CN114813627A - 一种基于近红外光谱的金钗石斛甘露糖含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于近红外光谱的金钗石斛甘露糖含量检测方法，涉及分析技术领域。所述的检测方法为：采用近红外光谱测定仪扫描获得波段范围为900‑1700nm的金钗石斛光谱数据，筛选最佳的光谱预处理方法和最佳主因子数，结合实测值和光预处理方法获得的光谱数据，偏最小二乘法全波段建立甘露糖含量的定量分析模型；然后选取验证集中的金钗石斛样品评估模型的预测精确度，最后检测未知甘露糖含量的金钗石斛样品。本发明可以快速、绿色和高效的检测金钗石斛甘露糖含量，为准确评价金钗石斛药材的品质提供参考，也为生产企业快速筛选高甘露糖含量的金钗石斛原材料提供了技术。
Description
技术领域
本发明涉及分析技术领域，具体涉及一种基于近红外光谱的金钗石斛甘露糖含量的检测方法。
背景技术
金钗石斛，又名扁金钗、扁黄草、扁草等，为兰科石斛属多年附生草本植物，是现行版《中国药典》石斛药材的首要来源，药用部位为茎。金钗石斛茎中含有多糖、生物碱、联苄、酚类等多种活性物质，而甘露糖则是金钗石斛多糖组成的主要单糖。作为一种天然活性单糖，甘露糖对肿瘤、糖尿病、肥胖病与尿道炎等疾病有较好的辅助疗效。在食品领域，甘露糖常作食品添加剂使用，低聚甘露糖也被批准为新食品原料。可见，甘露糖在医药和食品等行业具有广泛的应用前景。
目前金钗石斛甘露糖含量的测定方法主要为高效液相色谱法，如专利CN105116088A中公开了一种铁皮石斛中甘露糖含量的检测方法，该检测方法为：将铁皮石斛微波提取，水解，获得甘露糖供试品，采用HPLC进行检测，HPLC的色谱条件为：采用钙型糖柱，以纯化水或乙腈水溶液进行等度洗脱，根据HPLC检测结果，获得甘露糖含量。该方法的主要缺点是样品前处理操作繁琐、耗时长、不适用于快速检测、成本高等。
如专利CN112595692A中公开了一种水果总糖含量预测模型的建立方法及水果总糖含量的预测方法，利用近红外光谱分析了190个罗汉果的总糖含量，通过竞争性自适应权重取样法和最小二乘法进行筛选和建模，得到子模型；从得到的子模型中选取相关系数≥0.9的子模型，作为合格模型，最终获得了较好的校正精度。
近红外光谱分析技术具有快速、准确和无污染等优点。因此，建立绿色、快速、准确的检测金钗石斛药材(包括金钗石斛鲜品、干燥品、切片和枫斗等)中甘露糖含量的近红外定量分析模型，不仅可缩短检测时间、减少成本，为准确评价金钗石斛药材品质提供参考，也为生产企业快速筛选高甘露糖含量的金钗石斛原材料提供了技术。
发明内容
针对现有技术方案的不足，本发明旨在提供一种基于近红外光谱的金钗石斛甘露糖含量的检测方法，从而实现绿色、快速、高效的检测金钗石斛药材(包括金钗石斛鲜品、干燥品、切片和枫斗等)的甘露糖含量。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于近红外光谱的金钗石斛甘露糖含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)将多份金钗石斛样品分为校正集和验证集，其中校正集中的样品用于构建模型，而验证集中的样品用于验证模型准确性；
(2)提取校正集中每份金钗石斛样品的甘露糖，利用高效液相色谱法测定其含量；
(3)采用近红外光谱测定仪扫描获取校正集中金钗石斛样品的吸收光谱数据；
(4)将步骤(3)得到的吸收光谱数据进行光谱预处理，所述的光谱预处理通过内部交叉验证决定系数(R2)、预测标准偏差(RMSEP)、校正标准偏差(RMSEC)和RMSEP/RMSEC比值确定，所述的内部交叉验证决定系数(R2)、预测标准偏差(RMSEP)和校正标准偏差(RMSEC)的计算公式如公式1、公式2和公式3所示；
公式1
公式2
公式3
其中，yi,act为第i个样品实测值；yi,pre为交互验证时第i个校正集样品的预测值；n为校正集样品数；h为模型所选主因子数；m为验证集样本数；
