CN114806983B - 一种同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时生产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明中，以基因工程菌EC06S7G作为出发菌株，通过转录因子工程技术，敲除甘油代谢转录抑制因子GlpR，解除甘油代谢抑制；通过UTR工程技术将工程菌内碳通量重新分配，节约碳通量用于3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的合成。

Description

一种同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构 建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
3-羟基丙酸和1,3-丙二醇是工业上两种重要的平台化合物，作为生物可降解性聚合物的前体物质和食品添加剂广泛使用。3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产有化学合成法和生物法两种。化学法多以不可再生资源作为原料，其生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化，生产过程产生不可估量的环境污染。生物法合成3-羟基丙酸或1,3-丙二醇多以葡萄糖和甘油作为底物，其中以甘油作为底物生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇步骤简单，研究充分，原料廉价，且能解决甘油过剩的问题。
从甘油生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇，首先，经甘油脱水酶将甘油脱水生成中间代谢物3-羟基丙醛；后经NAD+依赖型醛脱氢酶和NAD(P)H依赖型1,3-丙二醇氧化还原酶/同工酶分别生成3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
目前，甘油代谢抑制，限制了甘油的进一步摄入，使得3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产产量低；并且过多的碳流量流向中心代谢途径将降低3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产率；以上两点是现阶段微生物发酵甘油产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的主要瓶颈。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明中，以基因工程菌EC06 S7G作为出发菌株，通过转录因子工程技术，敲除甘油代谢转录抑制因子GlpR，解除甘油代谢抑制；通过UTR工程技术将工程菌内碳通量重新分配，节约碳通量用于3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的合成。
本发明中首先提供了一种同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌，所述基因工程菌敲除EC06 S7G中的甘油代谢转录抑制因子GlpR，并调控了甘油激酶GlpK基因的表达量。
其中，EC06 S7G为在EC06工程菌中转入重组质粒pS0Y和pS7的基因工程菌；所述EC06工程菌通过将大肠杆菌E.coli W3110(DE3)中SthA、LdhA、AdhE、PflB、PoxB和Pta-AckA敲除得到。
其中，所述重组质粒pS0Y的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述重组质粒pS7Z的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
其中，所述调控为削弱甘油激酶GlpK基因的表达量。
本发明中提供了上述同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)GlpR敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇联产工程菌的构建：
使用CRIPSR CAS9工具质粒敲除EC06工程菌中的甘油转录抑制因子GlpR，命名为EC07；
将重组质粒pS0Y和重组质粒pS7Z转化至EC07中，得到GlpR敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇联产工程菌，记为EC07 S7G；
(2)联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建：
使用UTR工程技术，设计表达强度逐渐降低的人工UTR序列替换EC07 S7G基因组的GlpK基因的原始UTR序列，得到GlpK表达量削弱的基因工程菌，即联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌。
其中，所述人工UTR序列为如下7种序列的任一种：
glpK-U1 AGATTATACGGGACAACACGAA(SEQ ID No:19)；
glpK-U2 GTTAGCTACGGGACAAGGGTTT(SEQ ID No:20)；
glpK-U3 ATTCTTTACGGGACAACCATAA(SEQ ID No:21)；
glpK-U4 ACGTCTAACGGGACAAAGTTCC(SEQ ID No:22)；
glpK-U5 ACGGTTTACGGGACAACGCGG(SEQ ID No:23)；
glpK-U6 ACCGTCTACGGGACAACGCTGT(SEQ ID No:24)；
glpK-U7 CCGGTCTACGGGACAACGCTGT(SEQ ID No:25)。
优选的，所述人工UTR序列为glpK-U3：ATTCTTTACGGGACAACCATAA(SEQ ID No:21)。
本发明中所述基因工程菌在联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇中的应用。
进一步的，所述应用为发酵甘油高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本技术通过代谢工程和合成生物学设计，构建了一株可以高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程，通过敲除甘油代谢转录抑制因子，增强甘油代谢；通过UTR工程技术精准调节中心代谢途径与3-羟基丙酸和1,3-丙二醇合成途径的碳通量分配，减少碳通量浪费，同时提升3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量。
本发明中，通过解决甘油代谢抑制，提升了工程菌甘油代谢；通过UTR工程技术精准调节中心代谢途径与目标产物合成途径，具有重要的理论和实践意义，所构建的基因工程EC10S7G可高效生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇，且具有较高产率，具有大规模工业生产潜力。本发明中所述EC10 S7G(GlpK强度为70038.41a.u.)几乎不积累，且其3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量达到最高，为18.03g/L，此时3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的净产率达到0.80mol/mol。
附图说明
图1为基因工程菌EC07 S7G与EC06 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量对比图。
图2为基因工程菌EC07 S7G与EC06 S7G的甘油代谢途径关键酶的转录水平对比图。
图3为基因工程菌EC08 S7G-EC14 S7G中GlpK表达强度与丙酮酸积累对比图。
图4为基因工程菌EC08 S7G-EC14 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量以及产率对比图。
图5为基因工程菌EC10 S7G的基因改造策略概况图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
下列实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。
实施例1：GlpR基因缺陷工程菌的构建
(1)根据乳酸脱氢酶(GlpR)基因序列，使用sgRNAcas9选择合适靶点生成合适的sgRNA序列；根据上述基因序列和pTargetF质粒的序列特性使用Oligo7.0软件设计用于GlpR基因敲除的引物，引物序列如下所示：
sgRNA-glpR F：CGTAACGCGATGGTCAATATgttttagagctagaaatagc(SEQ ID No:3)；
sgRNA-glpR R：ATATTGACCATCGCGTTACGactagtattatacctaggac(SEQ ID No:4)；
glpR-up F：cgtggtggtgtttattgcc(SEQ ID No:5)；
glpR-up R：AGCACAGCTCCAGTTGAAtcatttataaatccctggaattatt(SEQ ID No:6)；
glpR-down F：AATAATTCCAGGGATTTATAAATGattcaactggagctgtg(SEQ ID No:7)；
glpR-down R：tgaagagaaaaccttttaccc(SEQ ID No:8)。
(2)以pTargetF质粒为模板，使用引物对sgRNA-glpR F和sgRNA-glpR R扩增，获得靶向GlpR基因的pTargetF骨架，然后使用吉布森组装使其自连，得到重组质粒pTargetF-GlpR。
(3)以大肠杆菌EC06基因组(将大肠杆菌E.coli W3110(DE3)中SthA、LdhA、AdhE、PflB、PoxB和Pta-AckA敲除得到)为模板，使用引物对glpR-up F和glpR-up R扩增，得到GlpR基因的上游序列；
使用引物对ldhA-down F和ldhA-down R扩增，得到LdhA基因下游序列；
以LdhA基因上游序列和GlpR基因下游序列为模板，使用引物对glpR-up F和glpR-down R扩增，得到GlpR基因上下游同源臂。
(4)将pCas9质粒转化进入EC06中，然后将含有pCas9质粒的EC06经过0.1M的L-阿拉伯糖诱导后制作成为电转感受态；同时将100ng的pTargetF-GlpR质粒和400ng的GlpR基因上下游同源臂使用电转仪转化进入含有pCas9质粒的EC06中。具体电转参数为：电压1800V，电阻200Ω，电容25μF，电转杯1mm，点击时间1.5ms。
