CN1148184C - 光动力治疗肿瘤药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供光动力治疗肿瘤药物组合物。所述组合物包含：a.单位剂量的叶绿素a稳定降解产物；b.药学上可接受的载体。所述叶绿素a稳定降解产物包括脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a、二氢卟吩e4、紫红素18/二氢卟吩p6。本发明的光动力治疗肿瘤药物在非细胞体系内的光动力敏化效应、对人癌细胞的光灭活作用和对动物移植瘤的光动力疗效均优于临床用的光动力治疗肿瘤药物血卟啉衍生物(HpD)。
Description
本发明属医药技术领域，具体涉及叶绿素a降解产物光动力治疗肿瘤药物。
目前临床应用的光动力治疗肿瘤药物，如：血卟啉衍生物(HematoporphyrinDerivative，HpD)、光敏素II或卟非姆钠(Photofrin II，Sodium Pofimer)和癌光啉(Photocarcinorin，PsD-007)存在着三个共同的缺点，即：(1)均为复杂的混合卟啉制剂，质量难以控制；(2)红光区吸收系数小，由此导致组织特别是靶病灶光动力效应低，限制了疗效的提高；(3)对肿瘤组织无选择性定位作用的光敏化卟啉含量高，造成正常组织光毒反应相对严重。上述缺点从安全、疗效、质量可控性三个方面限制了它们作为法定新药的发展(许德余：肿瘤光动力疗法，中国医药科技出版社，1996年5月，北京；Kessel D and Dougherty TJ：Porphyrin Photosensitization.Plenun Press，New York，1983；Spinelli P et al.ed：Photodynamic Therapy andBiomedical Lasers.Amsterdam-London，New York-Tokyo，Excerpta Medica，1992)。
因此，本发明的目的在于提供更加安全有效的光动力治疗肿瘤药物。
叶绿素a稳定降解产物在红光区的吸收系数高于上述混合卟啉制剂约一个数量级，肿瘤光生物活性远高于后者，且不含其他对肿瘤无定位作用的光敏化物质。毒性也明显低于上述混合卟啉制剂。本发明者将其开发成光动力治疗肿瘤药物。
本发明的光动力治疗肿瘤药物组合物包含：
a.单位剂量的叶绿素a稳定降解产物；
b.药学上可接受的载体。
以下对本发明作详细描述。
本发明的光动力治疗肿瘤药物组合物中，叶绿素a稳定降解产物包括脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a、二氢卟吩e4、紫红素18/二氢卟吩p6，以紫红素18/二氢卟吩p6和二氢卟吩e4为佳。
本发明中所述的“单位剂量”指一次静脉注射的剂量，在注射该剂量后3-6小时进行光辐照。一般采用的单位剂量为25-250mg，较佳为50-150mg，约相当于1-2mg/kg体重。光辐照剂量为150-180J/cm2(用670-690nm波长的光)。
本发明所述的“药学上可接受的载体”指适合于静脉注射的任何物质，较佳为注射用水。
本发明以我国丰富的廉价资源家蚕粪叶绿素初提物为基始原料，经酸降解得到中间体脱镁叶绿酸a和焦脱镁叶绿酸a混合物，并由此中间体混合物制备得到叶绿素a稳定降解产物脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a、二氢卟吩e4和紫红素18/二氢卟吩p6。
本发明对作为光动力治疗肿瘤药物的紫红素18和二氢卟吩e4的光敏化效应、对体外培养人癌细胞的光灭活作用和对动物移植瘤的光动力疗效进行了研究。
(1)叶绿素a稳定降解产物紫红素18/二氢卟吩p6和二氢卟吩e4在非细胞体系内的光敏化效应：
