CN114761429A - 新型抗cd3/抗egfr双特异性抗体及其用途 - Google Patents

新型抗cd3/抗egfr双特异性抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114761429A
CN114761429A CN202080081849.XA CN202080081849A CN114761429A CN 114761429 A CN114761429 A CN 114761429A CN 202080081849 A CN202080081849 A CN 202080081849A CN 114761429 A CN114761429 A CN 114761429A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antigen
amino acid
acid sequence
binding portion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202080081849.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114761429B (zh
Inventor
梅芹
王卓智
李竞
徐建清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Zhikang Hongyi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd filed Critical Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Publication of CN114761429A publication Critical patent/CN114761429A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114761429B publication Critical patent/CN114761429B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F16/00—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor
    • G06F16/20—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor of structured data, e.g. relational data
    • G06F16/23—Updating
    • G06F16/2365—Ensuring data consistency and integrity
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F16/00—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor
    • G06F16/20—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor of structured data, e.g. relational data
    • G06F16/25—Integrating or interfacing systems involving database management systems
    • G06F16/254—Extract, transform and load [ETL] procedures, e.g. ETL data flows in data warehouses
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F16/00—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor
    • G06F16/20—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor of structured data, e.g. relational data
    • G06F16/27—Replication, distribution or synchronisation of data between databases or within a distributed database system; Distributed database system architectures therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Computer Security & Cryptography (AREA)
  • Computing Systems (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Information Retrieval, Db Structures And Fs Structures Therefor (AREA)

Abstract

本发明提供一种针对CD3和EGFR的双特异性抗体、编码所述抗体的合适分子、用于表达所述抗体的表达载体和宿主细胞。所述抗体提供通过调节免疫功能用于治疗CD3相关和/或EGFR相关疾病的有效药剂。

