CN114786709A - 用于免疫抑制的il-2嵌合蛋白 - Google Patents

Abstract

提供了通过施用与野生型Il‑2相比具有增加的血清半衰期的IL‑2嵌合分子来增加受试者中调节性T细胞的方法。还提供了治疗炎性和自身免疫性疾病的方法。

Description

用于免疫抑制的IL-2嵌合蛋白

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月22日提交的美国临时专利申请号62/903,855的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明属于免疫抑制领域。

背景技术

已显示低剂量IL-2治疗在炎症和自身免疫的治疗中是有效的。这是由于低剂量的IL-2刺激调节性T细胞(T_reg)群的扩增。然而，IL-2在血液中的半衰期极短。为了在血液中保持低剂量的IL-2存在，重组野生型IL-2需要以非常高的频率施用，可能每天施用。此外，虽然包含IgG片段的IL-2融合蛋白显示增加了半衰期，但其也已显示导致调节性T细胞特异性死亡。在这方面，关于使用IgG片段延长IL-2半衰期的文献是矛盾的。

非常需要有效增加血清半衰期和诱导T_reg群体扩增的嵌合IL-2分子。此外，特异性增强T_reg增殖但不影响细胞毒性CD8⁺细胞的IL-2分子在治疗炎症和自身免疫方面非常有价值。

发明内容

本发明提供了通过施用与野生型IL-2相比具有增加的血清半衰期的IL-2嵌合分子来增加受试者中调节性T细胞(T_reg)增殖和/或数量以及治疗炎性和自身免疫性疾病的方法。

根据第一方面，提供了在有需要的受试者中增加调节性T细胞(T_reg)数量的方法，该方法包括向受试者施用白细胞介素-2(IL-2)嵌合分子，其特征在于与野生型IL-2分子相比，血清半衰期增加，并且其中IL-2嵌合分子缺乏免疫球蛋白部分，从而增加受试者中的T_reg增殖。

根据一些实施方式，施用包括施用低剂量的IL-2嵌合分子，其中低剂量是不活化CD8⁺细胞增殖、自然杀伤(NK)细胞增殖或两者的剂量。

根据一些实施方式，增加T_reg数量包括增加T_reg增殖。

根据一些实施方式，该方法进一步包括以下至少一种：增加受试者中的CD4⁺/CD25⁺细胞数、增加受试者中的CD8⁺/CD25⁺细胞数、增加受试者中的CD8⁺/CD25⁺/FoxP3⁺细胞数和不增加受试者中的CD69阳性免疫细胞。

根据一些实施方式，增加T_reg数量包括治疗炎症。

根据一些实施方式，炎症是炎性疾病或自身免疫性疾病。

自身免疫性疾病选自炎性肠病(IBD)和关节炎。

根据一些实施方式，增加的血清半衰期包括与野生型IL-2相比至少10倍更长的清除半衰期。

根据一些实施方式，嵌合分子进一步的特征还在于，与野生型IL-2相比，在结合时通过IL-2受体(IL-2R)的信号传导增加，与野生型IL-2相比，在结合时CTLL-2细胞的增殖诱导增加，或两者。

根据一些实施方式，IL-2选自野生型IL-2、突变以增加与T_reg结合的IL-2、突变以降低与CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞结合的IL-2、突变以增加与IL-2R gamma(IL-2Rγ)结合的IL-2和突变以降低与IL-2R beta(IL-2Rβ)结合的IL-2。

根据一些实施方式，野生型IL-2包含SEQ ID NO:13，并且其中突变的IL-2包含SEQID NO:8。

根据一些实施方式，嵌合分子以比野生型IL-2更高的亲和力结合CD25。

根据一些实施方式，嵌合分子包含NKp44铰链区部分。

根据一些实施方式，该部分选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

根据一些实施方式，NKp44部分附接至IL-2的N末端、C末端或两者。

根据一些实施方式，嵌合分子包含附接至IL-2的N-末端和C-末端的NKp44部分。

根据一些实施方式，NKp44部分是糖基化的。

根据一些实施方式，嵌合分子包含选自SEQ ID NO:4、5、6、7、14、15、16和17的氨基酸序列。

根据一些实施方式，嵌合分子包含选自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

根据一些实施方式，嵌合分子包含SEQ ID NO:6。

根据一些实施方式，施用是施用低剂量的IL-2嵌合分子，其中低剂量是IL-2嵌合分子的国际单位(IU)/天与低剂量野生型IL-2疗法的IU/天的等效数量。

根据一些实施方式，低剂量是低于5×10⁶IU/天的剂量。

根据一些实施方式，施用是施用与野生型IL-2疗法相比减少的给药方案，并且其中减少的给药方案包括比每天更小频率地给药。

根据一些实施方式，减少的给药方案包括每2-4天给药。

根据另一个方面，提供了嵌合分子，其包含选自SEQ ID NO:14-18的氨基酸序列。

根据一些实施方式，嵌合分子由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。

根据另一个方面，提供了药物组合物，其包含本发明的嵌合分子和药学上可接受的运载体、赋形剂或佐剂。

根据另一个方面，提供了IL-2嵌合分子，特征在于与野生型IL-2分子相比血清半衰期增加并且缺乏免疫球蛋白结构域，其用于在有需要的受试者中增加调节性T细胞(T_reg)数量。

从下文给出的详细描述中，本发明的其他实施方式和应用的全部范围将变得显而易见。然而，应当理解的是，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方式，但其仅以说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。

附图说明

图1A-1E：蛋白质生产和分析。(1A)描述蛋白质结构的方案，其包括高度糖基化的侧翼序列。(1B)纯化后的SDS-PAGE凝胶显示蛋白质大小约为50kDa，是从AA序列(26kDa)计算的两倍，原因是糖基化。(1C)代表性的ELISA结合曲线(拟合4参数逻辑)，显示重组IL-2和S2A嵌合体的相似结合曲线和EC₅₀值。(1D)代表性的CTLL-2增殖测试，使用MTT测定完成(拟合4参数逻辑)，显示S2A的典型较低ED₅₀(较高比活度)。(1E)CTLL-2MTT测定的总结(n＝5)，显示S2A和阿地白介素在ED₅₀方面的统计学明显性(Mann-Whitneyu-检验)和相对一致的差异。*p值<0.05。

图2A-2B：PKPD分析。(2A)小鼠(n＝5)皮下注射阿地白介素和S2A，使用ELISA在从尾部取回的血液中随时间测量细胞因子水平。表格中显示的是一室模型的计算结果。与S2A相比，阿地白介素的清除时间显著缩短。以及较小的AUC值，表明阿地白介素的生物利用度较低。(2B)不同浓度下注射的S2A、S2S和A2A随时间测量的细胞因子水平的线图。

图3A-3C：通过S2A接种诱导T_Reg。小鼠(n＝5)接种30,000单位的S2A、载体和相同体积的载体两次。每次接种后3天分离PBMC，并对C45、CD4、CD8、CD25、FoxP3和CD69进行染色。(3A)描述门控策略的点图和直方图的代表性方案。在Gallios流式细胞仪-BeckmanCoulter上进行FACS，并在Kaluza上进行分析。(3B)从第3天(第1次接种后3天)FACS数据的代表性(2个实验中的1个)汇总。数据根据谱系(CD4⁺和CD8⁺)排列，并在y轴上表示为指定群体的百分比。在接种S2A的小鼠中检测到经典T_Reg表型(CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺)的非常显著的诱导(与载体相比为4.8倍)。(3C)从第7天(第2次接种后3天)的FACS数据汇总。数据以与3B相同的方式排列。在接种S2A的小鼠中检测到CD4⁺CD25⁺的显著诱导(4.4倍)，以及经典T_Reg表型的诱导(6.1倍)。误差线代表95％CI。CD4⁺CD25⁺CD69⁺群体惨淡(dismal)。*p值<0.05，**p值<0.005，***p值<0.0005。

图4A-4E：肿瘤微环境(TME)中B16生长和T_Reg频率的增强。小鼠(n＝8)被静脉注射了100,000个B16BL8细胞，并在6天后开始3次接种，每4天一次。每次接种时注射30,000单位的S2A、阿地白介素和相应体积的载体。最后一次接种后第4天，处死小鼠，并取出肺。(4A)肺被B16转移结节覆盖的代表性实例。所有治疗的所有肺都表现出黑色素结节。(4B)为评估转移形成，对肺进行称重。在S2A处理的肺与阿地白介素和载体中的质量之间分别测量出1.3倍(p值<0.005)和1.5倍(p值<0.0005)的统计学显著性差异(实线-平均值，虚线-中位数)。(4C)除H&E外，对肺固定、嵌入、切割和FoxP3染色的显微照片，以检查TME。(4D)显示从S2A处理的小鼠制备的样品的箱线图显示FoxP3阳性细胞的频率更高(10倍，p值<0.005)，表明T_Reg到TME中更高的渗透。(4E)在处死当天分离的PBMC的FACS分析，根据谱系排列，并表示为在y轴上注明的群体的百分比。误差线代表95％CI。*p值<0.05，**p值<0.005，***p值<0.0005。

图5A-5F：S2A生成针对DSS诱导的结肠炎的保护作用。给小鼠(n＝12)喂食补充有DSS的水一周，这会诱发结肠炎，在此期间小鼠接种两次(第2天和第6天)30,000单位的S2A、阿地白介素和相应体积的载体。这段时间后，处死一半小鼠，使一半进入处死前的一周的恢复期。(5A)在DSS期结束时(第8天)和恢复期结束时(第16天)从处死小鼠取出的结肠的代表性照片。(5B)测量结肠长度，显示在第8天S2A处理组和载体之间有显著的统计学差异(p值<0.05)，以及在第16天S2A处理组与阿地白介素处理组(p值<0.05)和载体(p值<0.005)之间的统计学显著性差异。呈现的是2的代表性实验(实线-平均值，虚线-中位数)。(5C)在整个实验过程中对小鼠进行称重，并将体重减轻总结为原始体重的百分比针对时间进行作图(▼表示接种)。使用SPSS计算双向ANOVA，其中发现处理和时间的组合作用是显著的(p值<0.0005)。事后检验显示S2A与阿地白介素(p值<0.05)和载体(p值<0.0005)显著不同。(5D)除了体重减轻之外，还收集临床数据(腹泻和肛门出血)，并与体重减轻相结合，以编制临床评分，其总结针对时间进行作图(▼表示接种)。在SPSS中进行了双向ANOVA，发现处理和时间的组合作用是显著的(p值<0.0005)。事后检验显示S2A与载体之间存在显著差异，但与阿地白介素没有显著差异。然而，当仅考虑恢复期时，S2A和前白介素之间出现统计显著性(p值<0.005)。(5E-5F)PBMC在处死日期间分离：(5E)第8天和(5F)第16天。FACS分析的总结根据谱系排列，并表示为y轴上注明的群体百分比。在第8天发现经典T_Reg表型群体(CD4⁺CD25⁺FoxP3)的显著变化。误差线代表95％CI。*p值<0.05，**p值<0.005，***p值<0.0005。

