CN114806906A

CN114806906A - 一株产中性乳糖酶的乳酸克鲁维酵母

Info

Publication number: CN114806906A
Application number: CN202210609797.XA
Authority: CN
Inventors: 张国强; 李江华; 沈秀茹; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-05-31
Also published as: CN114806906B

Abstract

本发明公开了一株产中性乳糖酶的乳酸克鲁维酵母，属于生物工程技术和酶工程领域。本发明提供的乳酸克鲁维酵母JNXR‑2101已于2021年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211628。该菌株胞外中性乳糖酶酶活可达10.22U/mL，摇瓶发酵优化后胞内酶活可达83.36U/mL，5L发酵罐中分批补料优化后，其总酶活可达220‑250U/mL。本发明的乳酸克鲁维酵母JNXR‑2101所产的乳糖酶符合国家食品安全标准和食品添加剂标准，安全性较高。

Description

一株产中性乳糖酶的乳酸克鲁维酵母

技术领域

本发明涉及一株产中性乳糖酶的乳酸克鲁维酵母，属于生物工程技术和酶工程领域。

背景技术

乳糖酶或β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal，EC.3.2.1.23)是一种重要的糖苷水解酶，可以水解乳糖分子中的β-半乳糖苷键生成半乳糖和葡萄糖，也可通过转苷作用生成功能性低聚半乳糖(GOS)。主要应用于乳制品工业生产低乳糖乳制品。乳糖酶可以增加鲜奶的甜度，改善其品质和口感，既能解决“乳糖不耐”，又能提供高质量的蛋白质和能量，具有巨大的市场潜力和发展前景。

乳糖不耐受是由于乳糖酶分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻，又称乳糖酶缺乏症。哺乳动物的乳糖酶活性随年龄增长具有典型的生理性降低，乳糖酶缺乏已成为广泛存在的一个世界性问题。微生物来源的乳糖酶种类丰富、产量高、生产成本低、周期短，具有较好的工业应用价值。微生物来源的乳糖酶主要分布于细菌、霉菌、酵母及放线菌中，而不同微生物来源的乳糖酶的性质差异较大。商业应用中一般认为酵母(如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母)、黑曲霉和米曲霉最为安全。

乳糖酶根据不同来源可分为胞内酶或胞外酶，胞外酶的生产能有效减少下游分离提取工艺，降低生产成本。根据不同乳糖酶的最适反应pH能将他们应用于不同的加工条件。例如，霉菌来源的乳糖酶最适反应pH偏酸性，主要应用于酸性乳清和干酪的水解(含大量乳糖)，酵母和细菌所产乳糖酶最适pH近中性，可用于牛乳(pH 6.6)和鲜乳清(pH 6.1)的水解。微生物乳糖酶最适作用温度范围较宽，酵母乳糖酶最适反应温度在35℃左右，而霉菌最适反应温度在50℃～60℃。

虽然乳糖酶在乳制品行业中已有多年的应用历史，但我国乳糖酶研究起步较晚，乳糖酶产量偏低，应用成本较高，核心菌种与技术都掌握在国外酶制剂公司，这严重制约了乳糖酶在我国的推广与应用。乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)是一种能够以乳糖为唯一碳源生长的酵母，大多数乳酸克鲁维酵母都分离自碳源为乳糖的牛奶制品中，是一个食品安全级别较高的菌株，在食品酶和药用蛋白表达上应用广泛。但其所产乳糖酶多为胞内酶，需要破碎细胞才能得到，下游提取工艺复杂且成本较高。因此，以乳糖酶低成本的生产应用为目标，本发明提供一株产胞外乳糖酶的乳酸克鲁维酵母，对于进一步推广乳糖酶的生产应用具有重要价值。

发明内容

针对目前市场多为酸性乳糖酶，且野生型乳酸克鲁维酵母所产中性乳糖酶为胞内酶、产量较低、工业应用成本较高等问题，本发明通过高通量筛选方法获得一株高产乳糖酶的乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)JNXR-2101，并将其应用于中性乳糖酶的生产。

本发明提供了一种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)JNXR-2101，已于2021年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211628。