Description

新型抗CD3/抗EGFR双特异性抗体及其用途
优先权信息
本申请要求于2019年11月29日提交的PCT申请号PCT/CN2019/121869的优先权，所述申请通过引用完全结合在本申请中。
序列表
本申请同时提交了电子形式的序列表文件。序列表的完整内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明总体上涉及抗体。更具体而言，本申请涉及针对CD3和EGFR的双特异性抗体、制备该双特异性抗体的方法以及该双特异性抗体的用途。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)在广泛的人体组织中表达，其过度表达与多种上皮细胞来源的恶性肿瘤有关，所述上皮细胞来源的恶性肿瘤如结直肠癌、非小细胞肺癌、头颈癌。EGFR通过与其配体EGF的结合从无活性的单体形式转变为有活性的同源二聚体或异源二聚体，然后诱导酪氨酸磷酸化和下游信号，导致肿瘤细胞失控增殖。两种EGFR靶向抗体，即西妥昔单抗(Erbitux)和帕尼单抗(Vectibix)，已经被美国食品和药物管理局批准用于治疗结肠癌和头颈癌。
根据临床统计，对现有的EGFR特异性治疗抗体观察到不同的抗肿瘤疗效，难治性或复发的表达EGFR的肿瘤表明令人失望的临床结果。尤其是具有EGFR突变、KRAS、BRAF突变的患者(约占结直肠癌的40-50％)对抗EGFR治疗性抗体没有反应。
T细胞在消除肿瘤细胞和控制肿瘤生长方面发挥着极为关键的作用，该作用通过在T细胞识别和激活后针对肿瘤细胞的广泛的细胞毒性作用，如蛋白分解酶(颗粒酶)和孔隙形成蛋白(穿孔蛋白)来进行。靶向T细胞的单克隆抗体(如OKT3)，特别是靶向T细胞的CD3分子的单克隆抗体，已成为越来越有希望的免疫治疗方法，如
基于CD3的BITE单克隆抗体和CAR-T以及CD3介导的双特异性抗体。对人CD3有特异性的小鼠单克隆抗体，如OKT3(Kung等，Science,206:347-9(1979))，是开发用于治疗的第一代CD3抗体。尽管OKT3有很强的免疫抑制功效，但由于与其免疫原性和有丝分裂潜能关联的严重副作用，其临床应用受到阻碍(Chadenoud,Nature Reviews,3:123-132(2003))。OKT3诱导抗球蛋白反应，促进其自身快速清除和中和(Chadenoud等，Eur.J.Immunol.,137:830-8(1982))。此外，OKT3在体外诱导T细胞增殖和细胞因子的产生，并导致体内细胞因子的大规模释放(Hirsch等，J.Immunol,142:737-43(1989))。这种严重的副作用限制了OKT3在移植中更广泛的应用，以及限制将其应用扩展到其他临床领域，例如自身免疫。靶向CD3(T细胞活化)和EGFR的双特异性抗体可能为难治性或复发的表达EGFR的肿瘤患者提供一种替代性治疗方案。
因此，迫切需要开发一种靶向CD3和EGFR的双特异性抗体，作为对EGFR单克隆抗体(如西妥昔单抗(Erbitux)和帕尼单抗(Vectibix))治疗耐药或难治的肿瘤患者的替代性免疫治疗策略，以解决这一高度未满足的临床需求。
发明内容
本申请的目的是建立一种结合EGFR和CD3双重结合活性的双特异性抗体(BsAb)，其可以提供有希望的治疗效果。该BsAb可以结合EGFR并阻断EGFR与其配体之间的相互作用，并将细胞毒性T细胞重定向到表达EGFR的肿瘤细胞(包括表达野生型EGFR的肿瘤细胞和表达突变型EGFR变体的肿瘤细胞)，随后更特异、更有效地破坏肿瘤细胞，并且非肿瘤毒性(off-tumor toxicity)较低。
从广义上讲，本申请涉及具有提高的疗效的抗CD3和抗EGFR双特异性抗体，包含该双特异性抗体的化合物、组合物和制品，制备该抗体的方法。本申请提供的益处广泛适用于抗体治疗和诊断领域，并可同与各种靶标反应的抗体一起使用。
本申请提供了一种针对CD3和EGFR的双特异性抗体。本申请还提供了编码抗CD3/抗EGFR抗体的分离的核苷酸序列、用于表达双特异性抗体的表达载体和宿主细胞。本申请进一步提供了用于制备抗CD3/抗EGFR抗体的方法、用于验证其在体内和体外的功能的方法。本申请的双特异性抗体提供了一种非常有效的药剂，用于预防或治疗包括增殖性疾病、免疫性疾病或感染的疾病。在一些实施方案中，这些疾病是CD3相关和/或EGFR相关疾病。
在某些方面，本申请提供了一种双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含与CD3特异性结合的第一抗原结合位点和与不同于CD3的抗原特异性结合的第二抗原结合位点。
在某些方面，所述不同于CD3的抗原是EGFR。
在某些方面，本发明提供一种双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分相缔合，其中：
所述第一抗原结合部分是CD3抗原结合部分，并且包含：
第一抗体的第一重链可变结构域(VH1)，其可操作地连接至抗体重链CH1结构域，和
第一抗体的第一轻链可变结构域(VL1)，其可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域，
所述第二抗原结合部分是EGFR抗原结合部分，并且包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1和C2能够经由非天然的链间二硫键形成二聚体，所述非天然的链间二硫键能够稳定所述二聚体，
以及
其中：
所述抗CD3抗原结合部分来源于抗CD3抗体，并且包含：
a)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR1，
b)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR2，
c)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR3，
d)包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR1，
e)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR2，和
f)包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR3，和
所述抗EGFR抗原结合部分来源于抗EGFR抗体，并且包含：
a)包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR1，
b)包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR2，
c)包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR3，
d)包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR1，
e)包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR2，和
f)包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR3。
在某些实施方式中，本申请提供一种双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含CD3抗原结合部分和EGFR抗原结合部分，其中：
所述CD3抗原结合部分包含Fab，所述Fab包含：抗CD3抗体的第一VH(VH1)，其可操作地连接至重链CH1恒定区结构域；和抗CD3抗体的第一VL(VL1)，其可操作地连接至轻链恒定区(CL)；和
所述EGFR抗原结合部分包含嵌合Fab，所述嵌合Fab包含：抗EGFR抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)；和抗EGFR抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)；并且其中C1和C2能够经由非天然的链间二硫键形成二聚体，所述非天然的链间二硫键能够稳定所述二聚体，
其中：
(A)所述CD3抗原结合部分包含：
包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR1，
包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR2，
包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR3，
包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR1，
包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR2，和
包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR3，和
(B)所述抗EGFR抗原结合部分包含：
包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR1，
包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR2，
包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR3，
包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR1，
包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR2，和
包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR3。
在某些实施方案中，第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1结构域)包含TCRβ恒定区，所述TCRβ恒定区包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，并且在一个优选的实施方案中，所述C1结构域包含SEQ ID NO：29所示的TCRβ恒定区或由SEQ ID NO：29所示的TCRβ恒定区组成。
在某些实施方案中，第二T细胞受体(TCR)恒定区(C2结构域)包含TCRα恒定区，所述TCRα恒定区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，并且在一个优选的实施方案中，所述C2结构域包含SEQ ID NO：30所示的TCRα恒定区或由SEQ ID NO：30所示的TCRα恒定区组成。
在某些实施方案中，本申请公开的双特异性抗体或其抗原结合部分还包含Fc区，其中所述Fc区可操作地连接至CD3抗原结合部分的CH1结构域。
在某些实施方案中，Fc区是人Fc区，诸如人IgG Fc区，特别是人IgG4或IgG1 Fc区。优选地，Fc区是含有突变S228P、F234A和L235A的人IgG4 Fc区。
在某些实施方案中，本申请提供双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含CD3抗原结合部分和EGFR抗原结合部分，其中：
(A)所述CD3抗原结合部分包含：
由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，
由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的重链CDR3，
由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
和
(B)所述抗EGFR抗原结合部分包含：
由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，
由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成的重链CDR3，
由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体的CD3抗原结合部分来源于抗CD3抗体，并且包含：
(i)包含SEQ ID NO：13或由SEQ ID NO：13组成的重链可变结构域(VH1)序列，和
(ii)包含SEQ ID NO：14或由SEQ ID NO：14组成的轻链可变结构域(VL1)序列。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体的EGFR抗原结合部分来源于抗EGFR抗体，并且包含：
(i)包含SEQ ID NO：15或由SEQ ID NO：15组成的重链可变结构域(VH2)序列，和
(ii)包含SEQ ID NO：16或由SEQ ID NO：16组成的轻链可变结构域(VL2)序列。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分相缔合，其中：
所述第一抗原结合部分是CD3抗原结合部分，其包含：
(i)包含SEQ ID NO：13或由SEQ ID NO：13组成的重链可变结构域(VH1)序列，和
(ii)包含SEQ ID NO：14或由SEQ ID NO：14组成的轻链可变结构域(VL1)序列；
和
所述第二抗原结合部分是EGFR抗原结合部分，其包含：
(i)包含SEQ ID NO：15或由SEQ ID NO：15组成的重链可变结构域(VH2)序列，和
(ii)包含SEQ ID NO：16或由SEQ ID NO：16组成的轻链可变结构域(VL2)序列。
在某些实施方案中，所述CD3抗原结合部分包含：
(i)与SEQ ID NO：13具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对CD3的结合特异性的重链可变结构域(VH1)序列；和
(ii)与SEQ ID NO：14具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对CD3的结合特异性的轻链可变结构域(VL1)序列。
在某些实施方案中，所述EGFR抗原结合部分包含：
(i)与SEQ ID NO：15具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对EGFR的结合特异性的重链可变结构域(VH2)序列；和
(ii)与SEQ ID NO：16具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对EGFR的结合特异性的轻链可变结构域(VL2)序列。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分相缔合，其中：
所述第一抗原结合部分是CD3抗原结合部分，其包含：
(i)由SEQ ID NO：13组成的重链可变结构域(VH1)序列，和
(ii)由SEQ ID NO：14组成的轻链可变结构域(VL1)序列；
和
所述第二抗原结合部分是EGFR抗原结合部分，其包含：
(i)由SEQ ID NO：15组成的重链可变结构域(VH2)序列，和
(ii)由SEQ ID NO：16组成的轻链可变结构域(VL2)序列。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含四条多肽链：
i)VH1-CH1-铰链1-CH2-CH3所示的第一重链；
ii)VL1-CL所示的第一轻链；
iii)VH2-C1-铰链2-CH2-CH3所示的第二重链；和
iv)VL2-C2所示的第二轻链；
其中i)的VH1-CH1部分与VL1-CL形成抗CD3臂(称为T3，参见图1)，iii)的VH2-C1与VL2-C2形成抗EGFR臂(称为U1，参见图1)；
其中C1和C2能够形成包含至少一个非天然的链间键的二聚体，并且两个铰链区和/或两个CH3结构域能够形成一个或多个能够促进二聚化的链间键。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含下述四条多肽链：
i)第一重链，其如SEQ ID NO：23所示，或如与SEQ ID NO：23具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对CD3的结合特异性的氨基酸序列所示；
ii)第一轻链，其如SEQ ID NO：22所示，或如与SEQ ID NO：22具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对CD3的结合特异性的氨基酸序列所示；
iii)第二重链，其如SEQ ID NO：24所示，或如与SEQ ID NO：24具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对EGFR的结合特异性的氨基酸序列所示；和
iv)第二轻链，其如SEQ ID NO：21所示，或如与SEQ ID NO：21具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对EGFR的结合特异性的氨基酸序列所示。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含下述四条多肽链：
i)SEQ ID NO：23所示的第一重链；
ii)SEQ ID NO：22所示的第一轻链；
iii)SEQ ID NO：24所示的第二重链；和
iv)SEQ ID NO：21所示的第二轻链。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合部分由下述四条多肽链组成：
i)SEQ ID NO：23所示的第一重链；
ii)SEQ ID NO：22所示的第一轻链；
iii)SEQ ID NO：24所示的第二重链；和
iv)SEQ ID NO：21所示的第二轻链。
在某些实施方案中，CD3和EGFR抗原可以具体地来源于食蟹猴或人CD3和EGFR蛋白。优选地，CD3和EGFR蛋白是人CD3和EGFR蛋白。在一个优选的实施方案中，上述抗体可以同时特异性地结合人CD3和EGFR蛋白。
在某些实施方案中，第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1结构域)包含TCRβ恒定区，所述TCRβ恒定区包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，并且在一个优选的实施方案中，所述C1结构域包含SEQ ID NO：29所示的TCRβ恒定区或由SEQ ID NO：29所示的TCRβ恒定区组成。
在某些实施方案中，第二T细胞受体(TCR)恒定区(C2结构域)包含TCRα恒定区，所述TCRα恒定区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，并且在一个优选的实施方案中，所述C2结构域包含SEQ ID NO：30所示的TCRα恒定区或由SEQ ID NO：30所示的TCRα恒定区组成。
在某些实施方案中，C1结构域包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，并且C2结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
在某些实施方案中，C1结构域由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成，并且C2结构域由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，本申请公开的双特异性抗体或其抗原结合部分还包含Fc区，其中所述Fc区可操作地连接至CD3抗原结合部分的CH1结构域。
在某些实施方案中，Fc区是人Fc区，诸如人IgG Fc区，特别是人IgG4或IgG1 Fc区。优选地，Fc区是含有突变S228P、F234A和L235A的人IgG4 Fc区。
在某些实施方案中，本申请公开的双特异性抗体或其抗原结合部分是人源化抗体。
在某些方面，本申请提供具有一种或多种下述特性的双特异性抗体或其抗原结合部分：
(a)以高亲和力同时特异性结合人CD3和EGFR蛋白；
(b)特异性结合人CD3蛋白和/或食蟹猴CD3蛋白；
(c)特异性结合人EGFR蛋白和/或食蟹猴EGFR蛋白；
(d)与抗CD3抗体、抗EGFR抗体、二者的组合以及其他靶向CD3和EGFR的双特异性抗体相比，在表达EGFR的肿瘤细胞存在下，能够诱导有效的T细胞活化；
(e)具有良好的热稳定性并且在人血清中是稳定的；以及
(f)与抗CD3抗体、抗EGFR抗体、二者的组合以及其他靶向CD3和EGFR的双特异性抗体相比，提供优异的抗肿瘤效果。
在某些方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其包含编码本申请所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列。
在某些实施方案中，本申请提供编码CD3结合部分的重链可变结构域(VH1)的分离的核苷酸序列、编码CD3结合部分的轻链可变结构域(VL1)的分离的核苷酸序列、编码EGFR结合部分的重链可变结构域(VH2)的分离的核苷酸序列、以及编码EGFR结合部分的轻链可变结构域(VL2)的分离的核苷酸序列。
在某些实施方案中，编码CD3结合部分的重链可变结构域(VH1)的分离的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，并且编码CD3结合部分的轻链可变结构域(VL1)的分离的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
在某些实施方案中，编码EGFR结合部分的重链可变结构域(VH2)的分离的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，并且编码EGFR结合部分的轻链可变结构域(VL2)的分离的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
在某些实施方案中，本申请提供编码CD3结合部分的重链的分离的核苷酸序列，其中所述编码CD3结合部分的重链的分离的核苷酸序列包含下述或由下述组成：
(A)编码SEQ ID NO：23所示的重链的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：27所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
在某些实施方案中，本申请提供编码CD3结合部分的轻链的分离的核苷酸序列，其中所述编码CD3结合部分的轻链的分离的核苷酸序列包含下述或由下述组成：
(A)编码SEQ ID NO：22所示的重链的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：26所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
在某些实施方案中，本申请提供编码EGFR结合部分的重链的分离的核苷酸序列，其中所述编码EGFR结合部分的重链的分离的核苷酸序列包含下述或由下述组成：
(A)编码SEQ ID NO：24所示的重链的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：28所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
在某些实施方案中，本申请提供编码EGFR结合部分的轻链的分离的核苷酸序列，其中所述编码EGFR结合部分的轻链的分离的核苷酸序列包含下述或由下述组成：
(A)编码SEQ ID NO：21所示的轻链的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：25所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
在某些方面，本申请提供包含本文定义的核酸分子的载体。
在某些方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含本申请公开的分离的核酸分子，或本申请公开的载体。
在某些实施方案中，宿主细胞可以选自，但不限于：来自原核微生物或真核微生物的细胞，诸如细菌细胞(例如，真细菌，如革兰氏阴性生物或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如大肠杆菌(E.coli))和真菌细胞(例如，酵母细胞、丝状真菌细胞等)，植物细胞或动物细胞。
在某些方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的承载体。
在某些方面，本申请提供一种用于制备本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括下述步骤：
-在上文所述的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分；和
-从所述宿主细胞中分离所述抗体或其抗原结合部分。
在某些实施方案中，本申请提供一种用于制备本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括下述步骤：
-在宿主细胞中表达所述抗体或抗原结合部分，所述宿主细胞包含分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列，和
-从所述宿主细胞中分离所述抗体或其抗原结合部分。
在某些实施方案中，本申请提供一种用于制备本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括下述步骤：
-在宿主细胞中表达所述抗体或抗原结合部分，所述宿主细胞包含含有分离的核酸分子的载体，其中所述分离的核酸分子包含编码本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列，和
-从所述宿主细胞中分离所述抗体或其抗原结合部分。
在某些方面，本申请提供一种调节受试者中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分、或药物组合物。
在某些方面，本申请提供一种用于抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分、或药物组合物。
在某些方面，本申请提供一种用于预防或治疗受试者中CD3相关和/或EGFR相关疾病的方法，其中所述CD3相关和/或EGFR相关疾病包括增殖性病症、免疫病症或感染，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分、或药物组合物。
在某些实施方案中，所述增殖性病症是癌症，例如结肠癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食管癌或胃癌。
在某些实施方案中，所述感染是慢性感染。
在某些实施方案中，本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分可以与化学治疗剂、辐射和/或癌症免疫疗法中所用的其他药剂联合施用。
在某些方面，本申请提供双特异性抗体或其抗原结合部分，其用于：
i)调节免疫应答，例如恢复T细胞活性；
ii)在表达EGFR的肿瘤细胞存在下，增强T细胞活化；和/或
iii)刺激免疫应答或免疫功能，例如加强针对癌细胞的免疫应答。
在某些方面，本申请提供本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分，其用于治疗或预防CD3相关和/或EGFR相关疾病，所述疾病包括增殖性病症(例如癌症)、免疫病症或感染。
在某些方面，本申请提供本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分，其用于诊断CD3相关和/或EGFR相关疾病，所述疾病包括增殖性病症(例如癌症)、免疫病症或感染。在某些方面，本申请提供本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于调节受试者中的免疫应答或抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。
在某些方面，本申请提供本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防CD3相关和/或EGFR相关疾病的药物中的用途，所述疾病包括增殖性病症(例如癌症)、免疫病症或感染。
在某些方面，本申请提供一种试剂盒，其包括包含本文定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的容器。
在某些实施方案中，所述试剂盒用于治疗或诊断CD3相关和/或EGFR相关疾病，所述疾病包括增殖性病症(例如癌症)、免疫病症或感染。
在某些实施方案中，所述CD3相关和/或EGFR相关疾病是EGFR相关的实体瘤。在优选的实施方案中，所述EGFR相关的实体瘤的特征在于高EGFR表达。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括使用说明和分开试剂盒中的每组组分的包装。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括关于使用所述双特异性抗体检测、诊断、预后、预防或治疗受试者中的CD3相关和/或EGFR相关疾病的使用说明。
以上内容是概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化形式介绍概念集合，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。此外，贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用整体并入本文。
附图说明
图1是W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的示意图，其中T3表示抗CD3臂，U1表示抗EGFR臂。
图2显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的SDS-PAGE结果。M：蛋白质标记；泳道1：未还原的；泳道2：还原的。
图3显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的SEC-HPLC色谱图。
图4显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9与人CD3(A)和EGFR(B)的结合活性，分别使用Jurkat.2B8和A431细胞系通过FACS测定。
图5显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9与食蟹猴CD3(A)和EGFR(B)的结合活性，分别使用食蟹猴PBMC和表达EGFR的稳定CHOK1细胞系通过FACS测定。
图6显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9与人CD3(A)和EGFR(B)的结合亲和力，通过流式细胞术分别针对Jurkat.2B8和A431细胞测定。
图7显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9对表达CD3和EGFR的细胞的桥接结合活性，通过使用预先标记的Jurkat.2B8和A431细胞经由流式细胞术进行检测。
图8显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9针对肿瘤细胞A431(A，高EGFR表达)和HT-29(B，中等EGFR表达)的人T细胞活化，其中使用HCC1419细胞(阴性EGFR表达)作为对照。
图9显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9针对肿瘤细胞A431(A)和HT-29(B)的食蟹猴T细胞活化，其中使用HCC1419细胞(阴性EGFR表达)作为对照。
图10显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9对肿瘤细胞A431(A)、HT-29(B)、MCF-7细胞(C)和HCC1419细胞(D)的细胞毒性活性。
图11显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9对Jurkat.2B8(A和C)与A431细胞(B和D)的ADCC和CDC能力。
图12显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的热稳定性，通过差示扫描荧光法(DSF)测定。
图13显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的血清稳定性。
图14显示在人PBMC-HT29小鼠模型中检测的施用后相对体重变化。
图15显示在人PBMC-HT29模型中W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9体内抗肿瘤功效研究中外周血人CD3的百分比(A)和终末人CD3的百分比(B)。在(A)和(B)中，每组柱由4条柱组成，从左至右，分别表示来自0.3mg/kg同种型对照、0.3mg/kg帕尼单抗、0.3mg/kg W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9和0.08mg/kg W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的结果。
图16显示在人PBMC-HT29的小鼠模型中检测的施用后追踪的肿瘤生长。
图17显示施用后相对动物体重变化。同种型(0.1mg/kg)用作阴性对照，帕尼单抗(0.1mg/kg)用作阳性对照。
图18显示施用后监测的肿瘤生长。同种型(0.1mg/kg)用作阴性对照，帕尼单抗(0.1mg/kg)用作阳性对照。
图19显示单剂量PK研究中W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9在食蟹猴血清中的浓度的结果。
图20显示施用后CD4+和CD8+T细胞的检测结果。
图21显示W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9在施用后对细胞因子(即，IL-2、INF-γ、TNF、IL-4、IL-5和IL-6)释放的作用。
具体实施方式
虽然本申请可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是示例本发明原理的具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本申请不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。
除非在此另外定义，否则与本申请结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种”，“一个”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物，诸如此类。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有值。
通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及技术是本领域众所周知和常用的术语和技术。除非另有说明，否则本申请的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Abbas等,Cellular and Molecular Immunology,第6版,W.B.Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学，合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术都是本领域中众所周知和常用的。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。
定义
为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本申请中可互换使用，其指氨基酸残基的聚合物，或多个氨基酸残基聚合物的集合体。这些术语应用于其中的一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的氨基酸，以及之后经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即α碳结合至氢、羧基、氨基和R基)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰的R基(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。α-碳是指附接至官能团(如羰基)的第一个碳原子。β碳是指连接至α碳的第二个碳原子，并且此体系依希腊字母的字母排列顺序继续命名碳原子。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式作用的化学化合物。术语“蛋白”通常是指大的多肽。术语“肽”通常是指短的多肽。多肽序列通常记述为多肽序列的左手端为氨基末端(N末端)；多肽序列的右手端为羧基末端(C末端)。用于本申请的“多肽复合物”是指包含一个或多个与实现某些功能相关的多肽的复合物。在某些实施方式中，所述多肽是免疫相关的。
术语“抗体”或“Ab”在本文中以最宽泛意义使用，涵盖各种抗体结构，包括多克隆抗体、单特异性或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。一个天然的完整抗体通常是包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为高变区(称为互补决定区(CDR))和相对保守的区域(称为框架区(FR))，其中高变区由相对保守的区域间隔开。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端，FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。各个区域或结构域中的氨基酸分布遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature 342:878-883中的定义。抗体可以是不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，在本申请的上下文中可以互换使用，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。一般而言，参见FundamentalImmunology,第7章(Paul,W.编，第二版,Raven Press,N.Y.(1989)，其通过引用并入本文用于所有目的。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术，例如蛋白质水解消化作用或涉及编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA的操作和表达的重组基因工程技术，衍生自例如全抗体分子。这样的DNA是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)获得，或可以合成。DNA可用化学或通过使用分子生物技术来测序和操作，例如，以将一或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成适合的构型，或导入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、增加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基所组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子，例如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR-移接抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域，也涵盖在文中所用的表述“抗原结合片段”内。在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或接头区域连接。铰链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其导致单个多肽分子中相邻的可变和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。