图6A-6C：S2A在(RA)IL-1ra KO模型中减弱类风湿性关节炎的作用。IL-1ra KO小鼠在3-6周龄时自发发展RA。每3天给小鼠(n＝5)接种100,000单位，共接种7次。(6A)RA表型的代表性实例(后肢关节发炎和肿胀)。(6B)测量关节宽度，将其相对载体归一化并针对时间作图(▼表示接种)。对数据进行了双向ANOVA分析，虽然组合作用没有统计学显著性，但处理分量是显著的(p值<0.0005)。(6C)在第21天分离PBMC。FACS分析根据谱系排列，并表示为y轴上注明的群体百分比。S2A处理组和载体组之间CD45⁺的CD4⁺CD25⁺亚群的诱导显著变化(6.4倍)。在S2A处理组和载体组之间测量到经典T_Reg群体的水平的较小显著变化(2.1倍)。误差线代表95％CI。*p值<0.05，**p值<0.005，***p值<0.0005。

图7A-7C：用25,000、50,000或100,00单位的S2A、25,000或50,000单位的N88D IL-2和相同体积的载体接种小鼠(n＝3)。每次接种后3天分离PBMC，并对C45、CD4、CD8、CD25和FoxP3进行染色。(7A-7C)显示第3天(左)和第7天(右)的FACS数据的代表性汇总的条形图。数据根据谱系(CD4⁺和CD8⁺)排列，并表示为在y轴上表明的群体的百分比。(7A)N88D或S2A没有改变总CD4和CD8数量。(7B)S2A诱导了非常显著的CD25阳性细胞诱导，而N88D产生较小的诱导。(7C)经典T_Reg表型(CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺)在接种S2A的小鼠中大量增强，在接种N88D的小鼠中轻微增强。*p值<0.05，**p值<0.005，***p值<0.0005。

具体实施方式

在一些实施方式中，本发明提供了增加受试者中调节性T细胞(T_reg)数量的方法。本发明进一步涉及治疗炎性和自身免疫性疾病的方法。

本发明至少部分基于令人惊讶的发现，即包含非IgG半衰期延长部分的IL-2嵌合体，通过在循环中保持恒定的低水平IL-2，对于增加受试者中的T_reg增殖是理想的，同时不活化或最小活化CD8⁺ T细胞或自然杀伤(NK)细胞增殖。进一步令人惊讶地发现，这些分子出人意料地通过IL-2受体(IL-2R)诱导更强的信号，因此在诱导T_reg增殖、减少炎症和治疗自身免疫性/炎症性疾病方面具有优势。

通过第一方面，提供了在有需要的受试者中增加T_reg的方法，该方法包括向受试者施用以增加的血清半衰期为特征的白细胞介素-2(IL-2)嵌合分子，从而增加受试者中的T_reg。

在一些实施方式中，T细胞是CD3阳性细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD45阳性细胞。在一些实施方式中，辅助T细胞是CD4阳性(CD4⁺)细胞。在一些实施方式中，细胞毒性T细胞是CD8阳性(CD8⁺)细胞。在一些实施方式中，T_reg是CD4⁺。在一些实施方式中，T_reg是CD25阳性的(CD25⁺)。在一些实施方式中，T_reg是FOXP3阳性的(FoxP3⁺)。在一些实施方式中，T_reg是CD69阴性的(CD69^-)。在一些实施方式中，T_reg是CD8阴性的(CD8^-)。在一些实施方式中，非经典T_reg是CD8⁺。在一些实施方式中，T_reg是CD127阳性的。在一些实施方式中，T_reg是CD152阳性的。在一些实施方式中，T_reg是CD4⁺/CD25⁺/FoxP3⁺。调节性T细胞在本领域中是众所周知的，并且对于这种细胞类型而言，表面和细胞核的几种标志物是已知的。用于染色T_reg(例如来自Abcam)和用于分离T_reg(例如来自Miltenyi Biiotec)的商业试剂盒是可用的。

在一些实施方式中，增加T_reg包括增加T_reg数量。在一些实施方式中，增加T_reg包括增加T_reg增殖。在一些实施方式中，增加T_reg是增加T_reg增殖。在一些实施方式中，增加T_reg包括增加T_reg定位到炎症或免疫反应位点。在一些实施方式中，增加T_reg是增加为T_reg的CD4阳性T细胞的百分比。在一些实施方式中，增加T_reg是增加FoxP3阳性的CD4/CD25阳性T细胞的百分比。在一些实施方式中，增加T_reg是增加T_reg的产生。在一些实施方式中，增加T_reg是增加采用T_reg细胞命运的T辅助细胞。在一些实施方式中，增加是体内增加。在一些实施方式中，增加是体外增加。

增加的增殖可以通过本领域已知的任何测定来测量，包括下文描述的测定。在一些实施方式中，增加的增殖是在血液中测量的。在一些实施方式中，增加的增殖是在血清中测量的。在一些实施方式中，增加的增殖是在靶器官中测量的。在一些实施方式中，靶器官是包含炎症的器官。在一些实施方式中，器官是患病的器官。在一些实施方式中，器官是经历自身免疫性攻击的器官。在一些实施方式中，器官选自肠道、肠、关节、血液、血清、胰腺、肌肉、皮肤、甲状腺、神经系统、脑、淋巴结、肾、肺和心。

在一些实施方式中，增加是实质上增加。在一些实施方式中，增加是显著增加。在一些实施方式中，明显是统计学上显著的。在一些实施方式中，增加是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500％的增加。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，增加是局部增加。在一些实施方式中，增加是全身性增加。在一些实施方式中，增加位于靶器官中。在一些实施方式中，增加是与施用前的受试者相比。在一些实施方式中，增加是与健康对照相比。在一些实施方式中，增加是与具有与受试者相同的病症/疾病的对照相比。在一些实施方式中，增加是与预定基线或阈值相比。在一些实施方式中，增加是与施用非嵌合IL-2的受试者相比。在一些实施方式中，增加是与施用包含免疫球蛋白部分的嵌合IL-2的受试者相比。在一些实施方式中，增加是与施用包含N88D突变的IL-2的受试者相比。

在一些实施方式中，施用本发明的嵌合IL-2和施用另一种IL-2是等效剂量。在一些实施方式中，等效剂量是每天相同的单位(U)。在一些实施方式中，单位是国际单位(IU)。应当理解，每天相同的单位不必是每天完全相同的量，而是可以平均为每天相同的单位。例如，每天X单位的剂量等效于每隔一天2X单位的剂量或每周7X单位的剂量。

在一些实施方式中，方法进一步包括确认T_reg增殖的增加。在一些实施方式中，方法进一步包括确认T_reg数量的增加。在一些实施方式中，方法进一步包括确认T_reg百分比的增加。在一些实施方式中，方法包括确认增加的T_reg。在一些实施方式中，方法进一步包括接收来自受试者的样品。在一些实施方式中，确认是在样品中。在一些实施方式中，测量增加的增殖包括测量T_reg数量并将其与未处理的背景中的T_reg数量进行比较。在一些实施方式中，测量增殖包括从受试者中提取生物样品并测量T_reg数量。在一些实施方式中，生物样品选自血液、血浆、淋巴、尿液、精液、粪便、母乳、脑脊髓液、肺抽吸物和活组织检查。在一些实施方式中，活组织检查来自靶器官。可以通过本领域已知的任何方法对样品中的T_reg进行计数，其包括但不限于样品中细胞的流式细胞术分析。可以在样品的细胞上测量T_reg标志物，并根据染色计算T_reg百分比/数量。

在一些实施方式中，方法不包括增加细胞毒性细胞类型的增殖。在一些实施方式中，方法不包括实质上增加细胞毒性细胞类型的增殖。在一些实施方式中，细胞毒性细胞类型选自CD8⁺ T细胞和NK细胞。在一些实施方式中，细胞毒性细胞是NK细胞。在一些实施方式中，细胞毒性细胞是CD8⁺ T细胞。在一些实施方式中，细胞毒性细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方式中，实质上增加是大于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的增殖增加。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，方法不包括增加CD4阳性T细胞的增殖。在一些实施方式中，方法不包括增加整个CD4阳性群体的增殖。在一些实施方式中，方法包括增加为T_reg的CD4阳性T细胞的百分比。在一些实施方式中，方法包括降低不是T_reg的CD4阳性T细胞的数量。

在一些实施方式中，方法不活化免疫反应。在一些实施方式中，方法不增加正在进行的免疫反应。在一些实施方式中，方法降低免疫反应。在一些实施方式中，方法降低炎症。在一些实施方式中，炎症是全身性炎症。在一些实施方式中，炎症是局部炎症。在一些实施方式中，方法包括施用低剂量的IL-2嵌合分子。在一些实施方式中，方法包括施用低于低剂量IL-2疗法的剂量。在一些实施方式中，方法包括施用低于被施用以治疗炎症和/或自身免疫性疾病的低剂量的剂量。在一些实施方式中，低剂量是不活化CD8细胞增殖、自然杀伤细胞增殖或两者的剂量。

在一些实施方式中，施用是施用低剂量。在一些实施方式中，剂量是治疗有效剂量。在一些实施方式中，低剂量施用等效于低剂量野生型IL-2疗法中的低剂量施用。在一些实施方式中，等效是以单位/天为单位的IL-2剂量的等效。在一些实施方式中，IL-2的U/天等效于嵌合IL-2的U/天。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于10、9、8、7、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.1、0.08、0.05、0.03和0.01×10⁶U/天的剂量。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于5×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于1×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于0.5×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于0.3×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于0.1×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于0.08×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于0.05×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于0.03×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于0.01×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是约10、9、8、7、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.1、0.08、0.05、0.03和0.01×10⁶U/天的剂量。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，低剂量是约5×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是约1×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是约0.5×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是约0.3×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是约0.1×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是0.08×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是约0.05×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是约0.03×10⁶U/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是约0.01×10⁶U/天的剂量。应当理解，低剂量必须是治疗有效剂量，因此由于需要其有效而提供了下限。在一些实施方式中，剂量等于或大于10、9、8、7、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.1、0.08、0.05、0.03、0.01、0.005、0.001、0.0005和0.0001×10⁶U/天。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，剂量等于或大于0.01×10⁶U/天。在一些实施方式中，剂量等于或大于0.03×10⁶U/天。在一些实施方式中，剂量等于或大于0.05×10⁶U/天。在一些实施方式中，剂量等于或大于0.001×10⁶U/天。在一些实施方式中，剂量等于或大于0.005×10⁶U/天。在一些实施方式中，剂量等于或大于0.0001×10⁶U/天。在一些实施方式中，剂量等于或大于0.0005×10⁶U/天。

在一些实施方式中，增加T_reg包括降低炎症。在一些实施方式中，增加T_reg包括治疗炎症。在一些实施方式中，增加T_reg包括降低免疫反应。在一些实施方式中，增加T_reg包括治疗自身免疫性病症和/或疾病。在一些实施方式中，炎症是炎性疾病。在一些实施方式中，炎症是自身免疫性疾病。在一些实施方式中，免疫反应是自身免疫性病状和/或疾病。

在一些实施方式中，自身免疫性疾病选自炎症性肠病(IBD)、结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、糖尿病、狼疮、牛皮癣、格雷夫斯病(Grave’sdisease)、乳糜泻、桥本氏病、重症肌无力、格林-巴利综合征、硬皮病、哮喘、脱发、关节炎、视神经脊髓炎、脱髓鞘性多发性神经病和白塞综合征(

syndrome)。在一些实施方式中，IBD包括结肠炎和克罗恩病。在一些实施方式中，IBD包括结肠炎。在一些实施方式中，自身免疫性疾病选自IBD和RA。在一些实施方式中，自身免疫性疾病是IBD。在一些实施方式中，自身免疫性疾病是结肠炎。在一些实施方式中，自身免疫性疾病是关节炎。在一些实施方式中，自身免疫疾病是RA。

