CN113008815A - 一种基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法 - Google Patents

一种基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法，本发明采用高光谱图像技术无损采集酸枣仁样本的高光谱图像信息，利用分水岭算法对聚集的酸枣仁样品进行目标分割识别，实现感兴趣区域平均光谱的自动提取，以理化检测方法所测定的总黄酮含量为实测值，并对获取的高光谱图像信息进行多种预处理方法及特征波长的提取方法筛选，最终建立了酸枣仁中总黄酮的高光谱定量评价模型，实现了酸枣仁中总黄酮的快速无损检测；本发明利用高光谱图像信息技术实现了酸枣仁中总黄酮含量的快速无损检测，为快速判断酸枣仁质量提供了一种简捷有效的方法，可推广用于中药质量快速检测领域。

Description

一种基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法
技术领域
本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及一种基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法。
背景技术
酸枣仁是鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.Chou的干燥成熟种子，临床多运用于改善睡眠，养心安神。近年来国内外学者对酸枣仁开展了一系列研究，认为黄酮类成分是其主要活性成分之一，多种研究表明，酸枣仁所具有的镇静催眠、抗抑郁、抗焦虑等作用均与黄酮类成分有关。同时2015版药典也以斯皮诺素为代表检测了酸枣仁中黄酮类成分。但目前对酸枣仁中黄酮类成分的研究大多集中于理化检测手段，需要采用大量有机试剂且经过复杂的前处理过程，既不环保且操作费时繁琐。因此，急需一种快速、绿色、无损的检测技术应用到总黄酮含量检测。
高光谱图像技术是近年发展起来的一种集光学、光电子学、计算机信息处理于一体的光谱技术，它将光谱技术与计算机技术相结合，不仅有样品的图像信息，还包含每个像素点的光谱信息，具有快速、无损、准确等特点，可以用于中药材及制剂等方面的质量检测。但是，基于高光谱图像信息来检测中药指标成分的含量仍存在一定难度，需要经过精准的光谱预处理和特征波段提取。因此，本发明的重点和难点在于无损采集高光谱图像信息，再建立准确、可靠的数学模型来准确检测酸枣仁中的总黄酮，为中药的在线自动化控制提供一种新思路。
发明内容
本发明的目的在于基于高光谱图像信息建立一种酸枣仁中总黄酮含量的预测评价模型，实现了酸枣仁中总黄酮的快速无损检测。
本发明的技术方案如下：
一种基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)样本高光谱采集
采集不同批次的酸枣仁药材作为样本，利用高光谱成像系统进行高光谱图像信息的采集；
具体的，样本数量应大于或者等于50批次(优选84批次)，并且批次间总黄酮含量应有所差异；
高光谱图像采集操作参数设置如下：水平移动平台的速度为1.6mm·s-1，镜头与样品之间的距离为20.5cm，CCD相机曝光时间为26ms；获得高光谱数据立方体，其宽为640像素，长为1000像素，以1.67nm的间隔从898nm到1751nm的512个波长；
(2)理化检测总黄酮含量
用理化检测方法测定酸枣仁样本中总黄酮的含量，作为实测值；
具体的，理化检测总黄酮的方法为酶标仪测定法，测得酸枣仁总黄酮供试品溶液的吸光度值，并按照标准曲线计算每个样本中的总黄酮含量的实测值；
(3)样本高光谱图像黑白校正
在高光谱数据采集之前对样本高光谱图像进行黑白校正，以减少其他无关因素的干扰；
黑白校正公式为：Rcal＝(Rraw﹣Rdark)/(Rwhite﹣Rdark)
其中，Rwhite为采集标准Teflon白板得到的全白标定图像，Rdark为关闭相机快门得到的全黑标定图像，Rraw为采集到的原始高光谱图像，Rcal为经过黑白校正后的高光谱图像；
(4)感兴趣区域平均光谱的自动提取
使用Spyder(python 3.7)用来对黑白校正后的高光谱图像进行后续的处理与分析；先对黑白校正后的高光谱图像进行掩膜操作生成新的灰度图像，对其进行二进制阈值分割和背景去除得到二进制图像；同时由于酸枣仁样本存在聚集情况，故采用分水岭算法分割了聚集样本，得到了分开的单粒样本图像及其光谱矩阵；对同一批次的每粒样本的光谱矩阵进行平均化处理，即可获得每批次样本的平均光谱值，实现感兴趣区域平均光谱的自动提取；