用于本申请的术语“可变结构域”用于抗体时，是指包含一个或多个CDR的抗体可变区或其片段。尽管可变结构域可包含完整可变区(如HCVR或LCVR)，其也可能包含小于完整可变区但仍保持与抗原结合或形成抗原结合位点的能力。
用于本申请的术语“抗原结合部分”是指由含有一个或多个CDR的抗体部分所形成的抗体片段或者任何其他结合抗原但不包含完整抗体结构的抗体片段。抗原结合部分的例子包含但不限于可变结构域、可变区、双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双抗体(ds diabody)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、结构域抗体和双价结构域抗体。抗原结合部分可以与母体抗体结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合部分可包含移接至来自一个或多个不同的人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个CDR。抗原结合部分的更多详细的形式记述于Spiess等，2015(同上)和Brinkman等，mAbs，9(2)，pp.182–212(2017)，它们的全部内容通过引用并入本文。
抗体的“Fab”是指由一条轻链(可变区和恒定区二者)和一条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体。在某些实施方式中，轻链和重链的恒定区均由TCR恒定区取代。
“F(ab')2”指的是Fab的二聚体。
抗体的“fragment difficult(Fd)”是指可以与轻链组合以形成Fab的重链片段氨基末端的半段。
抗体的“Fc”是指由第一重链的第二恒定区(CH2)、第三恒定区(CH3)经二硫键结合第二重链的第二恒定区和第三恒定区而组成的抗体的部分。抗体的Fc部分负责多种不同的效应功能，如ADCC和CDC，但不参与抗原的结合。
就抗体而言的“铰链区”包含将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分。此铰链区包含大约25个氨基酸残基且是柔性的，从而使得两个N末端抗原结合区可以独立移动。
用于本申请的术语“CH2结构域”是指包含重链分子自IgG抗体的例如约氨基酸244延伸至氨基酸360的部分，使用常规编号方案(氨基酸244至360，Kabat编号系统；以及氨基酸231-340，EU编号系统；参见Kabat,E.等，U.S.Department of Health and HumanServices(1983))。
“CH3结构域”自IgG分子的CH2结构域延伸至C末端，并且包含大约108个氨基酸。某些免疫球蛋白类别，例如IgM，进一步包含CH4区。
抗体的“Fv”是指含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变结构域结合一条重链的可变结构域组成。提供了数种Fv设计，包含dsFv，其中两个结构域之间的连接通过引入的二硫键增强；并且可以使用肽接头将两个结构域结合在一起成为单个多肽而形成scFv。已产生了含有免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的可变结构域连接至对应的免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域和恒定结构域的Fv构建体。还已将Fv多聚化以形成双抗体和三抗体(Maynard等，Annu Rev Biomed Eng 2 339-376(2000))。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由一个轻链可变区和一个重链可变区直接或通过肽接头序列相互连接的工程化抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA，85：5879(1988))。
在某些实施方案中，“scFv二聚体”是一种二价双抗体或二价ScFv(BsFv)，包含VH-VL(通过肽接头连接)与另一个VH-VL部分二聚化，这样一个部分的VH与另一个部分的VL协调，形成两个结合点，可以靶向相同的抗原(或表位)或不同的抗原(或表位)。
在其他实施方案中，“scFv二聚体”是一种双特异性双抗体，包含与VL1-VH2(也由肽接头连接)相缔合的VH1-VL2(由肽接头连接)，使得VH1和VL1协调，VH2和VL2协调，每个协调对具有不同的抗原特异性。
“ScFab”是指具有经由多肽接头将Fd连接至轻链的融合多肽，产生了单链Fab片段(scFab)。
“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其一条轻链的可变区和一条重链的可变区之间的连接是二硫键。在某些实施方案中，“(dsFv)2”或“(dsFv-dsFv')”包括三条肽链：两个VH部分通过一个肽接头(例如长的柔性接头)连接，并通过二硫键分别与两个VL部分结合。在某些实施方案中，dsFv-dsFv'是双特异性的，其中每个二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
“附接IgG”是指Fab臂融合至IgG以形成双特异性(Fab)2-Fc形式的融合蛋白。其可以形成Fab融合至IgG分子的C末端或N末端的“IgG-Fab”或“Fab-IgG”，无论是否存在连接子。在某些实施方式中，附接IgG可以被进一步修饰为IgG-Fab4的形式(参见Brinkman等，2017，同上)。
术语“抗CD3抗体”或“CD3抗体”在用于本文时是指能够结合CD3(例如，人CD3)的抗体，如本文所定义的。
术语“CD3”和“CD3蛋白”在本文中可互换使用。CD3蛋白几乎存在于所有T细胞中。CD3-TCR复合物调节T细胞在先天免疫应答和适应性免疫应答中的功能，以及细胞和体液免疫功能。这些功能包括消除病原生物和通过广泛的细胞毒性作用控制肿瘤的生长。CD3 T细胞共受体是一种蛋白复合物，由四条不同的链组成：一条CD3γ链，一条CD3δ链，和两条CD3ε链。这四条链与一个被称为T细胞受体(TCR)和ζ链的分子结合，在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、ζ链和CD3分子组成TCR复合物，其中TCR作为一个亚基识别并与抗原结合，CD3作为一个亚基将抗原刺激转移并传达给信号传导通路，最终调节T细胞活性。术语“CD3”可包括人CD3，以及其变体、异构体和物种同源物。因此，本文定义和公开的抗体或其抗原结合部分也可以结合来自人以外物种的CD3，例如食蟹猴CD3。
本文所用的术语“人CD3”是指源自人的CD3，如人CD3的完整氨基酸序列。
本文所用的术语“食蟹猴CD3”是指源自食蟹猴的CD3，如恒河猴(Rhesus macaque)CD3的完整氨基酸序列。
本文所使用的术语“抗EGFR抗体”是指与EGFR特异性结合的抗体。“抗EGFR抗体”可以包括具有单一特异性的单价抗体。示例性的抗EGFR抗体在本文的其他地方有描述。
术语“表皮生长因子受体(EGFR)”是一种在上皮细胞表面表达的170千道尔顿(kDa)的膜结合蛋白。EGFR是蛋白酪氨酸激酶的生长因子受体家族中的一员，是一类细胞周期调节分子。(W.J.Gullick等，1986，Cancer Res.,46:285-292)。当EGFR的配体(EGF或TGF-α)与细胞外结构域结合时，EGFR被激活，导致受体的细胞内酪氨酸激酶结构域的自发磷酸化(S.Cohen等，1980,J.Biol.Chem.,255:4834-4842；A.B.Schreiber等,1983,J.Biol.Chem.,258:846-853)。
EGFR是一种促进生长的致癌基因erbB或ErbB1的蛋白产物，它是一个家族的成员，即ERBB原癌基因家族的成员，被认为在多种人类癌症的发展和进展中起着关键作用。特别是，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头颈癌和胃癌以及胶质母细胞瘤中已经观察到EGFR的表达增加。
如本文所用的术语“二价”是指具有两个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；术语“单价”是指仅具有一个单一抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是二价的。
如本文所用，“双特异性”抗体是指具有源自两种不同单克隆抗体的片段并能够结合两种不同表位的人工抗体。两个表位可以存在于相同的抗原上，或者它们可以存在于两种不同的抗原上。
术语“双特异性抗原结合分子”是指包含至少第一抗原结合结构域(在本文中也称为第一抗原结合位点)和第二抗原结合结构域(在本文中也称为第二抗原结合位点)的蛋白质、多肽或分子复合物。在某些实施方案中，“双特异性抗原结合分子”是“双特异性抗体”。双特异性抗体内的每个抗原结合结构域包含至少一个CDR，其单独地或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合地特异性结合特定抗原。在本申请的上下文中，第一抗原结合位点特异性结合第一抗原(例如CD3)，并且第二抗原结合位点特异性结合第二不同抗原(例如EGFR)。
术语“抗CD3/抗EGFR抗体”、“抗CD3/抗EGFR双特异性抗体”、“针对CD3和EGFR的抗体”、“抗CD3×EGFR双特异性抗体”、“CD3×EGFR抗体”在本文中可互换使用，其是指特异性结合CD3和EGFR的双特异性抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单分子成分的抗体分子制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
“结构域抗体”是指只包含重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或更多个VH结构域用肽接头共价连接，形成一个二价或多价结构域抗体。一个二价结构域抗体的两个VH结构域可以靶向相同或不同的抗原。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本申请的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经移接到人框架序列上的抗体。
术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移接到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一物种，例如其中可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列来源于人抗体。
如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，例如从对另一物种的免疫球蛋白基因是而言是转基因的动物分离的抗体，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体，或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
用于本申请的术语“间隔子”是指具有1、2、3、4或5个氨基酸残基，或长度为5至15、20、30、50或更多个氨基酸残基的通过肽键连接且用于连接一个或多个多肽的人造氨基酸序列。间隔子可具有或可不具有二级结构。间隔子序列在本领域中是已知的，参见例如Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak等，Structure 2:1121-1123(1994)。可以使用本领域已知的任意适宜的间隔子。例如，本申请中可用的间隔子可以富含甘氨酸和脯氨酸残基。实例包括具有有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸组成的单个或重复序列的间隔子，诸如TGGGG、GGGGS或SGGGG或其串联重复(例如，2、3、4个或更多个重复)。
术语“可操作地连接”或“被可操作地连接”是指两个或更多个目标生物学序列的以使其处于允许其以目的方式作用的关系的方式并列，无论是否存在间隔子或接头。当用于多肽时，该术语旨在表示多肽序列以使所连接的产物具有目的生物学功能的方式连接。例如，可将抗体可变区可操作地连接至恒定区，以形成具有抗原结合活性的稳定产物。所述术语还可用于多核苷酸。举例来说，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接至调控序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)时，该术语旨在表示所述多核苷酸序列以允许所述多肽由所述多核苷酸调控表达的方式连接。
用于本申请的术语“表位”是指抗原中与抗体结合的特定组的原子或氨基酸。表位可以形成自连续的氨基酸(也称为线性或顺序表位)或通过蛋白的三级折叠而并列的非连续的氨基酸(也称为构型或构象表位)。形成自连续的氨基酸的表位通常在蛋白上沿着一级氨基酸残基线性排列，且连续的氨基酸的小段可以由与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原消化，或在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位在一个独特的空间构象中通常包含至少3个，更常见地包含至少5个、约7个或约8-10个氨基酸。如果两种抗体表现出对一种抗原的竞争性结合，则它们可以结合相同或密切相关的抗原表位。例如，如果一种抗体或抗原结合分子阻断参照抗体与抗原的结合的至少85％，或至少90％，或至少95％，那么该抗体或抗原结合分子可被视为与参照抗体结合相同/密切相关的表位。
本文所用的术语“特异性的结合”或“特异性结合”是指两个分子之间(例如抗体和抗原之间)的非随机性结合反应。
KD用于指解离速率与结合速率的比值(koff/kon)，它可以通过使用本领域已知的任何常规方法来确定，包括但不限于表面等离子体共振法、微尺度热泳法、HPLC-MS法和流式细胞术(如FACS)方法。在某些实施方案中，KD值可以通过使用流式细胞术适当地确定。
术语“融合”或“融合的”在用于氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白)时，是指例如通过化学键合或重组手段，将两个或更多个氨基酸序列组合成为非天然存在的单一氨基酸序列。融合氨基酸序列可通过两个编码多核苷酸序列的基因重组产生，并且可以通过将含有重组的多核苷酸的构建体引入宿主细胞的方法来表达。
术语“抗原特异性”是指被抗原结合分子选择性地识别的特定抗原或其表位。
如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的空位(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在以下中描述的那些：ComputationalMolecular Biology,(Lesk,A.M.编),1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.编),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,SequenceAnalysis in MolecularBiology,New York:Academic Press；Sequence AnalysisPrimer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073。
如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。
用于本申请的术语“取代”在用于氨基酸残基时是指在肽、多肽或蛋白中天然存在的或引入的一个或多个氨基酸被另一个取代。多肽中的取代可导致多肽功能的减弱、增强或消除。
本申请使用的术语“突变”或“突变的”在用于氨基酸残基时是指氨基酸残基的取代、插入或添加。
天然“T细胞受体”或天然“TCR”是与不变的CD3链结合以形成能够介导信号转导的复合物的异二聚T细胞表面蛋白。TCR属于免疫球蛋白超家族，且与具有单一重链和单一轻链的半抗体相似。天然TCR具有胞外部分、跨膜部分和胞内部分。TCR的胞外结构域具有近膜恒定区和远膜可变区。在本文公开的某些实施方案中，双特异性抗体包含具有抗体的可变结构域和TCR的恒定结构域的可溶性嵌合蛋白，其中TCR恒定结构域的亚基(如α和β结构域)通过改造的二硫键连接。
本文中使用的术语“Ka”旨在指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kd”则旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。抗体的Kd值可以用本领域内充分建立的方法确定。本文中使用的术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离常数，它由Kd和Ka的比率(即Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。确定抗体Kd的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，如
Figure BDA0003662286220000261
系统。
本文中关于IgG抗体所用的术语“高亲和力”是指抗体对靶抗原具有1x 10-7M或更低、更优选5x 10-8M或更低，甚至更优选1x10-8 M或更低，甚至更优选5x 10-9M或更低，甚至更优选1x 10-9M或更低的KD。
本文中所用的术语“EC50”，也被称为“半数最大有效浓度”，是指在规定的暴露时间后，在基线和最大值之间的一半诱发反应的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的范围内，EC50以“nM”为单位表示。
本文所用的术语“竞争性结合”是指两个抗体在与结合靶标的结合中的相互作用。如果第一抗体与它的同源表位的结合在第二抗体存在的情况下与第一抗体在没有第二抗体的情况下的结合相比有可检测到的减少，那么第一抗体就会与第二抗体竞争结合。另一种情况是，在第一抗体存在的情况下，第二抗体与它的表位的结合也可检测到减少，但不一定是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，如果每个抗体都能抑制另一个抗体与其同源表位的结合，不管是在相同的、更大的还是更小的程度上，这些抗体被认为是彼此“交叉竞争”与其各自表位的结合。
本文中所用的“抑制结合”的能力是指抗体或其抗原结合片段抑制两个分子(如人CD3/EGFR和人抗CD3/抗EGFR抗体)的结合达到任何可检测的水平的能力。在某些实施方案中，两个分子的结合可以被该抗体或其抗原结合片段抑制至少50％。在某些实施方案中，这种抑制作用可以大于60％，大于70％，大于80％，或大于90％。
如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性”或“构象”表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris编(1996)。在线性表位中，蛋白和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用位点跨越蛋白中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如RSV融合蛋白)的抗体。在国际专利申请WO03/48731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，其基于它们的交叉竞争。
如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然环境变化，或者物质与天然环境分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。
如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD3/EGFR蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除CD3/EGFR以外的抗原)。但是，特异性结合人CD3/EGFR蛋白的分离的抗体可能与其他抗原如来自其他物种的CD3/EGFR蛋白具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于：逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生感兴趣的蛋白、蛋白片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；或人体组织或杂交瘤细胞；原核微生物或真核微生物的细胞，如细菌细胞(例如，真细菌，如革兰氏阴性生物或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科，如大肠杆菌)和真菌细胞(例如，酵母细胞、丝状真菌细胞等)；植物细胞或动物细胞，如昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，还涵盖这种细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等,1973,Virology 52:456；Sambrook等,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,supra；Davis等,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等,1981,Gene 13:197。
如本文所用，术语“SPR”或“表面等离子体共振”是指并且包括允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，N.J.)。关于详细描述，参见实施例5和
Figure BDA0003662286220000291
U.等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；
Figure BDA0003662286220000292
U.等(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson，B.等(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson，B.等(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.Retrieved2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且对于公众来说可以是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(FosterCity，Calif.)的FACS Star Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，Fla.)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs，Colo.)的MoFlo。
本申请使用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、缓解、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类。哺乳类受试者包含人、畜养动物、农场动物，以及动物园、竞技或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。
本文所用的术语“效应子功能”是指由于抗体的Fc区与其效应子(如C1复合物和Fc受体)结合而产生的生物活性。示例性的效应子功能包括：由抗体和C1复合物上的C1q相互作用引起的补体依赖性细胞毒性(CDC)；由抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合引起的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；和吞噬作用。
如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在Clynes等，PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动。为了评估补体活化，可以执行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的。
如本文所用，术语“癌症”是指特征在于恶性细胞生长或肿瘤、异常增殖、浸润或转移的医学病症，并且包括实体瘤和非实体癌(血液学恶性病，如白血病)。本文所用的“实体瘤”是指肿瘤性和/或恶性细胞的实体块。癌症或肿瘤的实例包括血液学恶性病、口腔癌(例如唇癌、舌癌或咽癌)、消化器官癌(例如食道癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、大肠癌或直肠癌)、腹膜癌、肝癌和胆道癌、胰腺癌、呼吸系统癌症如喉癌或肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、乳腺癌、生殖器官癌症(输卵管癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、卵巢癌或前列腺癌)、泌尿系统癌症(如膀胱癌或肾癌)、脑癌和内分泌腺体癌症(如甲状腺癌)。在某些实施方案中，癌症选自卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌和结直肠癌。
本文在治疗病况的情况中使用的术语“治疗”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病况进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病况消退，病况改善和病况治愈。还包括了作为预防措施(即预防、防止)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。
如本文所用，术语“治疗有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。例如，当与CD3/EGFR相关疾病或病况的治疗结合使用时，“治疗有效量”是指抗体或其抗原结合部分有效治疗所述疾病或病症的量或浓度。
本文所使用的术语“防止”或“预防”在提及哺乳动物的某种疾病状况时，是指防止或延迟该疾病的发生，或防止其临床或亚临床症状的表现。
如本文所用，术语“药学上可接受”是指媒介物、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。
如本文所用，术语“药学上可接受的承载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的承载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Gennaro AR编，第19版，Pennsylvania:MackPublishing Company，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至生物体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。
双特异性抗体及其抗原结合片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体及其抗原结合片段是双特异性的。在一些实施方案中，本文提供的双特异性抗体及其抗原结合片段具有针对CD3的第一特异性，并且具有针对不同于CD3第二抗原的第二特异性，并且与阻断单独的抗原相比，对它们的阻断可以产生协同作用。
在某些实施方案中，第二特异性是针对肿瘤相关抗原或其表位。术语“肿瘤相关抗原”是指由肿瘤细胞表达的靶抗原，然而在转化为肿瘤之前可能由同源细胞(或健康细胞)表达。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原可以只由肿瘤细胞呈现，而不是由正常细胞(即非肿瘤细胞)呈现。在其他一些实施方案中，肿瘤相关抗原可以只在肿瘤细胞上表达，或者与非肿瘤细胞相比，可以代表肿瘤特异性的突变。在其他一些实施方案中，肿瘤相关抗原可以在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中发现，但与非肿瘤细胞相比，在肿瘤细胞上过度表达，或者由于肿瘤组织与非肿瘤组织相比结构不那么紧凑，所以在肿瘤细胞中可以获得抗体结合。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原位于肿瘤的血管上。
肿瘤相关抗原的示例性实例是LAG-3、CD10、CD19、CD20、CD22、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3、CD135)、硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4，黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her2neu、Her3、IGFR、IL3R、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CDCP1、Derlin1、生腱蛋白、frizzled 1-10、血管抗原VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4、CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)、内皮糖蛋白(Endoglin)、CLEC14、Tem1-8和Tie2。进一步的实例可包括A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳水化合物酶IX(MN/CA IX)、de2-7 EGFR、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、叶酸结合蛋白、G250、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑色素瘤相关细胞表面硫酸软骨素蛋白多糖)、Muc-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)和TAG-72。
在某些实施方案中，第二特异性是针对传染病相关的抗原或其表位。传染性疾病相关抗原的非限制性实例包括，例如，在病毒颗粒表面表达的抗原，或优先在感染病毒的细胞上表达的抗原，其中病毒选自HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(如HSV-1、HSV-2、CMV、HAV-6、VZV、埃巴病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV、登革病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒脑炎病毒。备选地，靶抗原可以是一种在细菌表面表达的抗原，或优先在被细菌感染的细胞上表达的抗原，其中细菌选自衣原体、立克次氏体、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌、淋球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体和莱姆病菌。在某些实施方案中，靶抗原是一种在真菌表面表达的抗原，或优先在被真菌感染的细胞上表达的抗原，其中真菌选自念珠菌(白色念珠菌、克鲁斯氏念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等)、新隐球菌(Crytococcus neoformans)、曲霉(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉(Mucorales)(毛霉菌、犁头霉、根霉等)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。在某些实施方案中，靶抗原是一种在寄生虫表面表达的抗原，或优先在被寄生虫感染的细胞上表达的抗原，其中寄生虫选自溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋绦虫(Balantidiumcoli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba sp)、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)、肥头绦虫(Taenia crassiceps)和马来丝虫(Brugia malayi)。特定病原体相关抗原的非限制性实例包括，例如，HIV gp120、HIV CD4、乙型肝炎糖蛋白L、乙型肝炎糖蛋白M、乙型肝炎糖蛋白S、丙型肝炎E1、丙型肝炎E2、肝细胞特异性蛋白、单纯疱疹病毒gB、巨细胞病毒gB和HTLV包膜蛋白。
根据某些示例性实施方案，本申请包括双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点和特异性结合EGFR的第二抗原结合位点。这样的抗体在本文中可被称为例如“抗-CD3/抗-EGFR”、或“抗-CD3/EGFR”、或“抗-CD3xEGFR”、或“CD3xEGFR”双特异性分子，或其他类似术语。
本申请的双特异性抗体以高亲和力结合人CD3和人EGFR。本申请的抗体与CD3或EGFR的结合可以使用本领域中充分建立的一种或多种技术(例如ELISA)来评估。本申请的抗体的结合特异性也可以通过例如流式细胞术监测抗体与表达CD3蛋白或EGFR蛋白的细胞的结合来确定。例如，抗体可以通过流式细胞术测定来测试，其中抗体与表达人CD3的细胞系(例如已被转染以在其细胞表面上表达CD3的CHO细胞)反应。另外地或备选地，可以在BIAcore结合测定中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如KD值)。其他合适的结合测定包括ELISA或FACS测定，例如使用重组CD3蛋白进行的测定。
在某些实施方案中，本申请的双特异性抗体或其抗原结合部分包含CD3抗原结合部分和EGFR抗原结合部分，其中：
所述CD3抗原结合部分包含Fab，所述Fab包含：抗CD3抗体的第一VH(VH1)，其可操作地连接至重链CH1恒定区结构域；和抗CD3抗体的第一VL(VL1)，其可操作地连接至轻链恒定区(CL)；和
所述EGFR抗原结合部分包含嵌合Fab，所述嵌合Fab包含：抗EGFR抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)；和抗EGFR抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)；并且其中C1和C2能够经由非天然的链间二硫键形成二聚体，所述非天然的链间二硫键能够稳定所述二聚体，
其中：
(A)所述CD3抗原结合部分包含：
包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR1，
包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR2，
包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR3，
包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR1，
包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR2，和
包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR3，和
(B)所述抗EGFR抗原结合部分包含：
包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR1，
包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR2，
包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR3，
包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR1，
包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR2，和
包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR3。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合部分具有下述特性中的一种或多种：
(a)以高亲和力同时特异性结合人CD3和EGFR蛋白；
(b)特异性结合人CD3蛋白和/或食蟹猴CD3蛋白；
(c)特异性结合人EGFR蛋白和/或食蟹猴EGFR蛋白；
(d)与抗CD3抗体、抗EGFR抗体、二者的组合以及其他靶向CD3和EGFR的双特异性抗体相比，在表达EGFR的肿瘤细胞存在下，能够诱导有效的T细胞活化；
(e)具有良好的热稳定性并且在人血清中是稳定的；以及
(f)与抗CD3抗体、抗EGFR抗体、二者的组合以及其他靶向CD3和EGFR的双特异性抗体相比，提供优异的抗肿瘤效果。
例如，本申请的双特异性抗体以1×10-7M或更低的KD结合人CD3蛋白，以5×10-8M或更低的KD结合人CD3蛋白，以4×10-8M或更低的KD结合人CD3蛋白，以3×10-8M或更低的KD结合人CD3蛋白，以2×10-8M或更低的KD结合人CD3蛋白，以1×10-8M或更低的KD结合人CD3蛋白，以5×10-9M或更低的KD结合人CD3蛋白，或以4.70×10-9M或更低的KD结合人CD3蛋白。
例如，本申请的双特异性抗体以1×10-7M或更低的KD结合人EGFR蛋白，以5×10-8M或更低的KD结合人EGFR蛋白，以1×10-8M或更低的KD结合人EGFR蛋白，或以6.20×10-9M或更低的KD结合人EGFR蛋白。
例如，如在荷瘤小鼠模型中研究的，与帕尼单抗(一种抗EGFR抗体)相比，本申请的双特异性抗体实现了理想的肿瘤生长抑制(TGI)，并出乎意料地在较低剂量(如0.08毫克/千克体重)下实现了比正常剂量(如0.3毫克/千克体重)下的TGI更高的TGI。
与CD3特异性结合的第一抗原结合部分
第一抗原结合部分特异性结合CD3，因此其在本申请中也称为CD3抗原结合部分。这两个术语可互换使用。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分包含Fab，所述Fab包含：抗CD3抗体的第一VH(VH1)，其可操作地连接至重链CH1恒定区结构域；和抗CD3抗体的第一VL(VL1)，其可操作地连接至轻链恒定区(CL)。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分包含：
a)重链CDR1，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：1，和与SEQ ID NO：1有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；
