CN114778641B - 一种核酸适配体电化学生物传感器探测头、制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸适配体电化学生物传感器探测头、制备及其应用,属于生物传感器检测技术领域。包括自下而上依次设置的胶粘性基底、Bi2Se3单晶层、金纳米颗粒层和绝缘层,绝缘层上开有样品孔。Bi2Se3单晶层与金纳米颗粒层结合,可以为生物分子的固定提供良好的微环境,并可促进电极表面的电子转移。通过靶诱导电极表面核酸适配体构形的变化,导致电子转移效率的变化,进而可以采用电化学测试的方法,通过观察电信号的变化来检测目标分子,实现对目标蛋白的定量检测,且检测线性范围宽。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体电化学生物传感器探测头、制备及其应用,属于生物传感器检测技术领域。
背景技术
电化学生物传感器是以生物活性物质为敏感元件,以电极作为信号转换器,以电压、电流为检测信号的生物传感器。近年来,用于检测特定DNA序列或蛋白质的核酸适配体电化学生物传感器在临床诊断、环境分析和食品安全监测方面越来越受到关注。核酸适配体具有如下优点:更高的化学稳定性和热稳定性、易于修饰和合成、在某些极端条件下能够抵抗由于靶标结合导致的变性。因此,核酸适配体成为免疫检测过程中的一种较好的抗体替代物。
目前,核酸适配体电化学生物传感器是通过在普通金电极或者玻碳电极表面固定核酸适配体作为探测头。然后对电极进行生物化学修饰,如通过加载亚甲基蓝、二茂铁等标记物作为电子供体,放大电信号;通过酶裂解辅助目标循环扩增反应,来改善电化学信号;通过支链杂交扩增反应等,放大电信号,实现目标分子的检测。然而,金电极或玻碳电极在每次使用前都要进行繁琐的打磨、抛光、清洗等步骤;且生物化学修饰过程复杂,对操作人员技术要求高、成品率低且检测灵敏度有限。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种核酸适配体电化学生物传感器探测头、制备及其应用。
为实现上述目的,本发明的技术方案如下:
一种核酸适配体电化学生物传感器工作电极探测头,包括自下而上依次设置的胶粘性基底、Bi2Se3单晶层、金纳米颗粒层和绝缘层,绝缘层上开有样品孔;
Bi2Se3单晶层的厚度为5μm~10μm,粗糙度为50pm~100pm;
金纳米颗粒层的厚度为1nm~3nm,粗糙度为100pm~300pm,金纳米颗粒的粒径为2nm~6nm。
优选的,所述Bi2Se3单晶层的长为10mm~15mm,宽为5mm~8mm。
优选的,绝缘层的厚度为0.1mm~0.3mm。
优选的,所述样品孔的孔径为1mm~3mm。
一种本发明所述的核酸适配体电化学生物传感器工作电极探测头的制备方法,所述方法步骤如下:
(1)机械剥离Bi2Se3单晶层
将胶粘性基底粘贴于Bi2Se3单晶材料表面,按压后撕下,得到附着有Bi2Se3单晶层的胶粘性基底;
(2)离子溅射金纳米颗粒层
采用离子溅射法在所述附着有Bi2Se3单晶层的胶粘性基底的Bi2Se3单晶层上沉积一层金纳米颗粒层;
(3)粘贴绝缘层
在绝缘材料表面打样品孔,将绝缘材料粘贴在金纳米颗粒层上,得到绝缘层;
(4)自组装核酸适配体
将含核酸适配体的缓冲溶液加入样品孔中,核酸适配体与金纳米颗粒自组装结合,牛血清白蛋白V(BSA)封闭未结合的金纳米颗粒,得到一种核酸适配体电化学生物传感器探测头。
优选的,所述胶粘性基底为粘性胶带,所述绝缘材料为绝缘胶带。
优选的,步骤(2)中,离子溅射时,真空度小于等于6×10-2mBar,离子溅射靶材为金靶,溅射电流为20mA~30mA,溅射时间为5s~20s。