在一种实施方式中，本发明筛选得到的乳酸克鲁维酵母菌株JNXR-2101，其筛选步骤如下：

(1)通过荧光底物4-甲基伞型基-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)构建的高通量筛选方法，从土壤样品中分离获得具有乳糖酶活性的菌株，经ITS DNA序列分析，确定其为乳酸克鲁维酵母；

(2)将分离获得的乳酸克鲁维酵母菌株接种到液体YPD培养基中活化，然后转接到液体YPL培养基中发酵60h；

(3)离心收集发酵上清液和细胞，细胞重悬后使用高压匀浆仪破碎，离心收集上清液；

(4)将发酵上清和胞内粗酶液分别稀释一定的倍数，使用2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)测定乳糖酶的活性；筛选得到能够在胞外分泌且表达乳糖酶酶活较高的菌株，命名为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)JNXR-2101。

本发明还提供了含有所述乳酸克鲁维酵母JNXR-2101的微生物制剂。

本发明还提供了所述乳酸克鲁维酵母JNXR-2101或所述微生物制剂在发酵生产中性乳糖酶中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述乳酸克鲁维酵母JNXR-2101在培养基中培养一段时间，收集发酵液和/或细胞内的中性乳糖酶。

本发明还提供了所述乳酸克鲁维酵母JNXR-2101来源的中性乳糖酶，具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列；该酶的最适温度为40-45℃，最适pH为9.0，确定其为中性乳糖酶且在pH 6.5～8.0之间均能保持90％以上的酶活。

本发明还提供了一种提高所述菌株产中性乳糖酶的方法，是以乳糖为碳源，以蛋白胨和酵母粉为氮源进行发酵。

在一种实施方式中，所述培养基中乳糖的含量为20～60g/L。

在一种实施方式中，所述氮源为质量比为1:2的酵母粉和蛋白胨。

在一种实施方式中，所述培养基中氮源的含量为30～80g/L。

在一种实施方式中，所述培养基中还含有无机盐，包括但不限于MgS0₄、ZnS0₄、FeS0₄和MnS0₄中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述培养基含有：乳糖浓度40g/L，玉米浆40g/L、质量比为1:2的酵母粉和蛋白胨共50g/L、硫酸锰0.3g/L、硫酸镁0.5g/L。

在一种实施方式中，所述发酵是在25～30℃发酵至少60h。

在一种实施方式中，所述发酵过程中还补料乳糖。

在一种实施方式中，所述补料是自发酵第20h以5g/(L·h)速度补加乳糖。

有益效果：(1)本发明的乳酸克鲁维酵母为野生型乳酸克鲁维酵母，其所生产的JNXR-2101乳糖酶符合国家食品安全标准和食品添加剂标准，安全性较高；(2)本发明的乳酸克鲁维酵母JNXR-2101能够胞外分泌乳糖酶，对于开发具有自主知识产权的中性乳糖酶食品安全菌、降低工业化应用成本具有重要应用前景；(3)本发明还提供了提高乳酸克鲁维酵母中性乳糖酶产量的方法，是将所述乳酸克鲁维酵母在摇瓶优化培养条件后其胞外酶活可达10.22U/mL，胞内酶活为83.36U/mL。在5L罐发酵优化后，在pH 5.5-6.5范围内，乳酸克鲁维酵母JNXR-2101的乳糖酶总酶活(胞内+胞外)可达200-250U/mL。

生物材料保藏

乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)JNXR-2101，分类命名为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)JNXR-2101，已于2021年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211628，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

附图说明

图1为基于荧光底物MUGal的乳糖酶筛选方法构建与应用；

图2为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101乳糖酶粗酶液蛋白胶图及粗酶液胞内外酶活；A：粗酶液蛋白胶图，B：粗酶液胞内外酶活；

图3为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101乳糖酶最适温度及温度稳定性曲线；A：最适温度曲线，B：温度稳定性曲线；

图4为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101乳糖酶最适pH及pH稳定性曲线；A：最适pH曲线，B：pH稳定性曲线；