在一些实施方式中，施用包括施用低剂量的IL-2嵌合分子。在一些实施方式中，低剂量是不活化免疫反应的剂量。在一些实施方式中，低剂量是不增加细胞毒性细胞的增殖的剂量。在一些实施方式中，低剂量是不活化细胞毒性细胞的增殖的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005或0.01百万国际单位(MIU)/天的剂量。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于3.5MIU/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005或0.001MIU/米²(m²)/天的剂量。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，低剂量是等于或低于3.5MIU/m²/天的剂量。在一些实施方式中，低剂量是每天小于50,000单位。在一些实施方式中，低剂量是每天小于100,000单位。在一些实施方式中，低剂量是每天至少10,000单位。在一些实施方式中，低剂量在每天10,000和50,000单位之间。在一些实施方式中，低剂量在每天10,000和100,000单位之间。在一些实施方式中，低剂量是每天约10,000单位。在一些实施方式中，低剂量是每天约30,000单位。在一些实施方式中，低剂量是每天约50,000单位。在一些实施方式中，低剂量是每天约100,000单位。

在一些实施方式中，剂量低于用于治疗自身免疫性疾病的标准治疗剂量。在一些实施方式中，剂量低于用于治疗癌症的标准治疗剂量。在一些实施方式中，由于嵌合分子的半衰期延长，剂量减少。在一些实施方式中，由于嵌合分子的功效增加，剂量减少。在一些实施方式中，低剂量是不活化CD8阳性T细胞增殖的剂量。在一些实施方式中，低剂量是不活化自然杀伤(NK)细胞增殖的剂量。

在一些实施方式中，低剂量包括与标准疗法相比更小频率的剂量。在一些实施方式中，标准疗法是抗癌疗法。在一些实施方式中，标准疗法是自身免疫性疗法。在一些实施方式中，标准疗法是低剂量疗法。在一些实施方式中，低剂量包括至多一天一次、每隔一天一次、每三天一次、每四天一次、每周两次、每五天一次、每六天一次、每周一次、每十天一次、每隔一周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次的剂量。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，低剂量疗法是每天疗法。在一些实施方式中，方法包括每隔一天施用疗法。在一些实施方式中，方法包括每隔一天施用低剂量疗法。本领域技术人员将理解，由于IL-2标准低剂量疗法的半衰期短，需要每天施用。令人惊讶的是，半衰期延长的分子可以每隔一天施用，并且仍然产生优于每天施用重组IL-2的结果。在一些实施方式中，更小频率给药是比每天更小频率。在一些实施方式中，比每天更小频率是每隔一天。在一些实施方式中，比每天更小频率是每2天。在一些实施方式中，比每天更小频率是每3天。在一些实施方式中，比每天更小频率是每4天。在一些实施方式中，比每天更小频率是每5天。在一些实施方式中，比每天更小频率是每2-4天。在一些实施方式中，比每天更小频率是每2-5天。在一些实施方式中，比每天更小频率是每2至6天。在一些实施方式中，比每天更小频率是每2至7天。在一些实施方式中，施用是施用减少的给药方案。在一些实施方式中，减少是与IL-2疗法相比。在一些实施方式中，IL-2疗法是低剂量IL-2疗法。在一些实施方式中，IL-2是野生型IL-2。在一些实施方式中，IL-2是包含N88D突变的IL-2。在一些实施方式中，IL-2是与免疫球蛋白连接的嵌合IL-2。在一些实施方式中，减少的给药方案包括比每天更小频率的给药。

在一些实施方式中，由于嵌合分子的半衰期延长，剂量频率降低。在一些实施方式中，由于嵌合分子的功效增加，剂量频率降低。在一些实施方式中，频率的降低是在施用的第一疗程中。在一些实施方式中，第一疗程为持续1、2、3、4或5周。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，第一疗程为持续一周。在一些实施方式中，剂量的降低是在第二疗程或维持期中。在一些实施方式中，第二疗程为持续1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年或无限期。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，第一期和第二期使用不同的剂量。在一些实施方式中，第一期和第二期使用相同的剂量。

如本文所用，术语“施用(administering、administration)”类似术语是指在合理的医学实践中以提供疗法影响的方式递送包含活性剂的组合物至受试者的任何方法。在一些实施方式中，施用选自口服、肠胃外、皮下、静脉内、肛门、肌肉内和腹膜内施用。在一些实施方式中，施用包括施用治疗有效剂量的嵌合分子。在一些实施方式中，施用包括施用包含嵌合分子的治疗组合物。在一些实施方式中，治疗组合物包含药学上可接受的运载体、赋形剂或佐剂。在一些实施方式中，治疗组合物被配制用于全身性施用。

施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重、同时处理的种类(如果有的话)、处理的频率以及所期望效果的性质。

如本文所用，术语“运载体”、“赋形剂”或“佐剂”是指药物组合物中不是活性剂的任何组分。如本文所用，术语“药学上可接受的运载体”是指无毒、惰性固体、半固体液体填充剂、稀释剂、包封材料、任何类型的制剂助剂或简单的无菌水性介质，例如盐水。可以用作药学上可接受的运载体的材料的一些实例是糖类(例如乳糖、葡萄糖和蔗糖)、淀粉(例如玉米淀粉和马铃薯淀粉)、纤维素及其衍生物(例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素)；粉状黄芪胶；麦芽、明胶、滑石；赋形剂(例如可可脂和栓剂蜡)；油类(例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)；二醇类(例如丙二醇)、多元醇类(例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇)；酯类(例如油酸乙酯和月桂酸乙酯)、琼脂；缓冲剂(例如氢氧化镁和氢氧化铝)；海藻酸；无热原水；等渗盐水、林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液以及药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。可用作本文运载体的物质的一些非限制性实例包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、粉状黄芪胶、麦芽、明胶、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、硫酸钙、植物油、多元醇、海藻酸、无热原水、等渗盐水、磷酸盐缓冲溶液、可可脂(栓剂基质)、乳化剂以及用于其他药物制剂的其他无毒药学上相容性物质。润湿剂和润滑剂(例如十二烷基硫酸钠)，以及着色剂、调味剂、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂也可能存在。任何无毒、惰性和有效的运载体都可用于配制本文所考虑的组合物。在这方面合适的药学上可接受的运载体、赋形剂和稀释剂是本领域技术人员众所周知的，例如以下中所描述的那些：The MerckIndex,Thirteenth Edition,Budavari et al.,Eds.,Merck&Co.,Inc.,Rahway,N.J.(2001)；the CTFA(Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association)InternationalCosmetic Ingredient Dictionary and Handbook,Tenth Edition(2004)；和the“Inactive Ingredient Guide,”U.S.Food and Drug Administration(FDA)Center forDrug Evaluation and Research(CDER)Office of Management，所有这些内容通过引用以其整体并入本文。可用于本发明组合物的药学上可接受的赋形剂、运载体和稀释剂的实例包括蒸馏水、生理盐水、林格氏液、葡萄糖溶液、汉克氏液和DMSO。这些另外的非活性组分以及有效的制剂和施用程序在本领域中是众所周知的，并且在以下标准教科书中进行了描述，例如Goodman and Gillman’s:The Pharmacological Bases of Therapeutics,8thEd.,Gilman et al.Eds.Pergamon Press(1990)；Remington’s PharmaceuticalSciences,18th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)；和Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,(2005)，其每一篇通过引用以其整体并入本文。本文描述的组合物也可以包含在人工产生的结构中，例如脂质体、ISCOMS、缓释颗粒和增加血清中肽或多肽半衰期的其他载体。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、层纹状层等。与本文描述的肽一起使用的脂质体由标准的囊泡形成脂质形成，该脂质通常包括中性和带负电荷的磷脂和甾醇，例如胆固醇。脂质的选择通常由例如脂质体大小和血液中的稳定性的考虑因素决定。综述了可用于制备脂质体的多种方法，例如Coligan,J.E.et al,CurrentProtocols in Protein Science,1999,John Wiley&Sons,Inc.,New York，也参见美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。

运载体可占本文呈现的药物组合物重量的总计约0.1％至约99.99999％。

术语“嵌合体”是指由通过在一个肽的氨基末端和另一个肽的羧基末端之间形成的肽键连接两个或更多个肽形成的多肽。嵌合体可以通过组成肽的化学偶联形成，或者它可以表达为来自编码单一连续缀合物的核酸序列的单一多肽融合蛋白。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”涵盖天然肽、肽模拟物(通常包括非肽键或其他合成修饰)和肽类似物类肽和半类肽或其任何组合。在另一个实施方式中，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。

在一些实施方式中，嵌合分子的特征在于增加的半衰期。在一些实施方式中，嵌合分子的特征在于衰减降低。在一些实施方式中，增加的半衰期不是由Fc受体介导的。在一些实施方式中，增加的半衰期不是由新生儿Fc受体(FcRn)介导的。在一些实施方式中，增加的半衰期不是由再循环介导的。在一些实施方式中，嵌合分子包括增加的半衰期。在一些实施方式中，增加的半衰期是增加的血清半衰期。在一些实施方式中，半衰期是清除半衰期。在一些实施方式中，半衰期是血液清除半衰期。在一些实施方式中，增加是与IL-2相比。在一些实施方式中，增加是与野生型IL-2相比。在一些实施方式中，增加是与IL-2非嵌合分子相比。在一些实施方式中，增加是与缺乏非IL-2部分的IL-2分子相比。在一些实施方式中，增加与包含免疫球蛋白的嵌合IL-2分子相比。

在一些实施方式中，增加包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25倍更长的半衰期。每种可能性包括本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，增加包括至少10倍更长的半衰期。测量受试者中蛋白质的半衰期在本领域中被很好地表征，并且可以进行包括下文所述的那些的任何方法。在一些实施方式中，在不同的时间点进行分子浓度的测量以计算半衰期。

在一些实施方式中，IL-2是哺乳动物IL-2。在一些实施方式中，IL-2是人IL-2。在一些实施方式中，IL-2包含登录号NP_000577.2或XP_016863666.1中提供的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方式中，IL-2包含登录号NP_000577.2中提供的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方式中，IL-2是野生型IL-2。在一些实施方式中，IL-2包含信号肽。在一些实施方式中，IL-2不包含信号肽。在一些实施方式中，IL-2是分泌的IL-2。在一些实施方式中，IL-2包含氨基酸序列MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:12)或由其组成。在一些实施方式中，IL-2缺乏信号肽并且包含氨基酸序列APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFC QSIISTLT(SEQID NO:13)或由其组成。在一些实施方式中，IL-2由SEQ ID NO:12组成。在一些实施方式中，IL-2由SEQ ID NO:13组成。在一些实施方式中，分泌的IL-2由SEQ ID NO:13组成。在一些实施方式中，IL-2信号肽由氨基酸序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:9)组成。在一些实施方式中，嵌合分子在其N末端进一步包含信号肽。在一些实施方式中，信号肽是IL-2信号肽。