一种本发明所述的核酸适配体电化学生物传感器探测头的应用,将所述探测头固定在铂片电极上作为工作电极,银/氯化银电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,得到三电极体系;三电极体系放置于pH为7的Tris-HCl电解液中,与电化学工作站组装得到一种核酸适配体电化学生物传感器;将目标蛋白滴加到所述探测头的样品孔中,目标蛋白与核酸适配体相互作用后,采用方波伏安法对所述目标蛋白进行定量检测。
优选的,所述Tris-HCl电解液中含有铁氰化钾、亚铁氰化钾和氯化钾,铁氰化钾和亚铁氰化钾的浓度相同且为1mmol/L~10mmol/L;氯化钾的浓度为0.1~0.2mol/L。
优选的,所述核酸适配体电化学生物传感器用于对γ-干扰素(γ-IFN)进行定量检测,所述核酸适配体的核酸序列为:
5’-NH2-C6-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTCCAACCCC-C6-SH-3’。
有益效果
本发明提供了一种核酸适配体电化学生物传感器工作电极探测头,Bi2Se3单晶层完整连续的层状结构保护了其狄拉克锥形的拓扑表面态,有利于电荷的传递,发挥了较高拓扑材料性能,且性能稳定,具有良好的生物相容性,可作为电化学检测的固液界面。Bi2Se3单晶层与金纳米颗粒层结合,可以为生物分子的固定提供良好的微环境,并可促进电极表面的电子转移。其中,Bi2Se3单晶层过薄,材料中有断点,检测不出电信号;Bi2Se3单晶层过厚,检测出的电化学信号不稳定。金纳米颗粒层过薄,与核酸适配体结合不牢固;金纳米颗粒层过厚,阻碍了Bi2Se3拓扑绝缘体的拓扑表面态对电荷的传递作用,使传感器探测灵敏度降低。绝缘层过薄,不易控制样品孔的孔径;绝缘层过厚阻碍电解液和工作电极探测头的充分作用,检测出的电化学信号弱。
本发明提供了核酸适配体电化学生物传感器工作电极探测头的制备方法,直接在镀有金纳米颗粒的Bi2Se3拓扑材料上自组装环状核酸适配体就形成了电化学生物传感器工作电极的探测敏感区。所述方法简单、快速、易于操作,成本低,适用于规模化生产。
本发明提供了一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的应用,将所述探测头夹在多用铂片电极夹上作为核酸适配体电化学生物传感器的工作电极,参比电极为银/氯化银电极,对电极为铂丝电极。三电极体系放置于Tris-HCl电解液(PH=7)中,与电化学工作站构成电化学生物传感器体系。该体系易于操作,测试结果准确。
本发明提供了一种核酸适配体电化学生物传感器体系的应用,通过靶诱导电极表面核酸适配体构形的变化,导致电子转移效率的变化,进而可以采用电化学测试的方法,通过观察电信号的变化来检测目标分子,实现对目标蛋白的定量检测,且检测线性范围宽。其中对IFN-γ的线性范围可以达到1.0×10-7g/mL~1.0×10-12g/mL;且检测极限低,灵敏度高,能够达到1.0×10-12g/mL。且所述工作电极具有良好的稳定性。
附图说明
图1为实施例中所述探测头的结构示意图。
图2为实施例1通过电化学测试获得的不同浓度IFN-γ的方波伏安图。
图3为实施例2通过电化学测试获得的不同浓度IFN-γ的方波伏安图。
其中a-f曲线IFN-γ的浓度依次为1.0×10-12g/mL、1.0×10-11g/mL、1.0×10-10g/mL、1.0×10-9g/mL、1.0×10-8g/mL、1.0×10-7g/mL。
图4为实施例3中的方波伏安图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例中:
(1)所用的离子溅射/热蒸发一体化镀膜系统的厂家为英国Quorum公司,型号为Q150R ES。
(2)所用的电化学工作站的型号为上海辰华CHI650E。