图5为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101碳源优化；

图6为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101氮源优化；

图7为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101无机盐离子优化；

图8为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101生长因子优化；

图9为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101培养基正交优化；

图10为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101摇瓶发酵条件优化；

图11为乳酸克鲁维酵母JNXR-2101 5L罐发酵条件优化。

具体实施方式

培养基：

YPD固体培养基：胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L、20g/L琼脂。

YPL培养基：胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、乳糖20g/L。

优化后发酵培养基成分：乳糖浓度40g/L，玉米浆40g/L、氮源50g/L、硫酸锰0.3g/L、硫酸镁0.5g/L

本发明通过检测乳酸克鲁维酵母的乳糖酶胞内外酶活筛选出一株能够胞外表达乳糖酶的菌株JNXR-2101，测定其酶学性质并对其进行发酵优化。下面对本发明作进一步的详细描述：

乳糖酶活性检测：

取0.3mL待测酶液，加入1.5mL ONPG(2.5g/L)溶液，30℃水浴10min后加入0.6mLNa₂CO₃(50g/L)溶液，在420nm处测定吸光度值。粗酶液需稀释一定梯度使吸光值在标曲范围(0～0.5U/mL)内。

实施例1：野生型乳酸克鲁维酵母菌株的筛选

(1)产乳糖酶菌株高通量筛选方法构建：

根据荧光底物的经济成本和反应后荧光敏感度选择乳糖酶底物4-甲基伞型基-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)，通过以下实验验证了荧光底物MUGal对于乳糖酶高产K.lactis筛选的适用性：(1)荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(MUGal)能够转运进K.lactis胞内，被乳糖酶降解生成具有荧光的4-甲基伞形酮(4-MU)；(2)乳糖酶与荧光底物MUGal在30℃反应一段时间，在0～23U/mL范围内，荧光与酶活具有线性关系；0～50U/mL范围内，荧光与酶活具有相关关系；(3)将K.lactis接种到含有MUGal的乳糖培养基中，检测胞内荧光与酶活，结果显示，0～48h内乳糖酶酶活与4-MU荧光具有线性相关关系。

根据荧光底物MUGal可以转运进K.lactis，4-MU的荧光与酶活具有相关关系，因此可用4-MU荧光反映K.lactis胞内酶活，因此可使用其进行高通量筛选高乳糖酶活性菌株。

(2)产乳糖酶菌株高通量筛选：

取10g土壤样品加入100mL无菌生理盐水中，加入无菌玻璃珠，置于30℃摇床、220rpm/min恒温培养1h，制成均匀的土壤悬液。取土壤悬液1mL进行梯度稀释，取不同稀释梯度的悬液100μL涂布于YPD固体平板上(含终浓度35mg/L X-Gal和20mg/L IPTG)，每个梯度3个平行。将平板置于30℃恒温培养箱培养3d。

观察菌落形态，挑取具有蓝色水解圈的单菌落至装有200μL培养基的96浅孔板中培养24h，后转接50μL至装有750μL培养基的96深孔板中，培养24h后取样检测荧光。使用高通量筛选方法初步筛选到荧光较高的菌株，经ITS测序确定其中一株为乳酸克鲁维酵母，将其命名为乳酸克鲁维酵母(K.lactis)JNXR-2101。

(4)乳酸克鲁维酵母乳糖酶粗酶液制备：

挑取平板上K.lactis JNXR-2101的单菌落接种到50mL液体YPL培养基中，30℃、220rpm培养24h，获得OD₆₀₀为3.2的种子液；将种子液以2％比例转接到液体YPL培养基中，30℃、220rpm培养60h。得到的发酵液4500rpm离心10min，分离上清得到胞外粗酶液；菌体使用PBS缓冲液(pH＝7.5)重悬，后使用高压匀浆仪进行破碎，破壁程序为1000bar、4个循环，使用高速离心机12000rpm离心10min，收集上清液即为胞内粗酶液。

用乳糖酶胞外粗酶液和胞内粗酶液进行SDS-PAGE凝胶电泳实验，并测定其胞内外酶活，结果如图2所示，乳酸克鲁维酵母JNXR-2101具有乳糖酶胞外活性，胞外酶活为3.77U/mL，胞内酶活为14.29U/mL。