在一些实施方式中，IL-2是野生型IL-2。在一些实施方式中，IL-2没有突变。在一些实施方式中，IL-2是突变的IL-2。在一些实施方式中，突变是为了增加与T_reg的结合。在一些实施方式中，突变是为了降低与IL-2Rβ(IL-2Rβ)链的结合。在一些实施方式中，突变是为了降低与IL-2Rγ(IL-2Rγ)链的结合。在一些实施方式中，突变是为了降低与IL-2Rβ/γ(IL-2Rβγ)受体的结合。在一些实施方式中，突变是为了降低与细胞毒性细胞的结合。在一些实施方式中，突变是为了降低与CD8⁺ T细胞的结合。在一些实施方式中，突变是为了降低与IL-2Rα/β(IL-2Rαβ)受体的结合。在一些实施方式中，突变是为了增加与IL-2Rα/β(IL-2Rαβ)受体的结合。在一些实施方式中，突变是为了增加与中等亲和力IL-2R的结合。在一些实施方式中，突变是为了降低与中等亲和力IL-2R的结合。在一些实施方式中，突变是为了降低与高亲和力IL-2R的结合。在一些实施方式中，突变是为了增加与高亲和力IL-2R的结合。在一些实施方式中，突变是SEQ ID NO:13的第88位天冬酰胺(N)的突变。在一些实施方式中，突变是N88转化为天冬氨酸(D)。在一些实施方式中，突变是N88转化为赖氨酸(K)。

在一些实施方式中，分子的特征在于与CD25结合的亲和力更高。在一些实施方式中，分子的特征在于与CD25结合的亲和力更高。在一些实施方式中，嵌合分子以更高的亲和力结合CD25。在一些实施方式中，更高的亲和力是与IL-2相比。在一些实施方式中，更高的亲和力是与野生型IL-2相比。在一些实施方式中，分子的特征在于通过IL-2R增加的效果。在一些实施方式中，分子的特征在于通过IL-2R增加的信号传导。在一些实施方式中，增加是在与IL-2R结合时。在一些实施方式中，增加与IL-2相比。在一些实施方式中，增加与野生型IL-2相比。在一些实施方式中，增加的信号传导包括增加的表达IL-2R的细胞的增殖。在一些实施方式中，增加的信号传导包括增加的CTLL-2细胞增殖。在一些实施方式中，分子的特征在于增加的CTLL-2细胞增殖。在一些实施方式中，增加的信号传导包括增加的T_reg增殖。测量通过IL-2R信号传导的任何方法都可用于表征分子。也可以使用任何测量IL-2剂量的方法。

在一些实施方式中，方法进一步包括增加所述受试者中的CD4⁺/CD25⁺细胞数量、增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺细胞数量、增加所述受试者中的CD45⁺/CD44⁺细胞数量、增加所述受试者中的CD4⁺/CD25⁺/CD44⁺细胞数量、增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺/CD44⁺细胞数量、不增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺/FoxP3⁺细胞数量、增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺/FoxP3⁺细胞数量和不增加所述受试者中CD69阳性免疫细胞的至少一种。在一些实施方式中，方法进一步包括增加所述受试者中的CD4⁺/CD25⁺细胞数量。在一些实施方式中，方法进一步包括增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺细胞数量。在一些实施方式中，方法进一步包括增加所述受试者中的CD45⁺/CD44⁺细胞数量。在一些实施方式中，方法进一步包括增加所述受试者中的CD4⁺/CD25⁺/CD44⁺细胞数量。在一些实施方式中，方法进一步包括增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺/CD44⁺细胞数量。在一些实施方式中，方法进一步包括增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺/FoxP3⁺细胞数量。在一些实施方式中，方法进一步包括不增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺/FoxP3⁺细胞数量。在一些实施方式中，方法进一步包括不增加所述受试者中的CD69阳性免疫细胞数量。在一些实施方式中，CD69阳性免疫细胞是CD8⁺/CD69⁺细胞。在一些实施方式中，CD69阳性免疫细胞是CD4⁺/CD69⁺细胞。在一些实施方式中，CD69阳性细胞是CD69阳性T_reg。

在一些实施方式中，嵌合分子包含非IL-2部分。在一些实施方式中，该部分增加嵌合分子的半衰期。在一些实施方式中，增加是与野生型IL-2相比。在一些实施方式中，增加是与没有该部分的IL-2相比。在一些实施方式中，增加是与没有非IL-2部分的IL-2相比。在一些实施方式中，非IL-2部分不是免疫球蛋白部分。在一些实施方式中，嵌合分子缺乏或没有免疫球蛋白部分。

如本文所用，术语“部分”涉及分子的一部分，其可以包括整个官能团或部分官能团作为亚结构。术语“部分”进一步表示分子的一部分，其表现出与相应分子相似的一组特定化学和/或药理学特征。

延长蛋白质体内半衰期的部分的实例包括但不限于IgG、人血清蛋白(HSA)、转铁蛋白、CTP肽、GLK、HAP、ELP重复、PAS和XTEN。在一些实施方式中，该部分通过选自增加大小、增加流体动力学半径、增加再循环、增加负电荷和增加糖基化的机制来延长半衰期。在一些实施方式中，该部分通过选自增加大小、增加流体动力学半径、增加负电荷和增加糖基化的机制来延长半衰期。在一些实施方式中，该部分通过选自增加负电荷和增加糖基化的机制来延长半衰期。在一些实施方式中，该部分通过选自增加负电荷和增加糖基化的机制来延长半衰期。在一些实施方式中，糖基化是O-连接的糖基化。在一些实施方式中，糖基化主要是O-连接的糖基化。

在一些实施方式中，免疫球蛋白部分是IgG。在一些实施方式中，IgG是IgG1。在一些实施方式中，IgG是IgG2。在一些实施方式中，IgG是IgG3。在一些实施方式中，IgG是IgG4。在一些实施方式中，IgG是结合FcRn的IgG。在一些实施方式中，IgG是不结合FcRγ的IgG。在一些实施方式中，免疫球蛋白部分是抗体部分。在一些实施方式中，抗体部分是抗原结合结构域。在一些实施方式中，免疫球蛋白部分是免疫球蛋白结构域。在一些实施方式中，IgG是经突变以减少抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的IgG。在一些实施方式中，IgG是经突变以减少补体依赖性细胞毒性(CDC)的IgG。在一些实施方式中，突变的IgG是突变的IgG1。

在一些实施方式中，该部分附接至IL-2的N末端。在一些实施方式中，该部分附接至IL-2的C末端。在一些实施方式中，该部分附接至IL-2的N-或C-末端。在一些实施方式中，该部分附接至IL-2的N-末端、IL-2的C-末端或两者。在一些实施方式中，该部分附接至IL-2的N末端和C末端二者。

在一些实施方式中，附接是连接的。在一些实施方式中，连接是直接连接。在一些实施方式中，连接是通过接头连接的。在一些实施方式中，接头是肽接头。在一些实施方式中，接头是化学接头。在一些实施方式中，该部分和IL-2通过氨基键连接。在一些实施方式中，该部分和IL-2是单氨基酸链的一部分。

在一些实施方式中，该部分是NKp44部分。在一些实施方式中，NKp44部分是NKp44铰链区部分。在一些实施方式中，铰链区包含NKp44的氨基酸130至199。在一些实施方式中，铰链区包含SEQ ID NO:1的氨基酸130至199。在一些实施方式中，该部分包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或65个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，该部分包含至多20、25、30、35、40、45、50、55、60或65个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，该部分包含至少25个氨基酸。在一些实施方式中，该部分包含至少30个氨基酸。在一些实施方式中，该部分包含至少35个氨基酸。在一些实施方式中，该部分包含至多35个氨基酸。在一些实施方式中，该部分包含至多40个氨基酸。在一些实施方式中，该部分包含至多45个氨基酸。

在一些实施方式中，该部分是糖基化的。在一些实施方式中，糖基化选自N-连接和O-连接的糖基化。在一些实施方式中，糖基化是O-连接的糖基化。在一些实施方式中，糖基化主要是O-连接的糖基化。在一些实施方式中，主要是至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、93、95、97、99或100％的O-连接的糖基化。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

NKp44也称为自然细胞毒性触发受体2(NCR2)，以及CD336、NK-p44、LY95和dJ149M18.1。在一些实施方式中，NKp44是人NKp44。在一些实施方式中，NkP44包含在GenBank登录号：NP001186438.1中提供的氨基酸序列。在一些实施方式中，NkP44包含氨基酸序列MAWRALHPLLLLLLLFPGSQAQSKAQVLQSVAGQTLTVRCQYPPTGSLYEKKGWCKEASALVCIRLVTSSKPRTMAWTSRFTIWDDPDAGFFTVTMTDLREEDSGHYWCRIYRPSDNSVSKSVRFYLVVSPASASTQTSWTPRDLVSSQTQTQSCVPPTAGARQAPESPSTIPVPSHPSSPLPVPLPSRPQNSTLRPGPAAPIALVPVFCGLLVAKSLVLSALLVWWVLRNRHMQHQGRSLLHPAQPRPQAHRHFPLSHRAPGGTYGGKP(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，NKp44由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

根据一些实施方式，该部分是具有20至50个氨基酸残基的肽，所述肽包含源自NKp44(SEQ ID NO:1)的氨基酸130至199的序列。根据一些实施方式，本发明提供了源自SEQID NO:10的20至50个氨基酸残基的肽。SEQ ID NO:10由氨基酸序列SPASASTQTSWTPRDLVSSQTQTQSCVPPTAGARQAPESPSTIPVPSHPSSPLPVPLPSR PQNSTLRPGP组成。

在另一个实施方式中，该部分是源自SEQ ID NO:1的氨基酸130至199的肽，其中所述肽缺乏：(a)由氨基酸1至129组成的片段，和(b)由氨基酸200至270组成的片段。

在另一个实施方式中，肽包含源自SEQ ID NO:1的氨基酸130至199的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个连续氨基酸。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一个实施方式中，提供了包含源自SEQ ID NO:1的氨基酸130至199的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个连续氨基酸的肽，其中肽缺乏：(a)由氨基酸1至129组成的片段，和(b)由氨基酸200至270组成的片段。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

如本文所用，术语“源自”或“对应于”是指使用本领域技术人员已知的任何一种合适的方法(例如根据本领域的标准方案进行化学合成)，基于序列知识构建氨基酸序列。在一个实施方式中，源自或对应于NKp44序列的氨基酸130至199的肽是基于SEQ ID NO:1的残基130至199的肽，或其类似物、变体、衍生物或片段。在一个实施方式中，源自或对应于SEQID NO:1的氨基酸130至199的肽具有如SEQ ID NO:10叙述的氨基酸序列，或其类似物、变体、衍生物或片段。

