CN114793902B - 一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法。属于杂交育种技术领域。培育方法如下：将预处理的柑橘杂交种子，放置在添加有激素和无机营养元素的琼脂培养基表面，盖上盖子或者保鲜膜，置于25‑28℃温室中避光培养，待种胚长至15‑20mm时，得到经培育的柑橘杂交种子。本发明柑橘杂交种子嫁接苗培育方法，方便观察胚根长度，对培养基基质和添加物做了改进，使本发明培育的嫁接苗胚根粗壮且直，无需断根处理，不伤胚根，提高种子发芽整齐度和成活率，降低操作要求，方便日常管理，利于后续嫁接成活；解决了植物组织培养中常见的因培养基污染导致的实验失败的问题，且培养基可以反复使用，为高效完成柑橘新品种选育提供了技术支持。

Description

一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法

技术领域

本发明涉及杂交育种技术领域，更具体的说是涉及一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法。

背景技术

柑橘是世界上栽培面积最广，产量最高的水果，也是我国第一大水果，柑橘以其浓郁的风味，丰富的营养价值深受消费者喜爱。随着经济发展，人民生活水平的提高，人们越来越追求品质更好，多样化的水果，为适应市场需求，品种的更新不能懈怠。通常为缩短育种周期，加快新品种选育进度，人们会将柑橘杂交一代种子进行培养，当种胚长至15-20mm时嫁接到砧木上，以加快新品种的选育进度。

但是，现有技术中为了使胚根粗壮，在嫁接前两天会对种胚进行根尖断除处理后再培养，以此来提高嫁接成活率，但是此操作对根系伤害较大，且费时费力；不仅如此，杂交种子培养过程中需要及时了解胚根的长度，而柑橘种子发芽整齐度较差且种子胚根生长速度较快，若不及时观察，易出现过长现象，降低嫁接成活率，且胚根较细，提高嫁接操作的难度，目前常规方法是将种子直接放在蛭石中培养，但蛭石中培养，不能很好观察种胚长度，易错过种胚最佳嫁接期，降低嫁接成活率，同时对于珍贵多胚种子或小种子等，在蛭石中培养生长势较差；为提高种子生长势，在实验条件下，多采用植物常用的MS培养基培养，不仅能提供种子生长发芽所需营养元素，亦能随时观察种子胚根生长情况，但此方法需全程在无菌状态下进行，对环境条件和操作技术要求较高，若操作不善，易出现种子污染死亡的现象；为方便观察，也有研究人员将种子放在湿润滤纸上培养，但胚根弯曲现象较重，长势较差，不易嫁接。

因此，提供一种无需根尖断除，可以随时观察胚根长度，使胚根生长直且粗壮，提高杂交种子嫁接苗成活率的柑橘杂交种子培育方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法，本发明设计的培养基可以随时观察杂交种子生长过程中的胚根长度，能很好的提供杂交种子生长发育所需营养元素，种子胚根生长直且粗壮，长势好，提高杂交种子嫁接成活率以及育种效率，且该培养基可以反复接种种胚进行培养，不伤胚根，琼脂不污染，为高效完成柑橘育种过程中新品种选育提供技术支撑。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法，将预处理的柑橘杂交种子，放置在添加有激素和无机营养元素的琼脂培养基表面，置于25-28℃温室中避光培养，待种胚长至15-20mm时，得到经培育的柑橘杂交种子。

优选地，所述激素包括IBA(吲哚乙酸)和KT(激动素)，琼脂培养基中，两种激素的终浓度均为(0.03-0.08)mg/L。

优选地，无机营养元素包括大量元素1、大量元素2、大量元素3、Fe盐、维生素、微量元素和肌醇。

优选地，大量元素1包括NH₄NO₃、KNO₃和MgSO₄·7H₂O；大量元素2包括CaCl₂；大量元素3包括KH₂PO₄；铁盐包括FeSO₄·7H₂O和Na₂EDTA·2H₂O；维生素包括VB₃、VB₆、VB₁和甘氨酸；微量元素包括KT、H₃BO₃、MnSO₄·H₂O、ZnSO₄·7H₂O Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O和CoCl₂·6H₂O。