实施例2：乳糖酶的鉴定及酶学性质表征

1.1酶的氨基酸序列

将实施例1筛选的乳酸克鲁维酵母JNXR-2101提取基因组，测序分析，结果显示乳酸克鲁维酵母JNXR-2101生产的中性乳糖酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

1.2酶的比酶活测定

将按照实施例1的方法制备的乳酸克鲁维酵母JNXR-2101的粗酶液使用磷酸缓冲液稀(pH 6.5)稀释一定梯度，在30℃反应10min测定其酶活为28.89U/mL，并使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定粗酶液的蛋白浓度为8.33mg/mL，经换算，JNXR-2101的乳糖酶比酶活为3.47U/mg。

1.3乳酸克鲁维酵母JNXR-2101乳糖酶最适温度曲线：

将按照实施例1的方法制备的乳酸克鲁维酵母JNXR-2101的粗酶液使用磷酸缓冲液(pH6.5)稀释一定梯度，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃条件下测定酶活，以最适温度45℃测定的酶活为100％计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。如图3A所示，乳酸克鲁维酵母JNXR-2101所产乳糖酶在30～50℃之间的相对酶活可达60％以上，在55℃以上时相对酶活低于20％。

1.4乳酸克鲁维酵母JNXR-2101乳糖酶热稳定性曲线:

按照实施例1的方法制备的乳酸克鲁维酵母JNXR-2101粗酶液使用磷酸缓冲液(pH6.5)稀释一定梯度，在45℃条件下保温，取样测定残余酶活，以0h最高酶活为100％计算相对酶活，做时间-相对酶活曲线。如图3B所示，乳酸克鲁维酵母JNXR-2101所产乳糖酶的温度稳定性较好，45℃处理60min仍剩余62.6％残余酶活。

1.5乳酸克鲁维酵母JNXR-2101乳糖酶最适pH曲线：

将按照实施例1的方法制备的乳酸克鲁维酵母JNXR-2101粗酶液分别用pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的缓冲液稀释一定梯度，在30℃条件下测定酶活，以pH 9.0条件下测定的酶活为100％计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。缓冲液pH 4.0-6.0为0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液，缓冲液pH 6.0-8.0为0.2M磷酸缓冲液，pH 8.0-11.0为0.2M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。如图4A所示，乳酸克鲁维酵母JNXR-2101所产乳糖酶在pH 5.5～10.0之间的相对酶活可维持在50％以上，pH低于5.0时乳糖酶几乎完全失活。

1.6乳酸克鲁维酵母JNXR-2101乳糖酶pH稳定性曲线：

将按照实施例1的方法制备的乳酸克鲁维酵母JNXR-2101粗酶液分别用pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液稀释一定梯度，室温下孵育1h后在30℃条件下测定酶活，以pH 6.5条件下测定的酶活为100％计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。缓冲液pH 4.0-6.0为0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液，缓冲液pH 6.0-8.0为0.1M磷酸缓冲液，pH8.0-10.0为0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。如图4B所示，乳酸克鲁维酵母JNXR-2101所产乳糖酶的pH稳定性较好，在pH 6.5～8.0范围内相对酶活保持在60％以上，酶活性无显著降低，并由此可确定其为中性乳糖酶。

实施例3：乳酸克鲁维酵母JNXR-2101利用不同碳源产酶

碳源为微生物发酵提供所需的能量和细胞分裂的碳骨架，是细胞生长的基本营养成分之一，碳源的种类和浓度对于胞外酶的产量有较大影响。选取葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘油及可溶性淀粉作为唯一碳源，碳源浓度均为20g/L，其余成分与YPL培养基的成分及含量相同(即胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L)，自然pH值，按照实施例1的方法制备种子液，以2％接种量接种种子液，在30℃、220rpm条件下发酵60h，检测发酵液的胞内外乳糖酶活性。将确定的最佳碳源分别以10、20、30、40、50、60g/L的终浓度加入培养基，其余成分与YPL培养基的成分及含量相同，自然pH值，以2％接种量接种种子液，在30℃、220rpm条件下发酵60h，检测发酵液的胞内外乳糖酶活性。实验结果如图5，柱形图浅色部分表示胞内酶活，深色部分表示胞外酶活，JNXR-2101以乳糖为碳源时，总酶活可达13.80U/mL，在乳糖浓度为30g/L时总酶活为38.28U/mL。当乳糖浓度为20g/L时，胞外酶活可达10.22U/mL。