在另一个实施方式中，包含如SEQ ID NO:10叙述的氨基酸序列的肽具有小于80、79、78、77、76、75、74、73、72、71或70个氨基酸的长度。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在另一个实施方式中，源自NKp44的肽具有截短形式和/或为SEQ ID NO:10的片段。在另一个实施方式中，源自NKp44的肽包含源自SEQ ID NO:10的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、65、66、67、68、69或70个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在另一个实施方式中，源自NKp44的肽包含源自SEQ ID NO:10的20至70、20至60、20至55、20至50、20至40、25至70、25至60、25至55、25至50、25至40、30至70、30至60、30至50或30至40个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在另一个实施方式中，源自NKp44的肽为20至70、20至60、20至55、20至50、20至40、25至70、25至60、25至55、25至50、25至40、30至70、30至60、30至50或30至40个氨基酸长度。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一个实施方式中，源自NKp44的肽包含氨基酸序列SPASASTQTSWTPRDLVSSQTQTQSCVPPTAGAR(SEQ ID NO:2)或由其组成。SEQ ID NO:2也称为SPA部分。在一个实施方式中，源自NKp44的肽包含氨基酸序列QAPESPSTIPVPSHPSSPLPVPLPSRPQNSTLRPGP(SEQ ID NO:3)或由其组成。SEQ ID NO:3也称为APE部分。在一个实施方式中，源自NKp4的肽包含如SEQ IDNO:2叙述的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方式中，源自NKp44的截短肽包含如SEQ IDNO:3叙述的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方式中，该部分选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。在一些实施方式中，该部分是SEQ ID NO:2。在一些实施方式中，该部分是SEQ ID NO:3。在一些实施方式中，SEQID NO:2附接至IL-2的N末端。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2附接至IL-2的C末端。在一些实施方式中，SEQ ID NO:3附接至IL-2的N末端。在一些实施方式中，SEQ ID NO:3附接至IL-2的C末端。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2附接至IL-2的N末端和C末端二者(S2S分子)。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(没有信号肽的S2S分子)。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，SEQ IDNO:3附接至IL-2的N末端和C末端二者(A2A分子)。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列(没有信号肽的A2A分子)。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2附接至N末端或C末端并且SEQ ID NO:3附接至另一个末端。在一些实施方式中，嵌合分子包含选自SEQ ID NO:6(没有信号肽的S2A分子)和SEQ ID NO:7(没有信号肽的A2S分子)的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合分子由选自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，嵌合分子是S2A。在一些实施方式中，S2A包含信号肽。在一些实施方式中，S2A缺乏信号肽。

本领域技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的对肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是保守修饰变体，其中改变导致具有相似电荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸的取代，例如谷氨酸(E)被取代为天冬氨酸(D)。在一些实施方式中，嵌合分子在分子的IL-2段的第88位包含N到D的突变。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:14。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:14组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:15。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:15组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:16。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQID NO:16组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:17组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含选自SEQ ID NO:14、15、16和17的序列。在一些实施方式中，嵌合分子由选自SEQ ID NO:14、15、16和17的序列组成。在一些实施方式中，SEQ ID NO:14-17和SEQ ID NO:4-7分别但包含N88D突变。

在一些实施方式中，源自NKp44的肽包含源自SEQ ID NO:10的序列，具有一个或多个保守取代。根据本发明的另一个实施方式，源自NKp44的肽包含与SEQ ID NO:10同源的序列。根据本发明的另一个实施方式，源自NKp44的肽包含具有与SEQ ID NO:10大于70％、75％、80％、85％、90％或95％同源性的序列。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

如本文所用，术语“类似物”包括具有与本文具体显示的序列之一基本上相同的氨基酸序列的任何肽，其中一个或多个残基已被功能相似的残基保守地取代并且显示出如本文所述的能力。保守取代的实例包括用一个非极性(疏水)残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一个，用一个极性(亲水)残基取代另一个(例如在精氨酸和赖氨酸之间、在谷氨酰胺和天冬酰胺之间、在甘氨酸和丝氨酸之间)，用一个碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一个，或用一个酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一个。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

如本文所用，短语“保守取代”还包括使用化学衍生的残基代替非衍生的残基，条件是这种肽显示出必要的功能，例如本文所指定的铁沉淀。

在另一个实施方式中，源自SEQ ID NO:1的氨基酸130至199的肽是天然NKp44或其片段的变体，其与来自天然NKp44(SEQ ID NO:1)或其片段的氨基酸130-199相差至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个保守氨基酸取代。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在另一个实施方式中，源自NKp44的肽是天然NKp44的变体，其与SEQ ID NO:10相差至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在另一个实施方式中，源自NKp44的肽是天然NKp44的变体，其与SEQ ID NO:10相差最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一个实施方式中，源自NKp44的肽是SEQ ID NO:10的变体，其包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或由其组成。SEQ ID NO:11是SPASASTQTSWTPRDLVSSQTQTQSCVPPTAGARQAPESPSTIPVPSHPSSPLPVPLPSRPQASTLRPGP。

在另一个实施方式中，术语“变体”是指多肽或核苷酸序列，其分别与另一个多肽或多核苷酸相比包含一个或多个氨基酸或核苷酸的修饰。在一些实施方式中，修饰是分别与另一个多肽或多核苷酸相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的取代、缺失和/或插入。在一些实施方式中，变化可以是次要性质的，例如保守氨基酸取代或对于核苷酸序列，导致不显著影响多肽活性的保守氨基酸取代。在一些实施方式中，变化可以是氨基酸分子的取代，导致添加糖基化位点(N-或O-连接的)，从而增加多肽的糖基化。

通常，本发明包括肽的衍生物。术语“衍生物”或“化学衍生物”包括具有通过侧链或官能团反应化学衍生的一个或多个残基的肽的任何化学衍生物。这样衍生的分子包括，例如，其中游离氨基已经衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可衍生形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-咪唑(im)-苄基组氨酸。此外，作为化学衍生物包括含有二十种标准氨基酸残基的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羟脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；和鸟氨酸可以取代赖氨酸。

此外，肽衍生物可通过化学修饰(包括但不限于末端-NH2酰化、乙酰化或巯基乙酸酰胺化)和通过末端羧基酰胺化(例如，与氨、甲胺等)而与本发明肽的天然序列不同。肽可以是线性的、环状的或支链的等，这些构象可以使用本领域众所周知的方法来实现。

根据本发明的原理的肽衍生物和类似物还可以包括侧链键修饰，其包括但不限于-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-S＝O、OC-NH-、-CH2-O-、-CH2-CH2-、S＝C-NH-和-CH＝CH-，以及骨架修饰例如修饰的肽键。肽内的肽键(-CO-NH-)可以被以下取代：例如N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)；酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)H-N)；酮亚甲基键(-CO-CH2-)；a-氮杂键(a-azabond)(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基，例如甲基；碳代键(carba bond)(-CH2-NH-)；羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)；硫代酰胺键(-CS-NH)；烯烃双键(-CH＝CH-)；和肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是“正常”侧链，天然存在于碳原子上。这些修饰可以发生在沿肽链的一个或多个键上，甚至同时发生在几个(例如，2-3个)键上。

本发明还包括肽衍生物和类似物，其中游离氨基已经衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰氨基、苄氧羰基氨基、叔丁氧基羰基氨基、氯乙酰氨基或甲酰氨基。游离羧基可以衍生形成例如盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。组氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-咪唑(im)-苄基组氨酸。

如本文所用，术语“盐”是指羧基的盐和肽分子的氨基或胍基的酸加成盐。羧基的盐可以通过本领域已知的方法形成，并且包括无机盐(例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等)，以及使用有机碱的盐，例如与胺(例如三乙醇胺、哌啶、普鲁卡因等)形成的盐。酸加成盐包括例如使用无机酸(例如乙酸或草酸)的盐。本文的盐还描述了添加到肽溶液中以增强水凝胶形成和/或钙矿物质矿化的离子组分。

肽类似物还可以含有非天然氨基酸。非天然氨基酸的实例包括但不限于肌氨酸(Sar)、正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、高丝氨酸、异丙基赖氨酸、3-(2'-萘基)-Ala、烟酰Lys、氨基异丁酸和3-(3'-吡啶基-Ala)。

此外，肽类似物可以含有其他衍生的氨基酸残基，其包括但不限于甲基化氨基酸、N-苄基化氨基酸、O-苄基化氨基酸、N-乙酰化氨基酸、O-乙酰化氨基酸、苄氧羰基取代的氨基酸等。具体实例包括但不限于甲基-Ala(MeAla)、MeTyr、MeArg、MeGlu、MeVal、MeHis、N-乙酰基-Lys、O-乙酰基-Lys、苄氧羰基-Lys、Tyr-O-苄基、Glu-O-苄基、苄基-His、Arg-甲苯磺酰基、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸等。

本发明进一步包括肽类似物，其可以含有一种或多种D-同质异构体形式的氨基酸。其中至少一种氨基酸并且可能所有氨基酸都是D-氨基酸的逆反D-氨基酸肽的生产在本领域中是众所周知的。当肽中的所有氨基酸都是D-氨基酸，并且分子的N-和C-末端颠倒时，结果是具有相同结构基团的分子位于与在L-氨基酸形式的分子中相同的位置。然而，分子对蛋白水解降解更稳定，因此可用于本文所述的许多应用。非对映肽可能比具有相同氨基酸序列的所有L-或所有D-氨基酸肽高度有利，因为它们具有更高的水溶性、更低的免疫原性和对蛋白水解降解的更低敏感性。如本文所用，术语“非对映肽”是指同时包含L-氨基酸残基和D-氨基酸残基的肽。本发明的非对映肽中D-氨基酸残基的数量和位置可以是可变的，只要该肽能够显示延长嵌合多肽的半衰期的功能。

在一个实施方式中，源自NKp44的肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。在一个实施方式中，源自NKp44的肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

在一个实施方式中，源自NKp44的肽是糖基化的。在一个实施方式中，源自NKp44的肽的序列包含至少一个糖基化位点、2个糖基化位点、3个糖基化位点、4个糖基化位点、5个糖基化位点、6个糖基化位点、7个糖基化位点、8个糖基化位点、10个糖基化位点、11个糖基化位点、12个糖基化位点或13个糖基化位点。在一个实施方式中，糖基化位点是“N-连接的”糖基化位点和/或“O-连接的”糖基化位点。

如本文所用，“N-连接的”糖基化位点包括但不限于天冬酰胺(Asn)，后跟X-丝氨酸、X-苏氨酸和X-半胱氨酸中的任一个，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且糖基化发生在Asn残基上。在本发明中，位于两个N-连接的位点的N-末端、C-末端或在两个N-连接位点之间的任何多肽的氨基酸序列可以具有适合具体设计要求所需的任何内容物和长度。如本文所用，“O-连接”糖基化可发生在任何丝氨酸或苏氨酸残基处，没有单一的共同核心结构或共有蛋白质序列。

另一个方面，提供了嵌合分子，其包含选自SEQ ID NO:14-18的氨基酸序列。

在一些实施方式中，嵌合分子是IL-2嵌合分子。在一些实施方式中，嵌合分子由选自SEQ ID NO:14-18的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:14。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:14组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQID NO:15。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:15组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:16。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:16组成。在一些实施方式中，嵌合分子包含SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，嵌合分子由SEQ ID NO:17组成。

另一个方面，提供了包含本发明的嵌合分子的药物组合物。

在一些实施方式中，药物组合物包含药学上可接受的运载体、赋形剂或佐剂。在一些实施方式中，组合物被配制用于全身性施用。在一些实施方式中，组合物被配制用于局部施用。在一些实施方式中，局部是局部炎症。

另一个方面，提供了特征在于增加的血清半衰期的IL-2嵌合分子在增加受试者中的调节性T细胞(T_reg)中的用途。

通过另一方面，提供了特征在于增加的血清半衰期IL-2嵌合分子，其用于增加受试者中的调节性T细胞(T_reg)。

在一些实施方式中，受试者是有需要的受试者。在一些实施方式中，IL-2嵌合分子是包含IL-2嵌合分子的药物组合物。在一些实施方式中，IL-2嵌合分子是本发明的嵌合分子。在一些实施方式中，IL-2嵌合分子是如上文所述的分子。