光动力治癌的基础是某些化合物在恶性组织内通过对可见光入射光子的能量转递使周围介质中的分子氧成为单线态氧(1O2)、氢氧自由基(OH·)、超氧阴离子(O- 2·)和过氧化氢等活性氧物质。它们可使生物分子的敏感基团氧化失活，并由此导致细胞器损伤和最终引起肿瘤细胞死亡而达到治愈肿瘤的目的。已知单线态氧在活性氧物质中占有较大的比例，它在重水(D2O)中的寿命较长。通常以重水中的光敏化力作用来初步预测一种物质作为光动力治癌药物的可能发展前景。为了比较叶绿素a降解产物与目前临床使用的光动力治癌药物HpD在非细胞体系内光敏化作用的强弱，按Juri G et al：Med Biol Eviron1980，8：139；李益新等：生物物理学报1985，1(4)：257；Bodaness RS et al：J Biol Chem1977，252：8554；许德余等：第二军医大学学报1988，9(5)：435报道的方法，对比测定了叶绿素a稳定降解产物紫红素18/二氢卟吩p6和二氢卟吩e4在重水中对NADPH光氧化作用的敏化效应。结果如下表：
| 受试化合物 | 不同浓度(μmol/L)下NADPH的残存百分数±SD1 2 3 4 5 | ||||
| 紫红素18 | 39.63±4.90 | 25.45±2.67 | 18.90±2.24 | 12.55±1.90 | 8.97±1.23 |
| 二氢卟吩e4HpD | 38.51±2.2393.04±1.18 | 26.18±4.1387.87±2.89 | 14.17±1.1082.68±1.65 | 10.88±2.1980.06±1.34 | 5.44±1.9967.16±2.25 |
表中所列数据表明，两种叶绿素a稳定降解产物不同浓度下(1μmol/L-5μmol/L)对NADPH在重水中的光氧化作用均明显较HpD为强。
(2)叶绿素a稳定降解产物紫红素18/二氢卟吩p6和二氢卟吩e4对体外培养人癌细胞的光灭活作用
参照文献方法(彭迁，等：第二军医大学学报1986，7：280)测定了叶绿素a稳定降解产物紫红素18/二氢卟吩p6和二氢卟吩e4对体外培养人大肠癌细胞SW-1116系和人红白血病细胞K-562系的光灭活作用，结果见下表。
| 受试化合物 | 对人癌细胞半数光灭活浓度(IC50)μg/mL大肠癌细胞SW-1116系 红白血病细胞K-562 | |
| 紫红素18 | 0.464±0.070 | 0.366±0.046 |
| 二氢卟吩e4 | 0.970±0.062 | 0.615±0.058 |
| HpD | 4.67±1.03 | 5.50±2.01 |
| 单照光 | —— | —— |
| 单化合物 | —— | —— |
| 空白对照 | —— | —— |
表中数据表明，两种叶绿素a稳定降解产物对两种体外培养人癌细胞的光灭活作用均明显较HpD为强。单纯用同剂量激光辐照或单加受试化合物与空白对照一样均对体外培养人癌细胞无作用，表明叶绿素a稳定降解产物是颇有前景的肿瘤光动力敏化剂。其所致体外人癌细胞的光灭活作用是由其导致的光动力损伤效应的结果。
(3)三种叶绿素a稳定降解产物对动物移植瘤的光动力疗效
参照文献方法(陈文晖，等：第二军医大学学报1986，7：253)测定了紫红素18/二氢卟吩6、二氢卟吩e4对小鼠S-180肉瘤、Lews肺癌和U-14宫颈癌(均为实体瘤)的光动力疗效，结果如下表。
| 瘤种 | 受试化合物的疗效*紫红素18 二氢卟吩e4 HpD 空白对照 | |||
| Lews肺癌 | 8/10 | 7/10 | 2/10 | 0/10 |
| U-14宫颈癌 | 8/10 | 9/10 | 2/10 | 0/10 |
| S180肉瘤 | 9/10 | 9/10 | 1/10 | 0/10 |
光动力治疗条件：受试化合物剂量：5mg/kg；光剂量：270J/cm2，波长630nm；
疗效指标以荷瘤小鼠激光辐照后，肿瘤消失，经45天未见复发为治愈。
上表结果表明，两种叶绿素a稳定降解产物对不同动物移植瘤的光动力治疗效果均明显优于临床治癌用的HpD，提示它们是理想的光动力治癌新药。