电转完成后，30℃培养2h，然后涂布至含有50μg/mL壮观霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板30℃下培养24-48h。培养结束后挑取适量单菌落使用引物对glpR up F和glpRdown R进行菌落PCR验证，将疑似基因缺陷的工程菌送苏州金唯智测序验证，获得验证正确的GlpR基因敲除工程菌，保存备用。
(5)将GlpR基因敲除工程菌在含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中进行培养，使用0.5mM IPTG进行诱导(30℃，12h)，除去重组质粒pTargetF-GlpR，接着将除去重组质粒pTargetF-GlpR的工程菌进行过夜培养(37℃)除去pCas9质粒，获得成功除去重组质粒pTargetF-GlpR和pCas9的GlpR基因敲除工程菌，命名为EC07。
实施例2：GlpR敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇联产工程菌构建
(1)将重组质粒pS0Y和pS7Z经电击法转入EC07中，电击参数为：电转杯1mm，电压1800V，电阻200Ω，电容25μF，获得GlpR敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌，命名为EC07 S7G。
(2)将上述基因工程菌EC07 S7G在LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠)中过夜活化(37℃、220rpm)，按1％v/v接种量接种于改良MR培养基(甘油30g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，(NH4)2HPO4 4.0g/L，KH2PO4 6.67g/L，citric acid 0.8g/L，酵母粉1.0g/L，pH 7.0)中培养(37℃、220rpm)4小时后，OD600达到约0.8，加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续培养36h(35℃、220rpm)，使用高效液相色谱法测量3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量。液相色谱条件为：Aminex HPX-87H column色谱柱、0.4mL/min、65℃、RID检测器35℃、UV检测器210nm，测量结果如图1所示。
图1为基因工程菌EC07 S7G与EC06 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量对比图，从图中可以看出，敲除GlpR的工程菌EC07 S7G甘油消耗较出发菌株高24.64％，3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量提高了9.45％，但令人意外的是3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产率却下降了8.71％，进一步分析EC07 S7G的代谢产物，发现EC07 S7G的丙酮酸积累提高了2.19倍，这表明敲除GlpK导致更多的碳通量流向了中心代谢途径。
实施例3：GlpR敲除的工程菌构建的转录水平分析
(1)为了探明实施例2中丙酮酸升高的原因，对EC06 S7G和EC07 S7G的甘油有氧代谢途径关键酶甘油转运因子glpF、甘油激酶glpK、甘油脱氢酶glpD基因进行转录分析(qPCR)，首先根据glpF、glpK、glpD的基因序列，用Oligo7，设计用于qPCR的引物：
Q-recA F：ATTCTACGCCTCTGTTCGTCT(SEQ ID No:9)；
Q-recA R：CTTTTACGCCCAGGTCAACCA(SEQ ID No:10)；
Q-glpF F：TCCCGCTGTTACCATTGCAT(SEQ ID No:11)；
Q-glpF R：TGCCAGCCAGATCAACACT(SEQ ID No:12)；
Q-glpK F：AGCGTGAAACCACTATTGTCT(SEQ ID No:13)；
Q-glpK R：AAAAGTACGGGTCAATCACCA(SEQ ID No:14)；
Q-glpD F：GCTATTACCCGTGATTACACCCT(SEQ ID No:15)；
Q-glpF R：CCGGTAGCACACTCTCTTTCGT(SEQ ID No:16)。
(2)通过2×qPCR SYBR Green Master Mix，分别使用Q-recA F和Q-recAR引物对、Q-glpF F和Q-glpF R引物对、Q-glpK F和Q-glpK R引物对和Q-glpK F和Q-glpK R引物对来扩增recA、glpF、glpK和glpD，其中recA基因作为内参基因，qPCR反应条件为：95℃5min，98℃10s，60℃30s,40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。
EC06 S7G和EC07 S7G的转录水平如图2所示，从图中可以看出，glpF、glpK和glpD表达量均有所提升，其中甘油转运因子基因glpF表达量提高了1.31倍，这对3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的合成时有利的，因为起始甘油转运对目标产物的合成至关重要。同时甘油激酶基因glpK和甘油脱氢酶基因glpD转录水平分别提高了1.86和1.60倍，glpK和glpD是甘油有氧代谢的前两个基因，其转录水平的提高可能导致更多的碳通量流向中心代谢途径，这极有可能是EC10 S7G中丙酮酸积累急剧升高的原因。
实施例4：GlpK表达强度降低的基因工程菌构建
(1)EC07的甘油激酶(GlpK)基因的原始UTR序列为：TATGACTACGGGACAATTAAAC(SEQID No:17)，GlpK基因N端35bp序列为：ATGACTGAAAAAAAATATATCGTTGCGCTCGACCA(SEQ IDNo:18)，遵循UTR设计原则，人工设计的UTR序列格式应为NNNNNNTACGGGACAANNNNNN，其中TACGGGACAA为大肠杆菌的核糖体结合位点，N代表任意碱基，下划线部分为核糖体结合位点。为了使GlpK表达量达到预期范围，设计了7个强度由强到弱的UTR序列，如表1所示。
表1.不同UTR及其预测的表达强度
(2)根据甘油激酶(GlpK)基因序列，使用sgRNAcas9选择合适靶点生成合适的sgRNA序列；根据上述基因序列和ptargetF质粒的序列特性使用Oligo7.0软件设计用于替换GlpK基因UTR的引物：
sgRNA-glpKUTR F：CTTCGCTGTAATATGACTACgttttagagctagaaatagc(SEQ ID No:26)；
sgRNA-glpKUTR R：GTAGTCATATTACAGCGAAGactagtattatacctaggac(SEQ ID No:27)；
glpK-up F：cgcagttgagatggtgattaccg(SEQ ID No:28)；
glpK-up R：ttacagcgaagctttttgttc(SEQ ID No:29)；
glpK-down F：atgactgaaaaaaaatatatcgttgcg(SEQ ID No:30)；
glpK-down R：atccacttcactttggtgcca(SEQ ID No:31)；
glpK-up R1：TTCGTGTTGTCCCGTATAATCTttacagcgaagctttttgttc(SEQ ID No:32)；
glpK-up R2：AAACCCTTGTCCCGTAGCTAACttacagcgaagctttttgttc(SEQ ID No:33)；
glpK-up R3：TTATGGTTGTCCCGTAAAGAATttacagcgaagctttttgttc(SEQ ID No:34)；
glpK-up R4：GGAACTTTGTCCCGTTAGACGTttacagcgaagctttttgttc(SEQ ID No:35)；
glpK-up R5：CCGCGTTGTCCCGTAAACCGTttacagcgaagctttttgttc(SEQ ID No:36)；
glpK-up R6：ACAGCGTTGTCCCGTAGACGGTttacagcgaagctttttgttc(SEQ ID No:37)；
glpK-up R7：ACAGCGTTGTCCCGTAGACCGGttacagcgaagctttttgttc(SEQ ID No:38)；
glpK-down F1：AGATTATACGGGACAACACGAAatgactgaaaaaaaatatatcgttgcg(SEQ IDNo:39)；
glpK-down F2：GTTAGCTACGGGACAAGGGTTTatgactgaaaaaaaatatatcgttgcg(SEQ IDNo:40)；
glpK-down F3：ATTCTTTACGGGACAACCATAAatgactgaaaaaaaatatatcgttgcg(SEQ IDNo:41)；
glpK-down F4：ACGTCTAACGGGACAAAGTTCCatgactgaaaaaaaatatatcgttgcg(SEQ IDNo:42)；
glpK-down F5：ACGGTTTACGGGACAACGCGGatgactgaaaaaaaatatatcgttgcg(SEQ IDNo:43)；
glpK-down F6：ACCGTCTACGGGACAACGCTGTatgactgaaaaaaaatatatcgttgcg(SEQ IDNo:44)；
glpK-down F7：CCGGTCTACGGGACAACGCTGTatgactgaaaaaaaatatatcgttgcg(SEQ IDNo:45)；
(3)以pTargetF质粒为模板，使用引物对sgRNA-glpKUTR F和sgRNA-glpKUTR R扩增获得靶向GlpK基因UTR序列的pTargetF骨架；使用吉布森组装使其自连，获得重组质粒pTargetF-GlpKUTR。
(4)使用大肠杆菌EC07为模板，使用引物对glpK-up F和glpK-up R扩增GlpK基因上游序列，以GlpK基因上游序列为模板，使用引物对glpK-up F和glpK-up R1扩增获得含UTR-U1的GlpK基因上游序列；
使用引物对glpK-down F和glpK-down R扩增GlpK基因下游序列，以GlpK基因下游序列为模板，使用引物对glpK-down F1和glpK-down R扩增获得含UTR-U1的GlpK基因下游序列；