实施例4：乳酸克鲁维酵母JNXR-2101利用不同氮源产酶

氮源是构成生物体蛋白质、核酸的重要元素，微生物大部分对有机氮源利用较好，对无机氮源利用较差。选取有机氮源酵母提取物及胰蛋白胨(质量比1：2)、酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏，无机氮源尿素、乙酸铵分别为唯一氮源，碳源为20g/L乳糖，氮源浓度均为30g/L，自然pH值；按照实施例1的方法制备种子液，以2％接种量接种种子液，在30℃、220rpm条件下发酵60h，检测发酵液的胞内、胞外乳糖酶活性。将确定的最佳氮源分别以10、20、30、40、50、60、70、80g/L的浓度发酵，碳源为20g/L乳糖，自然pH值，以2％接种量接种种子液，在30℃、220rpm条件下发酵60h，检测发酵液的胞内外乳糖酶活性，从而确定最佳氮源浓度。实验结果如图6所示，氮源为组合氮源酵母粉与蛋白胨(质量比1:2)时乳糖酶的总活性可达13.80U/mL，最佳氮源酵母粉+蛋白胨(质量比1：2)浓度为40g/L时胞外酶活可达9.63U/mL，最佳氮源酵母粉+蛋白胨(质量比1：2)浓度为70g/L时总酶活为32.88U/mL。

实施例5：乳酸克鲁维酵母JNXR-2101利用不同无机盐离子及生长因子产酶

以优化过的碳源和氮源的发酵培养基为基础，分别添加无机盐MgS0₄、ZnS0₄、FeS0₄和MnS0₄进行发酵培养。MgS0₄、ZnS0₄使用1.0g/L的无机盐浓度梯度，FeS0₄和MnS0₄使用0.1g/L无机盐浓度梯度。如图7所示，无机盐离子ZnSO₄、FeSO₄不利于乳糖酶的积累；分别添加MgSO₄(1.0g/L)、MnSO₄(0.2g/L)有利于菌株JNXR-2101产酶。

以优化过的碳源和氮源的发酵培养基为基础，按照10、20、30、40、50、60、70g/L的浓度添加富含微量元素的复合氮源玉米浆进行发酵培养。按照实施例1的方法制备种子液，以2％接种量接种种子液，在30℃、220rpm条件下发酵60h，结果如图8所示，在培养基中添加20g/L玉米浆，其所提供的微量元素和复合氮源，对于乳酸克鲁维酵母JNXR-2101菌株的生长及产酶是有利的，总酶活可达到37.95U/mL。

实施例6：促进乳酸克鲁维酵母JNXR-2101产酶的培养基设计

依据培养基单因素优化实验结果，以30g/L乳糖为碳源、以40g/L质量比为1：2的酵母粉和蛋白胨为组合氮源、以及20g/L复合氮源玉米浆，微量元素(硫酸锰0.2g/L、硫酸镁1.0g/L)为优化培养基成分。

依据培养基单因素优化实验结果，针对碳源乳糖、组合氮源(酵母粉：蛋白胨＝1：2)、生长因子玉米浆以及微量元素硫酸锰硫酸镁的不同浓度梯度对于乳酸克鲁维酵母JNXR-2101产乳糖酶协同作用的影响，设计培养基正交优化实验(L16_4_5)。设置乳糖(A)浓度梯度为20、30、40、50g/L，组合氮源(B)浓度梯度为40、50、60、70g/L，玉米浆(C)浓度梯度为10、20、30、40g/L，硫酸镁(D)浓度梯度为0.1、0.5、1.0、2.0g/L，硫酸锰(E)浓度梯度为0.1、0.2、0.3、0.4g/L，以2％接种量接种种子液(按实施例1的方法制备)，在30℃、220rpm条件下发酵60h，检测发酵液的胞内外乳糖酶活性。对正交实验结果进行数据处理和主体间效应检验(如图9)：乳糖对乳酸克鲁维酵母JNXR-2101的乳糖酶酶活影响显著，影响主次为乳糖、玉米浆、硫酸镁、氮源、硫酸锰；培养基中乳糖浓度30-40g/L，玉米浆30-40g/L，质量比为1：2的酵母粉和蛋白胨40-50g/L，硫酸锰0.1-0.3g/L，硫酸镁0.5-1.0g/L的条件下，乳糖酶的酶活可达40U/mL以上；培养基成分为乳糖浓度40g/L，玉米浆40g/L、氮源(质量比1:2的酵母粉和蛋白胨)50g/L、硫酸锰0.3g/L、硫酸镁0.5g/L时，总酶活可达50.27U/mL。