急性毒性试验：用常规方法测定叶绿素a稳定降解产物紫红素18/二氢卟吩p6和二氢卟吩e4对小鼠静脉注射的半数致死量(LD50)，并与HpD进行比较。结果见下表：
紫红素18/二氢卟吩p6 280±12.43mg/kg
二氢卟吩e4 252±9.65mg/kg
HpD 175±21.20mg/kg
以上结果表明，紫红素18/二氢卟吩p6和二氢卟吩e4的毒性低于HpD。
以下用实施例对本发明进行举例说明，这些实施例旨在阐述本发明的最佳实施方案。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本申请权利要求的范围内。
实施例1 中间体粗品脱镁叶绿酸a和焦脱镁叶绿酸a的制备
取市售蚕沙叶绿素初提物500g，加入乙醚2L，充分搅匀后，缓缓加入浓盐酸(12N)2L，继续搅拌反应0.5-1小时，室温放冷，待分层后，分取酸层，用强碱调节pH至5-6，滤集析出的沉淀，后者用水洗净、抽干，置真空干燥器中，P2O5减压干燥。所得粗品脱镁叶绿酸a和焦脱镁叶绿酸a收率按蚕沙叶绿素初提物计算为20％。毋须分离纯化即可直接用于下步反应。
实施例2 紫红素18的制备
将脱镁叶绿酸a和焦脱镁叶绿酸a粗品混合物50g溶于2L乙醚，加入200mL25％氢氧化钾正丙醇溶液，室温下通空气反应4小时，反应混合物加2倍量水稀释后，用醋酸调节pH至2-3，上述酸性水溶液用氯仿萃取(400mL/次，3次)，合并氯仿萃取液，加无水硫酸镁干燥过夜，滤除干燥剂，在旋转蒸发器上蒸馏回收氯仿，残存物即为紫红素18粗品重10g。收率按粗品脱镁叶绿酸a计算20％。5g紫红素18粗品与适量硅胶H研匀，过200g硅胶H柱，展开剂：氯仿-丙酮-甲醇-甲酸(70∶20∶10∶1v/v/v/v)；洗脱液经薄层色谱检测，收集TLC上呈单一斑点的流份，水洗、无水硫酸钠干燥过夜，滤除干燥剂，然后在旋转蒸发器上蒸馏回收溶剂，残存物即为紫红素18，分离回收率为粗品的60％。HPLC分析：保留时间：14.55min；相对峰面积：≥95％(色谱条件：Whatman ODS柱(0.46×25cm)；流动相：60％(V/V)四氢呋喃水溶液+10％0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液；流速：0.75mL/min；柱温：25℃；柱压：3500psi；检测波长：400nm。)。紫红素18在减性水溶液中其六元内酸酐环即自动裂开而定量转变成二氢卟吩p6，二氢卟吩p6水溶液抽干后，则其13-和15-位上的羧基脱去一分子水定量转变成紫红素18。因此，无法直接得到二氢卟吩p6固体，同样也得不到紫红素18的水溶液。
紫红素18的理化性质：紫红色粉末状固体，不溶于水，溶于氯仿、四氢呋喃等有机溶剂；因分子中同时存在可质子化氮原子和游离羧基，故呈两性，在强酸或强减溶液中分别成盐而溶解。在碱性水溶液中，内酸酐环自动裂开转变成二氢卟吩p6盐；后者抽干后13-和15-位上的两个羧基脱去一分子水形成内酸酐而恢复紫红素18结构(I)；对热稳定，300℃以上不熔；2-位乙烯基可发生双键加成反应。
紫红素18分子的结构特征如下：
1H-NMR(CDCl3，TMS，δppm)：1.65(3H，t，4b-CH3)，1.76(3H，d，8-CH3)2.10-2.51(4H，m，7-CH2CH2)，3.17(3H，s，3-CH3)，3.34(3H，s，1-CH3)，3.62(2H，q，4a-CH2)，3.77(3H，s，5CH3)，4.42(1H，q，8-CH)，5.24(1H，m，7-CH)，6.20(1H，d，2b’-CH)，6.29(1H，d，2bCH)，7.87(1H，dd，2a-
H)，8.63(1H，s，δ-CH)，
9.40(1H，s，α-CH)，9.63(1H，s，β-CH)；FABMS m/z：566(M+2)，565(M+1)，564(M+)，491(M-CH2CH2COOH)；IR(KBr)，υcm-1：3360(N-H)，3000-2800(C-H)，1740，1710(C＝O)，1600(C＝C)，1530