如本文所用，术语“约”在与值组合时是指参考值的加减10％。例如，约1000纳米(nm)的长度是指1000nm±100nm的长度。

注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，涉及“多核苷酸”包括多个此类多核苷酸，和涉及“多肽”包括涉及本领域技术人员已知的一种或多种多肽及其等价物，等等。应进一步注意，可以撰写权利要求以排除任何任选的要素。因此，本声明旨在作为在引用权利要求要素使用“唯一”、“仅”等此类排他性术语或使用“否定”限制时的先行基础。

在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，一般来说，这种结构是指本领域技术人员会理解的惯例(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有以下的系统：A单独，B单独，C单独，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起，等等)。本领域技术人员将进一步理解，实际上呈现两个或多个可选术语的任何分离词和/或短语，无论是在说明书、权利要求或附图中，都应被理解为考虑包括这些术语之一、任何一个术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合地提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的多种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。属于本发明的实施方式的所有组合都被本发明具体地包含并且在本文中被公开，就好像每个组合被单独地和明确地公开一样。此外，多种实施方式及其要素的所有子组合也被本发明具体包含并在本文中公开，就好像每个这样的子组合在本文中单独且明确地公开一样。

本发明的另外的目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员在检查以下并非旨在限制性的实施例后将变得显而易见。此外，如上文所述和如在所附权利要求章节中所要求保护的本发明的多种实施方式和方面中的每一个可在以下实施例中找到实验支持。

如上文所描述和在所附权利要求章节中要求保护的本发明的多种实施方式和方面可在以下实施例中找到实验支持。

实施例

通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在以下文献中得到了详尽的解释。参见，例如，"MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific AmericanBooks,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；methodologies as set forth in U.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659and 5,272,057；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols inImmunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic andClinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell andShiigi(eds),"Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用并入。本文档通篇提供了其他一般参考资料。

材料和方法：

质粒设计：设计蛋白质序列并将其发送至

在其中匹配人源化DNA序列，并将盒插入pCDNA-3.1(+)骨架中。蛋白质的序列包括IL-2信号肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS,SEQ ID NO:9)，后跟NCR2(Nkp-44)蛋白质的片段(34AA；残基130至163)，IL-2的完整序列(133AA；残基21至153)和第二NCR2片段(36AA；残基164至199)⁴⁵。序列以HRV 3C切割位点结束，后跟6×His标签尾部。将质粒转化入DH1α细菌并在增殖后提取。

蛋白质生产和纯化：将质粒转染到在摇瓶中培养的HEK293F细胞中。三天后，使用离心和过滤将上清液与细胞分离。FPLC过程使用

(GE

)完成，其中上清液以1：25的比例补充500mM咪唑

溶液并加载到镍离子柱(HisTrap^TM GE

)上。用500mM咪唑溶液进行洗脱。浓缩洗涤过的部分并在

中以10kDa截止值进一步清洗。使用NanoDrop^TM(ThermoFisher

)测量样品浓度，假设根据蛋白质序列使用ExPASy Protparam工具计算消光系数。然后将蛋白质稀释至1mg/mL的水平，在Eppendorf Protein LoBind管中分成小等分试验，并在-80℃下冷冻。

SDS-PAGE：将5μg蛋白质溶液在95℃的β-巯基乙醇和SDS溶液中变性持续5分钟，然后加载到SDS-PAGE 12％丙烯酰胺凝胶上，并在100V下运行。使用InstantBlue^TM

对蛋白质进行染色。

用于结合测定的ELISA：我们使用

ELISA MAX^TM试剂盒检测人IL-2。对于结合测定，将纯化的S2A与重组人IL-2，Aldesleukin(Peprotech，目录号200-02)进行比较。根据试剂盒提供的方案，用捕获抗体包被96孔ELISA板，然后在板中连续稀释蛋白质。根据试剂盒提供的方案添加捕获抗体、HRP和TMB。在650nm处，没有终止溶液的情况下，连续读取板，并选择最佳读数。将数据拟合到4参数逻辑(4PL)模型，并使用

Prism^TM5.0推算EC₅₀。

使用CTLL-2细胞进行比活度评价的MTT测定：CTLL-2细胞在补充有25单位/mL的重组人IL-2(阿地白介

Novartis PharmaG mbH,Germany)的完全RPMI中培养。在96孔板中，进行细胞因子的连续稀释。然后用PBS洗涤CTLL-2细胞3次，在96孔板中每孔以培养基体积等于孔中培养基的体积接种1×10⁴个细胞，至总共90μL，基本上减半所有孔中细胞因子的浓度。将细胞温育两天，在第三天向每个孔中加入10μL 5mg/mL MTT

溶液。进一步温育细胞以使MTT代谢，和1-2小时后，通过向每孔中加入100μL异丙醇(补充有0.5％HCl)并移液来溶解甲臜晶体。在570nm和630nm处读取板并减去结果(从570nm中减去630nm)以获得归一化结果，将其拟合到4参数逻辑(4PL)模型并使用

Prism^TM 5.0推算ED⁵⁰。按以下公式计算比活度：

注射用细胞因子的制备：根据CTLL-2测定确定每种细胞因子可用的单位数量。在实验之前，考虑到由于两个解冻循环导致的28％损失，按照需要注射的单位量制作细胞因子的等分试样。计算等分试样的体积和稀释度，以适应每只小鼠100μL的注射体积。在无菌PBS 1×溶液

中进行稀释。然后将等分试样在-80℃下重新冷冻直至注射时间。载体是PBS 1×溶液。

药代动力学：小鼠(每组5只小鼠)在时间0接受皮下(SC)注射阿地白介素(180pmol，8,000单位)和S2A(15pmol、30pmol和60pmol，分别对应于3,000单位、6,000单位和12,000单位)。在给药前，在10和30分钟，然后在1、2、4、24、30、42和72小时从尾静脉收集血样(10μL)。向样品添加Alsever的溶液(200μL)以防止凝结，并将它们储存在-80℃等待分析。使用用于检测人IL-2的

ELISA MAX^TM试剂盒基于适当的校准曲线测量阿地白介素和S2A的血液浓度。使用

Excel^TM46的PKSolver 2.0插件对每只小鼠分别进行观察到的浓度对比时间数据的非隔室药代动力学分析，并通过治疗后分析取平均值。

PBMC分离和FACS分析：将200μL血液收集到包被有EDTA的管中以防止凝结，并立即添加到1mL的Alsever溶液中。在实验室制作的ACK缓冲液中裂解红细胞。对WBC进行计数，并将每个样品的100,000个细胞转移到96孔板的孔中，在此进行后续程序。用抗CD16/CD32(

克隆：3)封闭细胞，和用抗CD45PE/Cy7(

克隆：30-F11)、抗CD4 FITC(

克隆：GK1.5)、抗CD8 Pacific Blue(

克隆：53-6.7)、抗CD25 PE(

克隆：PC61)和抗CD69 APC/Cy7(

克隆：H1.2F3)染色膜蛋白。然后使用TruNuclear^TM试剂盒

固定和透化细胞，并用抗FoxP3APC(Thermo Fisher

克隆：FJK-16s)染色。然后在Beckman

Gallios^TM流式细胞仪中读取细胞。使用Kaluza^TM2.1对结果进行门控和分析。

免疫组织化学：使用全自动旋转切片机(Leica RM2255)从FFPE块上切下5μm厚的组织切片。使用苏木精(Mayer)和1％酒精伊红(Pioneer Research Chemical Ltd,UK)染色评估组织形态。对于IHC染色，组织切片用二甲苯连续脱蜡(3次，持续5分钟)，然后用无水乙醇再水化(2次，5分钟)。切片的内源性过氧化物酶活性用3％甲醇的H₂O₂溶液淬灭20分钟。用双倍蒸馏水洗涤后，在95℃下使用柠檬酸盐缓冲液pH6.0(Zytomed)作为抗原暴露溶液进行抗原修复。然后清洗切片，并根据制造商的封闭方案使用ImmPRESS通用试剂(VectorLaboratories，MP-7500)。在封闭后，切片在4℃下与针对FoxP3的一抗(1:50稀释，BioLegend，目录号-320001)一起温育过夜。充分洗涤后，切片然后与来自ImmPRESS通用试剂(Vector Laboratories，MP-7500)的HRP缀合的二抗一起温育30分钟。最后，根据制造商的方案，使用AEC溶液(Zymed Laboratories，SanFrancisco，CA，USA)观察染色，在水中停止反应，用苏木精复染，组织切片用水性封固剂(Vectamount^TMAQ，目录号-H-5501)封固。

组织图像由全景扫描仪扫描并由HistoQuant^TM软件(3D Histech)分析。对于FoxP3染色，软件计算每个组织的阳性细胞核数量和注释面积，并且该值表示为对象频率(pcs/mm²)。

朴素模型：从

获得8周龄的C57bl/6WT小鼠并注射30,000IU的阿地白介素、S2A和相同体积的PBS(第0天)。在第3天抽血并分离PBMC用于流式细胞术(如“PBMC分离和FACS分析”小节中所述)。一天后(第4天)以相同方式再次注射小鼠。在第7天，处死小鼠，抽血并分离PBMC用于流式细胞术。

伊文思蓝：在用于T细胞诱导的体内朴素模型中处死的当天，用无菌PBS中新鲜制备的100μl 2％伊文思蓝溶液静脉内注射小鼠。让小鼠休养并保持活动两小时，然后收获肺，在PBS中洗涤两次，并放入含有2mL甲酰胺的管中，并在37℃下温育24小时。温育后，在650nm处测量上清液的吸光度，并与伊文思蓝标准曲线进行比较。

转移性黑色素瘤模型：B16-BL8细胞在完全RPMI中培养。从

获得8周龄C57bl/6WT小鼠，并在实验前适应环境。注射前，洗涤细胞并在无血清RPMI培养基中悬浮。在第0天，每只小鼠在尾静脉中静脉内注射1×10⁵个细胞(在100μl培养基中，无任何补充剂)。在细胞因子注射之前，允许小鼠在肺中发展转移5天。如“注射用细胞因子的制备”标题下所述，每只小鼠被注射30,000单位的溶解在PBS 1×中的相应细胞因子，每次注射的总体积为100μl。载体是PBS×1。在B16-BL8接种5天后，每4天皮下给予注射。在第18天收集血样(处死)。如上所述，对PBMC进行染色和分析。在第18天，处死小鼠，收获肺并称重。如“免疫组织化学”章节所述，对切离的肺进行免疫组织化学。