实施例7：乳酸克鲁维酵母JNXR-2101摇瓶发酵条件优化

温度、pH等发酵条件对于菌株的生长和产酶有较大的影响。参考文献选择初始pH、温度、装液量三个主要影响因素，分别控制发酵培养基的初始pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、温度为20、25、28、30、33、37℃、装液量为20、30、40、50、60、70mL，使用优化培养基以2％接种量接种按实施例1的方法制备的种子液，于220rpm发酵60h，检测乳糖酶酶活。优化培养基按终浓度计含有：乳糖浓度40g/L，玉米浆40g/L、氮源50g/L、硫酸锰0.3g/L、硫酸镁0.5g/L。

发酵结束后，取样检测发酵液的乳糖酶活性。发酵条件单因素优化结果如图10所示，初始pH 5.0与对照培养基初始pH酶活相似，因此确定乳酸克鲁维酵母JNXR-2101的发酵条件为初始pH 4.75、发酵温度30℃、优化培养基的装液量为20mL，在上述条件下发酵60h乳糖酶总酶活可达85.36U/mL。

实施例8：乳酸克鲁维酵母JNXR-2101 5L罐发酵条件优化

使用实施例7获得的优化培养基在5L发酵罐中进行分批补料发酵。发酵条件为：在30℃、转速400rpm、通气量2vvm、种子液(OD₆₀₀为3.2)接种量2％，从20h以5g/(L·h)速度补加400g/L乳糖，如图11所示，发酵40h乳糖酶总酶活即达到152.5U/mL，发酵70h总酶活可达到209.8U/mL。调整pH范围为5.5-6.5，5L罐乳糖酶总酶活可达220-250U/mL。

对比例：

现有的文献报道的克鲁维酵母属的微生物产酶能力列表如表1所示。

表1不同克鲁维酵母产乳糖酶能力

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株产中性乳糖酶的乳酸克鲁维酵母

<130> BAA220281A

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1025

<212> PRT

<213> Kluyveromyces lactis

<400> 1

Met Ser Cys Leu Ile Pro Glu Asn Leu Arg Asn Pro Lys Lys Val His

1 5 10 15

Glu Asn Arg Leu Pro Thr Arg Ala Tyr Tyr Tyr Asp Gln Asp Ile Phe

20 25 30

Glu Ser Leu Asn Gly Pro Trp Ala Phe Ala Leu Phe Asp Ala Pro Leu

35 40 45

Asp Ala Pro Asp Ala Lys Asn Leu Asp Trp Glu Thr Ala Lys Lys Trp

50 55 60

Ser Thr Ile Ser Val Pro Ser His Trp Glu Leu Gln Glu Asp Trp Lys

65 70 75 80

Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Thr Asn Val Gln Tyr Pro Ile Pro Ile Asp