以含UTR-U1的GlpK基因上游序列和含UTR-U1的GlpK基因下游序列的基因片段为模板，使用glpK-down F和glpK-down R进行融合PCR，获得含UTR-U1的GlpK基因上下游同源臂。
同理，使用上述对应的引物，获得含UTR-U2、UTR-U3、UTR-U4、UTR-U5、UTR-U6和UTR-U7的GlpK基因上下游同源臂。
(5)将pCas9质粒转化进入EC07中；将含有pCas9质粒的EC07经过0.1M的L-阿拉伯糖诱导后制作成为电转感受态。然后分别将400ng的含UTR-U1、UTR-U2、UTR-U3、UTR-U4、UTR-U5、UTR-U6、UTR-U7基因上下游同源臂和100ng的pTargetF-GlpR质粒使用电转仪转化进入含有pCas9质粒的EC07中。其中，电转参数具体为：电压1800V，电阻200Ω，电容25μF，电转杯1mm，点击时间1.5ms。
电转结束后30℃培养2h后涂布含有50μg/mL壮观霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板，30℃培养24-48h，GlpK削弱的工程菌送苏州金唯智测序验证，获得7种验证正确的GlpK削弱的基因工程菌，保存备用。
(6)分别将得到的7种验证正确的GlpK削弱的基因工程菌在含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中进行培养，使用0.5mM IPTG进行诱导(30℃12h)，除去重组质粒TargetF-GlpKUTR，接着将除去重组质粒TargetF-GlpKUTR的工程菌进行过夜培养(37℃)除去pCas9质粒，得到成功除去重组质粒TargetF-GlpKUTR和pCas9的GlpK削弱的工程菌，命名为EC08-EC14。
(7)将pS0Y(SEQ ID No:1)和pS7Z(SEQ ID No:2)经电击法分别转入EC08-EC14中，电击参数为：电转杯1mm，电压1800V，电阻200Ω，电容25μF，得到GlpK削弱的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌，命名为EC08 S7G-EC14 S7G。
(8)将基因工程菌EC08 S7G-EC14 S7G在LB培养基中过夜活化(37℃、220rpm)，按1％v/v接种量接种于改良MR培养基中培养(37℃、220rpm)4小时后，OD600达到约0.8，加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续培养36h(35℃、220rpm)，使用高效液相色谱法测量3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量，测量结果如图3和图4所示。
从图3和4中可以看出，随着GlpK表达量的降低，丙酮酸的积累逐渐降低，其中EC10S7G(GlpK强度为70038.41a.u.)几乎不积累，且其3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量达到最高，为18.03g/L，此时3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的净产率达到0.80mol/mol。
综上所述，基因改造概况如图5所示工程菌的EC10 S7G可高效生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇，且具有较高产率，具有大规模工业生产潜力。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8618
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgaaaagat caaaacgatt tgcagtactg gcccagcgcc ccgtcaatca 120
ggacgggctg attggcgagt ggcctgaaga ggggctgatc gccatggaca gcccctttga 180
cccggtctct tcagtaaaag tggacaacgg tctgatcgtc gaactggacg gcaaacgccg 240
ggaccagttt gacatgatcg accggtttat cgccgattac gcgatcaacg ttgagcgcac 300
agagcaggca atgcgcctgg aggcggtgga aatagcccgc atgctggtgg atattcacgt 360
cagccgggag gagatcattg ccatcactac cgccatcacg ccggccaaag cggtcgaggt 420
gatggcgcag atgaacgtgg tggagatgat gatggcgctg cagaagatgc gtgcccgccg 480
gaccccctcc aaccagtgcc acgtcaccaa tctcaaagat aatccggtgc agattgccgc 540
tgacgccgcc gaggccggga tccgcggctt ctcagaacag gagaccacgg tcggtatcgc 600
gcgctatgcg ccgtttaacg ccctggcgct gttggtcggt tcgcagtgcg gccgtcccgg 660
cgtgttgacg cagtgctcgg tggaagaggc caccgagctg gagctgggca tgcgtggctt 720
aaccagctac gccgagacgg tgtcggtcta cggcacggaa gcggtattta ccgacggcga 780
tgatactccg tggtcaaagg cgttcctcgc ttcggcctac gcctcccgcg ggttgaaaat 840
gcgctacacc tccggcaccg gatccgaagc gctgatgggc tattcggaga gcaagtcgat 900
gctctacctc gaatcgcgct gcatcttcat taccaaaggc gccggggttc aggggctgca 960
aaacggcgcg gtgagctgta tcggcatgac cggcgctgtg ccgtcgggca ttcgggcggt 1020
gctggcggaa aacctgatcg cctctatgct cgacctcgaa gtggcgtccg ccaacgacca 1080
gactttctcc cactcggata ttcgccgcac cgcgcgcacc ctgatgcaga tgctgccggg 1140
caccgacttt attttctccg gctacagcgc ggtgccgaac tacgacaaca tgttcgccgg 1200
ctcgaacttc gatgcggaag attttgatga ttacaacatc ctgcagcgtg acctgatggt 1260
tgacggcggc ctgcgtccgg tgaccgaggc ggaaaccatt gccattcgcc agaaagcggc 1320
gcgggcgatc caggcggttt tccgcgagct ggggctgccg ccaatcgccg acgaggaggt 1380
ggaggccgcc acctacgcgc acggcagcaa cgagatgccg ccgcgtaacg tggtggagga 1440
tctgagtgcg gtggaagaga tgatgaagcg caacatcacc ggcctcgata ttgtcggcgc 1500
gctgagccgc agcggctttg aggatatcgc cagcaatatt ctcaatatgc tgcgccagcg 1560
ggtcaccggc gattacctgc agacctcggc cattctcgat cggcagttcg aggtggtgag 1620
tgcggtcaac gacatcaatg actatcaggg gccgggcacc ggctatcgca tctctgccga 1680
acgctgggcg gagatcaaaa atattccggg cgtggttcag cccgacacca ttgaataagg 1740
cggtattcct gtgcaacaga caacccaaat tcagccctct tttaccctga aaacccgcga 1800
gggcggggta gcttctgccg atgaacgcgc cgatgaagtg gtgatcggcg tcggccctgc 1860
cttcgataaa caccagcatc acactctgat cgatatgccc catggcgcga tcctcaaaga 1920
gctgattgcc ggggtggaag aagaggggct tcacgcccgg gtggtgcgca ttctgcgcac 1980
gtccgacgtc tcctttatgg cctgggatgc ggccaacctg agcggctcgg ggatcggcat 2040
cggtatccag tcgaagggga ccacggtcat ccatcagcgc gatctgctgc cgctcagcaa 2100
cctggagctg ttctcccagg cgccgctgct gacgctggag acctaccggc agattggcaa 2160
aaacgccgcg cgctatgcgc gcaaagagtc accttcgccg gtgccggtgg tgaacgatca 2220
gatggtgcgg ccgaaattta tggccaaagc cgcgctattt catatcaaag agaccaaaca 2280
tgtggtgcag gacgccgagc ccgtcaccct gcacgtcgac ttagtaaggg agtgaccatg 2340
agcgagaaaa ccatgcgcgt gcaggattat ccgttagcca cccgctgccc ggagcatatc 2400
ctgacgccta ccggcaaacc attgaccgat attaccctcg agaaggtgct ctctggcgag 2460
gtgggcccgc aggatgtgcg gatctcccgt cagacccttg agtaccaggc gcagattgcc 2520
gagcagatgc agcgccatgc ggtggcgcgc aatttccgcc gcgcggcgga gcttatcgcc 2580
