫酸钠干燥。然后在0℃下，将混合物加入到搅拌状态下的THF(5mL)溶液，此溶液中包含7-(丙 -1-烯-2-基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基]-5H-硫代色素[2,3-b] 吡啶-5-醇(274mg,0.521mmol,1.00eq)。在0℃下，将上述混合物中缓慢滴加到含有Pd(OAc)2(11.7mg，0.052mmol，0.10eq)的THF(1mL)溶液。将所得混合物在0℃下再搅拌10分钟。将混合物在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/ EA(4∶1)洗脱，得到浅黄色固体7-(1-甲基环丙基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基]-5H-硫代色素[2,3-b]吡啶-5-醇(200mg，81％)。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d) δ8.20(s,1H),7.78-7.74(m,1H),7.60-7.57(m,1H),7.43(d,J＝8.2Hz,1H),7.25(dd,J＝6.9,1.3Hz,1H),6.76(d,J＝2.7Hz,1H),5.62(s,1H),2.71(br s,1H),1.43(s,3H),0.88(q,J＝3.6Hz,2H),0.81-0.77(m,2H).
LCMS:(MS,ESI):472[M+H]+.
第十一步：合成7-(1-甲基环丙基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑- 1-基]硫代色素[2,3-b]吡啶-5-醇
Figure BDA0003563772160000102
向7-(1-甲基环丙基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基]-5H-硫代色素[2,3-b]吡啶-5-醇(200mg，0.424mmol，1.00eq)搅拌溶解在DCM(10mL)中，在0℃下，往里分批加入DMP(359mg，0.848mmol，2.00eq)。将混合物在室温搅拌2h。将混合物用冰/水(20mL)稀释，用DCM(2×20mL)萃取，之后用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。残留物通过硅胶柱色谱纯化(用PE/EA(5：1)洗脱)，然后进行制备型HPLC(色谱柱：Xselect CSH C18 OBD色谱柱30x150mm，5μm；流动相A：水 (0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/min；梯度：9分钟内70％B至80％B，80％B；波长：254nm；RT1(min)：9.07)得到黄绿色固体AM-118：7-(1-甲基环丙基)-2-(三氟甲基)-3-[3-(三氟甲基)吡唑-1-基]硫代色素[2,3-b]吡啶-5-酮 (53.9mg，26.85％)。
1HNMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.00(s,1H),8.48(dd,J＝1.9,0.9Hz,1H),7.83(d, J＝2.6Hz,1H),7.69–7.59(m,2H),6.82(d,J＝2.5Hz,1H),1.51(s,3H),1.04–0.95(m,2H),0.95–0.85(m,2H).
LCMS:(MS,ESI):470[M+H]+.
实施例2、化合物AM-121的合成
化合物AM-121的合成路线如下式所示：
Figure RE-GDA0003693553970000111
化合物AM-121的实验步骤和结果：
第一步：合成2
Figure BDA0003563772160000112
将化合物1(10.0g,65.3mmol,1.0eq)溶解于DMF(80mL)中，向其中分批加入NBS(17.8g,71.9mmol,1.1eq)。加毕，60℃反应15小时。反应完成后，将反应液降至室温，慢慢倒入水中(400mL)。将析出的固体过滤收集，用水洗固体(20 mL x3)，旋干后，得到化合物2(15.0g，粗品，白色固体)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ14.40(brs,1H),13.74(brs,1H),8.32(s,1H),2.45(s,3H).
LCMS:232.0,234.0([M+H]+).
第二步：合成3
Figure BDA0003563772160000113
将化合物2(15.5g，66.8mmol,1.0eq)和DMF(3滴)溶于干燥的二氯甲烷 (150mL)中，氮气保护下置于冰水浴中，将草酰氯(11.1g,86.8mmol,1.3eq) 滴加入上述溶液中，升至室温搅拌2小时。向反应液中滴加入无水甲醇(12mL)，加毕室温反应1小时。向反应液体中加入饱和的碳酸氢钠水溶液(30mL)，将析出的固体过滤收集，旋干后，得到化合物3(10.6g,64％，白色固体)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.51(brs,1H),8.08(s,1H),3.74(s,3H),2.33(s,3H).
LCMS:246.0,248.0([M+H]+).