结肠炎模型：为了诱导结肠炎，从

获得的6周龄C57bl/6WT小鼠在饮用水中给予2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS，

)持续一周(定义为DSS期)。在此期间，小鼠在第2天和第6天被注射两次细胞因子，从DSS施用开始算起。在第8天，每组中的一半小鼠被处死。抽血并取出结肠和测量长度。来自结肠的样本被固定用于IHC。在第15天以相同方式处死之前，让其余的小鼠恢复一周(给予不含DSS的淡水)。在整个实验过程中每天对小鼠称重。还通过使纸巾接触小鼠肛门并检查污渍来跟踪腹泻和便血的临床表现。临床评分是通过将体重减轻百分比与临床表现(体重：减轻1-5％-1分、减轻6-10％-2分、减轻11-20％-3分、超过20％-4分。粪便稠度：形成良好-0分，半成形粪便-2分，液体粪便-4分)相结合完成的。如“注射用细胞因子的制备”部分所述，每只小鼠注射30,000单位的溶解在PBS1×中的相应细胞因子，每次注射的总体积为100μL。载体是PBS1×。如上所述，对PBMC进行染色和分析。通过求和以下参数对IHC评分：损伤深度(无-0分，粘膜和粘膜下层-2分，透壁-3分)，隐窝损伤(无-0分，基底三分之一受损-1分，基底两三分之二受损–2分，仅表面上皮完整–3分，整个隐窝和上皮丢失–4分)、组织受累百分比(1-25％-1分，26-50％-2分，51-75％-3分，76-100％-4分)，免疫细胞浸润百分比(1-25％-1分，26-50％-2分，51-75％-3分，76-100％-4分)。

类风湿性关节炎模型：这些小鼠随着年龄自发地发展类风湿性关节炎。对于这个实验，在3周龄时，选择出现临床症状之前的小鼠。然后使用数字卡尺测量后肢关节，每周两次。如“注射用细胞因子的制备”章节所述，每只小鼠注射100,000单位分别溶解在PBS中的细胞因子，每次注射的总体积为100μL，以PBS 1×作为载体。每四天给予注射，总计7个剂量。在第21天，采血，并如上所述对PBMC进行染色和分析。

统计：学生t检验和曼-惠特尼U检验是使用利用了‘SciPy’库的统计模块的python脚本执行的。使用‘pandas’库计算平均值、中位数、置信区间和倍数。在Statistica^TM中计算方差分析。

实施例1：用源自NKp44的序列修饰IL-2

先前，发明人将源自NKp44同种型2的铰链区的氨基酸序列(NP_001186438.1，SEQID NO:1)定义为能够延长人生长激素的生物半衰期(T_1/2)。这些序列分别包括NKp44同种型2的SPA序列(SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:1的残基130至163的34个氨基酸)和APE序列(SEQ IDNO:3；SEQ ID NO:1的残基164至199的36个氨基酸)。因此，这些序列与表现出非常短的体内半衰期的蛋白质(例如IL-2)组合进行了测试。如图1A所示，产生了嵌合人IL-2，其中野生型人IL-2(NP_000577.2，SEQ ID NO:13，残基21至153，无信号肽)分别在N末端和C末端侧接SPA序列和APE序列。这种重组修饰的人IL-2被称为S2A(SEQ ID NO:4)。NKp44铰链区被高度糖基化，尤其是O-聚糖。SPA和APE的糖基化导致S2A的表观分子量接近50kDa(图1B)，与其相对，基于S2A的AA序列计算的分子量为26kDa。接下来测试SPA和APE修饰是否改变了S2A的IL-2组分的结构和体外功能。使用商业夹心ELISA来测试纯化的S2A和可商购的重组人IL-2，称为Aldesleukin(Peprotech，目录号200-02)。Aldesleukin的基于ELISA测量的EC50为7.5pg/ml，而S2A的测量的EC50为13.4pg/ml(图1C)。这种差异可能是实验误差，这是由于糖基化对消光系数的影响，或者由于SPA和APE添加对S2A中IL-2组分结构的影响，如由在这种商业夹心ELISA中的捕获和检测抗IL-2抗体所识别的。

ELISA结果显示SPA和APE修饰对IL-2结构的影响可以忽略不计。接下来，测试了这种修饰的体外功能影响。CTLL-2测定是计算以IU/mg为单位测量的IL-2比活度的标准测定。因此，CTLL-2测定用于比较S2A和临床中使用的Aldesleukin药物(阿地白介

)的体外功能。CTLL-2测定平均测量的Peoleukin的平均有效剂量(ED50)为340pg/ml，而测量的S2A的ED50为135pg/ml，接近一半(图1D)。这种差异不能归因于具体实验的实验误差范围。比较S2A和阿地白介素的5个不同CTLL-2实验的总结表明S2A和阿地白介素之间ED50的倍数变化确实接近一半(图1E)，这意味着与阿地白介素相比，S2A每mg蛋白质具有更高的IU，并且是因此更有效地刺激CTLL-2细胞的增殖。S2S、A2A和A2S也发现了类似的结果，因为它们也被发现优于阿地白介素。

实施例2：S2A和阿地白介素的药代动力学分析

为了比较皮下(SC)接种后S2A和阿地白介素的PK，给小鼠组(n＝5)注射一次剂量的S2A或阿地白介素。S2A的剂量为3000IU(15pmol)、6000IU(30pmol)或12000IU(60pmol)或阿地白介素的剂量为8000IU(180pmol)。首先在“0分钟”时间取血，然后皮下注射蛋白质。在所有随后的时间点，在没有另外注射蛋白质的情况下采集血样。稀释血液并保持冷冻。实验结束后，将样品解冻，通过ELISA分析并计算pmol/ml血液。图2A显示了计算的PK曲线。对于3种不同剂量的S2A，代表药物的生物利用度(被吸收并到达体循环的药物的分数)的曲线下面积(AUC)分别为5.8、8.5和15.2pmol/ml*min。相比之下，与S2A剂量的15、30和60pmol(3,000、6,000和12,000IU)相比，即使接种剂量为180pmol(8,000IU)，阿地白介素的AUC值也要低得多(2.86)。根据这些观察，计算出S2A的清除半衰期(T1/2清除率)接近1,000分钟(3剂量分别为1,084、937和1123分钟)，而阿地白介素的T1/2清除率显著更低(35分钟)。与AUC和T1/2清除的值的明显差异相反，代表血液中观察到的最大药物浓度的S2A和阿地白介素的Cmax值非常相似。60pmol(12,000IU)S2A的接种剂量导致0.009pmol/ml(1.77IU/ml)Cmax；而180pmol(8000IU)阿地白介素的剂量导致0.022pmol/ml(0.99IU/ml)Cmax。有趣的是，阿地白介素达到Cmax(Tmax)的时间明显更快(48分钟vs 12,000IU S2A的156分钟)，表明阿地白介素比S2A更快地被血液吸收，从而使S2A有效地成为缓释分子。对于两种其他IL-2嵌合分子S2S和A2A观察到类似的结果(图2B)。

实施例3：S2A接种诱导大量水平的T_reg

在第0天和第4天用30,000单位的S2A、阿地白介素和载体接种小鼠两次，并在第3天和第7天评估血液PBMC的表型。以下谱系和活化标志物被染色：CD45、CD4、CD8、CD25、FoxP3和CD69(图3A)。与载体相比，阿地白介素和S2A处理没有介导CD45⁺PBMC的CD4⁺分数的实质性变化。CD45⁺PBMC的CD8⁺分数在第3天被S2A处理轻微诱导(图3B)，尽管这种效果在第7天没有统计学显著性且未观察到(图3C)。然而，当针对CD25标志物染色细胞时，观察到了不同的模式；S2A，而不是阿地白介素处理表现出对CD45⁺PBMC中CD4⁺CD25⁺亚群的显著诱导(与载体相比的5.6倍)(图3B-3C，在第7天显著)。这种增强在S2A的两次接种后的第7天更为明显(图3C)。CD45⁺细胞中CD8⁺CD25⁺亚群的分数可以忽略不计。当针对经典的T_reg表型(CD4⁺细胞内的CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群)染色细胞时，S2A处理的效果更加突出，在第7天变得越来越明显，观察到T_reg增强了6.1倍(图3B-3C)。与载体相比，阿地白介素处理诱导的经典T_reg的量可忽略不计。对于CD8⁺细胞，CD25⁺FoxP3⁺细胞的数量可忽略不计，并且在阿地白介素和S2A之间相似。最后，评估了CD25⁺CD69⁺活化的T细胞的分数。与CD4⁺群体中CD25⁺FoxP3⁺细胞的明显增强的分数相比，S2A处理的小鼠的CD4⁺和CD8⁺PBMC细胞中CD25⁺CD69⁺亚群的分数可忽略不计。总而言之，用S2A处理而不是用阿地白介素处理诱导了经典T_reg表型的明显扩增；对于CD8⁺或CD4⁺细胞中的CD25⁺CD69⁺表型，没有观察到这种明显效果，这表明缺乏T细胞活化。

实施例4：S2A接种增强TME内B-16的生长和T_reg的频率

给小鼠(每个处理n＝5)注射100,000个黑色素细胞系B16BL8细胞，并在接下来的6天允许在肺中形成转移，此时给小鼠接种30,000单位S2A、阿地白介素和等效量的载体。每4天重复接种小鼠。最后一次注射后第4天，处死小鼠，取出肺。无论处理如何，所有肺都在肺表面出现黑色素结节(图4A)。为了评估肺部肿瘤的质量，对肺部进行称重。发现从用S2A治疗的小鼠中取出的肺比从用阿地白介素或载体处理的小鼠中取出的肺显著更重(分别为1.3倍和1.5倍)(图4B)，表明癌症扩散增加。在肺上进行FoxP3的免疫组织学染色以评估结节的肿瘤微环境和组织学(图4C)。扫描并计算FoxP3阳性细胞的对象频率，发现与阿地白介素和载体相比，从S2A组取出的肺显示出这些细胞的显著更高的频率(10倍)(图4D)。此外，在处死当天提取的PBMC以与上述相似的方式染色，发现接种S2A的小鼠的CD45⁺群体的CD4⁺和CD8⁺亚群显著降低(分别为0.6倍和0.58倍)(图4E)。同时，与载体相比，CD4⁺CD25⁺和CD8⁺CD25⁺亚群被显著诱导(每个5.3倍)(图4E)。此外，与载体和阿地白介素相比，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群也显著增加(5.3倍)，CD8⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群也是如此(8.2倍)。从绝对值来看，如作为CD8⁺群体的一部分考虑的，该增加低于CD4⁺群体(经典T_Reg)的相应百分比增加。CD4⁺群体的CD4⁺CD25⁺CD69⁺亚群和CD8⁺群体的CD8⁺CD25⁺CD69⁺亚群的诱导可忽略不计(图4E)。这表明S2A确实产生了免疫抑制环境，因此不适合癌症疗法。

实施例5：用S2A治疗减少了DSS诱导的结肠炎的发展

为了测试S2A在病理环境中诱导免疫抑制的能力，通过向小鼠的饮用水中添加DSS在小鼠中诱导结肠炎。然后在DSS期的第3天和DSS期的第6天给小鼠接种30,000单位S2A、阿地白介素或等效量的媒介物。DSS期持续一周，之后小鼠在没有DSS的情况下具有一周的恢复期。在DSS期结束时，每组中一半的小鼠被处死，取出并测量它们的结肠。在恢复期后处死剩余的小鼠，取出并测量它们的结肠(图5A)。发现接种S2A的小鼠比阿地白介素组和载体组更能抵抗结肠炎。与载体组相比，S2A组的结肠长度在DSS期结束时显著更长，并且与阿地白介素组相比更长(但无统计学显著性)(图5B，左)。在恢复期之后，与载体和阿地白介素组相比，结肠长度的差异是显著的(图5B，右)。