优选地，大量元素1各成分终浓度分别为1.5～1.8g/L NH₄NO₃、1.8～2.0g/L KNO₃和0.3～0.4g/L MgSO₄·7H₂O，大量元素2终浓度为330～335mg/L CaCl₂，大量元素3终浓度为165～175mg/L KH₂PO₄。

优选地，铁盐各成分终浓度分别为27～29mg/L FeSO₄·7H₂O、36～38mg/LNa₂EDTA·2H₂O；维生素各成分终浓度分别为0.4～0.6mg/L VB₃、0.4～0.6mg/L VB₆、0.08～0.12mg/L VB₁和1～3mg/L甘氨酸；微量元素各成分终浓度分别为6～7mg/L H₃BO₃、16～18mg/L MnSO₄·H₂O、8～10mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.2～0.4mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.02～0.03mg/L CuSO₄·5H₂O、0.02～0.03mg/L CoCl₂·6H₂O；肌醇终浓度为70～80mg/L。

优选地，琼脂培养基的Ph值为5.6-6.0。

优选地，琼脂培养基以1L计含有琼脂8-12g。

优选地，柑橘杂交种子的预处理为：从柑橘杂交果实中取出种子，摊平放置一晚晾干种子表面水分后，剥去杂交种子内外种皮。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明设计的培养基可以随时观察杂交种子胚根长度，避免了因不能很好的进行观察，错过最佳嫁接期，导致嫁接成活率降低的概率。

(2)本发明培养基基质以及添加物配方合理，能很好的提供杂交种子生长发育所需营养元素，种子胚根生长直且粗壮，长势好，整齐度高，无需根尖断除处理，不伤胚根，提高杂交种子嫁接成活率和育种效率；且对杂交多胚或小种子等珍贵种子的培养发芽生根效果更好。

(3)本发明解决了植物组织培养中常见的因培养基污染导致的实验失败的问题，且方法方便、可反复将种胚插入琼脂中培养，不伤胚根，琼脂不污染，可反复使用，降低了嫁接操作技术的要求，为高效完成柑橘育种过程中新品种选育提供技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

附图1：为本发明提供的不同培养基基质对柑橘杂交种子嫁接苗生长发育的影响示意图。

附图2：为本发明提供的琼脂培养基中不同添加物对柑橘杂交种子嫁接苗生长发育影响的培养基示意图。

附图3：为本发明提供的琼脂培养基中不同添加物对柑橘杂交种子嫁接苗生长发育影响的示意图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将柑橘杂交种子从柑橘杂交果实中取出，摊平，放置一晚晾干种子表面水分后，剥去杂交种子内外种皮，将处理好的种子，放置于含有IBA(吲哚乙酸)和KT(激动素)以及大量元素1、大量元素2、大量元素3、铁盐、维生素、微量元素和肌醇的琼脂培养基表面，盖上盖子或者保鲜膜，置于25℃温室中避光培养，待种胚长至15mm时，得到经培育的杂交种子。

其中琼脂培养基中，IBA和KT的终浓度均为0.03mg/L，大量元素1各成分终浓度分别为1.5g/L NH₄NO₃、1.8g/L KNO₃和0.3g/L MgSO₄·7H₂O；大量元素2终浓度为330mg/LCaCl₂；大量元素3终浓度为165mg/L KH₂PO₄；铁盐各成分终浓度分别为27mg/L FeSO₄·7H₂O、36mg/L Na₂EDTA·2H₂O；维生素各成分终浓度分别为0.4mg/L VB₃、0.4mg/L VB₆、0.08mg/LVB₁和1mg/L甘氨酸；微量元素各成分终浓度分别为6mg/L H₃BO₃、16mg/L MnSO₄·H₂O、8mg/LZnSO₄·7H₂O、0.2mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.02mg/L CuSO₄·5H₂O、0.02mg/L CoCl₂·6H₂O；肌醇各成分终浓度分别为70mg/L。