第三步：合成4
Figure BDA0003563772160000121
将化合物3(14.5g,59.2mmol,1.0eq)溶解于二氧六环(100mL)中，向其中滴加三氯氧磷(45.3g,295.9mmol,5.0eq)，滴完9℃反应15小时。将反应液冷至室温后，缓慢倒入冰冷的饱和碳酸氢钠中(100mL)，然后用乙酸乙酯萃取(100mL x 3)。将合并的有机相用饱和食盐水洗涤(100mL)，无水硫酸钠干燥，旋干后，得到粗品化合物，过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得到化合物4(12.4g,79％,淡黄色固体)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(s,1H),3.87(s,1H),2.61(s,3H).
LCMS:264.0,265.9([M+H]+).
第四步：合成5
Figure BDA0003563772160000122
将氢化钠(112mg,2.79mmol,1.2eq,60％含量)分散在无水四氢呋喃(100 mL)中，氮气保护，冰水浴降温，向其中滴加化合物4A(424mg,2.55mmol,1.1eq) 的四氢呋喃(3mL)溶液，滴完0℃反应30分钟。再向反应液中滴加化合物4(611 mg,2.32mmol,1.0eq)的四氢呋喃(5mL)溶液，0℃反应1小时。用饱和氯化铵水溶液(15mL)淬灭反应，乙酸乙酯萃取(20mL x2)。将有机相合并，盐水洗(20 mL)，无水硫酸钠干燥后，旋干得到粗品化合物，过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝30：1)，得到化合物5(730mg,80％，白色固体)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.30(s,1H),7.48-7.39(m,4H),3.88(s,3H),2.33(s,3H),1.31(s,9H).
LCMS:394.0,396.0([M+H]+).
第五步：合成6
Figure BDA0003563772160000131
将化合物5(845mg，2.15mmol，1.0eq)溶解在甲醇(3mL)和四氢呋喃(3 mL)中，向其中加入氢氧化钠(172mg,4.30mol,2.0eq)的水溶液(3mL)，50℃反应2小时。TLC，LCMS检测反应完全后，将有机溶剂旋蒸除去，用水稀释(10mL)，用硫酸氢钾调节水相的pH值至6。将析出的固体过滤，然后用少量水洗涤，干燥后得到粗品化合物6(75mg，粗品，淡黄色固体)。
LCMS:380.0,382.0([M+H]+).
第六步：合成7
Figure BDA0003563772160000132
将化合物6(745mg，1.97mmol,1.0eq)和DMF(3滴)溶于干燥的二氯甲烷 (10mL)中，氮气保护下置于冰水浴中，将草酰氯(374mg,2.95mmol,1.5eq) 滴加入上述溶液中，升至室温搅拌3小时，旋干，除去溶剂和过量的草酰氯，得到芳酰氯中间体粗品。将此芳酰氯中间体重新溶解在干燥的二氯甲烷(10mL)中，氮气保护下置于冰水浴中，向其中分批加入三氯化铝(1.57g,11.8mmol,6.0eq)，加毕室温反应过夜。向反应液中加入2N的稀盐酸至pH为2～3，分液，用二氯甲烷萃取水相(20mL x 2)，合并有机相，食盐水(20mL)洗，干燥，抽滤，滤液浓缩，得到粗品，过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得到化合物7(630mg,88％，黄色固体)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.75(s,1H),8.43(d,J＝2.1Hz,1H),7.95(dd,J＝ 8.4,2.1Hz,1H),7.86(d,J＝8.5Hz,1H),6.81(d,J＝2.0Hz,1H),2.73(s,3H),1.37(s,9H).
LCMS:362.0,364.0([M+H]+).
第七步：合成8
Figure BDA0003563772160000141
将化合物7(450mg,1.25mmol,1.0eq)溶于干燥的dioxane(8mL)中，向其中加入B2Pin2(379mg,1.50mmol,1.2eq)，KOAc(244mg,2.49mmol,2.0eq) 和Pd(dppf)Cl2(91mg,0.13mmol,0.1eq)，95℃反应15小时。LC-MS检测反应完全，冷却后，用水稀释(20mL)，二氯甲烷萃取(15mL x 3)。合并的有机相用饱和食盐水洗(20mL)，无水硫酸钠干燥，旋干，得到粗品化合物。将粗品化合物用硅胶柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝30：1)，得到化合物8(450mg,49.2％,白色固体)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.15(s,1H),8.61(d,J＝2.1Hz,1H),7.73(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),2.86(s,3H),1.41(s,9H),1.38(s,12H).