b)重链CDR2，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：2，和与SEQ ID NO：2有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；
c)重链CDR3，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：3，和与SEQ ID NO：3有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；
d)轻链CDR1，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：4，和与SEQ ID NO：4有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；
e)轻链CDR2，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：5，和与SEQ ID NO：5有不超过1个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；和
f)轻链CDR3，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：6，和与SEQ ID NO：6有不超过1个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分包含：
a)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的轻链CDR1，
e)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的轻链CDR2，和
f)包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的轻链CDR3。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分包含：
a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，
b)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，
c)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的重链CDR3，
d)由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
e)由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
f)由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分的重链可变结构域(VH1)包含：
(i)SEQ ID NO：13的氨基酸序列，
(ii)与SEQ ID NO：13至少85％相同，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，同时保持针对CD3的结合特异性的氨基酸序列，或
(iii)与SEQ ID NO：13相比具有一个或多个(例如，1-18、1-15、1-10或1-5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代同时保持针对CD3的结合特异性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分的轻链可变区(VL1)包含：
(i)SEQ ID NO：14的氨基酸序列，
(ii)与SEQ ID NO：14至少85％相同，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，同时保持针对CD3的结合特异性的氨基酸序列，或
(iii)与SEQ ID NO：14相比具有一个或多个(例如，1-17、1-15、1-10或1-5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代同时保持针对CD3的结合特异性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分的重链可变结构域(VH1)由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成，并且第一抗原结合部分的轻链可变区(VL1)由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分包含两条多肽链：
i)VH1-CH1-铰链1-CH2-CH3所示的第一重链；和
ii)VL1-CL所示的第一轻链；
其中i)的VH1-CH1部分与VL1-CL形成抗CD3臂(称为T3，参见图1)。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分包含两条多肽链：
i)第一重链，其如SEQ ID NO：23所示，或如与SEQ ID NO：23具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对CD3的结合特异性的氨基酸序列所示；和
ii)第一轻链，其如SEQ ID NO：22所示，或如与SEQ ID NO：22具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对CD3的结合特异性的氨基酸序列所示。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分包含两条多肽链：
i)SEQ ID NO：23所示的第一重链；和
ii)SEQ ID NO：22所示的第一轻链。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分由两条多肽链组成：
i)SEQ ID NO：23所示的第一重链；和
ii)SEQ ID NO：22所示的第一轻链。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分可操作地连接至Fc区。优选地，Fc区可操作地连接至CD3抗原结合部分的CH1结构域。
在某些实施方案中，Fc区是人Fc区，诸如人IgG Fc区，特别是人IgG4或IgG1 Fc区。优选地，Fc区是含有突变S228P、F234A和L235A的人IgG4 Fc区。
特异性结合EGFR的第二抗原结合部分
本文提供的第二抗原结合部分特异性结合EGFR，因此其在本申请中也称为EGFR抗原结合部分。这两个术语可互换使用。
第二抗原结合部分包含嵌合Fab，所述嵌合Fab包含：抗EGFR抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)；和抗EGFR抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)；并且其中C1和C2能够经由非天然的链间二硫键形成二聚体，所述非天然的链间二硫键能够稳定所述二聚体，
在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含：
重链CDR1，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：7，和与SEQ ID NO：7有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；
重链CDR2，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：8，和与SEQ ID NO：8有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；
重链CDR3，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：9，和与SEQ ID NO：9有不超过1个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；
轻链CDR1，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：10，和与SEQ ID NO：10有不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；
轻链CDR2，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：11，和与SEQ ID NO：11有不超过1个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列；和
轻链CDR3，其包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：SEQID NO：12，和与SEQ ID NO：12有不超过1个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差别的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含：
a)包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的轻链CDR1，
e)包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的轻链CDR2，和
f)包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的轻链CDR3。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含：
a)由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，
b)由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，
c)由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成的重链CDR3，
d)由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
e)由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
f)由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分的重链可变结构域(VH2)包含：
(i)SEQ ID NO：15的氨基酸序列，
(ii)与SEQ ID NO：15至少85％相同，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，同时保持针对EGFR的结合特异性的氨基酸序列，或
(iii)与SEQ ID NO：15相比具有一个或多个(例如，1-18、1-15、1-10或1-5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代同时保持针对EGFR的结合特异性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分的轻链可变区(VL2)包含：
(i)SEQ ID NO：16的氨基酸序列，
(ii)与SEQ ID NO：16至少85％相同，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，同时保持针对EGFR的结合特异性的氨基酸序列，或
(iii)与SEQ ID NO：16相比具有一个或多个(例如，1-16、1-15、1-10或1-5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代同时保持针对EGFR的结合特异性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分的重链可变结构域(VH2)由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成，并且第二抗原结合部分的轻链可变区(VL2)由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含两条多肽链：
i)VH2-C1-铰链2-CH2-CH3所示的第二重链；和
ii)VL2-C2所示的第二轻链；
其中iii)的VH2-C1与VL2-C2形成抗EGFR臂(称为U1，参见图1)，
其中C1和C2能够形成包含至少一个非天然的链间键的二聚体，并且两个铰链区和/或两个CH3结构域能够形成一个或多个能够促进二聚化的链间键。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含两条多肽链：
i)第二重链，其如SEQ ID NO：24所示，或如与SEQ ID NO：24具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对EGFR的结合特异性的氨基酸序列所示；和
ii)第二轻链，其如SEQ ID NO：21所示，或如与SEQ ID NO：21具有至少85％序列同一性，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性同时保持针对EGFR的结合特异性的氨基酸序列所示。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含两条多肽链：
i)SEQ ID NO：24所示的第二重链；和
ii)SEQ ID NO：21所示的第二轻链。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分由两条多肽链组成：
i)SEQ ID NO：24所示的第二重链；和
ii)SEQ ID NO：21所示的第二轻链。
在某些实施方案中，第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1结构域)包含TCRβ恒定区，所述TCRβ恒定区包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，并且在一个优选的实施方案中，所述C1结构域包含SEQ ID NO：29所示的TCRβ恒定区或由SEQ ID NO：29所示的TCRβ恒定区组成。
在某些实施方案中，第二T细胞受体(TCR)恒定区(C2结构域)包含TCRα恒定区，所述TCRα恒定区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，并且在一个优选的实施方案中，所述C2结构域包含SEQ ID NO：30所示的TCRα恒定区或由SEQ ID NO：30所示的TCRα恒定区组成。
在某些实施方案中，C1结构域包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，并且C2结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
除非另外指明，对每个CDR或每个VH或VL的氨基酸分配可以按照下述提供的编号方案之一进行：Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版),US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242；Chothia等,1987,PMID:3681981；Chothia等,1989,PMID:2687698；MacCallum等,1996,PMID:8876650；或Dubel,Ed.(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies,第3版,Wily-VCH Verlag GmbH and Co.。
抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库进行比对来鉴别。鉴别这些区域的方法记述在Kontermann和Dubel编，Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等，Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中。抗体序列的示例性数据库在“Abysis”网站www.bioinf.org.uk/abs(由英国伦敦的伦敦大学学院生物化学和分子生物学系的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org中有记载，并且可以通过这些网站访问，如Retter等，Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005)。优选地，使用Abysis数据库分析序列，该数据库将来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据整合在一起。参见Antibody Engineering Lab Manual(Duebel,S.和Kontermann编,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547，也可在网站bioinforg.uk/abs上找到)中AndrewC.R.Martin博士撰写的Protein Sequence and Structure Analysis of AntibodyVariable Domains章节。Abysis数据库网站还包括为鉴别CDR而开发的一般规则，这些规则可根据本文的教导使用。除非另有说明，本文提出的所有CDR都是根据Abysis数据库网站按照Kabat得出的。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
另外地或备选地，本申请的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如鉴别相关序列。这种搜索可以使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本申请的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用空位BLAST，如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
在其他实施方案中，CDR的氨基酸序列可以与上文所示的各个对应序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在其他实施方案中，可变区的氨基酸序列可以与上文所示的各个对应序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
优选地，分离的抗体或其抗原结合部分的CDR包含不超过2个氨基酸或不超过1个氨基酸的保守取代。本文使用的术语“保守取代”是指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质的氨基酸取代。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等，ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，它们通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分可以通过接头彼此连接。
在某些实施方案中，双特异性抗体进一步包含可操作地连接至第一抗原结合部分或第二抗原结合部分的Fc区。在某些实施方案中，Fc区可操作地连接至CD3抗原结合部分的CH1结构域。
本申请的双特异性抗体的Fc区可以是人Fc区。本申请的双特异性抗体的Fc区可以是任意同种型的，包括，但不限于：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在该方法的一个实施方案中，Fc区是IgG4同种型的。
在本申请的双特异性抗体的情形中，与Fc区的特定嵌合版本相比，Fc区可包含一个或多个氨基酸变化(例如插入、缺失或取代)，而不改变所需的功能。例如，本申请包括这样的双特异性抗原结合分子：其包含Fc区中的一个或多个修饰，导致修饰的Fc区在Fc和FcRn之间具有改变的结合相互作用(例如，增强或减弱)。这种Fc修饰的非限制性实例包括，例如，在人IgG4 Fc区的氨基酸序列的第228位，将丝氨酸(“S”)突变为脯氨酸(“P”)。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分是二价的。术语“二价”表示在一个抗原结合分子中分别存在两个结合位点。在某些实施方案中，这提供了比单价对应物更强的与抗原或表位的结合。在某些实施方案中，在二价抗原结合部分中，第一价结合位点和第二价结合位点在结构上是相同的(即具有相同的序列)。
TCR恒定区
人TCRα链恒定区称为TRAC，其NCBI登录号为P01848(https://www.uniprot.org/uniprot/P01848)，WT TCRα结构域的序列如下：IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS。
本发明中的工程化TCRα恒定结构域如下所示：PDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS(SEQ ID NO:30)。
人TCRβ链恒定区具有两个不同的变体，称为TRBC1和TRBC2(IMGT命名法)。在本发明中，野生型TCRβ结构域的序列如下所示：DLKNVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR，其NCBI登录号为A0A5B9(https://www.uniprot.org/uniprot/A0A5B9)，并且本发明中的工程化TCRβ恒定结构域如下所示：LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR(SEQ ID NO:29)。
在本申请中，本申请所提供的多肽复合物的第一TCR恒定区和第二TCR恒定区能够形成二聚体，所述二聚体包含在所述TCR恒定区之间的至少一个能够稳定所述二聚体的非天然链间键。
用于本申请的术语“二聚体”是指由两个分子(如多肽或蛋白)经由共价或非共价的相互作用形成的相缔合的结构。同源二聚体或同源二聚化由两个相同的分子形成，而异源二聚体或异源二聚化由两个不同的分子形成。由所述第一TCR恒定区和所述第二TCR恒定区形成的二聚体为异源二聚体。
在一个TCR恒定区的一个氨基酸残基与另一个TCR恒定区的另一个氨基酸残基之间形成链间键。在某些实施方案中，非天然链间键可以是能够使两个TCR恒定区域缔合成二聚体的任何键或相互作用。合适的非天然链间键的例子包括：二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥、或疏水-亲水相互作用、凸起-进-孔洞(knobs-into-holes)或其组合。
“二硫键”是指具有R-S-S-R’结构的共价键。氨基酸半胱氨酸包含一个硫醇基，该硫醇基可以与第二个硫醇基(例如，来自另一个半胱氨酸残基)形成二硫键。二硫键可以在两个分别位于两条肽链上的半胱氨酸残基的硫醇基之间形成，从而形成一个链间桥或链间键。
本文所用的“非天然”链间键是指在天然对应TCR恒定区的天然缔合中没有发现的链间键。例如，非天然链间键可以在一个突变氨基酸残基与一个天然氨基酸残基之间形成，每个残基都位于各自的TCR恒定区；或者备选地，在两个分别位于TCR恒定区的突变氨基酸残基之间形成。在某些实施方案中，形成至少一个非天然链间键，位于多肽复合物的第一TCR恒定区中包含的第一突变残基和第二TCR恒定区中包含的第二突变残基之间。
用于本申请的术语“接触界面”是指在所述多肽上所述多肽彼此相互作用/相缔合的一个或多个特定区域。接触界面包含一个或多个氨基酸残基，其能够在相互作用发生时与接触或缔合的一个或多个对应的氨基酸残基相互作用。接触界面中的氨基酸残基可处于或可不处于连续的序列中。例如，当所述界面是三维的时，所述界面内的氨基酸残基可以在线性序列上的不同位置彼此分开。
生成双特异性抗体
本申请提供的双特异性抗体及其抗原结合片段可以使用本领域公知的任何适宜方法制备。在常规方法中，可以在宿主细胞中共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，从而以重组方式生成双特异性抗体(参见，例如，Milstein和Cuello,Nature,305:537(1983))，然后通过亲和层析纯化。
也可以使用这样的重组方法，其中编码针对两种特异性的抗体重链可变结构域的序列分别融合至免疫球蛋白恒定结构域序列，然后插入到表达载体中，该表达载体与用于轻链序列的表达载体共转染到适当的宿主细胞中重组表达该双特异性抗体(参见，例如，WO94/04690；Suresh等,Methods in Enzymology,121:210(1986))。类似地，scFv二聚体也可以重组构建并从宿主细胞表达(参见，例如，Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))。
在另一种方法中，通过基因融合可以将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两个不同抗体的Fab'部分。连接的抗体在铰链区还原成四个半抗体(即，单体)，然后重新氧化以形成异源二聚体(Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))。
两个抗原结合结构域还可以缀合或交联以形成双特异性抗体或抗原结合片段。例如，一个抗体可以偶联至生物素，而另一个抗体可以偶联至抗生物素蛋白，生物素与抗生物素蛋白之间的强缔合作用将使两个抗体复合在一起形成双特异性抗体(参见，例如，美国专利号4,676,980B2；WO91/00360,WO 92/00373和EP 03089)。作为另一个实例，两个抗体或抗体结合片段可以通过本领域已知的常规方法交联在一起，如在美国专利号4,676,980B2中所公开的。
双特异性抗原结合片段可以自双特异性抗体生成，例如，通过蛋白水解切割，或通过化学连接生成。例如，可以制备抗体的抗原结合片段(例如，Fab5)并转化为Fab'-硫醇衍生物，然后与另一个转化的具有不同抗原特异性的Fab5衍生物混合并反应，从而形成双特异性抗原结合片段(参见，例如，Brennan等,Science,229:81(1985))。
编码本申请的抗体的核酸分子
在一些方面中，本申请涉及分离的核酸分子，其包含编码本文公开的双特异性抗体或抗原结合部分的核酸序列。例如，所述核酸序列可以编码双特异性抗体的重链和/或轻链。
编码CD3结合部分的重链可变结构域(VH1)的分离的核酸分子可以包含选自由以下组成的组的核酸序列：
(A)编码SEQ ID NO：13所示的重链可变结构域(VH1)的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：17所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
编码CD3结合部分的轻链可变结构域(VL1)的分离的核酸分子可以包含选自由以下组成的组的核酸序列：
(A)编码SEQ ID NO：14所示的轻链可变结构域(VL1)的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：18所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
编码EGFR结合部分的重链可变结构域(VH2)的分离的核酸分子可以包含选自由以下组成的组的核酸序列：
(A)编码SEQ ID NO：15所示的重链可变结构域(VH2)的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：19所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
编码EGFR结合部分的轻链可变结构域(VL2)的分离的核酸分子可以包含选自由以下组成的组的核酸序列：
(A)编码SEQ ID NO：16所示的轻链可变结构域(VL2)的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：20所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
在某些实施方案中，本申请提供编码CD3结合部分的重链的分离的核酸序列，其中所述编码CD3结合部分的重链的分离的核酸序列包含下述或由下述组成：
(A)编码SEQ ID NO：23所示的重链的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：27所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
在某些实施方案中，本申请提供编码CD3结合部分的轻链的分离的核酸序列，其中所述编码CD3结合部分的轻链的分离的核酸序列包含下述或由下述组成：
(A)编码SEQ ID NO：22所示的轻链的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：26所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
在某些实施方案中，本申请提供编码EGFR结合部分的重链的分离的核酸序列，其中所述编码EGFR结合部分的重链的分离的核酸序列包含下述或由下述组成：
(A)编码SEQ ID NO：24所示的重链的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：28所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
在某些实施方案中，本申请提供编码EGFR结合部分的轻链的分离的核酸序列，其中所述编码EGFR结合部分的轻链的分离的核酸序列包含下述或由下述组成：
(A)编码SEQ ID NO：21所示的轻链的核酸序列；
(B)SEQ ID NO：25所示的核酸序列；或
(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
在某些方面中，本申请涉及包含本文公开的核酸序列的载体。在另一个实施方案中，所述表达载体进一步包含编码双特异性抗体(例如，人源化的双特异性抗体)的恒定区的核苷酸序列。
在本申请的情况下载体可以是任何合适的载体，包括染色体的、非染色体的和合成的核酸载体(包含一组合适的表达控制元件的核酸序列)。这样的载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，和病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，CD3或EGFR抗体-编码核酸包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(描述于例如Sykes和Johnston,Nat Biotech 17,355-59(1997))、紧密核酸载体(描述于例如US 6,077,835和/或WO 00/70087)、质粒载体(例如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119)、“midge”最小尺寸的核酸载体(描述于例如Schakowski等,Mol Ther 3,793-800(2001))或作为沉淀的核酸载体构建体，例如CaP04-沉淀的构建体(描述于例如WO200046147,Benvenisty和Reshef,PNAS USA 83,9551-55(1986),Wigler等,Cell 14,725(1978)和Coraro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7,603(1981))。这样的核酸载体和其用途是本领域众所周知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一个实施方案中，载体适合在细菌细胞中表达抗CD3抗体和/或抗EGFR抗体。这样的载体的实例包括表达载体，例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke&Schuster,J Biol Chem 264,5503-5509(1989)、pET载体(Novagen,Madison WI)等。表达载体还可以或备选地是适合在酵母系统中表达的载体。可使用适合在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括，例如包含组成型或诱导型启动子，例如α因子、醇氧化酶和PGH的载体(综述于：F.Ausubel等,编Current Protocols in MolecularBiology,GreenePublishing and Wiley InterScience New York(1987)和Grant等,Methods in Enzymol153,516-544(1987))。
载体还可以或备选地是适合在哺乳动物细胞中表达的载体，例如，包含谷氨酰胺合成酶作为可选择标记的载体，例如描述于Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10:169-175中的载体。
核酸和/或载体还可以包含编码分泌/定位序列的核酸序列，所述分泌/定位序列可将多肽(例如新生的多肽链)靶向周质空间或细胞培养基。这样的序列是本领域已知的，并且包括分泌前导序列或信号肽。
载体可包含任何合适的启动子、增强子和其它表达促进元件或与其缔合。这样的元件的实例包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的多聚(A)终止序列、在大肠杆菌中用于质粒产物的复制起点、作为可选择标记的抗生素抗性基因和/或方便的克隆位点(例如，多聚接头)。核酸还可以包含与组成型启动子相对的诱导型启动子，例如CMV IE。
在另一个方面中，本申请涉及包含上文所述的载体的宿主细胞。
因此，本申请还涉及产生本申请的双特异性抗体的重组的真核或原核宿主细胞，例如转染瘤。
CD3特异性抗体可在重组的真核或原核宿主细胞例如转染瘤中表达，其产生本文定义的本发明的抗体，或本文定义的本发明的双特异性抗体。EGFR特异性抗体可同样地在重组的真核或原核宿主细胞例如转染瘤中表达，其产生本文定义的本发明的抗体或本文定义的本发明的双特异性抗体。
宿主细胞的实例包括酵母、细菌、植物和哺乳动物细胞，例如CHO、CHO-S、HEK、HEK293、HEK-293F、Expi293F、PER.C6或NSO细胞或淋巴细胞。例如，在一个实施方案中，宿主细胞可包含稳定整合至细胞基因组的第一和第二核酸构建体。在另一个实施方案中，本申请提供包含非整合核酸(例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件)的细胞，所述非整合核酸包含上文所述的第一和第二核酸构建体。
在另一方面，本申请涉及转基因非人动物或植物，其包含编码一组或两组人重链和人轻链的核酸，其中所述动物或植物产生本申请的双特异性抗体。
在另一方面，本申请涉及杂交瘤，其产生用于本文定义的本发明的双特异性抗体的抗体。在其它方面，本申请涉及转基因非人动物或植物，其包含编码一组或两组人重链和人轻链的核酸，其中所述动物或植物产生用于双特异性抗体的抗体或产生本发明的双特异性抗体。
在一个方面，本申请涉及表达载体，其包含：
(i)编码下述的核酸序列：本文公开的任一实施方案所述的第一抗原结合部分的重链可变区和/或第二抗原结合部分的重链可变区，任选地，还编码CH1结构域或CL结构域；
(ii)编码下述的核酸序列：本文公开的任一实施方案所述的第一抗原结合部分的轻链可变区和/或第二抗原结合部分的轻链可变区；
(iii)编码TCRβ恒定结构域或TCRα恒定结构域的核酸序列；
(iv)编码Fc区的核酸序列；
(v)编码接头的核酸序列；或
(vi)至少上述中两者的组合。
在一个方面中，本申请涉及编码序列表中所示的一个或多个氨基酸序列的核酸构建体。
在一个方面中，本申请涉及用于产生本文公开的任一实施方案所述的双特异性抗体的方法，包括以下步骤：培养本文公开的宿主细胞，所述宿主细胞包含本文公开的表达本文公开的双特异性抗体的一种或多于一种表达载体，和从培养基纯化所述抗体。在一个方面中，本发明涉及包含上文定义的表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是重组真核宿主细胞、重组原核宿主细胞或重组微生物宿主细胞。
药物组合物
在一些方面，本申请涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的承载体。
组合物的组分
药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗作为组合疗法施用，使得抗CD3/抗EGFR抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的承载体可以包括例如：药学上可接受的液体、凝胶或固体承载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。
合适的组分可以包括例如：抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如：甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，在包含本发明的抗体或抗原结合片段的溶剂中，本发明公开的组合物包含一种或多种抗氧化剂，如甲硫氨酸，所述抗氧化剂将可能被氧化的抗体或其抗原结合部分还原。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合，从而抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化，以延长其保质期和/或增加活性。
为了进一步说明，药学上可接受的承载体可以包括例如含水媒介物，例如氯化钠注射液，林格氏注射液，等渗右旋糖注射液，无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性媒介物如植物来源的不挥发油，棉籽油，玉米油，芝麻油或花生油，处在抑细菌剂或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或右旋糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80)，隔绝剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙二醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作承载体的抗微生物剂可以添加到包含酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
施用、制剂和剂量
本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于：口服，静脉内，动脉内，皮下，肠胃外，鼻内，肌内，颅内，心内，心室内，气管内，口腔，直肠，腹膜内，皮内，局部，经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于：片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，灌肠剂，注射剂，吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。
用于肠内施用的合适制剂包括：硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂，包括包衣片剂，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。