琼脂培养基PH值为5.6。

琼脂培养基以1L计含有琼脂8g。

实施例2

将柑橘杂交种子从柑橘杂交果实中取出，摊平，放置一晚晾干种子表面水分后，剥去杂交种子内外种皮，将处理好的种子，放置于含有IBA(吲哚乙酸)和KT(激动素)以及大量元素1、大量元素2、大量元素3、铁盐、维生素、微量元素和肌醇的琼脂培养基表面，盖上盖子或者保鲜膜，置于28℃温室中避光培养，待种胚长至20mm时，得到经培育的杂交种子。

其中琼脂培养基中，IBA和KT的终浓度均为0.08mg/L，大量元素1各成分终浓度分别为1.8g/L NH₄NO₃、2.0g/L KNO₃和0.4g/L MgSO₄·7H₂O；大量元素2终浓度为335mg/LCaCl₂；大量元素3终浓度为175mg/L KH₂PO₄；铁盐各成分终浓度分别为27mg/L FeSO₄·7H₂O、38mg/L Na₂EDTA·2H₂O；维生素各成分终浓度分别为0.6mg/L VB₃、0.6mg/L VB₆、0.12mg/LVB₁和3mg/L甘氨酸；微量元素各成分终浓度分别为7mg/L H₃BO₃、18mg/L MnSO₄·H₂O、10mg/LZnSO₄·7H₂O、0.4mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.03mg/L CuSO₄·5H₂O、0.03mg/L CoCl₂·6H₂O；肌醇终浓度为80mg/L。

琼脂培养基PH值为6.0。

琼脂培养基以1L计含有琼脂12g。

实施例3

将柑橘杂交种子从柑橘杂交果实中取出，摊平，放置一晚晾干种子表面水分后，剥去杂交种子内外种皮，将处理好的种子，放置于含有IBA(吲哚乙酸)和KT(激动素)以及大量元素1、大量元素2、大量元素3、铁盐、维生素、微量元素和肌醇的琼脂培养基表面，盖上盖子或者保鲜膜，置于28℃温室中避光培养，待种胚长至18mm时，得到经培育的杂交种子。

其中琼脂培养基中，IBA和KT的终浓度均为0.05mg/L，大量元素1各成分终浓度分别为1.65g/L NH₄NO₃、1.9g/L KNO₃和0.37g/L MgSO₄·7H₂O；大量元素2终浓度为332mg/LCaCl₂；大量元素3终浓度为170mg/L KH₂PO₄；铁盐各成分终浓度分别为27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA·2H₂O；维生素各成分终浓度分别为0.5mg/L VB₃、0.5mg/L VB₆、0.1mg/L VB₁和2mg/L甘氨酸；微量元素各成分终浓度分别为6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/LMnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O；肌醇终浓度为75mg/L。

琼脂培养基PH值为5.8。

琼脂培养基以1L计含有琼脂10g。

实施例4

测定不同培养基基质对杂交种子嫁接苗生长发育的影响

分别以琼脂(琼脂浓度10g/L)、滤纸和蛭石作为培养基基质，对杂交种子进行培养，观察不同培养基基质对杂交种子生长发育的影响。

配制浓度为10g/L的琼脂，分装入组培瓶备用；并设置滤纸和1-3mm蛭石培养基作为对照组，取杂交一代柑橘种子，剥去内外种皮，分别播种在琼脂培养基、滤纸上和蛭石，置于温室中避光培养。

分别测量其胚根长、生长量、发芽率，每组处理随机选取30个样品进行测量，取平均值，并记录其实验结果如表1所示：

表1：不同培养基基质对柑橘杂交种子嫁接苗生长发育的影响

处理	胚根长/mm	生长量/mm	出芽率/％
				滤纸	7.51±0.65cB	7.79±0.84bB	24.44±2.22cC
蛭石	11.07±0.81bA	5.75±0.75bB	60.00±3.85bB
				琼脂	13.64±0.20aA	12.81±0.88aA	75.56±2.22aA