LCMS:410.2([M+H]+).
第八步：合成9
Figure BDA0003563772160000142
将化合物8(450mg,1.1mmol,1.0eq)加至THF(9mL)和H2O(3mL)中溶解，再加入NaIO4(1.18g,5.5mmol,5.0eq)，50℃反应4小时。旋去THF，用二氯甲烷(20mL)和水(20mL)稀释，分液后，用二氯甲烷萃取水相(20mL x 2)。合并的有机相再用盐水洗涤(20mL)，无水Na2SO4干燥，旋干得粗品化合物9(300mg, 黄色固体)。
LCMS:328.1([M+H]+).
第九步：合成JT-121
Figure BDA0003563772160000151
将化合物9(220mg,0.66mmol,1.0eq)溶于DCM(10mL)中，向其中加入化合物9A(268mg,1.97mmol,3.0eq)，Cu(OAc)2(239mg,1.32mmol,2.0eq)和 TEA(199mg,1.97mmol,3.0eq)，室温反应22小时。LC-MS检测反应完全，向反应体系中加入氨水(3mL)，搅拌30min后，用二氯甲烷(20mL)和水(20mL)稀释，分液后，用二氯甲烷萃取水相(20mL x 2)。合并的有机相再用盐水洗涤(20mL)，无水Na2SO4干燥，旋干，得粗品化合物，过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝50：1～ 20：1)，得到目标化合物AM-121(30mg,11％，黄色固体)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.74(s,1H),8.61(d,J＝2.2Hz,1H),7.83-7.75(m,2H),7.63(d,J＝8.5Hz,1H),6.81(d,J＝2.0Hz,1H),2.64(s,3H),1.42(s,9H).
LCMS:418.1([M+H]+).
HPLC：99.26％.
实施例3、化合物AM-123的合成
化合物AM-123的合成路线如下式所示：
Figure RE-GDA0003693553970000171
化合物AM-123的实验步骤和结果：
第一步：合成3
Figure BDA0003563772160000161
氮气保护下，将钠丝加入到乙醚中(600mL)，搅拌下将化合物1(86g,1.0mol,1.0eq)和化合物2(74g,1.0mol,1.0eq)的混合物滴加到其中，滴加的速度保持体系轻微回流状态，滴加完毕后，回流反应5小时。将反应液冷却到室温，将析出的固体过滤收集，固体用乙醚洗(200mL)，干燥后得到化合物3(81.2g,粗品，白色固体)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.07(d,J＝9.9Hz,1H),4.55(s,1H),2.17(brs,1H),0.91-0.87(m,6H).
第二步：合成4
Figure BDA0003563772160000162
将化合物3(81.2g,0.60mol,1.0eq)溶解于水(300mL)中，向其中加入氰基乙酰胺(50.0g,0.60mol,1.0eq)，加毕回流反应15小时。将反应液冷却至室温，将析出的固体过滤收集。将滤液用浓盐酸调节pH值到5，再将析出的固体过滤收集。将两次得到的固体用二氯甲烷(200mL)溶解，将不溶物过滤除去。将滤液旋干后，过柱纯化(二氯甲烷：甲醇＝100：1)得到化合物4(41.0g,42％，黄色固体)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.23(s,1H),7.84(d,J＝7.5Hz,1H),6.22(d,J＝7.5 Hz,1H),2.99(dt,J＝13.9,6.9Hz,1H),1.35(d,J＝6.9Hz,6H).
LCMS:163.2([M+H]+).
第三步：合成5
Figure BDA0003563772160000163
将化合物4(5.0g,30.8mmol,1.0eq)溶解于DMF(40mL)中，向其中分批加入NBS(6.0g,33.9mmol,1.1eq)。加毕，室温反应1小时。反应完成后，将反应液慢慢倒入水中(300mL)。将析出的固体过滤收集，用水洗固体(100mL)，旋干后得到化合物5(6.8g，粗品，白色固体)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.45(s,1H),7.94(s,1H),3.43(dt,J＝14.0,7.0Hz,1H),1.39(d,J＝7.0Hz,6H).