85 90 95

Ile Pro Asn Pro Pro Thr Val Asn Pro Thr Gly Val Tyr Ala Arg Thr

100 105 110

Phe Glu Leu Asp Ser Lys Ser Ile Glu Ser Phe Glu His Arg Leu Arg

115 120 125

Phe Glu Gly Val Asp Asn Cys Tyr Glu Leu Tyr Val Asn Gly Gln Tyr

130 135 140

Val Gly Phe Asn Lys Gly Ser Arg Asn Gly Ala Glu Phe Asp Ile Gln

145 150 155 160

Lys Tyr Val Ser Glu Gly Glu Asn Leu Val Val Val Lys Val Phe Lys

165 170 175

Trp Ser Asp Ser Thr Tyr Ile Glu Asp Gln Asp Gln Trp Trp Leu Ser

180 185 190

Gly Ile Tyr Arg Asp Val Ser Leu Leu Lys Leu Pro Lys Lys Ala His

195 200 205

Ile Glu Asp Val Arg Val Thr Thr Thr Phe Val Asp Ser Gln Tyr Gln

210 215 220

Asp Ala Glu Leu Ser Val Lys Val Asp Val Gln Gly Ser Ser Tyr Asp

225 230 235 240

His Ile Asn Phe Thr Leu Tyr Glu Pro Glu Asp Gly Ser Lys Val Tyr

245 250 255

Asp Ala Ser Ser Leu Leu Asn Glu Glu Asn Gly Asn Thr Thr Phe Ser

260 265 270

Thr Lys Glu Phe Ile Ser Phe Ser Thr Lys Lys Asn Glu Glu Thr Ala

275 280 285

Phe Lys Ile Asn Val Lys Ala Pro Glu His Trp Thr Ala Glu Asn Pro

290 295 300

Thr Leu Tyr Lys Tyr Gln Leu Asp Leu Ile Gly Ser Asp Gly Ser Val

305 310 315 320

Ile Gln Ser Ile Lys His His Val Gly Phe Arg Gln Val Glu Leu Lys

325 330 335

Asp Gly Asn Ile Thr Val Asn Gly Lys Asp Ile Leu Phe Arg Gly Val

340 345 350

Asn Arg His Asp His His Pro Arg Phe Gly Arg Ala Val Pro Leu Asp

355 360 365

Phe Val Val Arg Asp Leu Ile Leu Met Lys Lys Phe Asn Ile Asn Ala

370 375 380

Val Arg Asn Ser His Tyr Pro Asn His Pro Lys Val Tyr Asp Leu Phe

385 390 395 400

Asp Lys Val Gly Phe Trp Val Ile Asp Glu Ala Asp Leu Glu Thr His

405 410 415

Gly Val Gln Glu Pro Phe Asn Arg His Thr Asn Leu Glu Ala Glu Tyr

420 425 430

Pro Asp Thr Lys Asn Lys Leu Tyr Asp Val Asn Ala His Tyr Leu Ser

435 440 445

Asp Asn Pro Glu Tyr Glu Val Ala Tyr Leu Asp Arg Ala Ser Gln Leu

450 455 460

Val Leu Arg Asp Val Asn His Pro Ser Ile Ile Ile Trp Ser Leu Gly

465 470 475 480

Asn Glu Ala Cys Tyr Gly Arg Asn His Lys Ala Met Tyr Lys Leu Ile

485 490 495

Lys Gln Leu Asp Pro Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Asp Leu Asn