适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供在其中(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌的液体(例如溶液、混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如：水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗承载体的实例包括氯化钠注射液，林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量、给药时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期、清除率等)的经验考虑。
施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且是基于减少增殖或致瘤细胞的数量、维持这种肿瘤细胞的减少、减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。备选地，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。
本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于：特定化合物的活性，施用，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，以及物种，患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。
通常，本发明的抗体或其抗原结合部分可以以各种范围施用。这些包括每剂量约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重；每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量为至少约100μg/kg体重、至少约250μg/kg体重、至少约750μg/kg体重、至少约3mg/kg体重、至少约5mg/kg体重、至少约10mg/kg体重。
无论如何，本发明的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑来确定。
在某些优选的实施方案中，涉及本发明的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地，本发明的抗体或其抗原结合部分可以每天、每两天、每四天、每周、每十天、每两周、每三周、每月、每六周、每两个月、每十周或每三个月施用。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。
在已给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病况的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的减轻；与肿瘤相关的语言、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤病况的类型、肿瘤病况的阶段、肿瘤病况是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。
用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约10μg/ml至约100mg/ml的本文公开的抗体或其抗原结合部分。在某些选定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括：20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方案中，ADC浓度将包括：2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，14mg ml，16mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml或100mg/ml。
发明的应用
在一些方面，本发明提供了治疗受试者病症的方法，其包括向需要治疗的患者(例如人)施用治疗有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分。例如，所述病症是癌症。
可以使用本公开提供的方法治疗或预防涉及CD3和/或EGFR的多种癌症，无论是恶性的还是良性的，以及是原发性的还是继发性的。这些癌症可以是实体癌或血液恶性肿瘤。这些癌症的实例包括：肺癌如支气管癌(例如鳞状细胞癌，小细胞癌，大细胞癌和腺癌)，肺泡细胞癌，支气管腺瘤，软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌，例如粘液瘤，纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌，例如骨软骨瘤，软骨瘤，软骨母细胞瘤，软骨粘液纤维瘤，骨样骨瘤，巨细胞瘤，软骨肉瘤，多发性骨髓瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，尤因氏肿瘤(尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌，例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)，间变性星形细胞瘤，星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，脊索瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，脑膜瘤，垂体腺瘤，松果体瘤，骨瘤，血管母细胞瘤，颅咽管瘤，脊索瘤，生殖细胞瘤，畸胎瘤，皮样囊肿和血管瘤；消化系统中的癌症，例如结肠癌，平滑肌瘤，表皮样癌，腺癌，平滑肌肉瘤，胃腺癌，肠脂肪瘤，肠神经纤维瘤，肠纤维瘤，大肠息肉和结直肠癌；肝癌，例如肝细胞腺瘤，血管瘤，肝细胞癌，纤维板层癌，胆管癌，肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌，例如肾腺癌，肾细胞癌，高肾上腺瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；皮肤癌，例如基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，卡波西肉瘤和佩吉特氏病；头颈部癌症；与眼相关的癌症，例如成视网膜细胞瘤和眼内黑素癌(58hlorambuci melanocarcinoma)；男性生殖系统癌症，例如良性前列腺增生，前列腺癌和睾丸癌(例如，精原细胞瘤，畸胎瘤，胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症，例如子宫癌(子宫内膜癌)，宫颈癌(宫颈肿瘤)，卵巢癌(卵巢肿瘤)，外阴癌，阴道癌，输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状、滤泡状、间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌。在具体的实施方案中，癌症是结肠癌。
与化学疗法组合使用
抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。
术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症(例如癌症)的任何药剂，并且包括但不限于：细胞毒性剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，减积剂(debulkingagents)，化学治疗剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌剂，BRM，治疗性抗体，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言，在一些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶联物。因此，这样的工程化缀合物被明确地考虑在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方案中，该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于：细菌的小分子毒素或酶促活性毒素(例如，白喉毒素，假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素A)，真菌的小分子毒素或酶促活性毒素(例如α-八叠球菌素，局限曲霉素)，植物的小分子毒素或酶促活性毒素(相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴莲根毒素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，美洲商陆(Phytolacca mericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒素，石碱草抑制剂(59hlorambuofficinalis inhibitor)，白树毒素，mitegellin，局限曲霉素，酚霉素，新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物的小分子毒素或酶促活性毒素(例如，细胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)。
为了本发明的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学试剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成癌性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合施用的，并且通常是最有效的，例如，在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。
可以与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、磺酸烷基酯、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基蜜胺、番荔枝内酯(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利他汀(callystatin)、CC-1065、念珠藻环肽(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、软珊瑚醇(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵抑素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、达内霉素(dynemicin)、二膦酸盐、埃斯波霉素、色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素(authrarmycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、
Figure BDA0003662286220000571
多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂如亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基酮戊酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、地磷酰胺(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵、埃博霉素、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇(mopidanmol)、尼曲吖啶(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、
Figure BDA0003662286220000581
多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；
Figure BDA0003662286220000582
吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，
Figure BDA0003662286220000583
长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗雄激素；以及曲沙他滨(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，
Figure BDA0003662286220000584
rIL-2；
Figure BDA0003662286220000585
拓扑异构酶1抑制剂；
Figure BDA0003662286220000586
rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
与放射疗法组合使用
本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射、X-射线、UV-照射、微波、电子发射等)的组合。还考虑了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且所公开的缀合物可以与靶向的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。
药物包装和试剂盒
还提供了包含一个或多个含有一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分的容器的药物包装和试剂盒。在某些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分，具有或不具有一种或多种另外的试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量提供在一次性使用的预充式注射用注射器中。在其他实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖等；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。备选地，在一些实施方案中，缀合物组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与一个或多个容器相关联的任何标签指示封装的缀合物组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。
本发明还提供了用于产生位点特异性缀合物以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的缀合或非缀合形式的缀合物。在其他优选实施例中，一个或多个容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含工程化缀合物的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合疗法。例如，除了本发明的抗体或其抗原结合部分之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。
更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。在提供用于缀合的组合治疗剂的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。备选地，试剂盒的缀合物和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。
当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为一种或多种干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供在另一个容器中。
如上文简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具，例如一种或多种针、静脉内注射(I.V.)袋或注射器、或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注塑或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。
序列表概述
本申请附带有包含多个氨基酸序列和核酸序列的序列表。下表A提供了所包含的序列的概述。
本文公开的一种示例性抗体是抗CD3/抗EGFR双特异性抗体，被命名为“W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9”，在下文中称作lead BsAb。
表A.CDR的氨基酸序列
Figure BDA0003662286220000601
Figure BDA0003662286220000611
表B.可变区的氨基酸序列
Figure BDA0003662286220000612
表C.可变区的核苷酸序列
Figure BDA0003662286220000613
Figure BDA0003662286220000621
表D.轻链和重链的全长氨基酸序列
Figure BDA0003662286220000622
表E.轻链和重链的全长核苷酸序列
Figure BDA0003662286220000631
Figure BDA0003662286220000641
实施例
通过参考下述实施例，将更容易理解这样概括描述的本公开内容，所述实施例是以举例说明的方式提供的，不旨在限制本公开内容。所述实施例不旨在表示下文的实验是所进行的全部或唯一的实验。
实施例1
材料、基准(BMK)抗体和细胞系的准备
实施例中所用的可商购的材料的信息提供在表F中。除非另外指明，实验中所用的试剂和其他材料是可商购获得的。
表F.商购的材料
材料 供应商 目录号(Cat.)
人CD4<sup>+</sup>T细胞分离试剂盒 Stemcell 19052
人CD8<sup>+</sup>T细胞分离试剂盒 Stemcell 19053
人CD3<sup>+</sup>T细胞分离试剂盒 Stemcell 17951
Jurkat.2B8(人急性T细胞白血病) ATCC TIB-152
A431(人表皮样癌) ATCC CRL-1555
HT-29(人结肠直肠腺癌) ATCC HTB-38
MCF-7(人乳腺癌) ATCC HTB-22
HCC1419(人乳腺癌) ATCC CRL-2326
人CD3 epsilon(CD3ε)蛋白(His标签) Sino Biological Inc. 10977-H08H
表G.缩写
缩写 全称
CD3 分化簇3
EGFR 表皮生长因子受体
BsAb 双特异性抗体
ECD 胞外结构域
CHOK1-cynoPro1 表达食蟹猴EGFR的细胞系
cyno 食蟹猴
PBMC 外周血单核细胞
ADCC 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
CDC 补体依赖性的细胞毒性
DSF 差式扫描荧光法
LDH 乳酸脱氢酶
PBST 包含0.05％(v/v)Tween 20的磷酸缓冲盐水
TMB 四甲基联苯胺
ELISA 酶联免疫吸附测定
FACS 荧光激活细胞分选
表H.材料代码
Figure BDA0003662286220000661
1.1制备BMK抗体
在本申请中，按照标准分子学方法制备抗EGFR单克隆抗体(帕尼单抗和西妥昔单抗)和抗CD3单克隆抗体(W3311-2.306.4-z1-uIgG1K，制备的详细信息参见WO/2019/057099)以及抗CD3和抗EGFR双特异性抗体和一些BMK对照抗体。
合成编码抗CD3抗体、帕尼单抗和西妥昔单抗的可变区的DNA序列，并分别克隆到具有人IgG1、IgG2和IgG1的恒定区的表达载体中。
一般来说，按照制造商的使用说明(Expi293F转染试剂盒，Invitrogen)，将重组质粒转染到EXpi293细胞中。将细胞在培养箱中在37℃、8％CO2中培养，然后在培养5天后收集上清液。使用蛋白A柱和SEC柱纯化蛋白。
1.2生成表达靶标的细胞系
将食蟹猴EGFR的全长编码基因克隆到表达载体中，用于开发表达食蟹猴EGFR的细胞系。简言之，通过使用lipofectamine 2000试剂，用包含食蟹猴EGFR全长编码基因的重组质粒转染处于70-90％汇合的CHO-K1细胞。将转染的细胞在培养箱中在37℃、5％CO2培养。转染后24小时，使用终浓度为2-10μg/mL的杀稻瘟菌素(blasticidin)选择稳定的集合。然后，将阳性集合细胞通过有限稀释法进行亚克隆。挑取单个克隆，并使用抗EGFR抗体通过FACS检测。得到的表达食蟹猴EGFR的细胞系命名为CHOK1-cynoPro1(EGFR+/CD3-)细胞系。
另外，使用下述培养在完全培养基(RPMI 1640，补充有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中的细胞系：Jurkat.2B8(CD3+/EGFR-)细胞；MCF-7(CD3-/EGFRLow)细胞和HCC1419(CD3-/EGFR-)细胞。
使用在相应培养基中培养的其他细胞系：A431(CD3-/EGFRHigh)，在补充有10％FBS的DMEM中；HT29(CD3-/EGFRMed)细胞，在补充有10％FBS的MCCoy’s 5A中。
通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare-17-1440-03)密度离心，从来自健康的正常供体采集的肝素化静脉血新鲜分离人和食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)。分别通过EasySep试剂盒(Stemcell-19053)和EasySep试剂盒(Stemcell-19052)从新鲜人PBMC分离原代人CD8+T细胞和人CD4+T细胞，而通过EasySep试剂盒(Stemcell-17951)分离人CD3+T细胞。通过Pan T细胞分离试剂盒_非人灵长类(Miltenyi-130-091-993)分离食蟹猴T细胞。
实施例2
生成双特异性抗体
2.1生成双特异性抗体以选择抗体对
为了生成双特异性抗体，使用抗CD3抗体的序列(W3311-2.306.4-z1-uIgGK，在实施例1中制备)和抗EGFR抗体(帕尼单抗)的序列来构建不同的BsAb形式。
结果：
鉴定了用于生成双特异性抗体的抗体对。结果显示在表1中。
表1.用于制备双特异性抗体的序列信息
靶标名称 抗体 T/U形式
CD3 W3311-2.306.4-z1-uIgG1K(人源化抗CD3 mAb) T3
EGFR 帕尼单抗(抗EGFR mAb) U1
2.2生成不同形式的双特异性抗体
在本文提供的多肽复合物中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分缔合成Ig样结构。所述Ig样结构类似于具有Y型构建体的天然抗体，具有两个用于抗原结合的臂和一个用于缔合和稳定的茎。与天然抗体的类似性可以提供多种益处，例如良好的体内药代动力学、合乎需要的免疫应答和稳定性等。已经发现包含缔合在一起的本文提供的第一抗原结合部分和本文提供的第二抗原结合部分的Ig样结构具有与Ig(例如，IgG)相当的热稳定性。在某些实施方案中，本文提供的Ig样结构的热稳定性是天然IgG热稳定性的至少70％、80％、90％、95％或100％。
本文提供的双特异性多肽复合物包含四条多肽链：i)VH1-CH1-铰链1-CH2-CH3所示的第一重链；ii)VL1-CL所示的第一轻链；iii)VH2-C1-铰链2-CH2-CH3所示的第二重链；和iv)VL2-C2所示的第二轻链，其中C1和C2能够形成包含至少一个非天然链间键的二聚体，并且两个铰链区和/或两个CH3结构域能够形成一个或多个能够促进二聚化的链间键；其中i)的VH1-CH1部分与VL1-CL形成抗CD3臂(称为T3，参见图1)，并且iii)的VH2-C1与VL2-C2形成抗EGFR臂(称为U1，参见图1)。
2.3制备双特异性抗体用于体内研究
通过PCR从抗CD3单克隆抗体(W3311-2.306.4-z1-uIgG1K)扩增编码抗CD3抗体的VL和VH的核酸序列。抗EGFR抗体的VL和VH来自ABX(帕尼单抗)，并且它们的编码核酸序列分别由金唯智公司(Genewiz Inc)合成。Cα和Cβ基因由金唯智公司合成。将抗CD3天然或抗EFGR嵌合轻链基因插入到线性化载体中，该线性化载体包含CMV启动子和κ信号肽。将抗CD3VH-CH1的DNA片段插入到线性化载体中，该载体包含具有凸起突变的人IgG4V9(突变S228P、F234A和L235A)恒定区CH2-CH3。抗EGFR VH-Cβ的DNA片段插入到线性化载体中，该载体包含具有孔洞突变的人IgG4V9(突变S228P、F234A和L235A)恒定区CH2-CH3。载体包含CMV启动子和人抗体重链信号肽。
使用Expi293表达系统试剂盒(ThermoFisher-A14635)，按照制造商的使用说明，将得到的编码重链和轻链的重组表达质粒共转染到Expi293细胞中。转染后五天，收集上清液，并通过使用蛋白A柱(GE Healthcare-17543 802)纯化蛋白，通过使用大小排阻柱(GEHealthcare-17104301)进一步纯化。通过Nano Drop测量抗体浓度。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC评价蛋白的纯度。
结果：
设计、构建并产生抗CD3 x EGFR抗体，即W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9。该双特异性抗体的形式显示在图1中，SDS-PAGE和SEC-HPLC色谱图分别显示在图2和图3中。通过瞬时表达，抗体W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的表达滴度高于170mg/L，纯度达到93.82％。
实施例3
双特异性抗体的体外表征
3.1通过FACS测量的人CD3和EGFR结合活性
通过流式细胞术测定EGFR×CD3双特异性抗体与表达人CD3和EGFR的细胞的结合。
简言之，将1×105个Jurkat.2B8(CD3+/EGFR-)或A431(EGFR+/CD3-)细胞与EGFR×CD3双特异性抗体或hIgG4同种型对照抗体的连续稀释液在4℃孵育60分钟。用补充有1％牛血清白蛋白的冷PBS(洗涤缓冲液)洗涤两次后，通过将细胞与荧光标记的抗人IgG抗体在4℃孵育30分钟而检测细胞表面结合的抗体。将细胞在相同缓冲液中洗涤两次，使用FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)测量染色细胞的平均荧光(MFI)。使用不含抗体或仅含二抗的孔建立背景荧光。通过使用GraphPad Prism软件，使用四参数非线性回归分析来获得关于细胞结合的EC50值。
结果：
使用Jurkat.2B8和A431细胞系，通过FACS进行lead BsAb(即，W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9)与人CD3和EGFR的结合活性检测。结果显示在图4和表2中。数据显示lead BsAb能够以中等亲和力结合人CD3(即，如图4A所示，lead BsAb与Jurkat.2B8(CD3+/EGFR-)细胞的结合活性低于人源化抗CD3抗体W3311-2.306.4-z1-uIgG1K)，而显示出与表达人EGFR的细胞的强结合活性(即，如图4B所示，lead BsAb与A431(EGFR+/CD3-)细胞的结合活性高于抗EGFR抗体帕尼单抗)。
表2.lead BsAb与人CD3和EGFR的结合活性
Figure BDA0003662286220000691
NA:未分析。
3.2通过FACS测量食蟹猴CD3和EGFR的交叉结合活性
通过流式细胞术测定EGFR×CD3双特异性抗体与表达食蟹猴CD3和EGFR的细胞的结合。
简言之，将1×105个食蟹猴PBMC(CD3+/EGFR-)细胞或CHOK1-cynoPro1(EGFR+/CD3-)细胞与EGFR×CD3双特异性抗体或hIgG4同种型对照抗体的连续稀释液在4℃孵育60分钟。用补充有1％牛血清白蛋白的冷PBS(洗涤缓冲液)洗涤两次后，通过将细胞与荧光标记的抗人IgG抗体在4℃孵育30分钟而检测细胞表面结合的抗体。将细胞在相同缓冲液中洗涤两次，使用FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)测量染色细胞的平均荧光(MFI)。使用不含抗体或仅含二抗的孔建立背景荧光。通过使用GraphPad Prism软件，使用四参数非线性回归分析来获得关于细胞结合的EC50值。
结果：
使用食蟹猴PBMC细胞和表达EGFR的稳定CHOK1细胞，通过FACS进行lead BsAb(即，W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9)与食蟹猴CD3和EGFR的结合活性检测。结果显示在图5和表3中。数据显示lead BsAb能够以中等亲和力结合食蟹猴CD3(即，如图5A所示，lead BsAb与食蟹猴T细胞(Cyno T细胞)的结合活性低于人源化抗CD3抗体W3311-2.306.4-z1-uIgG1K)，而显示出与表达食蟹猴EGFR的细胞的强结合活性(即，如图5B所示，lead BsAb与CHOK1-cynoPro1(EGFR+/CD3-)细胞的结合活性高于抗EGFR抗体帕尼单抗)。
表3.lead BsAb与食蟹猴CD3和EGFR的结合活性
Figure BDA0003662286220000701
NA:未分析。
3.3通过FACS测量人CD3和EGFR的结合活性
通过FACS分析测量EGFR×CD3双特异性抗体与人CD3和EGFR的结合亲和力。将A431(EGFR+/CD3-)细胞和Jurkat.2B8(CD3+/EGFR-)细胞分别以5x104个细胞/ml的密度转移到96孔U底板中。测试的抗体在洗涤缓冲液(1×PBS/1％BSA)中连续稀释，并与细胞在4℃孵育1小时。加入二抗山羊抗人IgG Fc FITC(Jackson,109-095-098，每摩尔IgG 3.6摩尔FITC)，并在4℃在暗处孵育0.5小时。然后，洗涤细胞一次，并将细胞重悬在1×PBS/1％BSA中，通过流式细胞术分析。基于定量珠(QuantumTM MESF试剂盒,Bangs Laboratories,Inc.)，将荧光强度转化成结合的分子/细胞。
结果：
通过流失细胞术，在Jurkat.2B8细胞和A431细胞上检测W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9与人CD3和EGFR的结合亲和力。如在图6和表4中所示，与CD3结合(图6A所示)和与EGFR结合(图6B所示)的拟合的KD值分别为4.7nM和6.2nM。
表4.lead BsAb与人CD3和EGFR的结合亲和力
样品 Jurkat.2B8(hCD3) A431(hEGFR)
Bmax(M) 1.40×10<sup>-11</sup> 3.00×10<sup>-9</sup>
KD(M) 4.70×10<sup>-9</sup> 6.20×10<sup>-9</sup>
r<sup>2</sup> 0.98 0.98
3.4通过FACS测量对靶细胞的双重结合
为了测试lead BsAb与表达人CD3和EGFR的细胞的同时结合，将1×106个/ml A431(EGFR+/CD3-)细胞和1×106个/ml Jurkat.2B8(CD3+/EGFR-)细胞分别用50nM钙黄绿素-AM(Invitrogen-C3099)和20nM FarRed(Invitrogen-C34572)标记。用冷1％BSA/1XPBS洗涤后，将标记的A431和Jurkat.2B8细胞重悬并以2:3(细胞数目比例)混合至1×106个/ml的终浓度。将1x105个/孔的混合细胞铺板，然后加入BsAb的连续稀释液。在4℃孵育60分钟后，通过FACS分析钙黄绿素-AM和FarRed双重阳性细胞的百分比。
结果：
通过流式细胞术，使用预先标记的Jurkat.2B8和A431细胞检测W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9与表达CD3和EGFR的细胞的结合活性。如图7所示，与阴性对照相比，桥接的Jurkat.2B8和A431细胞群体中大约18％是通过双特异性抗体W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9桥接。
3.5人T细胞活化的评估
新鲜分离的人PBMC用作效应细胞，并通过EGFR×CD3双特异性抗体活化，通过CD69和CD25表面表达的诱导进行测量。通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,#17-1440-03)密度离心从肝素化的静脉血新鲜分离PBMC，然后将其在完全培养基(RPMI 1640，补充有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中培养过夜。在测定当天，PBMC与或不与A431、HT-29和HCC1419(靶细胞：1×104个细胞/孔；E:T比例，10:1)和抗体在RPMI1640/10％FBS中在37℃共孵育24小时。在用1％BSA洗涤一次后，将细胞沉淀物用含有抗人Ab组(FITC标记的抗人CD4(BD Pharmingen-550628)；PerCP-Cy5.5标记的抗人CD8(BD Pharmingen-560662)；PE标记的抗人CD69(BD Pharmingen-555531)和APC标记的抗人CD25(BD Pharmingen-555434))的染色缓冲液重悬。在4℃孵育30分钟后，将细胞用1％BSA洗涤两次。通过流式细胞术(BD Biosciences)测定FITC或PerCp-Cy5.5阳性细胞中PE或APC阳性细胞的百分比。
通过用流式细胞术测量表达CD69或CD25的效应细胞的百分比，来确定BsAb的T细胞活化。将新鲜分离的纯化的人CD4+T细胞和CD8+T细胞分别作为效应细胞进行检验。简言之，将5x104个CD4+T或CD8+T细胞铺在110μl/孔的完全培养基(包含BsAb或hIgG4同种型对照抗体的连续稀释液)中，在1x104个A431、HT-29或HCC1419细胞/孔的存在下或不存在下在37℃24小时。孵育后，将细胞用1％BSA/1XDPBS洗涤两次，然后用抗人Ab组(FITC标记的抗人CD4(BD Pharmingen-550628)；PerCP-Cy5.5标记的抗人CD8(BD Pharmingen-560662)；PE标记的抗人CD69(BD Pharmingen-555531)和APC标记的抗人CD25(BD Pharmingen-555434))在4℃染色30分钟。通过FACS分析经由CD69或CD25表达评价的T细胞活化。通过使用Prism四参数非线性回归分析确定T细胞活化的EC50。
结果：
为了测试W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的人T细胞活化，将肿瘤细胞A431(高EGFR表达)、HT-29(中等EGFR表达)和HCC1419(阴性EGFR表达)用作靶细胞。如图8和表5所示，在人PBMC T细胞活化测定中，在表达EGFR的细胞(A431和HT-29)的存在下，W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9有效地诱导CD8+T-细胞活化，而在阴性EGFR表达的细胞(HCC1419)的存在下，存在程度低得多的T细胞活化。
表5.在肿瘤细胞存在下的人T细胞活化
Figure BDA0003662286220000731
NA:未分析。
3.6针对肿瘤细胞的食蟹猴T细胞活化
为了检测W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的T细胞活化，使用肿瘤细胞A431(高EGFR表达)、HT-29(中等EGFR表达)和HCC1419(阴性EGFR表达)作为靶细胞。方法步骤类似于3.5节。
结果：
如图9和表6所示，在猴PBMC T细胞活化测定中，在表达EGFR的细胞(A431和HT-29)的存在下，W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9有效地诱导CD8+T细胞活化，而在阴性EGFR表达的细胞(HCC1419)的存在下，存在程度低得多的T细胞活化。
表6.在肿瘤细胞存在下的食蟹猴T细胞活化
Figure BDA0003662286220000732
NA:未分析。
3.7针对肿瘤细胞的细胞毒性测定
使用预先活化的人PBMC作为效应细胞，在萤光素酶定量测定中，确定EGFR×CD3双特异性抗体调节特异性肿瘤细胞裂解的能力。简言之，将分离的人PBMC在含有50IU/ml重组人IL-2(Delusheng,#20171166b)和10ng/ml OKT-3(eBioscience,#16-0037-85)的完全培养基(RPMI1640，补充有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)中培养3天。在测定当天，将靶细胞一式两份接种在具有效应细胞(PBMC/靶细胞比例为10:1)和双特异性抗体或亲本单克隆抗体在完全培养基中的连续稀释液的96孔微量平板中。允许效应细胞和肿瘤细胞在37℃接触3天。在测试当天，将平板用180μL/孔的DPBS洗涤两次，然后加入50μL/孔的Cell Titer Glo试剂(Promega,#G7573)。在暗处孵育10分钟后，通过Envision(PerkinElmer)测量生物发光信号。
细胞毒性百分比使用下述等式计算：
％细胞毒性＝(Luc S–仅有效应细胞的Luc)/(仅有肿瘤细胞的Luc–仅有效应细胞的Luc)*100％
其中“Luc S”是测试孔的生物发光信号，“仅有效应细胞的Luc”是残余效应细胞的生物发光信号，“仅有肿瘤细胞的Luc”是仅有肿瘤细胞的对照孔的生物发光信号。
结果表示为来自一式两份孔的特异性裂解％(平均值±SD)。
结果：
使用四种不同的表达EGFR的肿瘤细胞，在原代T细胞的存在下，评价W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的细胞毒性活性。如图10和表7所示，lead BsAb显示出针对表达EGFR的肿瘤细胞的选择性且更有效的细胞毒性，但对EGFR阴性细胞仅有可忽略的杀伤作用。细胞毒性具有0.6至19.88的EC50值，这与肿瘤细胞上的EGFR表达一致。
表7.针对肿瘤细胞的T细胞杀伤作用
Figure BDA0003662286220000741
Figure BDA0003662286220000751
NA:未分析。
3.8 ADCC和CDC测定
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)通过LDH释放测定来确定。通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,#17-1440-03)密度离心从肝素化静脉血新鲜分离人外周血单核细胞(PBMC)，然后在完全培养基(RPMI1640，补充有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中培养过夜。通过人CD56阳性选择试剂盒(Miltenyi-130-050-401)分离NK细胞。简言之，在ADCC测定当天，将表达EGFR的靶细胞A431或表达CD3的靶细胞Jurkat.2B8(2E4/孔)以110μL铺板，其中具有效应细胞(NK/靶细胞比例为2.5:1)和抗体或hIgG同种型对照的连续稀释液，在完全培养基中在37℃4小时。孵育后，将平板离心并将70μL上清液转移到透明底96孔平板(Corning,#3599)中，并向每个孔中加入50μL反应混合物(Roche,#116447930，细胞毒性反应试剂盒)并孵育15分钟。在加入终止溶液后，通过M5e读取平板，以测量在492nm和600nm处样品的吸光度。