attcctgacg agcgcattct ggctatctat aacgcgctgc gcccgttccg ctcctcgcag 2640
gcggagctgc tggcgatcgc cgacgagctg gagcacacct ggcatgcgac agtgaatgcc 2700
gcctttgtcc gggagtcggc ggaagtgtat cagcagcggc ataagctgcg taaaggaagc 2760
taagcggagg tcagcatgcc gttaatagcc gggattgata tcggcaacgc caccaccgag 2820
gtggcgctgg cgtccgacga cccgcaggcg agggcgtttg ttgccagcgg gatcgtcgcg 2880
acgacgggca tgaaagggac gcgggacaat atcgccggga ccctcgccgc gctggagcag 2940
gccctggcga aaacaccgtg gtcgatgagc gatgtctctc gcatctatct taacgaagcc 3000
gcgccggtga ttggcgatgt ggcgatggag accatcaccg agaccattat caccgaatcg 3060
accatgatcg gtcataaccc gcagacgccg ggcggggtgg gcgttggcgt ggggacgact 3120
atcgccctcg ggcggctggc gacgctgccg gcggcgcaat atgccgaggg gtggatcgta 3180
ctgattgacg acgccgtcga tttccttgac gccgtgtggt ggctcaatga ggcgctcgac 3240
cgggggatca acgtggtggc ggcgatcctc aaaaaggacg acggcgtgct ggtgaacaac 3300
cgcctgcgta aaaccctgcc ggtggtagat gaagtgacgc tgctggagca ggtccccgag 3360
ggggtgatgg cggcggtgga agtggccgcg ccgggccagg tggtgcggat cctgtcgaat 3420
ccctacggga tcgccacctt cttcgggcta agcccggaag agacccaggc catcgtcccc 3480
atcgcccgcg ccctgattgg caaccgttca gcggtggtgc tcaagacccc gcagggggac 3540
gtgcagtcgc gggtgatccc ggcgggcaac ctctacatta gcggcgaaaa gcgccgcgga 3600
gaggccgatg tcgccgaggg cgcggaagcc atcatgcagg cgatgagcgc ctgcgctccg 3660
gtacgcgaca tccgcggcga accgggcact cacgccggcg gcatgcttga gcgggtgcgc 3720
aaggtaatgg cgtccctgac cggccatgag atgagcgcga tatacatcca ggatctgctg 3780
gcggtggata cgtttattcc gcgcaaggtg cagggcggga tggccggcga gtgcgccatg 3840
gagaatgccg tcgggatggc ggcgatggtg aaagcggacc gtctgcaaat gcaggttatc 3900
gcccgcgaac tgagcgcccg actgcagacc gaggtggtgg tgggcggcgt ggaggccaac 3960
atggccatcg ccggggcgtt aaccactccc ggctgtgcgg cgccgctggc gatcctcgat 4020
ctcggcgccg gctcgacgga tgcggcgatc gtcaacgcgg aggggcagat aacggcggtc 4080
catctcgccg gggcggggaa tatggtcagc ctgttgatta aaaccgagct gggtctcgag 4140
gatctttcgc tggcggaagc gataaaaaag tacccgctgg ccaaagtgga aagcctgttc 4200
agtattcgtc acgagaatgg cgcggtggag ttctttcggg aagccctcag cccggcggtg 4260
ttcgccaaag tggtgtacat caaggagggc gaactggtgc cgatcgataa cgccagcccg 4320
ctggaaaaaa ttcgtctcgt gcgccggcag gcgaaagaga aagtgtttgt caccaactgc 4380
ctgcgcgcgc tgcgccaggt ctcacccggc ggttccattc gcgatatcgc ctttgtggtg 4440
ctggtgggcg gctcatcgct ggactttgag atcccgcagc ttatcacgga agccttgtcg 4500
cactatggcg tggtcgccgg gcagggcaat attcggggaa cagaagggcc gcgcaatgcg 4560
gtcgccaccg ggctgctact ggccggtcag gcgaattaag tgttaacgag ggggccgtca 4620
tgtcgctttc accgccaggc gtacgcctgt tttacgatcc gcgcgggcac catgccggcg 4680
ccatcaatga gctgtgctgg gggctggagg agcagggggt cccctgccag accataacct 4740
atgacggagg cggtgacgcc gctgcgctgg gcgccctggc ggccagaagc tcgcccctgc 4800
gggtgggtat cgggctcagc gcgtccggcg agatagccct cactcatgcc cagctgccgg 4860
cggacgcgcc gctggctacc ggacacgtca ccgatagcga cgatcatctg cgtacgctcg 4920
gcgccaacgc cgggcagctg gttaaagtcc tgccgttaag tgagagaaac tgagtcgaca 4980
agcttgcggc cgcataatgc ttaagtcgaa cagaaagtaa tcgtattgta cacggccgca 5040
taatcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttccccatct 5100
tagtatatta gttaagtata agaaggagat atacatatgg cagatctcaa ttggatatcg 5160
gccggccacg cgatcgctga cgtcggtacc ctcgagtctg gtaaagaaac cgctgctgcg 5220
aaatttgaac gccagcacat ggactcgtct actagcgcag cttaattaac ctaggctgct 5280
gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt 5340
tttttgctga aacctcaggc atttgagaag cacacggtca cactgcttcc ggtagtcaat 5400
aaaccggtaa accagcaata gacataagcg gctatttaac gaccctgccc tgaaccgacg 5460
accgggtcat cgtggccgga tcttgcggcc cctcggcttg aacgaattgt tagacattat 5520
ttgccgacta ccttggtgat ctcgcctttc acgtagtgga caaattcttc caactgatct 5580
gcgcgcgagg ccaagcgatc ttcttcttgt ccaagataag cctgtctagc ttcaagtatg 5640
acgggctgat actgggccgg caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac atccttcggc 5700
gcgattttgc cggttactgc gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac tacatttcgc 5760
tcatcgccag cccagtcggg cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt tagcgcctca 5820
aatagatcct gttcaggaac cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc taccaaggca 5880
acgctatgtt ctcttgcttt tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat cgtggctggc 5940
tcgaagatac ctgcaagaat gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag ttcgcgctta 6000
gctggataac gccacggaat gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc tacagcgcgg 6060
agaatctcgc tctctccagg ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat caaagctcgc 6120
cgcgttgttt catcaagcct tacggtcacc gtaaccagca aatcaatatc actgtgtggc 6180
ttcaggccgc catccactgc ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt cggttcgaga 6240
tggcgctcga tgacgccaac tacctctgat agttgagtcg atacttcggc gatcaccgct 6300
tccctcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 6360
agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa tagctagctc actcggtcgc 6420