(5)计算交互验证标准差(RMSECV)，计算公式如公式4，采用交叉验证法选择主因子数；
公式4
其中，yi,act为第i个样品实测值；yi,pre为交互验证时第i个校正集样品的预测值；n为校正集样品数；h为模型所选主因子数；
(6)结合步骤(2)中高效液相色谱法测定的样品甘露糖含量和步骤(3)获得的光谱数据采用偏最小二乘法全波段建立初始校正模型，再根据步骤(4)确定的光谱预处理方法和步骤(5)确定的主因子数，得到定量分析模型；
(7)利用验证集中的多个金钗石斛样品对定量分析模型进行外部验证；
(8)利用光谱定量分析模型，快速检测待测定的金钗石斛样品的甘露糖含量。
步骤(2)中所述的提取校正集中金钗石斛甘露糖的方法为：
将金钗石斛样品粉末和乙醇加热回流后弃去乙醇溶液，然后将粉末干燥加水加热煎煮，冷却后加水混匀进行离心，吸取上清液置于玻璃容器中，加入盐酸溶液，封口，混匀，置于沸水浴中水解，冷却后调节溶液的pH，加入PMP(1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮)甲醇溶液和氢氧化钠混匀，70℃水浴反应，然后冷却，加入盐酸溶液混匀，用三氯甲烷洗涤三次，弃去三氯甲烷层，水层离心后吸取其上清液，过微孔滤膜，即可得甘露糖。
步骤(2)中所述的高效液相色谱法测定金钗石斛样品中甘露糖含量，色谱条件为：ODS-C18色谱柱(4.6×250mm，×5μm)；检测波长：250nm；流动相：乙腈-0.02mol/L的乙酸铵溶液(20：80)；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL，利用甘露糖标准品，绘制标准曲线进行定量分析。
步骤(3)中所述的采用近红外光谱测定仪获取样品的吸收光谱原始数据方法为：取样品粉末装入称量瓶，盖上称量瓶盖振摇均匀。以空气作为空白对照，进行扫描。
步骤(3)中所述的近红外光谱测定仪扫描条件为积分时间11200μs，采样的次数为100次，扫描波段范围为900～1700nm，温度为33.55±2℃，相对湿度为25％～30％。
步骤(4)中所述的内部交叉验证决定系数R2值最接近于1，预测标准偏差(RMSEP)和校正标准偏差(RMSEC)值最接近0，且1＜RMSEP/RMSEC≤1.20时为最佳。
进一步地，步骤(4)中所述的光谱预处理方法为多元散射矫正法、标准归一化法、一阶倒数法和二阶倒数法中的一种或几种。
再进一步地，步骤(4)中所述的内部交叉验证决定系数R2值为0.9997，预测标准偏差(RMSEP)为0.0145和校正标准偏差(RMSEC)为0.0122、RMSEP/RMSEC＝1.1885。
优选地，步骤(4)中所述的光谱预处理方法为标准归一化法加二阶倒数法。
步骤(5)中所述的主因子数为最佳主因子数，所述的最佳主因子数是以主因子数为横坐标，以交互验证标准差(RMSECV)值作为纵坐标作图得到，当交互验证标准差(RMSECV)值较小且主因子数最少时为最佳主因子数。
优选地，最佳主因子数为4。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、建立金钗石斛甘露糖含量的近红外光谱定量分析模型，以实现绿色、高效、准确的检测金钗石斛药材的甘露糖含量；
第二、成本低，对环境无污染；
第三、为生产企业快速筛选高甘露糖含量的金钗石斛原材料提供了技术。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为甘露糖标准品的标准曲线；
图2为甘露糖标准品和待测溶液的色谱图：A甘露糖标准品；B金钗石斛样品；1为甘露糖标准品中的甘露糖峰；2为金钗石斛样品中的甘露糖峰；
图3为交互验证标准差(RMSECV)随主因子数的变化情况；黑色箭头所指为最佳主因子数；
图4为金钗石斛甘露糖含量的近红外光谱定量分析模型；
图5为84份不同产地的金钗石斛样品平均光谱叠加图。
具体实施方式
以下，根据本发明具体的实施形态进行说明。但是本发明不仅限定于该说明，在不脱离本发明的范围内，根据业者的知识，进行各种变更、修正及改良后而得的结果。