LCMS:241.0,243.0([M+H]+).
第四步：合成6
Figure BDA0003563772160000171
将化合物5(5.8g,24.2mmol,1.0eq)溶解于三氯氧磷(36.9g,241.7mol, 10.0eq)中，向其中分批加入五氯化磷(15.1g,72.5mmol,3.0eq)。加毕110℃反应15小时。旋蒸除去大多数的三氯氧磷，得到的粗品用乙酸乙酯稀释(100mL)后，缓慢加入到饱和的碳酸氢钠水溶液中(300mL)。分液后，水相用乙酸乙酯萃取(100 mL x 2)。将有机相合并，盐水洗(50mL)，无水硫酸钠干燥后，旋干得到粗品，过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝100：1)，得到化合物6(2.9g,46％，白色固体)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),3.54(dt,J＝14.0,7.0Hz,1H),1.29(s,3H),1.27(s,3H).
LCMS:259.0,261.0([M+H]+).
第五步：合成7
Figure BDA0003563772160000172
将氢化钠(233mg,5.6mmol,1.2eq,60％含量)分散在无水四氢呋喃(10mL) 中，氮气保护，冰水浴降温，向其中滴加化合物6A(849mg,5.1mmol,1.1eq)的四氢呋喃(5mL)溶液，滴完0℃反应30分钟。再向反应液中滴加化合物6(1.2g, 4.6mmol,1.0eq)的四氢呋喃(5mL)溶液，0℃反应1小时。用水淬灭反应，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)。将有机相合并，盐水洗(20mL)，无水硫酸钠干燥后，旋干得到粗品化合物，过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝100：1)，得到化合物7(1.5g, 85％，白色固体)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(s,1H),7.49-7.41(m,4H),3.32(dt,J＝13.4,6.7Hz,1H),1.35(s,9H),0.89(d,J＝6.7Hz,6H).
LCMS:389.0,391.0([M+H]+).
第六步：合成8
Figure BDA0003563772160000181
将化合物7(1.5g，3.9mmol，1.0eq)溶解在乙醇(15mL)中，向其中加入氢氧化钾(4.3g,77.3mol,20.0eq)的水溶液(5mL)，90℃反应6小时。将有机相旋蒸除去，用2N的稀盐酸将水溶液的pH值调至6。将析出的固体过滤，然后用少量水洗涤，干燥后得到粗品化合物8(1.5g，粗品，白色固体)。
LCMS:408.0,410.0([M+H]+).
第七步：合成9
Figure BDA0003563772160000182
将化合物8(800mg，1.97mmol,1.0eq)和DMF(3滴)溶于干燥的二氯甲烷 (20mL)中，氮气保护下置于冰水浴中，将草酰氯(374mg,2.95mmol,1.5eq) 滴加入上述溶液中，升至室温搅拌1小时，旋干除去溶剂和过量的草酰氯，得到芳酰氯中间体粗品。将此芳酰氯中间体重新溶解在干燥的二氯甲烷(10mL)中，氮气保护下置于冰水浴中，向其中分批加入三氯化铝(1.57g,11.8mmol,6.0eq)，加毕室温反应过夜。向反应液中加入2N的稀盐酸至pH为2～3，分液，用二氯甲烷萃取水相(20mL x 2)，合并有机相，食盐水(20mL)洗，干燥，抽滤，滤液浓缩，得到粗品，过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝80：1)，得到化合物9(520mg,88％，黄色固体)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(s,1H),8.59(d,J＝2.1Hz,1H),7.74(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.58(d,J＝8.5Hz,1H),3.65(dt,J＝13.5,6.7Hz,1H),1.41(s,9H),1.34(d,J＝6.7Hz,6H).
LCMS:390.0,392.0([M+H]+).
第八步：合成10
Figure BDA0003563772160000191
将化合物9(520mg,1.34mmol,1.0eq)溶于干燥的dioxane(8mL)中，向其中加入B2Pin2(441mg,1.74mmol,1.3eq)，KOAc(262mg,2.67mmol,2.0eq) 和Pd(dppf)Cl2(98mg,0.13mmol,0.1eq)，90℃反应9小时。LC-MS检测反应完全，冷却后，用水稀释(20mL)，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)。合并的有机相用饱和食盐水洗(20mL)，无水硫酸钠干燥，旋干，得到粗品化合物。将粗品化合物用硅胶柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝80：1)，得到化合物10(350mg,63％,淡黄色固体)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),8.60(d,J＝2.2Hz,1H),7.71(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),3.83(dt,J＝13.5,6.7Hz,1H),1.41(s,9H),1.38(s,12H),1.32(d,J＝6.7Hz,6H).