(5)预测模型建立
利用自动提取出的感兴趣区域的平均光谱与理化检测的总黄酮含量相对应建立预测模型，通过筛选不同的光谱预处理方法及提取特征波长方法以提高模型的预测精度，同时对所建立的预测模型进行评估；
样本通过Kennard-Stone算法以7：3的比例划分校正集与预测集；其中，校正集58个样本，预测集26个样本；
光谱预处理方法包括：一阶导数(derivative 1)、二阶导数(derivative 2)、S-G平滑(savitzky-golay smoothing,S-G smoothing)、多元散射校正(multiplicativescatter correction,MSC)、标准正态变量变换(standard normal variate,SNV)、标准化(Autoscale)、中心化(Mean center)；
提取特征波长方法包括：连续投影算法(SPA)、竞争性自适应重加权算法(CARS)、向后阈值区间偏最小二乘筛选法(biPLS)、联合区间偏最小二乘法(siPLS)、遗传算法(genetic algorithms，GA)；
所建立的预测模型为偏最小二乘回归(PLSR)模型；
PLSR模型性能的评价指标主要以决定系数(R2)和均方根误差(RMSE)来表示；R2越接近于1，RMSE越接近于0时，模型性能较好；若R2的值高于0.9，则表示该模型有很好的预测能力；
(6)实际样品检测
采集待测样品的高光谱图像信息，将待测样品的高光谱图像数据输入步骤(5)建立的预测模型中，即可获得待测样品的总黄酮含量。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
(1)本发明与目前常用的理化检测方法相比，无需复杂的样品前处理过程，且不需要消耗有机试剂，检测方法绿色环保；
(2)本发明所用的方法简便快捷，检测迅速，可短时间检测大量样本；
(3)本发明对样本不产生侵入性的损伤，不会破坏样本内部结构及表面特征。
附图说明
图1为高光谱含量测定方法的技术路线图；
图2为酸枣仁原始高光谱图像；
图3为酸枣仁经Autoscale预处理后的高光谱图像；
图4为CARS特征波长选择；
图5为酸枣仁中总黄酮含量实测值与预测值的散点图；
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供的是一种基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法，其技术路线如图1所示，具体按照以下步骤进行：
(1)样本高光谱采集过程
高光谱仪器采集系统打开后先预热30min，并打开Spectral Image光谱软件，再对酸枣仁药材进行图像采集。采集时将酸枣仁药材随意散布于培养皿中，培养皿置于水平移动平台上进行光谱采集，采集开始后需将暗箱门关闭，以减小外界光线对采集的影响。高光谱图像采集操作参数设置如下：水平移动平台的速度为1.6mm·s-1，镜头与样品之间的距离为20.5cm，CCD相机曝光时间为26ms。获得高光谱数据立方体，其宽为640像素，长为1000像素，以1.67nm的间隔从898nm到1751nm的512个波长。图2所示为酸枣仁原始光谱图像。
(2)理化检测总黄酮含量
酶标仪法具体步骤：
a、溶剂提取法提取酸枣仁中总黄酮。精密称定酸枣仁粉(过60目筛)1.0g置于锥形瓶中，向其中加入30mL的70％乙醇，浸泡4h，然后将其放入超声中，超声温度设置为50℃，超声时间设置为30min，放冷至室温后滤过，并用70％乙醇洗涤样品粉末3次，合并提取液及洗涤液置于50mL量瓶中，并加入70％乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
b、标准曲线绘制。精密称取芦丁对照品适量，置于不同容量瓶中，加70％乙醇稀释，制成浓度不同的芦丁对照品溶液。分别精密吸取各浓度标准品溶液500μL，并置于25mL容量瓶中，先向其中加入6mL的70％乙醇，再加入5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置6min，再加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，静置6min，再加4％氢氧化钠溶液10mL，最后加入70％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min。另外用不含对照品的相应试剂设置一组空白对照组。取一块洁净的空白96孔板，分别精密吸取空白对照组及各试液200μL，在500nm处先测得其吸光度值，将得到的不同试液的吸光度值减去空白对照组的吸光度值得到校正后的吸光度值。以浓度为横坐标，校正后吸光度值为纵坐标，进行线性回归，并绘制标准曲线。
c、总黄酮含量的测定。精密量取酸枣仁总黄酮供试品溶液3mL于25mL容量瓶中，测得酸枣仁总黄酮供试品溶液的吸光度值，并按照标准曲线计算每个样品中的总黄酮含量的实测值。
(3)样本高光谱图像黑白校正
与样品采集条件相同的情况下，分别采集标准Teflon白板得到的全白标定图像Rwhite及关闭相机快门得到的全黑标定图像Rdark，Rraw为采集到的原始高光谱图像，则经过黑白校正后的高光谱图像Rcal＝(Rraw﹣Rdark)/(Rwhite﹣Rdark)。
(4)感兴趣区域平均光谱的自动提取
为了节省手动提取感兴趣区域平均光谱所耗费的时间与劳力，本发明基于分水岭算法开发了一种分割目标边界的方法用来提取单粒样本平均光谱。
本方法对黑白校正后的高光谱图像进行掩膜操作生成新的灰度图像，将二进制阈值分割应用于灰度图像以去除背景并获得二进制mask图像。另外为了使酸枣仁样品颗粒间的差距比较明显，从而方便后续边界分割，对提取出的原始光谱矩阵进行RGB可视化操作扩大其差异，同时将掩膜后的光谱矩阵与RGB可视化结果进行并运算。然后采用分水岭算法分割聚集样本，同时保存单粒样本的边缘坐标，并以不同像素值标记不同样本。后采用泛洪法填充，得到分开的单粒样本的图像及光谱矩阵。最后将每一个单粒样本区域的所有像素点的光谱进行平均化操作，从而实现的快速自动获取，然后对同一批次的每粒样本的光谱矩阵进行平均化处理，可以获得每批次样本的平均光谱值，用于后续数据处理分析。
(5)光谱预处理
将样本通过Kennard-Stone算法以7：3的比例划分校正集与预测集。其中校正集58个样本，预测集26个样本；由于样本表面存在不平整的情况并且仪器本身的不稳定，在采集样本时会产生噪声和基线漂移的现象，从而对采集到的高光谱图像产生干扰，影响了预测模型的准确性。本研究采用并对比了derivative 1、derivative 2、S-G平滑、MSC、SNV、Autoscale和Mean center这七种预处理方法。由于1601～1751nm波长范围内包含较大的随机噪声，信噪比较低，且存在重合和交叉现象，本研究仅选取了900～1601nm的波长范围，共包含421个波长进行后续分析。表1为不同预处理方法和提取特征波长方法的PLSR模型的结果。
根据表1可知，在使用同一种提取特征波长方法的前提下，对比无预处理与经过其他预处理后的结果发现，使用不同预处理方法后，除了导数预处理(包括derivative 1与derivative 2)对比无预处理的模型准确度总体上有所降低外，其余预处理方法对于模型结果的影响并不显著。综合对比各种预处理方法的预测集及测试集准确度结果，最终选择了Autoscale作为最后的光谱预处理方法。图3为酸枣仁经Autoscale预处理后的高光谱图像。
表1不同预处理方法和提取特征波长方法的PLSR模型结果
Figure BDA0002950313430000041
Figure BDA0002950313430000051
(6)特征波长选择
本发明筛选了SPA、CARS、biPLS、siPLS、GA五种提取特征波长方法，如表1所示，对比相同预处理条件下的不同提取特征波长的结果发现，特征波长方法的选取对模型准确度的结果影响显著，其中显示出CARS对于提取特征波长显著的优越性，故选择CARS作为最后的提取特征波长的方法。图4为CARS特征波长选择的结果，CARS所选的波长有47个，分别为923.31nm、953.28nm、966.60nm、1011.56nm、1048.19nm、1063.18nm、1074.83nm、1076.50nm、1088.15nm、1089.82nm、1091.48nm、1111.47nm、1116.46nm、1126.45nm、1134.78nm、1146.43nm、1173.07nm、1186.39nm、1218.03nm、1224.69nm、1262.99nm、1286.30nm、1291.29nm、1297.95nm、1301.29nm、1302.95nm、1306.28nm、1309.61nm、1312.94nm、1319.60nm、1326.26nm、1339.58nm、1342.91nm、1351.24nm、1366.22nm、1374.55nm、1376.21nm、1404.52nm、1412.85nm、1441.15nm、1454.47nm、1466.13nm、1482.78nm、1532.73nm、1574.36nm、1579.35nm，占全波长的11.16％。