实施例1一种基于近红外光谱的金钗石斛甘露糖含量检测方法
具体包括以下步骤：
(1)取2020年12月期间从广东、广西、云南、四川、贵州等地种植及栽培基地获得的84份的金钗石斛样品，将其分成校正集和验证集，其中校正集包含75份样品，而验证集包含9份样品。
(2)选取校正集中金钗石斛茎，切成小段，105℃杀青15min，然后60℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛。称取样品粉末0.12g，置于索氏提取器中，加入25mL80％乙醇，加热回流提取4h后，弃去乙醇溶液，将粉末取出挥干溶剂，置于具塞锥形瓶中，加入100mL的水，加热煎煮1h，过程中需不时搅拌。放冷，用水补足至溶液体积为100mL，震摇混匀，离心，吸取上清液1mL置于具塞玻璃管中。加入0.5mL的3.0mol/L盐酸溶液，封口，混匀，置于沸水浴中水解1h，放冷，用3.0mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH至中性。吸取400μL，加入0.5mol/LPMP(1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮)甲醇溶液和0.3mol/L氢氧化钠各400μL，充分混匀，70℃水浴反应100min，放冷，加入500μL的0.3mol/L盐酸溶液，混匀。溶液用少量的三氯甲烷的洗涤三次，弃去三氯甲烷层，水层离心后吸取其上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得甘露糖待测溶液。
(3)高效液相色谱法测定金钗石斛样品中甘露糖含量，至少提取测定3次。色谱条件为：ODS-C18色谱柱(4.6×250mm，×5μm)；检测波长：250nm；流动相：乙腈-0.02mol/L的乙酸铵溶液(20：80)；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。利用甘露糖标准品进行定量分析。精密称取10mg甘露糖对照品，置于100mL的容量瓶中用水溶解并定容，制备100μg/mL的甘露糖对照品溶液，并稀释成0.15、0.25、0.5、0.525、1.25、2.5、10、25μg/mL的标准品溶液，按照上述方法进行高效液相色谱法测定。以峰面积作为纵坐标，以对照品溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，得甘露糖回归方程为y＝9798.3989x+1.1051，R2＝0.9999(图1和图2)。由此可知，在0.15～25μg/mL线性范围内，甘露糖与其峰面积可成良好的线性关系。
(4)将校正集中每份样品粉末各自混匀，分别装入已清洗干净的称量瓶中，盖上称量瓶盖振摇样品杯以使样品在杯内分布均匀，利用近红外光谱测定仪进行扫描，以空气作为空白对照(每20min需要重新扫描一次空气背景)。光谱仪扫描条件：积分时间为11200μs，采样的次数为100次，扫描波段范围为900～1700nm，温度为33.55±2℃，相对湿度为25％～30％。每份样品平行扫描3次，求取平均光谱。
(5)原始的光谱数据信息通常包含了因样品的粉碎程度、样品颜色、仪器状态等带来的基线漂移、噪音等无用的数据信息。使用The Unscrambler X 10.4软件对原始光谱数据进行不同方法的光谱预处理，并计算内部交叉验证决定系数R2、预测标准偏差(RMSEP)、校正标准偏差(RMSEC)和RMSEP/RMSEC比值等模型评价参数。计算公式为如下：
公式(1)
公式(2)
公式(3)
其中，yi,act为第i个样品实测值；yi,pre为交互验证时第i个校正集样品的预测值。n为校正集样品数；h为模型所选主因子数。m为验证集样本数。式中R2越接近1，RMSEC，RMSEP值越小，且1＜RMSEP/RMSEC≤1.20时模型的预测能力越好。最后得到最佳的光谱预处理方法为SNV+2nd derivative(表1)。
表1不同光谱预处理方法对模型参数的影响