500 505 510

Ala Leu Ser Ala Asp Ile Phe Ser Phe Met Tyr Pro Thr Phe Glu Ile

515 520 525

Met Glu Arg Trp Arg Lys Asn His Thr Asp Glu Asn Gly Lys Phe Glu

530 535 540

Lys Pro Leu Ile Leu Cys Glu Tyr Gly His Ala Met Gly Asn Gly Pro

545 550 555 560

Gly Ser Leu Lys Glu Tyr Gln Glu Leu Phe Tyr Lys Glu Lys Phe Tyr

565 570 575

Gln Gly Gly Phe Ile Trp Glu Trp Ala Asn His Gly Ile Glu Phe Glu

580 585 590

Asp Val Ser Thr Ala Asp Gly Lys Leu His Lys Ala Tyr Ala Tyr Gly

595 600 605

Gly Asp Phe Lys Glu Glu Val His Asp Gly Val Phe Ile Met Asp Gly

610 615 620

Leu Cys Asn Ser Glu His Asn Pro Thr Pro Gly Leu Val Glu Tyr Lys

625 630 635 640

Lys Val Ile Glu Pro Val His Ile Lys Ile Ala His Gly Ser Val Thr

645 650 655

Ile Thr Asn Lys His Asp Phe Ile Thr Thr Asp His Leu Leu Phe Ile

660 665 670

Asp Lys Asp Thr Gly Lys Thr Ile Asp Val Pro Ser Leu Lys Pro Glu

675 680 685

Glu Ser Val Thr Ile Pro Ser Asp Thr Thr Tyr Val Val Ala Val Leu

690 695 700

Lys Asp Asp Ala Gly Val Leu Lys Ala Gly His Glu Ile Ala Trp Gly

705 710 715 720

Gln Ala Glu Leu Pro Leu Lys Val Pro Asp Phe Val Thr Glu Thr Ala

725 730 735

Glu Lys Ala Ala Lys Ile Asn Asp Gly Lys Arg Tyr Val Ser Val Glu

740 745 750

Ser Ser Gly Leu His Phe Ile Leu Asp Lys Leu Leu Gly Lys Ile Glu

755 760 765

Ser Leu Lys Val Lys Gly Lys Glu Ile Ser Ser Lys Phe Glu Gly Ser

770 775 780

Ser Ile Thr Phe Trp Arg Pro Pro Thr Asn Asn Asp Glu Pro Arg Asp

785 790 795 800

Phe Lys Asn Trp Lys Lys Tyr Asn Ile Asp Leu Met Lys Gln Asn Ile

805 810 815

His Gly Val Ser Val Glu Lys Gly Ser Asn Gly Ser Leu Ala Val Val

820 825 830

Thr Val Asn Ser Arg Ile Ser Pro Val Val Phe Tyr Tyr Gly Phe Glu

835 840 845

Thr Val Gln Lys Tyr Thr Ile Phe Ala Asn Lys Ile Asn Leu Asn Thr

850 855 860

Ser Met Lys Leu Thr Gly Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Phe Pro Ser Val

865 870 875 880

Gly Tyr Glu Phe Trp Leu Gly Asp Ser Tyr Glu Ser Phe Glu Trp Leu

885 890 895

Gly Arg Gly Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Glu Ser Gln Arg

900 905 910

Phe Gly Leu Tyr Asp Ser Lys Asp Val Glu Glu Phe Val Tyr Asp Tyr

915 920 925

Pro Gln Glu Asn Gly Asn His Thr Asp Thr His Phe Leu Asn Ile Lys

930 935 940

Phe Glu Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Phe Gln Lys Glu Lys Pro Phe

945 950 955 960

Asn Phe Lys Ile Ser Asp Glu Tyr Gly Val Asp Glu Ala Ala His Ala

965 970 975

Cys Asp Val Lys Arg Tyr Gly Arg His Tyr Leu Arg Leu Asp His Ala

980 985 990

Ile His Gly Val Gly Ser Glu Ala Cys Gly Pro Ala Val Leu Asp Gln

995 1000 1005

Tyr Arg Leu Lys Ala Gln Asp Phe Asn Phe Glu Phe Asp Leu Ala

1010 1015 1020

Phe Glu

1025

Claims

1.一种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)JNXR-2101，已于2021年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211628。

2.含有权利要求1所述乳酸克鲁维酵母JNXR-2101的微生物制剂。

3.权利要求1所述乳酸克鲁维酵母JNXR-2101或权利要求2所述的微生物制剂在发酵生产中性乳糖酶中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述乳酸克鲁维酵母JNXR-2101在培养基中培养一段时间，收集发酵液和/或细胞内的中性乳糖酶。

5.一种提高权利要求1所述乳酸克鲁维酵母JNXR-2101中性乳糖酶产量的方法，其特征在于，以乳糖为碳源，以蛋白胨和酵母粉为氮源进行发酵。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基中还含有无机盐；所述无机盐包括但不限于MgS0₄、ZnS0₄、FeS0₄和MnS0₄中的一种或多种。

7.一种发酵生产中性乳糖酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的乳酸克鲁维酵母JNXR-2101在28～30℃发酵至少60h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵过程还补料乳糖。

9.用于乳酸克鲁维酵母发酵生产中性乳糖酶的培养基，其特征在于，含有乳糖浓度30～40g/L，玉米浆30～40g/L、质量比为1:2的酵母粉和蛋白胨共40～50g/L、硫酸锰0.1～0.3g/L、硫酸镁0.5～1.0g/L。

10.权利要求1所述乳酸克鲁维酵母JNXR-2101生产的中性乳糖酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。