细胞毒性百分比使用以下等式计算：
％细胞毒性＝(样品–效应细胞对照–靶细胞对照)/(靶细胞裂解–靶细胞对照)*100％
对于CDC测定，将表达EGFR的靶细胞A431或表达CD3的靶细胞Jurkat.2B8(2E4/孔)以110μL铺板，其中具有人正常血清(最终1:50稀释)(Quidel,#A113)和抗体或hIgG同种型对照的连续稀释液，在完全培养基中在37℃2小时。孵育后，将平板离心并将70μL上清液转移到透明底96孔平板(Corning,#3599)中，并向每个孔中加入50μL反应混合物(Roche,#116447930，细胞毒性反应试剂盒)并孵育15分钟。在加入终止溶液后，通过M5e读取平板，以测量在492nm和600nm处样品的吸光度。
细胞毒性百分比使用以下等式计算：
％细胞毒性＝(样品–靶细胞对照)/(靶细胞裂解–靶细胞对照)*100％
使用GraphPad Prism软件确定杀伤作用的IC50值，使用四参数非线性回归分析计算各值。
结果：
评价lead抗体W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9针对Jurkat.2B8和A431细胞的ADCC和CDC能力。如图11所示，该lead BsAb对Jurkat.2B8和A431肿瘤细胞二者都没有诱导ADCC和CDC活性。
3.9热稳定性(DSF)
使用QuantStudioTM7Flex实时PCR系统(Applied Biosystems)研究抗体的Tm。
简言之，将19μL抗体溶液与1μL 62.5X SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合并转移至96孔平板(Biosystems)。将平板以0.9℃/min的速率从26℃加热至95℃，并收集产生的荧光数据。计算关于不同温度的荧光变化的负导数，最大值定义为解链温度Tm。如果蛋白具有多个解折叠转换，则报告前两个Tm，分别命名为Tm1和Tm2。数据收集和Tm计算由操作软件(QuantStudioTM实时PCR软件v1.3)自动进行。
结果：
差式扫描荧光法(DSF)用于评价W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的热稳定性。如表8和图12所示，W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的Tm1和Tm2分别为55.4℃和71.8℃。
表8.DSF测定的热稳定性参数
Figure BDA0003662286220000761
3.10血清稳定性
对于双重结合FACS分析，将来自不同时间点的样品同时在4℃自由解冻。将解冻的抗体连续稀释并添加到1×105个A431细胞/孔中且在4℃孵育1小时。将细胞用补充有1％牛血清白蛋白的PBS洗涤两次。向细胞中加入W331-hPro1.ECD.His(Sino)(3.16nM)并在4℃孵育1小时。1小时孵育后，将细胞用补充有1％牛血清白蛋白的PBS洗涤两次，然后向细胞中加入在1％牛血清白蛋白中1:400稀释的His标签抗体[生物素]，mAb，小鼠(GenScript-A00613)，并在4℃孵育30分钟。在将细胞用1％牛血清白蛋白洗涤两次后，向细胞中加入在1％牛血清白蛋白中1:4000稀释的Alexa647-缀合的链霉抗生物素蛋白(Jackson ImmunoResearch-016-600-084)并在4℃孵育30分钟。将细胞在相同缓冲液中洗涤两次，使用FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)测量染色细胞的平均荧光(MFI)，并通过FlowJo分析。不含抗体或仅含二抗的孔用来建立背景荧光。通过GraphPad Prism软件，使用四参数非线性回归分析得到关于细胞结合的EC50值。
结果：
在人血清中进行W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的血清稳定性测定。将lead BsAbW3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9与人血清在37℃共同培养0、1、4、7和14天，并通过FACS测试结合活性。如图13所示，数据显示血清培养对W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9与CD3和EGFR的结合能力没有不利影响。
实施例4
在人PBMC-HT29模型中的体内抗肿瘤功效研究
在NCG雌性小鼠(Nanjing Galaxy Biopharmaceutical Co.)中的人PBMC-HT29模型中测试W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的抗肿瘤功效。在研究中使用13-14周龄的雌性NCG小鼠(购自NCG)。在37℃在空气中5％CO2的气氛中，将HT29细胞在体外作为单层培养物维持在RPMI 1640培养基(补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理，将肿瘤细胞每周常规传代培养两次。收集处于指数生长期生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
为了建立治疗模型，在第0天，每只小鼠在右前方侧腹部皮下接种HT29肿瘤细胞(2.0×106个细胞，在100ul PBS中)并腹膜内注射处在100ul PBS中的2.0×106个PBMC细胞(Hemacare,Lot Number:19054078)。在PBMC植入后第11天，通过FACS检测外周血人/小鼠CD45、人CD3。选择具有绝对人CD3>3％的动物用于后续研究；在PBMC植入后第12天，当平均肿瘤体积达到约130mm3时，将动物随机分成4组，每组包含5只小鼠。这4组小鼠分别每周一次接受下述腹膜内注射，共4次注射：0.3mg/kg体重的同种型对照；0.3mg/kg体重的帕尼单抗；0.3mg/kg体重的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9；0.08mg/kg体重的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9。将第一次注射的那天视为第0天。对于所有肿瘤研究，对小鼠称重，使用卡尺每周两次测量肿瘤生长。定期检测外周血人CD45、人CD3。研究中所有与动物操作、管理和处理相关的步骤都按照由上海SIPPR-BK实验动物有限公司(Shanghai SIPPR-BK LaboratoryAnimal Co.,Ltd)的机构动物管理和使用委员会(IACUC)遵循国际实验动物评估和认可委员会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)核准的指南进行。肿瘤体积使用下式计算：(1/2(长×宽2)。使用下式对每组计算TGI(肿瘤生长抑制)：
TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，
Ti是治疗组在指定日期的平均肿瘤体积。T0是治疗组在治疗第一天的平均肿瘤体积。Vi是媒介物对照组在与Ti同日的平均肿瘤体积，V0是媒介物对照组在治疗第一天的平均肿瘤体积。
结果表示为平均值和标准误差(平均值±SEM)。数据使用Graphpad Prism 6.0通过双向ANOVA Tukey多重比较检验进行分析，并且p<0.05视为是统计学显著的。
结果：
在研究期间所有小鼠都存活。两只动物(同种型对照组中有1只，0.3mg/kg体重的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9组中有1只)显示出明显的体重减轻(>15％)，它们被鉴定为GVHD(移植物抗宿主病)，并被从最终数据分析中排除。如图14所示，所有组中整体平均体重减轻在5％之内，在各组之间没有观察到统计学差异(p>0.05，双向ANOVA)。
如图15A所示，在研究期间监测外周血人CD3的百分比。在0.08mg/kg和0.3mg/kg的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9组中没有观察到明显的T细胞去除。如图15B所示，在治疗后第27天，与同种型对照相比，在低剂量W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9组(0.08mg/kg体重，p<0.01，单向ANOVA)，观察到外周血人CD3的显著增加；在肿瘤组织中，在所有组之间没有观察到人CD3的差异。
如图16所示，在第一次给药后第27天，同种型对照组的平均肿瘤体积是2174mm3，这表明HT29模型得到良好地建立。与同种型组相比，0.3mg/kg体重的帕尼单抗不抑制肿瘤生长(p>0.05)；W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9在0.08mpk和0.3mpk均显著抑制肿瘤生长(分别具有p<0.0001和p<0.001)。与0.3mg/kg体重的帕尼单抗相比，0.3mg/kg体重的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9显著抑制肿瘤生长(p<0.01)，0.08mg/kg体重的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9显著抑制肿瘤生长(p<0.0001)。每组在第27天的TGI如下：对于0.3mg/kg体重的帕尼单抗，16.21％；对于0.3mg/kg体重的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9，33.35％；对于0.08mg/kg体重的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9，58.61％，显示在表9中。
图16和表9中的数据表明W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9在0.08mg/kg的较低剂量获得的TGI出乎意料地高于在0.3mg/kg获得的TGI。
表9.肿瘤生长抑制
Figure BDA0003662286220000791
实施例5
在人PBMC-HCT116 NCG小鼠模型中的体内抗肿瘤功效研究
在人PBMC-HCT116 NCG小鼠模型(Nanjing Galaxy Biopharmaceutical Co.)中研究W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的抗肿瘤功效。在研究中使用10-11周龄的雌性NCG小鼠。在37℃在空气中5％CO2的气氛中，将HCT116细胞在体外作为单层培养物维持在McCoy's5A培养基(补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理，将肿瘤细胞每周常规传代培养两次。收集处于指数生长期生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
为了建立治疗模型，在第0天，每只小鼠在右前方侧腹部皮下接种HCT116肿瘤细胞(1.5×106个细胞，在100ul PBS中)并腹膜内注射处在100ul PBS中的3.0×106个PBMC细胞(Hemacare,Lot Number:19054078)。在PBMC植入后第11天，通过FACS检测外周血人/小鼠CD45、人CD3。选择具有绝对人CD3>3％的动物用于后续研究：在PBMC植入后第11天，当平均肿瘤体积达到约120mm3时，将动物随机分成5组，每组包含7只小鼠。这5组小鼠分别每周一次接受下述腹膜内注射，共4次注射：0.1mg/kg的同种型对照；0.1mg/kg的帕尼单抗(WBP336-hBMK2.IgG2)；0.3mg/kg的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9；0.1mg/kg的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9；0.03mg/kg的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9。将第一次注射的那天视为第0天。对于所有肿瘤研究，对小鼠称重，使用卡尺每周两次测量肿瘤生长。定期检测外周血人CD45、人CD3。研究中所有与动物操作、管理和处理相关的步骤都按照由上海SIPPR-BK实验动物有限公司(Shanghai SIPPR-BK Laboratory Animal Co.,Ltd)的机构动物管理和使用委员会(IACUC)遵循国际实验动物评估和认可委员会(Association for Assessmentand Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)核准的指南进行。肿瘤体积使用下式计算：(1/2(长×宽2)。使用下式对每组计算TGI(肿瘤生长抑制)：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中Ti是治疗组在指定日期的平均肿瘤体积，T0是治疗组在治疗第一天的平均肿瘤体积，Vi是媒介物对照组在与Ti同日的平均肿瘤体积，V0是媒介物对照组在治疗第一天的平均肿瘤体积。结果表示为平均值和标准误差(平均值±SEM)。数据使用Graphpad Prism 6.0通过双向ANOVA Tukey多重比较检验进行分析，并且p<0.05视为是统计学显著的。
结果：
在研究期间所有小鼠都存活。通过流式细胞术测量外周血淋巴细胞重建的比例。在三只动物中证实几乎没有CD45+细胞，将这三只动物从最终数据分析中排除(在0.3mg/kgW3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9组中有1只，在0.1mg/kg W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9组中有1只，在0.03mg/kg W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9组中有1只)。如图17所示，所有组中整体平均体重减轻不超过5％，在各组之间没有观察到统计学差异(p>0.05，双向ANOVA)。
如图18所示，在第一次给药后第23天，同种型对照组的平均肿瘤体积是1720mm3，这表明HCT116模型得到良好地建立。与同种型组相比，0.1mg/kg的帕尼单抗不抑制肿瘤生长(p>0.05)；W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9在0.3mg/kg显著抑制肿瘤生长(p<0.001)，TGI在表10中列出。
表10.肿瘤生长抑制
Figure BDA0003662286220000811
实施例6
在食蟹猴中W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的单剂量PK和初步毒性研究
4只食蟹猴分成两组(2只动物/组)。组1和组2的动物通过单次静脉内推注给药分别施用1mg/kg和10mg/kg的W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9。动物信息在表11中列出。进行整体健康和外观、特别是皮肤刺激的笼边观察。分别通过血液细胞分析仪(ADVIA2120)和化学(HITACHI 7180)测定关于血液学(CBC)的全血样品分析和关于化学检测的血清分析。样品采集信息在表12中列出。
表11.动物信息
Figure BDA0003662286220000812
Figure BDA0003662286220000821
结果：
本研究的目的是确定在首次用于免疫的雌性食蟹猴中单次静脉内推注施用后W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9的药代动力学和初步毒性作用。血清药物浓度显示在图19中，对于1mg/kg和10mg/kg，T1/2分别为7.75小时和19.4小时。PK参数在表13中列出。
在食蟹猴中的初步毒性研究
如图20所示，在给药后24小时，外周血中CD4+和CD8+T细胞百分比下降。对于1mg/kg组，在施用后3天，外周血CD4+和CD8+T细胞群体的水平完全恢复；对于10mg/kg组，在施用后14天，T细胞水平完全恢复。在这两个给药方案中观察到剂量依赖性作用。
如图21所示，在W3448-T3U1.E17R-1.uIgG4V9施用后，观察到IL-4和IL5浓度没有显著变化。在以1mg/kg和10mg/kg施用后8小时，IFN-γ略微增加。在以1mg/kg施用后1小时(C1502)，观察到TNF-α浓度短暂增加。
以10mg/kg，发现一只猴子(C2501，雌性)在注射后8小时濒临死亡，在注射后4小时观察到IL-2浓度增加，在注射后8小时和12小时检测到非常高的IL-6浓度，并且这只猴子在给药后12小时安乐死。
表13.在食蟹猴中的PK参数
Figure BDA0003662286220000831
“NC”意指由于少于3个定量值没有进行计算。
“--”意指不适用。
C2501*在治疗后12小时安乐死。
本领域技术人员应该进一步理解，本发明可以在不背离其精神和核心属性的前提下以其他具体形式实施。由于在前述说明书中，本发明仅公开了示例性的实施方案，应该理解其他的变化也被包括在本发明的范围之内。因此，本发明不限于本文详细描述的具体实施方案。相反，关于本发明的范围和内容，应该参考后附的权利要求书。
参考文献
1.Patent:EP 0018795 B1；1986,06 26.(OKT3).Monoclonal-antibody-producing hybrid cell line,antibody and method of preparing it,therapeuticcomposition containing it and its diagnostic and therapeutic uses.
2.Patent No:US 6,217,866 B1,April 17,2001；June 7,1995(Erbitux).Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor andtherapeutic methods employing same.
3.Patent No:US 6,235,883 B1；May 22,2001；May 5,1997(Panitumumab).Humanmonoclonal antibodies to Epidermal Growth Factor Receptor.
4.WO/2019/057099
5.The EGFR family and its ligands in human cancer:signalingmechanisms and therapeutic opportunities.Y.Yarden.European Journal of Cancer37(2001)S3–S8
6.Anti-CD3 X Anti-EGFR Bispecific antibody redirect T-cell cytolyticactivity to EGFR-positive cancer In vitro and in an animal model.UrsulaReusch,et al.Clin Cancer Res 2006；12(1).
7.Cytotoxicity of cytokine-induced killer cells targeted by abispecific antibody to gastric cancer cells.Lin Zhang,et al.Oncology letters5,2013
8.Human IgG2 Antibodies against Epidermal Growth Factor ReceptorEffectively Trigger Antibody-Dependent Cellular cytotoxicity but,in Contrastto IgG1,Only by Cells of myeloid Lineage.Tanja Schneider-Merck,et al.JImmunol 2010；184:512-520
9.Targeting the EGFR signaling pathway in cancertherapy.Parthasarathy Seshacharyulu,et al.Expert Opin TherTargets.2012January；16(1):15–31
10.Anti-EGFR Therapy:Mechanism and Advances in Clinical Efficacy inBreast Cancer.John F.Flynn,et al.Journal of Oncology Volume 2009
11.EGFR Antagonists in Cancer Treatment.Fortunato Ciardiello,et.al.NEngl J Med 2008；358:1160-74
12.Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFRtherapy in colorectal cancer.Sandra Misael,et al.Nature volume 486,Pages 532–536(2012)。
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司（WUXI BIOLOGICS (SHANGHAI) CO., LTD.）
WUXI BIOLOGICS IRELAND LIMITED
<120> 新型抗CD3/抗EGFR双特异性抗体及其用途
<130> IEC196135PCT
<150> PCT/CN2019/121869
<151> 2019-11-29
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 1
Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 2
Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 3
Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 4
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 6
Thr Gln Ser His Thr Leu Arg Thr
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 7
Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr
1 5 10
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 8
His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 9
Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 10
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 11
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 12
Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu Ala
1 5
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val
115
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 17
caggtgcagc ttgtgcagtc tggggcagaa gtgaagaagc ctgggtctag tgtcaaggtg 60
tcatgcaagg ctagcgggtt cgcctttact gactactaca tccactgggt gcggcaggct 120
cccggacaag ggttggagtg gatgggatgg atctccccag gcaatgtcaa cacaaagtac 180
aacgagaact tcaaaggccg cgtcaccatt accgccgaca agagcacctc cacagcctac 240
atggagctgt ccagcctcag aagcgaggac actgccgtct actactgtgc cagggatggg 300
tactccctgt attactttga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
<210> 18
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 18
gatatcgtga tgacccagag cccagactcc cttgctgtct ccctcggcga aagagcaacc 60
atcaactgca agagctccca aagcctgctg aactccagga ccaggaagaa ttacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct aagctgctca tctactgggc ctccacccgg 180
cagtctgggg tgcccgatcg gtttagtgga tctgggagcg ggacagactt cacattgaca 240
attagctcac tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300
cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaag 336
<210> 19
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 19
caggtgcaac tgcaggaaag cggaccagga cttgtgaagc cctctgagac tttgtccctg 60
acctgtaccg tctccggggg ctctgtcagt tcaggggatt actactggac atggatcagg 120
cagagtcctg ggaaaggcct ggagtggatt gggcacatct actactcagg gaacaccaac 180
tacaatccca gcctcaagag cagactgacc atcagcattg acacctccaa gacacagttc 240
tccctgaagc tcagcagcgt gactgccgcc gacacagcaa tctactattg cgtgcgcgac 300
cgggtgacag gcgcttttga tatttggggc cagggcacaa tggtcactgt g 351
<210> 20
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 20
gatatccaga tgacccagtc cccttcctcc ttgtccgcaa gtgtgggaga tagagtgacc 60
atcacatgcc aggcttctca ggacatctct aactacctga actggtacca acagaagccc 120
ggcaaggccc ctaagctcct tatctacgac gcctcaaatc tggagaccgg agtcccaagc 180
aggttcagcg gcagcgggag cgggacagat ttcactttta caattagctc cctccagcca 240
gaagacattg ccacatattt ctgtcagcac tttgaccatc tgcccctggc ctttgggggc 300
gggactaaag tggagattaa g 321
<210> 21
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二轻链
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Pro Asp Ile Gln Asn
100 105 110
Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys
115 120 125
Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met
145 150 155 160
Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Gln Lys
165 170 175
Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile Pro Glu
180 185 190
Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200
<210> 22
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一轻链
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一重链
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二重链
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
115 120 125
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
145 150 155 160
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
165 170 175
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr
180 185 190
Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
195 200 205
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
210 215 220
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
225 230 235 240
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
420 425 430
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
465 470
<210> 25
<211> 606
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二轻链
<400> 25
gatatccaga tgacccagtc cccttcctcc ttgtccgcaa gtgtgggaga tagagtgacc 60
atcacatgcc aggcttctca ggacatctct aactacctga actggtacca acagaagccc 120
ggcaaggccc ctaagctcct tatctacgac gcctcaaatc tggagaccgg agtcccaagc 180
aggttcagcg gcagcgggag cgggacagat ttcactttta caattagctc cctccagcca 240
gaagacattg ccacatattt ctgtcagcac tttgaccatc tgcccctggc ctttgggggc 300
gggactaaag tggagattaa gcccgacatc cagaaccccg accccgccgt gtaccagctg 360
agagacagca agagcagcga caagagcgtg tgcctgttca ccgacttcga cagccagacc 420
caggtgagcc agagcaagga ctccgacgtg tatatcaccg acaagtgcgt gctggacatg 480
aggagcatgg acttcaagag caacagcgcc gtggcctgga gccagaagag cgacttcgcc 540
tgcgccaacg ccttccagaa cagcatcatc cccgaggaca ccttcttccc cagccccgag 600
agcagc 606
<210> 26
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一轻链
<400> 26
gatatcgtga tgacccagag cccagactcc cttgctgtct ccctcggcga aagagcaacc 60
atcaactgca agagctccca aagcctgctg aactccagga ccaggaagaa ttacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct aagctgctca tctactgggc ctccacccgg 180
cagtctgggg tgcccgatcg gtttagtgga tctgggagcg ggacagactt cacattgaca 240
attagctcac tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300
cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 27
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一重链
<400> 27
caggtgcagc ttgtgcagtc tggggcagaa gtgaagaagc ctgggtctag tgtcaaggtg 60
tcatgcaagg ctagcgggtt cgcctttact gactactaca tccactgggt gcggcaggct 120
cccggacaag ggttggagtg gatgggatgg atctccccag gcaatgtcaa cacaaagtac 180
aacgagaact tcaaaggccg cgtcaccatt accgccgaca agagcacctc cacagcctac 240
atggagctgt ccagcctcag aagcgaggac actgccgtct actactgtgc cagggatggg 300
tactccctgt attactttga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctccgcg 360
tcgaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 600
acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 660
tatggtcccc catgcccacc atgcccagca cctgaggcag cagggggacc atcagtcttc 720
ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatgcc aggaggagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320
tccctgtctc tgggtaaa 1338
<210> 28
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二重链
<400> 28
caggtgcaac tgcaggaaag cggaccagga cttgtgaagc cctctgagac tttgtccctg 60
acctgtaccg tctccggggg ctctgtcagt tcaggggatt actactggac atggatcagg 120
cagagtcctg ggaaaggcct ggagtggatt gggcacatct actactcagg gaacaccaac 180
tacaatccca gcctcaagag cagactgacc atcagcattg acacctccaa gacacagttc 240
tccctgaagc tcagcagcgt gactgccgcc gacacagcaa tctactattg cgtgcgcgac 300
cgggtgacag gcgcttttga tatttggggc cagggcacaa tggtcactgt gctggaggac 360
ctgaagaacg tgttccctcc cgaggtggcc gtgttcgaac ccagcgaggc cgagatcagc 420
cacacccaga aggccaccct ggtgtgtctg gccaccggct tctaccccga ccacgtggag 480
ctgagctggt gggtgaacgg caaggaggtg cacagcggcg tgtgtaccga ccctcagccc 540
ctgaaggagc agcccgccct gcaggacagc aggtacgccc tgagcagcag gctgagagtg 600
agcgccacct tctggcagaa ccccaggaac cacttcaggt gccaggtgca gttctacggc 660
ctgagcgaga acgacgagtg gacccaggac agggccaagc ccgtgaccca gatcgtgagc 720
gctgaggcct ggggcagata tggtccccca tgcccaccat gcccagcacc tgaggcagca 780
gggggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc 900
aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt gcaccctgcc cccatcccag 1140
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg agctgcgcgg tcaaaggctt ctaccccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctcgttagca ggctaaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacacaga agagcctctc cctgtctctg ggtaaa 1416
<210> 29
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR beta恒定结构域
<400> 29
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg
<210> 30
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR alpha恒定结构域
<400> 30
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95