(3)所述Tris-HCl缓冲液包含100mM的Trizma盐酸盐溶液和100mM NaCl。
(4)所用的蓝色塑料粘性胶带为Ultron Systems公司生产,型号为1035R-1.0。
(5)所用的电镀绝缘胶带为3M的1600#无铅电工胶带。
(6)如图1所示,一种所述核酸适配体电化学生物传感器工作电极探测敏感区,包括自下而上依次设置的胶粘性基底1、Bi2Se3单晶层2、金纳米颗粒层3和绝缘层4,绝缘层4上开有样品孔,核酸适配体5封闭在样品孔内。
Bi2Se3单晶层2的厚度为5μm~10μm,粗糙度为50pm~100pm。
金纳米颗粒层2的厚度为1nm~3nm,粗糙度为100pm~300pm,金纳米颗粒的粒径为2nm~6nm。
绝缘层4的厚度为0.1mm~0.3mm。
所述样品孔的孔径为1mm~3mm。
实施例1
一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的制备方法,所述方法步骤如下:
(1)机械剥离Bi2Se3单晶层
将蓝色塑料粘性胶带粘贴于Bi2Se3单晶材料表面,手指稍作用力按压,快速将蓝色塑料粘性胶带从Bi2Se3单晶材料表面撕下。蓝色塑料粘性胶带上即附着一层Bi2Se3单晶层;所述Bi2Se3单晶层长为12mm,宽为6mm,单晶层厚度均匀为7μm,表面平整干净,粗糙度为50pm。
(2)离子溅射喷镀金纳米颗粒层
将附着有Bi2Se3单晶层的蓝色塑料粘性胶带放置于离子溅射/热蒸发一体化镀膜系统中,离子溅射所用的金属靶为金靶,并使Bi2Se3单晶层面向金靶;抽真空,使系统真空度小于等于6×10-2mBar,设置溅射电流为23mA,溅射时间为10s;离子溅射完成后,Bi2Se3单晶层上均匀分散着一层金纳米颗粒层,平均厚度为2nm,粗糙度为200pm,金纳米颗粒的平均粒径为3nm。
(3)粘贴绝缘层
用2mm孔径的打孔器在电镀绝缘胶带上打圆孔即为样品孔;孔边缘距离电镀绝缘胶带边缘保留3mm距离;将带有圆孔的电镀绝缘胶带粘贴到金纳米颗粒层表面,使金纳米颗粒从圆孔部分暴露出来,并且有部分Bi2Se3单晶层直接暴露在电镀绝缘胶带外,其余Bi2Se3单晶层被覆盖在电镀绝缘胶带下。后续实验操作只修饰圆孔部分。
(4)自组装核酸适配体
环状适配体初始浓度为100μM,用Tris-HCl缓冲液将其稀释到1μM。用移液枪取10μL含有环状核酸适配体的缓冲溶液滴加到圆孔内,在4℃下孵育14h,孵育完成后,去除表面缓冲溶液,用超纯去离子水反复清洗圆孔3次,以去除未自组装在金纳米颗粒层表面的环状核酸适配体,并在室温(25℃)下干燥;
其中,所述环状适配体的核酸序列为:
5’-NH2-C6-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTCCAACCCC-C6-SH-3’。
(5)牛血清白蛋白V(BSA)封闭
用移液枪取10μL体积分数为5%牛血清白蛋白V(BSA)缓冲溶液加入到所述探测头的圆孔内,在室温(25℃)下孵育1h,使没有与环状核酸适配体结合的金纳米颗粒封闭,以去除非特异性吸附。孵育结束后,用超纯去离子水反复清洗圆孔部分3次,以去除多余的牛血清白蛋白V(BSA)缓冲溶液,得到一种核酸适配体电化学生物传感器探测头。
(6)核酸适配体电化学生物传感器工作电极制备
用铂片电极夹夹住直接暴露在电镀绝缘胶带外的Bi2Se3单晶层部分。漏出孔边缘距离电镀绝缘胶带边缘保留的3mm距离,得到工作电极;参比电极为银/氯化银电极,对电极为铂丝电极,得到三电极体系;将所述三电极体系放置于Tris-HCl电解液(PH=7)中,与电化学工作站构成一种核酸适配体电化学生物传感器。
所述Tris-HCl电解液(PH=7)中含有铁氰化钾(K3Fe(CN)6)、亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)和氯化钾(KCl),铁氰化钾和亚铁氰化钾的浓度均为5mmol/L;氯化钾的浓度为0.1mol/L。