备注：胚根长：为处理7d后胚根长。

生长量＝处理12天胚根长-处理7天胚根长。

发芽率(％)＝处理7天种子发芽数/全部种子数100，(胚根长度达到种子长度1/2视为萌发)。

如表1所示，滤纸培养的柑橘杂交种子嫁接苗胚根长，极显著低于蛭石培养的种子，琼脂培养基培养胚根长度显著高于蛭石，说明琼脂培养条件有利于种子胚根的生长；滤纸培养胚根生长量高于蛭石，但未达到显著水平，琼脂培养的生长量显著高于蛭石，说明种子再培养时，蛭石培养不利于胚根的再生长，而琼脂培养不影响胚根的再生长。滤纸培养的发芽率极显著低于蛭石，琼脂培养发芽率高于蛭石，说明滤纸培养不利于种子的出芽。总体说明，琼脂培养有利于柑橘杂交种子发芽和胚根生长

拍照记录不同培养基基质培养对杂交种子嫁接苗生长发育的影响，其结果如附图1所示。

如附图1所示，在8层湿润滤纸上培养的种子，虽能随时观察种子生长状态，但胚根弯曲严重，种胚生长状态不佳，对后续嫁接操作造成困难；蛭石中培养的种子，生长正常，但整齐度较差，胚根长短不齐，胚根较细；在琼脂培养基中，未出现污染现象，柑橘种子发芽生长正常，能随时观察种子生长状态，且操作方便。

实施例5

测定琼脂培养基中不同添加物对柑橘杂交种子嫁接苗生长发育的影响

试验组：以实施例3中培养基为试验组

空白对照组：10g/L琼脂

对照组1：10g/L琼脂+激素(J)(不添加营养元素(V)其余同实施例3)

对照组2：10g/L琼脂+无机营养物(V)(不添加激素(J)其余同实施例3)

MS培养基对照组：10g/L琼脂+激素(J)+无机营养物(V)+30g/L蔗糖(每升培养基还添加了30g蔗糖，其余同实施例3)

取上述培养基分装入组培瓶，高温灭菌备用；取杂交一代柑橘种子剥去内外种皮，放在不同培养基中，置于温室中避光培养，以上处理，种子不进行消毒处理，全程在非无菌环境下进行。

分别测量其胚根长、茎长、生长量、胚根粗、发芽率，每组处理随机选取30个样品进行测量，取平均值，并记录其实验结果如表2所示：

表2：琼脂培养基中不同添加物对柑橘杂交种子嫁接苗生长发育的影响

处理	胚根长/mm	茎长/mm	生长量/mm	胚根粗/mm	出芽率/％
						琼脂	13.64±0.21bB	9.13±0.32cC	12.81±0.88bB	1.48±0.01dC	75.56±2.22bB
琼脂+J	11.59±0.17cC	12.53±0.16bB	12.75±0.91bB	1.69±0.02cB	73.33±3.85bB
						琼脂+V	12.06±0.54cB	11.92±0.17bB	12.24±0.82bB	1.81±0.05bB	72.86±3.44bB
琼脂+J+V	16.48±0.50aA	23.78±0.26aA	16.71±0.75aA	2.08±0.02aA	91.11±2.22aA

备注：胚根长和胚根粗：处理7天后的胚根长和胚根粗；

生长量＝处理12天胚根长-处理7天胚根长；

茎长：处理14d后茎长；

发芽率(％)＝处理7天种子发芽数/全部种子数*100，(胚根长度达到种子长度1/2视为萌发)。

如表2所示，琼脂中添加物不同对种子的胚根生长有显著影响，在琼脂+激素培养基中，种子胚根长度显著低于琼脂，但胚根略粗壮；在添加无机营养物的培养基中，柑橘种子胚根显著粗于琼脂，茎长高于琼脂；在添加激素和无机营养物的培养基中，柑橘种子发芽整齐，发芽率高，胚根长度极显著高于琼脂培养，且胚根明显较粗壮，易于嫁接。