在整个实验过程中跟踪小鼠体重和临床症状(腹泻和肛门出血)(图5C-5D)。当考虑时间和处理的影响时，计算重量减轻占初始重量的百分比，发现在双向ANOVA检验中存在显著差异(p值<0.0005)(图5C)。单独处理的效果也很显著(p值<0.0005)，并且在事后检验中，发现S2A组的体重减轻与阿地白介素组(p值<0.05)和载体组(p值<0.0005)的显著不同。临床症状与体重减轻相结合以编制临床评分。在双向ANOVA检验中，发现临床评分的显著差异(p值<0.0005)归因于处理和时间的组合作用，以及仅由于处理分量的显著差异(p值<0.0005)(图5D)。在事后检验中，发现S2A组和载体组之间的临床评分存在显著差异，但S2A和阿地白介素之间没有。尽管如此，当仅考虑恢复期，S2A组和阿地白介素组之间的统计学显著的差异是明显的(p值<0.005)。

在DSS期结束时以及在恢复期结束时分析PBMC群体。虽然在DSS期结束时(第8天)CD45⁺群体的CD4⁺子群体没有明显的相对诱导，并且CD4⁺CD25⁺子群体在所有组中占CD45⁺群体的百分比几乎可忽略不计，但与载体和阿地白介素二者相比，在S2A处理的小鼠中，CD4⁺群体的CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺(经典T_Reg)亚群被显著诱导(分别为2.7倍和1.3倍)(图5E)。CD8⁺CD25⁺FoxP3亚群在S2A组中有所诱导，但在DSS期结束时不显著(图5E)。在DSS期结束时没有测量到CD4⁺CD25⁺CD69⁺或CD8⁺CD25⁺CD69⁺亚群的显著诱导。在恢复期结束时(第16天和自上次接种后的第10天)，在任何处理的任何群体中没有显著差异是明显的(图5F)。

实施例6：用S2A处理减少了类风湿性关节炎(RA)的诱导

还测试了S2A在第二病理环境中的作用。由于无法抵消IL-1的促炎作用，IL-1受体拮抗剂敲除(IL-1raKO)小鼠在出生后3-6周自发发展类风湿性关节炎(RA)。研究了与阿地白介素相比S2A接种是否可以减轻RA的严重性和进展的问题。4周龄的小鼠(n＝5)接种100,000单位的S2A、阿地白介素或相应体积的载体。第2天开始接种，每3天进行一次，共接种7次。如所预期的，RA的迹象很快表现为后肢关节炎症和肿胀的形式(图6A)。在整个实验过程中测量关节宽度。对针对载体处理组归一化的数据进行的双向ANOVA发现虽然时间和处理的组合作用不显著，但单独的处理分量是显著的(p值<0.0005)(图6B)。在实验的第21天(第5次接种后3天)分离PBMC。与载体组相比，在第21天测量了S2A组中CD45⁺细胞的CD4⁺CD25⁺亚群的显著诱导(6.4倍，p值<0.05)。虽然它没有统计学显著性，但与阿地白介素组相比，也观察到了小的诱导(1.8倍)(图6C)。在CD8⁺CD25⁺亚型中也观察到了类似的诱导；然而，这些都没有统计学显著性。经典的T_Reg表型(CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺)在S2A组中与载体组相比显示出显著的诱导(2.1倍，p值<0.005)，并且与阿地白介素相比显示出较小且不显著的诱导(1.3倍)。CD8⁺CD25⁺FoxP3⁺水平在所有处理组中可忽略不计。

实施例7：S2A优于N88D IL-2突变体

在确定了S2A分子与野生型IL-2(阿地白介素)相比的优势后，接下来将该分子与已知的IL-2突变体N88D进行比较。已显示N88D突变体与IL-2Rβγ受体的结合减少，并诱导T_reg扩增。也已知N88K突变具有相同的效果。对实施例2中的进行了类似的实验，但在这种情况下，将S2A与N88D进行比较。

在第0天和第4天用25,000或50,000国际单位(IU)的N88D，25,000、50,000或100,000IU的S2A和载体接种小鼠两次，并在第3天和第7天评估血液PBMC的表型。无论处理如何，总CD4和CD8细胞在第3天或第7天都没有改变(图7A)。然而，对CD25阳性亚群的检查表明，S2A和N88D都增强了细胞的这一群体，然而，与N88D相比，在第3天和第7天S2A都显著优异(图7B)。还观察到CD8阳性CD25细胞的增强，尽管该亚群与CD4群体相比是次要的，并且增加仅由S2A而不是N88D引起。最值得注意的是，S2A极大地增强了CD4/CD25/FoxP3的T_reg表型，而N88D则以较小程度有所增强(图7C)。这种差异在第3天最为突出，但在第7天仍然显著。CD8/CD25/FoxP3亚群在这两天和利用所有处理都可忽略不计。

尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但很明显许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变化。

序列表

<110> 国家生物技术研究所公司

<120> 用于免疫抑制的IL-2嵌合蛋白

<130> NIBN-P-035-PCT

<150> 62/903,855

<151> 2019-09-22

<160> 17

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 270

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Trp Arg Ala Leu His Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

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115 120 125

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130 135 140

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260 265 270

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr Ser Trp Thr Pro Arg Asp Leu

1 5 10 15

Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly

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<210> 3

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 4

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成的

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Ser Pro Leu Pro Val Pro Leu Pro Ser Arg Pro Gln Asn Ser Thr Leu

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成的

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<210> 7

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 7

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1 5 10 15

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115 120 125

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

130 135 140

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

145 150 155 160

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr

165 170 175

Gln Thr Ser Trp Thr Pro Arg Asp Leu Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr

180 185 190

Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly Ala Arg

195 200

<210> 8

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210> 10

<211> 70

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr Ser Trp Thr Pro Arg Asp Leu

1 5 10 15

Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile Pro Val Pro Ser His

35 40 45

Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Pro Leu Pro Ser Arg Pro Gln Asn Ser

50 55 60

Thr Leu Arg Pro Gly Pro

65 70

<210> 11

<211> 70

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr Ser Trp Thr Pro Arg Asp Leu

1 5 10 15

Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile Pro Val Pro Ser His

35 40 45

Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Pro Leu Pro Ser Arg Pro Gln Ala Ser

50 55 60

Thr Leu Arg Pro Gly Pro

65 70

<210> 12

<211> 153

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 13

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 14

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr Ser Trp Thr Pro Arg Asp Leu

1 5 10 15

Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu

35 40 45

Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn

50 55 60

Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met

65 70 75 80

Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu

85 90 95

Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe

100 105 110

His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile Val Leu

115 120 125

Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu

130 135 140

Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile

165 170 175

Pro Val Pro Ser His Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Pro Leu Pro Ser

180 185 190

Arg Pro Gln Asn Ser Thr Leu Arg Pro Gly Pro

195 200

<210> 15

<211> 201

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 15

Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr Ser Trp Thr Pro Arg Asp Leu

1 5 10 15

Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu

35 40 45

Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn

50 55 60

Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met

65 70 75 80

Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu

85 90 95

Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe

100 105 110

His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile Val Leu

115 120 125

Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu

130 135 140

Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr

165 170 175

Ser Trp Thr Pro Arg Asp Leu Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser

180 185 190

Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly Ala Arg

195 200

<210> 16

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 16

Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile Pro Val Pro Ser His Pro Ser

1 5 10 15

Ser Pro Leu Pro Val Pro Leu Pro Ser Arg Pro Gln Asn Ser Thr Leu

20 25 30

Arg Pro Gly Pro Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

35 40 45

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

50 55 60

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

65 70 75 80

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

85 90 95

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

100 105 110

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile

115 120 125

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

130 135 140

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

145 150 155 160

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser

165 170 175

Thr Ile Pro Val Pro Ser His Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Pro Leu

180 185 190

Pro Ser Arg Pro Gln Asn Ser Thr Leu Arg Pro Gly Pro

195 200 205

<210> 17

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 17

Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile Pro Val Pro Ser His Pro Ser

1 5 10 15

Ser Pro Leu Pro Val Pro Leu Pro Ser Arg Pro Gln Asn Ser Thr Leu

20 25 30

Arg Pro Gly Pro Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

35 40 45

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

50 55 60

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile

115 120 125

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

130 135 140

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

145 150 155 160

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr

165 170 175

Gln Thr Ser Trp Thr Pro Arg Asp Leu Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr

180 185 190

Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly Ala Arg

195 200

Claims (28)

1.一种在有需要的受试者中增加调节性T细胞(T_reg)数量的方法，所述方法包括向所述受试者施用白细胞介素-2(IL-2)嵌合分子，其特征在于与野生型IL-2分子相比，血清半衰期增加，并且其中所述IL-2嵌合分子缺乏免疫球蛋白部分，从而增加受试者中的T_reg增殖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用包括施用低剂量的所述IL-2嵌合分子，其中所述低剂量是不活化CD8⁺细胞增殖、自然杀伤(NK)细胞增殖或两者的剂量。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述增加T_reg数量包括增加T_reg增殖。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下至少一种：增加所述受试者中的CD4⁺/CD25⁺细胞数量、增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺细胞数量、增加所述受试者中的CD8⁺/CD25⁺/FoxP3⁺细胞数量和不增加所述受试者中的CD69阳性免疫细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述增加T_reg数量包括治疗炎症。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述炎症是炎性疾病或自身免疫性疾病。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述自身免疫病选自炎性肠病(IBD)和关节炎。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述增加的血清半衰期包括与野生型IL-2相比至少10倍更长的清除半衰期。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述嵌合分子的特征进一步在于，与野生型IL-2相比在结合时通过IL-2受体(IL-2R)的信号传导增加，与野生型IL-2相比在结合时CTLL-2细胞的增殖诱导增加，或两者。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述IL-2选自野生型IL-2、突变以增加与T_reg结合的IL-2、突变以降低与CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞结合的IL-2、突变以增加与IL-2R gamma(IL-2Rγ)结合的IL-2、突变以降低与IL-2R beta(IL-2Rβ)的结合的IL-2。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述野生型IL-2包含SEQ ID NO:13并且其中所述突变的IL-2包含SEQ ID NO:8。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述嵌合分子以比野生型IL-2更高的亲和力结合CD25。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述嵌合分子包含NKp44铰链区部分。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述部分选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述NKp44部分附接至所述IL-2的N末端、C末端或两者。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述嵌合分子包含附接至所述IL-2的N末端和C末端的NKp44部分。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述NKp44部分是糖基化的。

18.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述嵌合分子包含选自SEQ IDNO:4、5、6、7、14、15、16和17的氨基酸序列。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述嵌合分子包含选自SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:14的氨基酸序列。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述嵌合分子包含SEQ ID NO:6。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述施用是施用低剂量的所述IL-2嵌合分子，其中所述低剂量是所述IL-2嵌合分子的国际单位(IU)/天与低剂量野生型IL-2疗法的IU/天的等效数量。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述低剂量是低于5×10⁶IU/天的剂量。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述施用是施用与野生型IL-2疗法相比减少的给药方案，并且其中所述减少的给药方案包括比每天更小频率地给药。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述减少的给药方案包括每2-4天给药。

25.一种嵌合分子，其包含选自SEQ ID NO:14-18的氨基酸序列。

26.根据权利要求21所述的嵌合分子，其由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。

27.一种药物组合物，其包含权利要求25或26的嵌合分子和药学上可接受的运载体、赋形剂或佐剂。

28.一种IL-2嵌合分子，特征在于与野生型IL-2分子相比血清半衰期增加并且缺乏免疫球蛋白结构域，其用于在有需要的受试者中增加调节性T细胞(T_reg)数量。

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