Claims (37)

1.一种双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含CD3抗原结合部分和EGFR抗原结合部分，
其中所述CD3抗原结合部分包含Fab，所述Fab包含：抗CD3抗体的第一VH(VH1)，其可操作地连接至重链CH1恒定区结构域；和抗CD3抗体的第一VL(VL1)，其可操作地连接至轻链恒定区(CL)，和
所述EGFR抗原结合部分包含嵌合Fab，所述嵌合Fab包含：抗EGFR抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)；和抗EGFR抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)；并且其中C1和C2能够经由非天然的链间二硫键形成二聚体，所述非天然的链间二硫键能够稳定所述二聚体，
其中：
(A)所述CD3抗原结合部分包含：
包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR1，
包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR2，
包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR3，
包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR1，
包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR2，和
包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR3，
和
(B)所述抗EGFR抗原结合部分包含：
包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR1，
包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR2，
包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由其组成的重链CDR3，
包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR1，
包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR2，和
包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中：
(A)所述CD3抗原结合部分包含：
由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，
由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的重链CDR3，
由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
和
(B)所述抗EGFR抗原结合部分包含：
由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，
由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成的重链CDR3，
由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中：
(A)所述CD3抗原结合部分包含：
(i)包含SEQ ID NO：13或由SEQ ID NO：13组成的重链可变结构域(VH1)序列，和
(ii)包含SEQ ID NO：14或由SEQ ID NO：14组成的轻链可变结构域(VL1)序列；
和
(B)所述抗EGFR抗原结合部分包含：
(i)包含SEQ ID NO：15或由SEQ ID NO：15组成的重链可变结构域(VH2)序列，和
(ii)包含SEQ ID NO：16或由SEQ ID NO：16组成的轻链可变结构域(VL2)序列。
4.根据权利要求3所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中：
(A)所述CD3抗原结合部分包含：
(i)由SEQ ID NO：13组成的重链可变结构域(VH1)序列，和
(ii)由SEQ ID NO：14组成的轻链可变结构域(VL1)序列；
和
(B)所述抗EGFR抗原结合部分包含：
(i)由SEQ ID NO：15组成的重链可变结构域(VH2)序列，和
(ii)由SEQ ID NO：16组成的轻链可变结构域(VL2)序列。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含四条多肽链：
i)由VH1-CH1-铰链1-CH2-CH3组成的第一重链，其中所述第一重链如SEQ ID NO：23所示；
ii)由VL1-CL组成的第一轻链，其中所述第一轻链如SEQ ID NO：22所示；
iii)由VH2-C1-铰链2-CH2-CH3组成的第二重链，其中所述第二重链如SEQ ID NO：24所示；和
iv)由VL2-C2组成的第二轻链，其中所述第二轻链如SEQ ID NO：21所示；
其中i)的VH1-CH1部分与VL1-CL形成抗CD3臂，iii)的VH2-C1与VL2-C2形成抗EGFR臂。
6.根据权利要求5所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分由四条多肽链组成：
i)SEQ ID NO：23所示的第一重链；
ii)SEQ ID NO：22所示第一轻链；
iii)SEQ ID NO：24所示的第二重链；和
iv)SEQ ID NO：21所示第二轻链。
7.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中C1结构域包含改造的TCRβ恒定区并且包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；并且C2结构域包含改造的TCRα恒定区并且包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述CD3抗原结合部分和所述EGFR抗原结合部分通过接头融合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其还包含Fc区，其中所述Fc区可操作地连接至所述CD3抗原结合部分的CH1结构域。
10.根据权利要求9所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述Fc区是人Fc区，例如人IgG Fc区。
11.根据权利要求10所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述人Fc区是人IgG4 Fc区或人IgG1 Fc区。
12.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分是人源化抗体。
13.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-12中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列。
14.根据权利要求13所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码CD3结合部分的重链可变结构域(VH1)，并包含编码SEQ ID NO：13所示的重链可变结构域(VH1)的核酸序列。
15.根据权利要求14所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码CD3结合部分的重链可变结构域(VH1)，并包含SEQ ID NO：17所示的核酸序列。
16.根据权利要求13所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码CD3结合部分的轻链可变结构域(VL1)，并包含编码SEQ ID NO：14所示的轻链可变结构域(VL1)的核酸序列。
17.根据权利要求16所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码CD3结合部分的轻链可变结构域(VL1)，并包含SEQ ID NO：18所示的核酸序列。
18.根据权利要求13所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码EGFR结合部分的重链可变结构域(VH2)，并包含编码SEQ ID NO：15所示的重链可变结构域(VH2)的核酸序列。
19.根据权利要求18所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码EGFR结合部分的重链可变结构域(VH2)，并包含SEQ ID NO：19所示的核酸序列。
20.根据权利要求13所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码EGFR结合部分的轻链可变结构域(VL2)，并包含编码SEQ ID NO：16所示的轻链可变结构域(VL2)的核酸序列。
21.根据权利要求13所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码EGFR结合部分的轻链可变结构域(VL2)，并包含SEQ ID NO：20所示的核酸序列。
22.一种载体，其包含权利要求13至21中任一项所述的核酸分子。
23.一种宿主细胞，其包含权利要求13至21中任一项所述的核酸分子或权利要求22所述的载体。
24.一种药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的承载体。
25.一种用于制备权利要求1至12中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括以下步骤：
-在权利要求23所述的宿主细胞中表达权利要求1至12中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分；和
-从所述宿主细胞分离所述抗体或其抗原结合部分。
26.一种用于调节受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至12中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分、或权利要求24所述的药物组合物。
27.一种用于抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至12中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分、或权利要求24所述的药物组合物。
28.一种用于预防或治疗受试者中CD3相关和/或EGFR相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至12中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分、或权利要求24所述的药物组合物，其中所述CD3相关和/或EGFR相关疾病是增殖性病症、免疫病症或感染。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述增殖性病症是癌症，例如结肠癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食管癌或胃癌。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述感染是慢性感染。
31.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中权利要求1至12中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分与化学治疗剂、辐射和/或癌症免疫疗法中所用的其他药剂联合施用。
32.根据权利要求1至12中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其用于：
i)调节免疫应答，例如恢复T细胞活性；
ii)在表达EGFR的肿瘤细胞存在下，增强T细胞活化；和/或
iii)刺激免疫应答或免疫功能，例如加强针对癌细胞的免疫应答。
33.根据权利要求1至12中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其用于治疗或预防受试者中的CD3相关和/或EGFR相关疾病，其中所述CD3相关和/或EGFR相关疾病包括增殖性病症、免疫病症或感染。
34.根据权利要求1至12中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其用于诊断增殖性病症、免疫病症或感染。
35.权利要求1至12中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于调节受试者中的免疫应答或抑制受试者中的肿瘤生长的药物中的用途。
36.权利要求1至12中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防受试者中CD3相关和/或EGFR相关疾病的药物中的用途，其中所述CD3相关和/或EGFR相关疾病包括增殖性病症、免疫病症或感染。
37.一种试剂盒，其包括包含权利要求1至12中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的容器。
CN202080081849.XA 2019-11-29 2020-11-27 新型抗cd3/抗egfr双特异性抗体及其用途 Active CN114761429B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019121869 2019-11-29
CNPCT/CN2019/121869 2019-11-29
PCT/CN2020/132157 WO2021104430A1 (en) 2019-11-29 2020-11-27 A novel anti-cd3/anti-egfr bispecific antibody and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114761429A true CN114761429A (zh) 2022-07-15
CN114761429B CN114761429B (zh) 2023-11-10