LCMS:438.2([M+H]+).
第九步：合成11
Figure BDA0003563772160000192
将化合物10(350mg,0.8mmol,1.0eq)加至THF(9mL)和H2O(3mL)中溶解，再加入NaIO4(857mg,4.0mmol,5.0eq)，50℃反应15小时。旋去THF，用二氯甲烷(20mL)和水(20mL)稀释，分液后，用二氯甲烷萃取水相(20mL x 2)。合并的有机相再用盐水洗涤(20mL)，无水Na2SO4干燥，旋干得粗品，过柱纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到化合物11(260mg,99％,淡黄色固体)。
LCMS:356.0([M+H]+).
第10步：合成JT-123
Figure BDA0003563772160000201
将化合物11(260mg,0.73mmol,1.0eq)溶于DCM(10mL)中，向其中加入化合物11A(299mg,2.20mmol,3.0eq)，Cu(OAc)2(267mg,1.46mmol,2.0eq) 和TEA(222mg,2.20mmol,3.0eq)，室温反应15小时。LC-MS检测反应完全，向反应体系中加入氨水(3mL)，搅拌30min后，用二氯甲烷(20mL)和水(20mL)稀释，分液后，用二氯甲烷萃取水相(20mL x 2)。合并的有机相再用盐水洗涤(20 mL)，无水Na2SO4干燥，旋干，得粗品化合物，过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝50：1 ～20：1)，得到目标化合物AM-123(30mg,9.2％，黄色固体)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.69(s,1H),8.60(d,J＝2.2Hz,1H),7.80-7.73(m,2H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),6.80(d,J＝2.4Hz,1H),3.12(dt,J＝13.5,6.7Hz,1H),1.42(s,9H),1.30(d,J＝6.7Hz,1H).
LCMS:446.0([M+H]+).
HPLC：98.96％.
实施例4
实验材料：LNCaP细胞系(
Figure BDA0003563772160000202
CRL-1740TM)，PC3细胞系(
Figure BDA0003563772160000203
CRL- 1435TM)，96孔低吸附板(Corning,3474,NY)，B27(Invitrogen,Carlsbad,CA),20ng/ml epidermalgrowth factor(EGF)(Peprotech,Rocky Hill,NJ),20ng/ml basic fibroblast growthfactor(FGF；Peprotech)，6孔板(Corning,3516,NY)。
实验步骤：
1.细胞成球实验
①配置细胞成球培养基：在DMEM/F12基础培养基中添加2％B27，1％N2，20ng/mL重组人成纤维细胞生长因子FGF以及20ng/mL重组人表皮生长因子EGF，混合均匀即可使用。
②将细胞状态较好的LNCaP细胞消化成单细胞，细胞计数后，用成球培养基配置，按600个细胞/孔的密度,体积为100ul,沿孔板壁添加到96孔低吸附板中。设立实验组以及对照组，实验组中所有的培养基添加不同浓度(0.5，1和5μM)的不同化合物 (AM-118，AM121和AM-123),对照组加入等比例的DMSO。
③每3天给分别给每孔补40uL含药或DMSO的培养基，处理10天后拍照并统计成球数量。
结果如图2，添加不同浓度的AM-118，AM121和AM-123后，成球数量大小明显减少。以化合物NJ-78
Figure BDA0003563772160000211
NJ-95
Figure BDA0003563772160000212
作对照，其结果如图1所示，由图1可知，需要添加高浓度(5μM)的NJ-78和NJ-95 才可以使成球数量减少。
2.实时定量聚合酶链反应
①细胞RNA抽提：将细胞状态较好的PC3细胞按照30000个/孔的密度铺在6孔板中，设立实验组以及对照组，实验组的孔中分别添加不同浓度(0.5，1和5μM)的不同化合物(AM-118，AM121和AM-123)，对照组加入等比例的DMSO。孵育5天后，根据诺维赞公司RNA提取试剂盒(#RC112-01)提取细胞RNA。
②RNA逆转录：
根据诺维赞公司逆转录试剂盒(#R333-01)得到cDNA用于下一步实验。
③实时定量PCR：
根据诺维赞公司qPCR试剂盒(Q711-03)，按表1-表3进行实时定量PCR。
表1、在qPCR管中配制如下混合液