注：MSC表示多元散射矫正法；SNV表示标准归一化法；1st derivative表示一阶倒数法；2nd derivative表示二阶倒数法。
(5)选择的主因子数量过多或者过少可能会导致模型过度拟合或拟合不足，从而扩大了预测误差。采用交叉验证方法，并按公式(4)计算交互验证标准差(RMSECV)。以主因子数为横坐标，以RMSECV值作为纵坐标作图，合理选择最佳主因子数，可以提高对光谱中有效信息的利用率，从而使得到的近红外定量分析模型对样品含量的预测更加精准、正确。当RMSECV值较小且主因子数最少时为最佳主因子数。金钗石斛中甘露糖定量分析模型的最佳主因子数为4(图3)。
公式(4)
其中，yi,act为第i个样品实测值；yi,pre为交互验证时第i个校正集样品的预测值。n为校正集样品数；h为模型所选主因子数。
对金钗石斛样品中甘露糖的实际测定值和吸收光谱数据的平均值一一对应进行线性拟合，采用偏最小二乘法(PLS)建立，全波段建模从而建立初始校正模型，再通过对样本光谱预处理方法的选择，最佳主因子数的选取等操作，从而得到性能优良的定量分析预测模型(图4)。模型中，以金钗石斛样品的甘露糖含量光谱预测值为纵坐标，金钗石斛样品的甘露糖含量实际测定值为横坐标，二者存在较好的线性关系。在评价及验证近红外模型时，常使用内部交叉验证决定系数(R2)来评价预测值的准确性；使用交互验证标准差(RMSECV)来确定最佳主因子数；使用校正标准偏差(RMSEC)来评价模型回归的效果；使用预测标准偏差(RMSEP)来评价模型预测能力。本发明中，得到的模型各参数分别为R2＝0.9997，RMSEP＝0.0145，RMSEC＝0.0122，RMSEP/RMSEC＝1.1885，均符合建立定量分析模型的要求。
实施例2一种基于近红外光谱的金钗石斛甘露糖含量检测方法
为验证所建模型的预测精确度，利用验证集的样品对模型进行外部验证。
(1)取实施例1步骤(1)中验证集的9份金钗石斛样品，按照实施例1中步骤(2)的方法提取甘露糖，按照实施例1中步骤(3)高效液相色谱法测定并获得9份样品的甘露糖含量值。验证集和校正集中金钗石斛样品甘露糖含量实测值比较见表2，可见，验证集中样品的甘露糖含量值均在校正集的含量范围内。
表2校正集和验证集金钗石斛样品甘露糖含量范围分布情况
(2)按照实施例1中步骤(4)的方法，利用近红外光谱测定仪对9份金钗石斛样品进行扫描，获得其红外光谱数据。验证集和校正集中共84份金钗石斛样品的近红外光谱图见图5。
(3)使用实施例1中已建立的定量分析模型，对9份金钗石斛样品的近红外光谱数据进行分析，得到验证集中样品甘露糖含量的预测值。将实际甘露糖含量值与预测值进行对比，结果见表3，计算可得平均回收率为99.75％。
表3验证集样品的甘露糖含量实测值和预测值比较
实施例3一种基于近红外光谱的金钗石斛甘露糖含量检测方法
未知甘露糖含量的金钗石斛新鲜样品的快速检测：
(1)按照实施例1步骤(2)的方法，将未知甘露糖含量的金钗石斛新鲜样品进行切段、烘干、粉碎和过筛。
(2)按照实施例1中步骤(4)的方法，利用近红外光谱仪对该份金钗石斛样品进行扫描，获得其红外光谱数据。
(3)结合该样品的红外光谱数据，利用建立的光谱定量分析模型对其甘露糖含量进行分析，得到该金钗石斛样品的甘露糖含量为2.17％，从而达到了绿色、快速、高效的检测金钗石斛样品甘露糖含量的目的。
Claims (10)
1.一种基于近红外光谱的金钗石斛甘露糖含量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将金钗石斛样品分为校正集和验证集；
(2)提取校正集中金钗石斛的甘露糖，利用高效液相色谱法测定其含量；
(3)采用近红外光谱测定仪扫描获取校正集中金钗石斛样品的吸收光谱数据；
(4)将步骤(3)得到的吸收光谱数据进行光谱预处理，所述的光谱预处理通过内部交叉验证决定系数R2、预测标准偏差RMSEP、校正标准偏差RMSEC和RMSEP/RMSEC比值确定，所述的内部交叉验证决定系数R2、预测标准偏差RMSEP和校正标准偏差RMSEC的计算公式如公式1、公式2和公式3所示；