tacgctccgg gcgtgagact gcggcgggcg ctgcggacac atacaaagtt acccacagat 6480
tccgtggata agcaggggac taacatgtga ggcaaaacag cagggccgcg ccggtggcgt 6540
ttttccatag gctccgccct cctgccagag ttcacataaa cagacgcttt tccggtgcat 6600
ctgtgggagc cgtgaggctc aaccatgaat ctgacagtac gggcgaaacc cgacaggact 6660
taaagatccc caccgtttcc ggcgggtcgc tccctcttgc gctctcctgt tccgaccctg 6720
ccgtttaccg gatacctgtt ccgcctttct cccttacggg aagtgtggcg ctttctcata 6780
gctcacacac tggtatctcg gctcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtaagca 6840
agaactcccc gttcagcccg actgctgcgc cttatccggt aactgttcac ttgagtccaa 6900
cccggaaaag cacggtaaaa cgccactggc agcagccatt ggtaactggg agttcgcaga 6960
ggatttgttt agctaaacac gcggttgctc ttgaagtgtg cgccaaagtc cggctacact 7020
ggaaggacag atttggttgc tgtgctctgc gaaagccagt taccacggtt aagcagttcc 7080
ccaactgact taaccttcga tcaaaccacc tccccaggtg gttttttcgt ttacagggca 7140
aaagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctactgaacc 7200
gctctagatt tcagtgcaat ttatctcttc aaatgtagca cctgaagtca gccccatacg 7260
atataagttg taattctcat gttagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg 7320
ttgaaggctc tcaagggcat cggtcgagat cccggtgcct aatgagtgag ctaacttaca 7380
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 7440
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt 7500
tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag 7560
ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt 7620
taacggcggg atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatgtc 7680
cgcaccaacg cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc 7740
gttggcaacc agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg 7800
aaaaccggac atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg 7860
agtgagatat ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc 7920
cgctaacagc gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt 7980
accgtcttca tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa 8040
taacgccgga acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg 8100
atagttaatg atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca 8160
ggcttcgacg ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc 8220
gcgagattta atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc 8280
aacgccaatc agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta 8340
attcagctcc gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc 8400
ctggttcacc acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta 8460
taacgttact ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc 8520
cataccgcga aaggttttgc gccattcgat ggtgtccggg atctcgacgc tctcccttat 8580
gcgactcctg cattaggaaa ttaatacgac tcactata 8618
<210> 2
<211> 9178
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtaaga cgaaaagaag 60
gagattagaa atgtaccaag atctggcact gtatatcgac ggcgaattca ttaaaggcgg 120
tgatcgtcgt gagcaggatg tgattaaccc ggctacccag gaagtgctgg gcaaactgcc 180
gcacgcgtct cgcgcggacc tggaccgtgc cctggctgct gcgcagcgtg cttttgaaac 240
ttggaagaaa acctctcctc tggaacgtgc gcgtattctg cgtcgcgttg gtgaactgac 300
tcgtgaacgc gcaaaggaaa ttggtcgtaa catcacgctg gaccagggca aaccgctggc 360
ggaagctgtg ggcgaagtta tggtttgcgc tgagcacgcg gactggcacg ctgaagagtg 420
ccgtcgtatt tatggccgtg ttatccctcc acgccagcct aacgtacgcc agatcgttgt 480
tcgtgagccg attggtgttt gcgctgcttt cactccgtgg aactttccgt ttaaccaagc 540
gatccgtaaa attgtcagcg cactgggcgc tggttgtacg ctgattctga aaggcccgga 600
agactctcca tccgcggttg tggcactggc tcagctgttc catgatgcag gcctgccgcc 660
gggcgttctg aacatcgtgt ggggcgtacc gtctcaggtg tctacctacc tgatcgaatc 720
tccaatcgtt cgcaagatct ccttcaccgg tagcgtaccg gtgggcaaac agctggccgc 780
gctggcgggt gcacatatga aacgtgtaac catggagctg ggtggtcata gcccggtgct 840
ggtctttgat gatgccgata tcgatccggc tgcgcaaatg ctggcgcgtt tcaaactgcg 900
taacgcgggt caggtatgtg tgagcccgac ccgtttttat gtgcaggaaa aagcttacga 960
ccgtttcctg gcccgcttca ccgaagtgat tggcagcatc aaagttggta acggcctgga 1020
agacggtacg cagatgggcc cgctggcaca tgaacgtcgt gtcctgtcta tggagcagtt 1080
cctggatgat gcgagccagc gcggtggtaa agtggtagct ggtggttccc gtctgggcga 1140
caaaggttac ttcttcgcac cgactgttgt aactgatctg ccagacgaca gccgtctgat 1200
gactgatgaa ccgttcggtc cggtggctcc tgtgacccgt tttaaagaca ccgcggaagt 1260
tctgcgtcgt gcgaattctc tgccatttgg tctggcgtct tatgttttca ccaactctct 1320
gaaaactgcc accgaggtat ccaatggcct ggaagctggc atggtgaaca ttaaccactt 1380
tggcatggct ctggccgaaa ctcctttcgg tggcatcaag gatagcggta tcggctccga 1440
aggtggtcag gaaaccttcg acggttatct ggttaccaag ttcatcaccc aagcgtaaaa 1500
ccgatggaag ggaatatcat gcgaattggc ataccaagag aacggttaac caatgaaacc 1560
cgtgttgcag caacgccaaa aacagtggaa cagctgctga aactgggttt taccgtcgcg 1620
gtagagagcg gcgcgggtca actggcaagt tttgacgata aagcgtttgt gcaagcgggc 1680