Figure BDA0003563772160000213
表2、按下列条件进行qPCR反应
Figure BDA0003563772160000214
Figure BDA0003563772160000221
表3、引物信息
Figure BDA0003563772160000222
结果如图3(b)，用实时定量PCR检测在mRNA水平上AM-118，AM121和AM-123 实验组和DMSO对照组的干细胞标志物Oct4和Bmi1的mRNA转录水平。AM-118和 AM121在0.5，1和5μM浓度，AM-123在0.5和1μM浓度时都抑制了干细胞标志物 Oct4和Bmi1的mRNA转录水平。图3(a)为NJ-78和NJ-95实验组的干细胞标志物 Oct4和Bmi1的mRNA转录水平的变化，由图3可知，添加了不同浓度的NJ-78和NJ- 95处理细胞后，只有1μM的NJ-95抑制了干细胞标志物Oct4的mRNA转录水平。
3.肿瘤细胞迁移实验
将PC3细胞按照每孔5000个细胞的密度，铺在6孔板里，设立实验组以及对照组，实验组中分别添加不同浓度(0.5、1、2.5和5μM)的AM-118，AM121和AM-123，对照组加入等比例的DMSO，用含10％血清的完全培养基，在培养条件为37℃、5％CO2的培养箱中预培养96小时后，再饥饿处理(用不含血清的DMEM培养基24小时排除细胞增长的影响后，每孔都消化成单细胞，用不含血清的DMEM培养基重悬成密度为5*105的单细胞悬液。继续设立实验组以及对照组，实验组中所有的培养基(包括小室中的无血清培养基)分别添加0.5、1、2.5和5μM的AM-118，AM121和AM-123，对照组加入等比例的DMSO。Transwell孔中添加500ul含10％FBS的DMEM培养基，并在每个 transewell小室添加100ul细胞悬液。37℃培养，24小时后取出小室，弃去小室中的培养基，放入4％多聚甲醛中固定15min。PBS涮洗数次，用棉签轻轻拭去小室内层可能残留的细胞，并将小室置于结晶紫中染色20min。PBS涮洗数次，用棉签轻轻擦去多余结晶紫染料及PBS。待小室晾干后，在显微镜下观察并记录细胞数量。
结果如图6，添加AM-118，AM121和AM-123这些化合物后，迁移至小室下层的细胞数量明显减少，细胞的迁移能力降低。图4(a)、图5(a)为NJ-78和NJ-95对肿瘤细胞迁移的影响图；图4(b)、图5(b)为NJ-78和NJ-95对肿瘤细胞迁移的影响统计图；由图4、5可知，添加了NJ-78和NJ-95能使迁移至小室下层的细胞数量减少，细胞迁移能力降低，但是效果不如化合物AM-118，AM121和AM-123明显。
其中，****表示p<0.0001,***表示p<0.001,**表示p<0.01,*表示p<0.05,实验结果表示为平均值±S.E.M。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (9)

1.一类具有如下结构式的化合物：
Figure FDA0003563772150000011
其中，R1选自低级直链烷基、低级支链烷基或卤素元素取代的低级烷基，R2选自低级支链烷基或低级环烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述低级支链烷基为C3-8支链烷基，所述低级直链烷基为C1-8直链烷基，所述卤素元素取代的低级烷基为卤素取代的C1-8烷基，所述低级环烷基为C3-8环烷基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物的结构式包括：
Figure FDA0003563772150000012
4.一种根据权利要求1所述的化合物在制备抑制肿瘤细胞干性的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述抑制肿瘤细胞干性的药物中，所述化合物的有效浓度为0.5μM-5μM。
6.一种抑制肿瘤细胞干性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以如权利要求1所述的化合物为活性成分。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中化合物的总有效浓度为0.5μM-5μM。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
9.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述化合物包括AM-118
Figure FDA0003563772150000021
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