公式1
公式2
公式3
其中，yi,act为第i个样品实测值；yi,pre为交互验证时第i个校正集样品的预测值；n为校正集样品数；h为模型所选主因子数；m为验证集样本数；
(5)计算交互验证标准差RMSECV，计算公式如公式4，采用交叉验证法，选择主因子数；
公式4
其中，yi,act为第i个样品实测值；yi,pre为交互验证时第i个校正集样品的预测值；n为校正集样品数；h为模型所选主因子数；
(6)结合步骤(2)中高效液相色谱法测定的样品甘露糖含量和步骤(3)获得的光谱数据采用偏最小二乘法全波段建立初始校正模型，再根据步骤(4)确定的光谱预处理方法和步骤(5)确定的主因子数，得到定量分析模型；
(7)利用验证集中的多个金钗石斛样品对定量分析模型进行外部验证；
(8)利用光谱定量分析模型，快速检测待测定的金钗石斛样品的甘露糖含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的提取校正集中金钗石斛甘露糖的方法为：
将金钗石斛样品粉末和乙醇加热回流后弃去乙醇溶液，然后将粉末干燥加水加热煎煮，冷却后加水混匀进行离心，吸取上清液置于玻璃容器中，加入盐酸溶液，封口，混匀，置于沸水浴中水解，冷却后调节溶液的pH，加入PMP(1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮)甲醇溶液和氢氧化钠混匀，70℃水浴反应，然后冷却，加入盐酸溶液混匀，用三氯甲烷洗涤三次，弃去三氯甲烷层，水层离心后吸取上清液，过微孔滤膜，即可得甘露糖。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的高效液相色谱法测定金钗石斛样品中甘露糖含量，色谱条件为：ODS-C18色谱柱：4.6×250mm，×5μm；检测波长：250nm；流动相：乙腈-0.02mol/L的乙酸铵溶液比例20：80；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL，利用甘露糖标准品，绘制标准曲线进行定量分析。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的近红外光谱测定仪扫描条件为：积分时间11200μs，采样的次数为100次，扫描波段范围为900-1700nm，温度为33.55±2℃，相对湿度为25％-30％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述的内部交叉验证决定系数R2值最接近于1，预测标准偏差RMSEP和校正标准偏差RMSEC值最接近0，且1＜RMSEP/RMSEC≤1.20。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述的光谱预处理方法为多元散射矫正法、标准归一化法、一阶倒数法和二阶倒数法中的一种或几种。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述的内部交叉验证决定系数R2值为0.9997，预测标准偏差RMSEP为0.0145和校正标准偏差RMSEC为0.0122，RMSEP/RMSEC＝1.1885。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述的光谱预处理方法为标准归一化法加二阶倒数法。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(5)中所述的主因子数为最佳主因子数，所述的最佳主因子数是以主因子数为横坐标，以交互验证标准差RMSECV值作为纵坐标作图得到。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述的最佳主因子数为4。
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