gctgaaattg tagaagggaa tagcgtctgg cagtcagaga tcattctgaa ggtcaatgcg 1740
ccgttagatg atgaaattgc gttactgaat cctgggacaa cgctggtgag ttttatctgg 1800
cctgcgcaga atccggaatt aatgcaaaaa cttgcggaac gtaacgtgac cgtgatggcg 1860
atggactctg tgccgcgtat ctcacgcgca caatcgctgg acgcactaag ctcgatggcg 1920
aacatcgccg gttatcgcgc cattgttgaa gcggcacatg aatttgggcg cttctttacc 1980
gggcaaatta ctgcggccgg gaaagtgcca ccggcaaaag tgatggtgat tggtgcgggt 2040
gttgcaggtc tggccgccat tggcgcagca aacagtctcg gcgcgattgt gcgtgcattc 2100
gacacccgcc cggaagtgaa agaacaagtt caaagtatgg gcgcggaatt cctcgagctg 2160
gattttaaag aggaagctgg cagcggcgat ggctatgcca aagtgatgtc ggacgcgttc 2220
atcaaagcgg aaatggaact ctttgccgcc caggcaaaag aggtcgatat cattgtcacc 2280
accgcgctta ttccaggcaa accagcgccg aagctaatta cccgtgaaat ggttgactcc 2340
atgaaggcgg gcagtgtgat tgtcgacctg gcagcccaaa acggcggcaa ctgtgaatac 2400
accgtgccgg gtgaaatctt cactacggaa aatggtgtca aagtgattgg ttataccgat 2460
cttccgggcc gtctgccgac gcaatcctca cagctttacg gcacaaacct cgttaatctg 2520
ctgaaactgt tgtgcaaaga gaaagacggc aatatcactg ttgattttga tgatgtggtg 2580
attcgcggcg tgaccgtgat ccgtgcgggc gaaattacct ggccggcacc gccgattcag 2640
gtatcagctc agccgcaggc ggcacaaaaa gcggcaccgg aagtgaaaac tgaggaaaaa 2700
tgtacctgct caccgtggcg taaatacgcg ttgatggcgc tggcaatcat tctttttggc 2760
tggatggcaa gcgttgcgcc gaaagaattc cttgggcact tcaccgtttt cgcgctggcc 2820
tgcgttgtcg gttattacgt ggtgtggaat gtatcgcacg cgctgcatac accgttgatg 2880
tcggtcacca acgcgatttc agggattatt gttgtcggag cactgttgca gattggccag 2940
ggcggctggg ttagcttcct tagttttatc gcggtgctta tagccagcat taatattttc 3000
ggtggcttca ccgtgactca gcgcatgctg aaaatgttcc gcaaaaatta aggggtaaca 3060
tatgtctgga ggattagtta cagctgcata cattgttgcc gcgatcctgt ttatcttcag 3120
tctggccggt ctttcgaaac atgaaacgtc tcgccagggt aacaacttcg gtatcgccgg 3180
gatggcgatt gcgttaatcg caaccatttt tggaccggat acgggtaatg ttggctggat 3240
cttgctggcg atggtcattg gtggggcaat tggtatccgt ctggcgaaga aagttgaaat 3300
gaccgaaatg ccagaactgg tggcgatcct gcatagcttc gtgggtctgg cggcagtgct 3360
ggttggcttt aacagctatc tgcatcatga cgcgggaatg gcaccgattc tggtcaatat 3420
tcacctgacg gaagtgttcc tcggtatctt catcggggcg gtaacgttca cgggttcggt 3480
ggtggcgttc ggcaaactgt gtggcaagat ttcgtctaaa ccattgatgc tgccaaaccg 3540
tcacaaaatg aacctggcgg ctctggtcgt ttccttcctg ctgctgattg tatttgttcg 3600
cacggacagc gtcggcctgc aagtgctggc attgctgata atgaccgcaa ttgcgctggt 3660
attcggctgg catttagtcg cctccatcgg tggtgcagat atgccagtgg tggtgtcgat 3720
gctgaactcg tactccggct gggcggctgc ggctgcgggc tttatgctca gcaacgacct 3780
gctgattgtg accggtgcgc tggtcggttc ttcgggggct atcctttctt acattatgtg 3840
taaggcgatg aaccgttcct ttatcagcgt tattgcgggt ggtttcggca ccgacggctc 3900
ttctactggc gatgatcagg aagtgggtga gcaccgcgaa atcaccgcag aagagacagc 3960
ggaactgctg aaaaactccc attcagtgat cattactccg gggtacggca tggcagtcgc 4020
gcaggcgcaa tatcctgtcg ctgaaattac tgagaaattg cgcgctcgtg gtattaatgt 4080
gcgtttcggt atccacccgg tcgcggggcg tttgcctgga catatgaacg tattgctggc 4140
tgaagcaaaa gtaccgtatg acatcgtgct ggaaatggac gagatcaatg atgactttgc 4200
tgataccgat accgtactgg tgattggtgc taacgatacg gttaacccgg cggcgcagga 4260
tgatccgaag agtccgattg ctggtatgcc tgtgctggaa gtgtggaaag cgcagaacgt 4320
gattgtcttt aaacgttcga tgaacactgg ctatgctggt gtgcaaaacc cgctgttctt 4380
caaggaaaac acccacatgc tgtttggtga cgccaaagcc agcgtggatg caatcctgaa 4440
agctctgtaa gtcgacaagc ttgcggccgc ataatgctta agtcgaacag aaagtaatcg 4500
tattgtacac ggccgcataa tcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg 4560
ataacaattc cccatcttag tatattagtt aagtataaga aggagatata catatgaaca 4620
actttaatct gcacacccca acccgcattc tgtttggtaa aggcgcaatc gctggtttac 4680
gcgaacaaat tcctcacgat gctcgcgtat tgattaccta cggcggcggc agcgtgaaaa 4740
aaaccggcgt tctcgatcaa gttctggatg ccctgaaagg catggacgtg ctggaatttg 4800
gcggtattga gccaaacccg gcttatgaaa cgctgatgaa cgccgtgaaa ctggttcgcg 4860
aacagaaagt gactttcctg ctggcggttg gcggcggttc tgtactggac ggcaccaaat 4920
ttatcgccgc agcggctaac tatccggaaa atatcgatcc gtggcacatt ctgcaaacgg 4980
gcggtaaaga gattaaaagc gccatcccga tgggctgtgt gctgacgctg ccagcaaccg 5040
gttcagaatc caacgcaggc gcggtgatct cccgtaaaac cacaggcgac aagcaggcgt 5100
tccattctgc ccatgttcag ccggtatttg ccgtgctcga tccggtttat acctacaccc 5160
tgccgccgcg tcaggtggct aacggcgtag tggacgcctt tgtacacacc gtggaacagt 5220
atgttaccaa accggttgat gccaaaattc aggaccgttt cgcagaaggc attttgctga 5280
cgctaatcga agatggtccg aaagccctga aagagccaga aaactacgat gtgcgcgcca 5340
acgtcatgtg ggcggcgact caggcgctga acggtttgat tggcgctggc gtaccgcagg 5400
actgggcaac gcatatgctg ggccacgaac tgactgcgat gcacggtctg gatcacgcgc 5460
aaacactggc tatcgtcctg cctgcactgt ggaatgaaaa acgcgatacc aagcgcgcta 5520
agctgctgca atatgctgaa cgcgtctgga acatcactga aggttccgat gatgagcgta 5580
ttgacgccgc gattgccgca acccgcaatt tctttgagca attaggcgtg ccgacccacc 5640