(二氢卟吩骨架)，1300(CN)，990(CH＝)；UV/VISλmax(CHCl3)nm：412，478，510，547，645，701；
Flu(THF)λexnm：405，λemnm：705。
实施例3 二氢卟吩e4的制备
取实施例1所述方法制得的脱镁叶绿酸a和焦脱镁叶绿酸a粗品混合物40g，加入300mL 39％KOH乙醇溶液，回流反应1小时，冷却后用稀盐酸调节pH至4，加水稀释，滤集析出的沉淀，水洗后，减压干燥，所得为粗品二氢卟吩e6，经硅胶柱色谱分离得黑色粉末状纯二氢卟吩e614g。
取上述二氢卟吩e610g与200mL吡啶混合加热回流1小时，放冷，加入反应液2倍体积的水，用盐酸调节pH至5-6，滤集析出的沉淀，水洗、吸干，置真空干燥器中P2O5减压干燥，粗品重6.5g(收率65％)。所得粗品经硅胶柱色谱分离得纯二氢卟吩4，为黑色粉末状固体，分离回收率75％。分离纯化条件同(2)。HPLC分析：保留时间：9.0分钟；相对峰面积≥95％，色谱条件同(2)。
二氢卟吩e4分子的结构特征如下：
1H-NMR(CDCl3，TMS，δppm)：1.61(3H，t，4b-CH3)，2.27-2.68(4H，m，7a，7b-CH2)，3.20(3H，s，3a-CH3)，3.43(3H，s，1a-CH3)，3.56(3H，s，5a-CH3)，3.39(3H，s，10CH3)，4.524.63(2H，m，
7，8-CH)，6.05-6.09(1H，dd，2b-
Ha)，6.30-6.36(1H，dd，2b-
Hb)，8.10-8.20(2H，m，2a-H)，9.04(1H，s，δ-
H)，9.52(1H，s，α-
H)，9.65(1H，s，β-
H)；FABMS9m/z)：509(M+)；IR(KBr)υcm-1：3350(NH)，2960-2870(CH)，1715(C＝O)，1620(C＝C)，1450二氢卟吩骨架)，1230(CN)；UV/VIS(CDCl3)λmaxnm：402，498，534，559，608，664；Flu(THF)λexnm：398，λemnm：670。
实施例4 紫红素18(二氢卟吩p6)钠盐静脉注射液的配制
精密称取50g新鲜经硅胶柱色谱分离得到的干燥紫红素18，加入用注射用水配制的0.2N NaOH 1.5L，充分搅拌使紫红素分子中的酸酐环完全裂开形成二氢卟吩p6钠盐溶解。上述二氢卟吩p6溶液用注射用水配制的0.2N HCl调节pH至7-7.5，记录中和所消耗的酸体积，加生理盐水稀释至溶液总体积为5L(相当于浓度为1％的二氢卟吩p6溶液)。然后加压滤菌，所得滤液分装于10mL玻璃安瓿中，熔封后经抽样热源试验结果阴性并经高效液相色谱分析结果制剂中的二氢卟吩p6含量与标示一致，即得1％二氢卟吩p6钠盐静脉注射液。
所有上述配制步骤均在无菌操作条件下进行(许德余，等：中国医院药学杂志1986，6(9)：29)。
实施例5 二氢卟吩e4钠盐静脉注射液的配制
以二氢卟吩e4代替紫红素18如实施例4所述方法配制得1％二氢卟吩e4钠盐静脉注射液。
Claims (5)
1.光动力治疗肿瘤药物组合物，所述组合物包含：
a.单位剂量的叶绿素a稳定降解产物，所述的降解产物是二氢卟吩e4；
b.药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述单位剂量为25-250mg。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述单位剂量为50-150mg。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述载体为注射用水。
5.如权利要求1-4中任何一项所述的组合物，其中所述组合物为1％二氢卟吩e4钠盐静脉注射液。
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