(7)模型建立及评价指标
为了实现对酸枣仁总黄酮含量的快速定量，对酸枣仁样品进行PLSR预测模型的建立。根据对比表1的所有结果，Autoscale-CARS-PLSR预测模型的结果较优，其对应的R2c与R2p分别为0.9989与0.9441，RMSEC为0.0491mg/g，RMSEP为0.3415mg/g，预测集的决定系数R2p大于0.9，说明模型的预测性能优越。图5为酸枣仁中总黄酮含量实测值与预测值的散点图，如图5所示，散点均集中于对角线周围，显示出实测值与预测值非常接近，说明本研究所建模型定量准确度高，可以用于预测酸枣仁中总黄酮的含量。
以上实施例并非仅限于本发明的保护范围，所有基于本发明的基本思想而进行的修改或变动都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)样本高光谱采集
采集不同批次的酸枣仁药材作为样本，利用高光谱成像系统进行高光谱图像信息的采集；
(2)理化检测总黄酮含量
用理化检测方法测定酸枣仁样本中总黄酮的含量，作为实测值；
(3)样本高光谱图像黑白校正
在高光谱数据采集之前对样本高光谱图像进行黑白校正，以减少其他无关因素的干扰；
黑白校正公式为：Rcal＝(Rraw﹣Rdark)/(Rwhite﹣Rdark)
其中，Rwhite为采集标准Teflon白板得到的全白标定图像，Rdark为关闭相机快门得到的全黑标定图像，Rraw为采集到的原始高光谱图像，Rcal为经过黑白校正后的高光谱图像；
(4)感兴趣区域平均光谱的自动提取
使用Spyder(python 3.7)用来对黑白校正后的高光谱图像进行后续的处理与分析；先对黑白校正后的高光谱图像进行掩膜操作生成新的灰度图像，对其进行二进制阈值分割和背景去除得到二进制图像；同时由于酸枣仁样本存在聚集情况，故采用分水岭算法分割了聚集样本，得到了分开的单粒样本图像及其光谱矩阵；对同一批次的每粒样本的光谱矩阵进行平均化处理，即可获得每批次样本的平均光谱值，实现感兴趣区域平均光谱的自动提取；
(5)预测模型建立
利用自动提取出的感兴趣区域的平均光谱与理化检测的总黄酮含量相对应建立预测模型，通过筛选不同的光谱预处理方法及提取特征波长方法以提高模型的预测精度，同时对所建立的预测模型进行评估；
样本通过Kennard-Stone算法以7：3的比例划分校正集与预测集；
光谱预处理方法包括：一阶导数、二阶导数、S-G平滑、多元散射校正、标准正态变量变换、标准化、中心化；
提取特征波长方法包括：连续投影算法、竞争性自适应重加权算法、向后阈值区间偏最小二乘筛选法、联合区间偏最小二乘法、遗传算法；
所建立的预测模型为偏最小二乘回归PLSR模型；
PLSR模型性能的评价指标主要以决定系数R2和均方根误差RMSE来表示；R2越接近于1，RMSE越接近于0时，模型性能较好；若R2的值高于0.9，则表示该模型有很好的预测能力；
(6)实际样品检测
采集待测样品的高光谱图像信息，将待测样品的高光谱图像数据输入步骤(5)建立的预测模型中，即可获得待测样品的总黄酮含量。
2.如权利要求1所述基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法，其特征在于，步骤(1)中，样本数量大于或者等于50批次，并且批次间总黄酮含量有所差异。
3.如权利要求1所述基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法，其特征在于，步骤(1)中，高光谱图像采集操作参数设置如下：水平移动平台的速度为1.6mm·s-1，镜头与样品之间的距离为20.5cm，CCD相机曝光时间为26ms；获得高光谱数据立方体，其宽为640像素，长为1000像素，以1.67nm的间隔从898nm到1751nm的512个波长。
4.如权利要求1所述基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法，其特征在于，步骤(2)中，理化检测总黄酮的方法为酶标仪测定法，测得酸枣仁总黄酮供试品溶液的吸光度值，并按照标准曲线计算每个样本中的总黄酮含量的实测值。
5.如权利要求1所述基于高光谱图像信息无损检测酸枣仁中总黄酮的方法，其特征在于，步骤(5)中，校正集58个样本，预测集26个样本。
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