tctccgacta cggtctggac ggcagctcca tcccggcttt gctgaaaaaa ctggaagagc 5700
acggcatgac ccaactgggc gaaaatcatg acattacgtt ggatgtcagc cgccgtatat 5760
acgaagccgc ccgctaatta acctaggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac 5820
cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaacctcag gcatttgaga 5880
agcacacggt cacactgctt ccggtagtca ataaaccggt aaaccagcaa tagacataag 5940
cggctattta acgaccctgc cctgaaccga cgacaagctg acgaccgggt ctccgcaagt 6000
ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 6060
aatatgtatc cgctcatgaa ttaattctta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg 6120
caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga 6180
aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat 6240
tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc 6300
aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gtttatgcat 6360
ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc 6420
aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc ggtcgctgtt 6480
aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc 6540
aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttcccggg 6600
gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg 6660
aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc 6720
aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg 6780
atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc 6840
agcatccatg ttggaattta atcgcggcct agagcaagac gtttcccgtt gaatatggct 6900
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 6960
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggc atgcagcgct cttccgcttc 7020
ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg cgagcggtgt cagctcactc 7080
aaaagcggta atacggttat ccacagaatc aggggataaa gccggaaaga acatgtgagc 7140
aaaaagcaaa gcaccggaag aagccaacgc cgcaggcgtt tttccatagg ctccgccccc 7200
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gccagaggtg gcgaaacccg acaggactat 7260
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 7320
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 7380
cacgctgttg gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 7440
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 7500
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccattgg taactgattt agaggacttt 7560
gtcttgaagt tatgcacctg ttaaggctaa actgaaagaa cagattttgg tgagtgcggt 7620
cctccaaccc acttaccttg gttcaaagag ttggtagctc agcgaacctt gagaaaacca 7680
ccgttggtag cggtggtttt tctttattta tgagatgatg aatcaatcgg tctatcaagt 7740
caacgaacag ctattccgtt actctagatt tcagtgcaat ttatctcttc aaatgtagca 7800
cctgaagtca gccccatacg atataagttg taattctcat gttagtcatg ccccgcgccc 7860
accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat cggtcgagat cccggtgcct 7920
aatgagtgag ctaacttaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 7980
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 8040
ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc 8100
accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga 8160
aaatcctgtt tgatggtggt taacggcggg atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg 8220
tatcccacta ccgagatgtc cgcaccaacg cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt 8280
gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc 8340
agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct 8400
atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc 8460
gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga 8520
tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc 8580
tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg 8640
gcatcctggt catccagcgg atagttaatg atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga 8700
ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg 8760
ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc 8820
agggccagac tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt 8880
gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt 8940
ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg 9000
gcatactctg cgacatcgta taacgttact ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc 9060
tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga aaggttttgc gccattcgat ggtgtccggg 9120
atctcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaaa ttaatacgac tcactata 9178
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtaacgcga tggtcaatat gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atattgacca tcgcgttacg actagtatta tacctaggac 40
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtggtggtg tttattgcc 19
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcacagctc cagttgaatc atttataaat ccctggaatt att 43
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aataattcca gggatttata aatgattcaa ctggagctgt g 41
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgaagagaaa accttttacc c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