拍照记录不同添加物对柑橘杂交种子嫁接苗生长发育的影响，其结果如附图2所示。

琼脂中添加不同物质对杂交种子嫁接苗的生长发育影响很大。在琼脂、琼脂添加激素、琼脂添加激素和微量元素的培养基中，均未出现污染现象，种子正常生长；在MS培养基中，在培养第2天，出现白色菌落，即轻微污染现象，在后续培养中，白点菌落扩大，污染加重，第2天，胚根增长停滞，第5天，培养基表层全被污染，种子全部腐烂死亡；因此MS培养基不适宜日常种子培养，后续数据未采集。

实施例6

分别测定不同培养方式对柑橘幼苗嫁接的影响，并设置了滤纸、蛭石、琼脂、琼脂+J、琼脂+V、琼脂+J+V六种不同的处理方式，每个处理50棵幼苗，由4个工人进行嫁接，分别统计嫁接所需时间和嫁接成活率，根据4人嫁接结果统计取平均值。

表3：不同培养方式对柑橘嫁接苗的影响

嫁接效率(棵/min)＝50/嫁接用时.

如表3所示，不同培养方式影响柑橘杂交育种过程中杂交种子实生幼苗的嫁接。滤纸培养条件下的柑橘杂交种子嫁接成活率和嫁接效率显著低于蛭石，嫁接用时显著高于蛭石培养；琼脂、琼脂添加激素、琼脂添加无机营养物培养条件下的嫁接成活率和嫁接效率均高于蛭石，但均未达到显著水平，嫁接用时低于蛭石培养条件；琼脂添加激素和无机营养物培养条件，成活率和效率显著高于蛭石，嫁接用时极显著低于蛭石培养。说明以琼脂添加激素和无机营养物为培养基培养柑橘杂交种子，有利于后续的嫁接效率和提高嫁接成活率。

本方法不仅优化了柑橘杂交种子实生苗培养的方式，提高种子发芽整齐度和成活率，降低操作要求，方便日常管理，利于后续嫁接成活，同时也解决了植物组织培养中常见的因培养基污染导致的实验失败的现象，本方法，不仅可以用于培养植物种子，还可以用于后续植物小苗的培养，琼脂中添加物也能很好的提供植物生长所需的营养物质。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法，其特征在于，将预处理的柑橘杂交种子，放置在添加有激素和无机营养元素的琼脂培养基表面，置于25-28°C温室中避光培养，待种胚长至15-20mm时，得到经培育的柑橘杂交种子嫁接苗；

所述激素为IBA和KT，两种激素的终浓度均为0.03-0.08mg/L；

所述无机营养元素由大量元素1、大量元素2、大量元素3、Fe盐、维生素、微量元素和肌醇组成；

所述大量元素1为：1.5-1.8g/L NH₄NO₃、1.8-2.0g/L KNO₃和0.3-0.4g/L MgSO₄·7H₂O；

大量元素2为：330-335mg/L CaCl₂；

大量元素3为165-175mg/L KH₂PO₄；

铁盐为27-29mg/L FeSO₄·7H₂O、36-38mg/L Na₂EDTA·2H₂O；

维生素为0.4-0.6mg/L VB₃、0.4-0.6mg/L VB₆、0.08-0.12mg/L VB₁和1-3mg/L甘氨酸；

微量元素为KT、H₃BO₃、MnSO₄·H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O和CoCl₂·6H₂O，终浓度分别为6-7mg/L H₃BO₃、16-18mg/L MnSO₄·H₂O、8-10mg/L ZnSO₄·7H₂O、0 .2-0.4mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0 .02-0.03mg/L CuSO₄·5H₂O、0 .02-0 .03mg/L CoCl₂·6H₂O；

肌醇终浓度为70-80mg/L。

2.根据权利要求1所述的一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法，其特征在于，所述琼脂培养基的Ph值为5.6-6.0。

3.根据权利要求1所述的一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法，其特征在于，所述琼脂培养基以1L计含有琼脂8-12g。

4.根据权利要求1所述的一种柑橘杂交种子嫁接苗培育方法，其特征在于，所述杂交种子的预处理为：从柑橘杂交果实中取出种子，摊平放置一晚晾干种子表面水分后，剥去杂交种子内外种皮。

Images