利用本实施例构建的核酸适配体电化学生物传感器体系对目标蛋白IFN-γ进行检测,检测方法为:
(1)目标蛋白预处理
用Tris-HCl缓冲液将含有IFN-γ浓度为1.0×10-7g/mL的缓冲溶液逐步稀释到1.0×10-8g/mL、1.0×10-9g/mL、1.0×10-10g/mL、1.0×10-11g/mL、1.0×10-12g/mL一系列浓度梯度的IFN-γ缓冲液。
(2)定量检测不同浓度目标蛋白
用移液枪取10μL不同浓度IFN-γ缓冲溶液分别滴加到多个所述探测头的圆孔中,在35℃的条件下,使不同浓度IFN-γ分别和环状核酸适配体相互作用1h。孵育结束后,用超纯去离子水反复清洗圆孔部分3次,以清洗掉未完成相互作用的IFN-γ,在室温下干燥。
用所述核酸适配体电化学生物传感器体系进行不同浓度IFN-γ的定量检测。
所述目标蛋白定量检测过程的电化学测试方法为方波伏安法。
其中,方波伏安法(SWV)测试的参数:初始电位为-0.5V,最高电位为1.0V,脉冲步长为0.004V,脉冲幅度为0.04V,频率为10Hz。
方波伏安法(SWV)测试的结果如图2所示:从图中可以看出,IFN-γ浓度在1.0×10-7g/mL~1.0×10-12g/mL范围内,SWV峰值电流随着IFN-γ浓度的增加而下降。这是因为IFN-γ与环状核酸适配体特异性识别,导致核酸适配体构象发生改变,核酸适配体环状结构被展开,IFN-γ结合在其上,由于表面覆盖一层生物大分子,阻碍了氧化还原对[Fe(CN)6]3-/4-与电极表面的电荷交换,导致固液界面电子转移效率的变低,从而电信号变弱。所以本实施例构建的核酸适配体电化学生物传感器体系能够检测出浓度为1.0×10-7g/mL~1.0×10-12g/mL的IFN-γ,最低检测限可达1.0×10-12g/mL。
实施例2
一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的制备方法,所述方法步骤如下:
(1)机械剥离Bi2Se3单晶层
将蓝色塑料粘性胶带粘贴于Bi2Se3单晶材料表面,手指稍作用力按压,快速将蓝色塑料粘性胶带从Bi2Se3单晶材料表面撕下。蓝色塑料粘性胶带上即附着一层Bi2Se3单晶层;所述Bi2Se3单晶层长为10mm,宽为7mm,单晶层厚度均匀为10μm,表面平整干净,粗糙度为100pm。
(2)离子溅射喷镀金纳米颗粒层
将附着有Bi2Se3单晶层的蓝色塑料粘性胶带放置于离子溅射/热蒸发一体化镀膜系统中,离子溅射所用的金属靶为金靶,并使Bi2Se3单晶层面向金靶;抽真空,使系统真空度小于等于6×10-2mBar,设置溅射电流为25mA,溅射时间为20s;离子溅射完成后,Bi2Se3单晶层上均匀分散着一层金纳米颗粒层,平均厚度为3nm,粗糙度为300pm,金纳米颗粒的平均粒径为4nm。
(3)粘贴绝缘层
用2mm孔径的打孔器在电镀绝缘胶带上打圆孔即为样品孔;孔边缘距离电镀绝缘胶带边缘保留2mm距离;将带有圆孔的电镀绝缘胶带粘贴到金纳米颗粒层表面,使金纳米颗粒从圆孔部分暴露出来,并且有部分Bi2Se3单晶层直接暴露在电镀绝缘胶带外,其余Bi2Se3单晶层被覆盖在电镀绝缘胶带下。后续实验操作只修饰圆孔部分。
(4)自组装核酸适配体
环状适配体初始浓度为100μM,用Tris-HCl缓冲液将其稀释到100nM。用移液枪取15μL含有环状核酸适配体的缓冲溶液滴加到圆孔内,在4℃下孵育16h,孵育完成后,去除表面缓冲溶液,用超纯去离子水反复清洗圆孔3次,以去除未自组装在金纳米颗粒层表面的环状核酸适配体,并在室温(25℃)下干燥;
其中,所述环状适配体的核酸序列为:
5’-NH2-C6-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTCCAACCCC-C6-SH-3’。
(5)牛血清白蛋白V(BSA)封闭
用移液枪取15μL体积分数为5%牛血清白蛋白V(BSA)缓冲溶液加入到所述探测头的圆孔内,在室温(25℃)下孵育30min,使没有与环状核酸适配体结合的金纳米颗粒封闭,以去除非特异性吸附。孵育结束后,用超纯去离子水反复清洗圆孔部分3次,以去除多余的牛血清白蛋白V(BSA)缓冲溶液,得到一种核酸适配体电化学生物传感器探测头。
(6)核酸适配体电化学生物传感器工作电极制备
用铂片电极夹夹住直接暴露在电镀绝缘胶带外的Bi2Se3单晶层部分。漏出孔边缘距离电镀绝缘胶带边缘保留的2mm距离,得到工作电极;参比电极为银/氯化银电极,对电极为铂丝电极,得到三电极体系;将所述三电极体系放置于Tris-HCl电解液(PH=7)中,与电化学工作站构成一种核酸适配体电化学生物传感器。
所述Tris-HCl电解液(PH=7)中含有铁氰化钾(K3Fe(CN)6)、亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)和氯化钾(KCl),铁氰化钾和亚铁氰化钾的浓度均为5mmol/L;氯化钾的浓度为0.1mol/L。
利用本实施例构建的核酸适配体电化学生物传感器体系对目标蛋白IFN-γ进行检测,检测方法为:
(1)目标蛋白预处理
用Tris-HCl缓冲液将含有IFN-γ浓度为1.0×10-7g/mL的缓冲溶液逐步稀释到1.0×10-8g/mL、1.0×10-9g/mL、1.0×10-10g/mL、1.0×10-11g/mL、1.0×10-12g/mL一系列浓度梯度的IFN-γ缓冲液。
(2)定量检测不同浓度目标蛋白
用移液枪取15μL不同浓度IFN-γ缓冲溶液分别滴加到多个所述探测头的圆孔中,在37℃的条件下,使不同浓度IFN-γ分别和环状核酸适配体相互作用40min。孵育结束后,用超纯去离子水反复清洗圆孔部分3次,以清洗掉未完成相互作用的IFN-γ,在室温下干燥。
用所述核酸适配体电化学生物传感器体系进行不同浓度IFN-γ的定量检测。
所述目标蛋白定量检测过程的电化学测试方法为方波伏安法。
其中,方波伏安法(SWV)测试的参数:初始电位为-0.5V,最高电位为1.0V,脉冲步长为0.004V,脉冲幅度为0.04V,频率为10Hz。
方波伏安法(SWV)测试的结果如图3所示:从图中可以看出,IFN-γ浓度在1.0×10-7g/mL~1.0×10-12g/mL范围内,SWV峰值电流随着IFN-γ浓度的增加而下降。本本实施例构建的核酸适配体电化学生物传感器体系能够检测出浓度为1.0×10-7g/mL~1.0×10-12g/mL的IFN-γ,最低检测限可达1.0×10-12g/mL。
实施例3
一种核酸适配体电化学生物传感器探测头稳定性的测试方法,具体如下:
将实施例1所述探测头在4℃条件下分别保存1~14天。
用实施例1所述的核酸适配体电化学生物传感器体系分别在第1、7、14天时对一次性探测头进行稳定性测试。
所述稳定性测试过程的电化学测试方法为方波伏安法。
方波伏安法(SWV)测试的结果如图4所示:从图中可以看出7天后电信号为初始的94.4%,14天后电信号为初始的83.5%,4℃条件下保存14天,电流变化很小,说明所述探测头具有良好的稳定性。
综上所述,发明包括但不限于以上实施例,凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进,都将视为在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的应用,其特征在于:所述核酸适配体电化学生物传感器探测头通过以下方法制备得到:
(1)将胶粘性基底粘贴于Bi2Se3单晶材料表面,按压后撕下,得到附着有Bi2Se3单晶层的胶粘性基底;其中,Bi2Se3单晶层的厚度为5μm~10μm,粗糙度为50pm~100pm;
(2)在所述附着有Bi2Se3单晶层的胶粘性基底的Bi2Se3单晶层上沉积一层金纳米颗粒层;其中,金纳米颗粒层的厚度为1nm~3nm,粗糙度为100pm~300pm,金纳米颗粒的粒径为2nm~6nm;
(3)在绝缘材料表面打样品孔,将绝缘材料粘贴在金纳米颗粒层上,得到绝缘层;
(4)将含核酸适配体的缓冲溶液加入样品孔中,核酸适配体与金纳米颗粒自组装结合,BSA封闭未结合的金纳米颗粒,得到一种核酸适配体电化学生物传感器探测头;其中,含核酸适配体的缓冲溶液的浓度为1μM或100nM,缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液,核酸适配体与金纳米颗粒自组装结合时在4℃下孵育14h或16h;
所述核酸适配体电化学生物传感器用于对γ-干扰素(γ-IFN)进行定量检测,所述核酸适配体为环状核酸适配体,核酸序列为:
5’-NH2-C6-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTCCAACCCC-C6-SH-3’;
使用时,将所述探测头固定在铂片电极上作为工作电极,银/氯化银电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,得到三电极体系;三电极体系放置于pH为7的Tris-HCl电解液中,与电化学工作站组装得到一种核酸适配体电化学生物传感器;将γ-IFN滴加到所述探测头的样品孔中,γ-IFN与核酸适配体相互作用后,采用方波伏安法对所述γ-IFN进行定量检测;其中,γ-IFN与核酸适配体相互作用时,在35℃的条件下γ-IFN和环状核酸适配体相互作用1h或在37℃的条件下γ-IFN和环状核酸适配体相互作用40min;所述Tris-HCl电解液中含有铁氰化钾、亚铁氰化钾和氯化钾;方波伏安法测试的参数:初始电位为-0.5V,最高电位为1.0V,脉冲步长为0.004V,脉冲幅度为0.04V,频率为10Hz。
2.如权利要求1所述的一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的应用,其特征在于:所述绝缘层的厚度为0.1mm~0.3mm。
3.如权利要求1所述的一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的应用,其特征在于:所述样品孔的孔径为1mm~3mm。
4.如权利要求1所述的一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的应用,其特征在于:所述绝缘层的厚度为0.1mm~0.3mm;所述样品孔的孔径为1mm~3mm。
5.如权利要求1所述的一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的应用,其特征在于:所述胶粘性基底为粘性胶带,所述绝缘材料为绝缘胶带。
6.如权利要求1所述的一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的应用,其特征在于:步骤(2)中,离子溅射时,在真空度小于等于6×10-2mBar,离子溅射靶材为金靶,溅射电流为20mA~30mA,溅射时间为5s~20s。
7.如权利要求1所述的一种核酸适配体电化学生物传感器探测头的应用,其特征在于:所述Tris-HCl电解液中,铁氰化钾和亚铁氰化钾的浓度相同且为1mmol/L~10mmol/L;氯化钾的浓度为0.1~0.2mol/L。
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