attctacgcc tctgttcgtc t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttttacgcc caggtcaacc a 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcccgctgtt accattgcat 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgccagccag atcaacact 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcgtgaaac cactattgtc t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaagtacgg gtcaatcacc a 21
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctattaccc gtgattacac cct 23
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccggtagcac actctctttc gt 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tatgactacg ggacaattaa ac 22
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgactgaaa aaaaatatat cgttgcgctc gacca 35
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agattatacg ggacaacacg aa 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gttagctacg ggacaagggt tt 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
attctttacg ggacaaccat aa 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgtctaacg ggacaaagtt cc 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acggtttacg ggacaacgcg g 21
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
accgtctacg ggacaacgct gt 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccggtctacg ggacaacgct gt 22
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttcgctgta atatgactac gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtagtcatat tacagcgaag actagtatta tacctaggac 40
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgcagttgag atggtgatta ccg 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ttacagcgaa gctttttgtt c 21
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgactgaaa aaaaatatat cgttgcg 27
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atccacttca ctttggtgcc a 21
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttcgtgttgt cccgtataat ctttacagcg aagctttttg ttc 43
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aaacccttgt cccgtagcta acttacagcg aagctttttg ttc 43
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttatggttgt cccgtaaaga atttacagcg aagctttttg ttc 43
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggaactttgt cccgttagac gtttacagcg aagctttttg ttc 43
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccgcgttgtc ccgtaaaccg tttacagcga agctttttgt tc 42
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acagcgttgt cccgtagacg gtttacagcg aagctttttg ttc 43
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acagcgttgt cccgtagacc ggttacagcg aagctttttg ttc 43
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agattatacg ggacaacacg aaatgactga aaaaaaatat atcgttgcg 49
<210> 40
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gttagctacg ggacaagggt ttatgactga aaaaaaatat atcgttgcg 49
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
attctttacg ggacaaccat aaatgactga aaaaaaatat atcgttgcg 49
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acgtctaacg ggacaaagtt ccatgactga aaaaaaatat atcgttgcg 49
<210> 43
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acggtttacg ggacaacgcg gatgactgaa aaaaaatata tcgttgcg 48
<210> 44
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
accgtctacg ggacaacgct gtatgactga aaaaaaatat atcgttgcg 49
<210> 45
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccggtctacg ggacaacgct gtatgactga aaaaaaatat atcgttgcg 49

Claims (4)

1. 一种同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌敲除EC06 S7G中的甘油代谢转录抑制因子GlpR，并调控了甘油激酶GlpK基因的表达量；
所述EC06 S7G为在EC06工程菌中转入重组质粒pS0Y和pS7Z的基因工程菌；所述EC06工程菌通过将大肠杆菌E. coli W3110 (DE3)中SthA、LdhA、AdhE、PflB、PoxB和Pta-AckA敲除得到；
所述重组质粒pS0Y的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述重组质粒pS7Z的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；
通过强度降低的人工UTR序列替换EC07 S7G基因组的GlpK基因的原始UTR序列，得到GlpK表达量削弱的基因工程菌；所述人工UTR序列为glpK-U3：ATTCTTTACGGGACAACCATAA（SEQ ID No:21）。
2.权利要求1所述的同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：
（1）GlpR敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇联产工程菌的构建：
使用CRIPSR CAS9工具质粒敲除EC06工程菌中的甘油转录抑制因子GlpR，命名为EC07；
将重组质粒pS0Y和重组质粒pS7Z转化至EC07中，得到GlpR敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇联产工程菌，记为EC07 S7G；
（2）联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建：
使用UTR工程技术，设计表达强度降低的人工UTR序列替换EC07 S7G基因组的GlpK基因的原始UTR序列，得到GlpK表达量削弱的基因工程菌，即联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌；所述人工UTR序列为glpK-U3：ATTCTTTACGGGACAACCATAA（SEQ ID No:21）。
3.权利要求1所述的基因工程菌在联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为发酵甘油高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
CN202210191491.7A 2022-02-28 2022-02-28 一种同时生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用 Active CN114806983B (zh)

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