Family

ID=76129139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080081849.XA Active CN114761429B (zh) 2019-11-29 2020-11-27 新型抗cd3/抗egfr双特异性抗体及其用途

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20230067182A1 (zh)
EP (1) EP4065604A4 (zh)
JP (1) JP2023503624A (zh)
CN (1) CN114761429B (zh)
WO (1) WO2021104430A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023036137A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Process for preparing highly homogenous antibody-drug conjugates for engineered antibodies
US20230295310A1 (en) * 2022-03-20 2023-09-21 Abcellera Biologics Inc. CD3 T-Cell Engagers and Methods of Use
CN114685675B (zh) * 2022-04-27 2023-02-03 深圳市汉科生物工程有限公司 双特异性抗体及其在治疗癌症中的用途
CN114621351B (zh) * 2022-04-27 2023-01-03 华羊生物技术股份有限公司 多特异性抗体及其治疗癌症的用途
WO2024109792A1 (en) * 2022-11-24 2024-05-30 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Psma antibodies and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101675077A (zh) * 2007-04-03 2010-03-17 米克罗麦特股份公司 跨种特异性的双特异性结合剂
WO2019057099A1 (en) * 2017-09-21 2019-03-28 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. NOVEL ANTI-CD3EPSILON ANTIBODIES
WO2019057122A1 (en) * 2017-09-22 2019-03-28 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. NEW BISPECIFIC POLYPEPTIDE COMPLEXES

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8630984B1 (en) * 2003-01-17 2014-01-14 Renew Data Corp. System and method for data extraction from email files
US7908339B2 (en) * 2004-06-03 2011-03-15 Maxsp Corporation Transaction based virtual file system optimized for high-latency network connections
US7818728B1 (en) * 2005-04-04 2010-10-19 Qd Technology Llc Maximizing system resources used to decompress read-only compressed analytic data in a relational database table
US7917957B2 (en) * 2007-05-29 2011-03-29 Alcatel Lucent Method and system for counting new destination addresses
DK2155788T3 (da) * 2007-04-03 2012-10-08 Amgen Res Munich Gmbh Krydsartsspecifikke bispecifikke bindemidler
US9779121B2 (en) * 2014-06-27 2017-10-03 Sap Se Transparent access to multi-temperature data
CN104774268B (zh) * 2015-01-21 2018-09-28 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体egfr×cd3的构建及应用
CN106632681B (zh) * 2016-10-11 2017-11-14 北京东方百泰生物科技有限公司 抗egfr和抗cd3双特异抗体及其应用
SG11201909498XA (en) * 2017-04-24 2019-11-28 Glenmark Pharmaceuticals Sa T cell redirecting bispecific antibodies for the treatment of egfr positive cancers
JP2020531438A (ja) * 2017-08-16 2020-11-05 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、およびｅｇｆｒ、ｈｌａ−ｅ、ｃｃｒ４、またはｐｄ−ｌ１に結合するタンパク質
SG11202002508XA (en) * 2017-09-22 2020-04-29 Wuxi Biologics Ireland Ltd Novel bispecific cd3/cd19 polypeptide complexes
KR102062531B1 (ko) * 2018-06-25 2020-01-06 주식회사 티맥스 소프트 결정 테이블을 결정 트리로 변환하는 데이터베이스 서버 및 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램
US11423020B2 (en) * 2018-10-19 2022-08-23 Oracle International Corporation Efficient extraction of large data sets from a database
JP2020177425A (ja) * 2019-04-17 2020-10-29 富士ゼロックス株式会社 情報処理装置及びプログラム

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101675077A (zh) * 2007-04-03 2010-03-17 米克罗麦特股份公司 跨种特异性的双特异性结合剂
WO2019057099A1 (en) * 2017-09-21 2019-03-28 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. NOVEL ANTI-CD3EPSILON ANTIBODIES
WO2019057122A1 (en) * 2017-09-22 2019-03-28 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. NEW BISPECIFIC POLYPEPTIDE COMPLEXES

Also Published As

Publication number Publication date
US20230008090A1 (en) 2023-01-12
CN114761429B (zh) 2023-11-10
WO2021104430A1 (en) 2021-06-03
EP4065604A1 (en) 2022-10-05
EP4065604A4 (en) 2023-12-27
JP2023503624A (ja) 2023-01-31
US20230067182A1 (en) 2023-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111116747B (zh) 针对程序性死亡配体(pd-l1)的单域抗体及其衍生蛋白
CN114761429B (zh) 新型抗cd3/抗egfr双特异性抗体及其用途
CN110204614B (zh) 抗人lag-3单克隆抗体及其制备方法和用途
CN110467674B (zh) 抗ox40的全人抗体及其制备方法和用途
CN113214400B (zh) 一种双特异性抗pd-l1/vegf抗体及其用途
CN112867507A (zh) 新型抗sirpa抗体
CN114181310B (zh) 抗tigit抗体、其药物组合物及用途
US20210380710A1 (en) A novel anti-cd3/anti-cd20 bispecific antibody
CN112236454B (zh) 新型抗pd-1抗体
CN114524878B (zh) 一种双特异性抗体及其用途
CN117062841A (zh) 双特异性抗pd-l1/vegf抗体及其用途
TWI813951B (zh) 一種雙功能融合蛋白及其用途
CN110540593B (zh) 新型的抗cd3/抗cd20双特异性抗体
CN114430746A (zh) 新型抗pd-l1抗体
JP2021501583A (ja) 抗体および使用方法
CN112552411B (zh) 新型抗pd-l1/抗lag-3双特异性抗体及其用途
WO2023010100A1 (en) Novel anti-sirpa antibodies
WO2024109792A1 (en) Psma antibodies and uses thereof
WO2023222017A1 (en) Anti-b7h3 antibody and uses thereof
WO2023173393A1 (zh) 结合b7-h3的抗体及其用途
WO2023072294A1 (en) Novel anti-lag3 antibodies
AU2023273853A1 (en) Anti-b7h3 antibody and uses thereof
TW202430553A (zh) Psma抗體及其用途
CN116601170A (zh) 抗p-钙粘蛋白抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230707

Address after: 214026 24th Floor, West Building, Huichuang Building, No. 581, Jianzhu West Road, Binhu District, Wuxi City, Jiangsu Province

Applicant after: Wuxi Zhikang Hongyi Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: No. 299, Fute Middle Road, Pudong New Area, Shanghai 200131

Applicant before: WUXI BIOLOGICS (SHANGHAI) Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant