CN114760856A - 一种形成肉基调味料的方法 - Google Patents

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fermentation
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Abstract

提供了一种形成肉基调味料的方法，该方法包括用非亲水微生物发酵肉基水解产物以形成肉基调味料，其中该方法不包括盐的添加。还提供了一种由该方法形成的肉基调味料。在优选的实施方案中，肉基是指非海鲜肉类产品，例如猪肉和牛肉。非亲水微生物包括非亲水酵母、非亲水乳酸菌或其组合。

Description

一种形成肉基调味料的方法
技术领域
本发明涉及一种形成肉基调味料的方法。
背景技术
动物屠宰场或肉类生产行业的副产品常作为废弃食品丢弃或作为低价值产品如动物饲料和肥料再利用。这些肉基副产品中的大多数都含有大量的营养物质，其包括脂质、蛋白质、肽、游离氨基酸、维生素和矿物质。
因此需要减少食物浪费并将它们转化为有用的产品。
发明内容
本发明试图解决这些问题，和/或提供一种改进的形成肉基调味料的方法。
根据第一方面，本发明提供了一种形成肉基调味料的方法，其包括用非嗜盐微生物发酵肉基水解产物以形成肉基调味料。根据特别的方面，方法不包括盐的添加。
非嗜盐微生物可为任何合适的微生物。例如，非嗜盐微生物可为但不限于非嗜盐酵母、非嗜盐乳酸菌或其组合。
根据特别的方面，非嗜盐微生物可为非嗜盐酵母。
根据特别的方面，非嗜盐微生物可为非嗜盐乳酸菌。特别地，非嗜盐乳酸菌可为但不限于：益生乳酸菌、乳品乳酸菌或其组合。
发酵可包括将肉基水解产物发酵合适的时间段。例如，发酵可包括将肉基水解产物发酵1天至20天。
发酵可包括在合适的温度下发酵肉基水解产物。例如，发酵可包括在15℃至45℃的温度下发酵。
根据特别的方面，发酵可包括用非嗜盐酵母将肉基水解产物发酵1天至20天。发酵可在15℃至40℃的温度下进行。
根据另一个特别的方面，发酵可包括用非嗜盐乳酸菌将肉基水解产物发酵1天至7天。发酵可在15℃至45℃的温度下进行。
根据另一个特别的方面，发酵可包括用非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌发酵肉基水解产物。例如，发酵可包括依次用非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌发酵肉基水解产物，或者发酵可包括用非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌的共接种发酵肉基水解产物。
发酵还可包括添加可发酵糖。
根据另一个特别的方面，方法还可包括在发酵之前在酶的存在下水解肉基混合物以形成肉基水解产物。酶可为任何合适的水解酶。例如，酶可为但不限于蛋白酶。
水解可在合适的条件下进行。例如，水解可在合适的pH和温度下进行。特别地，水解可在5.5至7.5的pH下进行。特别地，水解可在45℃至60℃的温度下进行。
方法还可包括在发酵之后对肉基调味料进行热处理。热处理可在合适的条件下进行。例如，热处理可在合适的温度和pH下进行合适的时间段。特别地，热处理可在90℃至121℃的温度下进行。特别地，热处理可持续30分钟至120分钟。特别地，热处理可在4至6的pH下进行。
根据第二方面，本发明提供了一种由第一方面的方法制备的肉基调味料。
根据第三方面，还提供了一种肉基调味料，其包含10mg/mL至45mg/mL的游离氨基酸。特别地，肉基调味料可包含基于肉基调味料的总重量计≤2重量％的钠含量。
附图说明
为了使本发明可被充分理解并容易地付诸实践，现在通过非限制性实例的方式描述仅示例性的实施方案，该描述参考所附的示意性附图。在附图中：
图1示出了根据本发明的一个实施方案的方法的示意图；
图2示出了根据本发明的一个实施方案的方法的一部分的示意图；
图3示出了根据本发明的一个实施方案的方法的一部分的示意图；
图4示出了根据本发明的一个实施方案的方法的一部分的示意图；
图5(a)示出了酶促水解过程中的水解度(DH)；图5(b)示出了使用四种蛋白酶水解6小时后的蛋白质回收率(n＝3)；
图6(a)示出了由易变假丝酵母(Candida versatilis)NCYC1433、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)Prelude、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MERIT.ferm和克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)FrootZen发酵的猪肉碎屑水解产物的酵母细胞计数随时间的变化；图6(b)示出了猪肉碎屑水解产物的pH随时间的变化。a,b,c：不同天数时同一样品内跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)。A,B,C：相同发酵天数时样品之间跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)；
图7示出了在由易变假丝酵母NCYC1433、戴尔有孢圆酵母Prelude、酿酒酵母MERIT.ferm和克鲁维毕赤酵母FrootZen发酵的猪肉碎屑水解产物中总还原糖和有机酸的变化。a,b,c：不同天数时同一样品内跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)。A,B,C：相同发酵天数时样品之间跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)；
图8示出了在由酵母1433、Prelude、Merit和FrootZen发酵的猪肉碎屑水解产物中(a)酸类；(b)乙醇；(c)除乙醇外的醇类；(d)醛类；(e)酮类；(f)酯类；(g)呋喃类的GC-FID峰面积的变化。a,b,c：不同天数时同一样品内跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)。A,B,C：相同发酵天数时样品之间跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)；
图9(a)示出了由发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)PCC、植物乳杆菌(Lb.plantarum)299V、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)DSM20069、鼠李糖乳杆菌(Lb.rhamnosus)GG、嗜酸乳杆菌(Lb.acidophilus)NCFM和干酪乳杆菌(Lb.casei)Shirota发酵的猪肉碎屑水解产物的乳酸菌(LAB)细胞计数随时间的变化；图9(b)示出了猪肉碎屑水解产物的pH随时间的变化。a,b,c：不同天数时同一样品内跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)。A,B,C：相同发酵天数时样品之间跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)；
图10示出了在由乳酸菌发酵乳杆菌PCC、植物乳杆菌299V、乳酸乳球菌乳脂亚种DSM20069、鼠李糖乳杆菌GG、嗜酸乳杆菌NCFM和干酪乳杆菌Shirota发酵的猪肉碎屑水解产物中总还原糖和有机酸的变化。a,b,c：不同天数时同一样品内跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)。A,B,C：相同发酵天数时样品之间跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)；
图11示出了在由乳酸菌发酵乳杆菌PCC、植物乳杆菌299V、乳酸乳球菌乳脂亚种DSM20069、鼠李糖乳杆菌GG、嗜酸乳杆菌NCFM和干酪乳杆菌Shirota发酵的肉酱样品中(a)酸类；(b)醇类；(c)醛类；(d)酮类；(e)呋喃类的GC-FID峰面积的变化。a,b,c：不同天数时同一样品内跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)。A,B,C：相同发酵天数时样品之间跟相同字母的值差异不显著(P>0.05)；
图12针对(a)发酵乳杆菌的单一培养物、(b)克鲁维毕赤酵母的单一培养物、(c)共接种和(d)依次接种示出了在猪肉水解产物发酵期间发酵乳杆菌和克鲁维毕赤酵母的pH和生长的变化；
图13示出了在用发酵乳杆菌和克鲁维毕赤酵母的不同接种顺序进行猪肉水解产物发酵期间的(a)葡萄糖；(b)琥珀酸；(c)乳酸；(d)乙酸的量的变化；
图14示出了(a)乙醇；(b)乙酸；(c)己醛；(d)1-己醇；(e)乙酸异戊酯；(f)乙酸乙酯；(g)乙酸己酯；(h)乙酸2-苯乙酯；和(i)苯乙醇的GC-FID峰面积的变化；
图15示出了对照(0℃)及在90℃、95℃和100℃下热处理期间pH调节至(a)5.5和(b)4.5的猪肉水解产物中pH的变化。所有值均为平均值±标准偏差，每个样品处理重复三次(n＝3)；
图16示出了在90℃、95℃和100℃下热处理期间pH调节至(a)5.5和(b)4.5的猪肉水解产物中糖还原的量(mg/mL)。所有值均为平均值±标准偏差，每个样品处理重复三次(n＝3)；
图17示出了(a)pH 5.5下对照中和每个经热处理的样品中脯氨酸的量的变化；(b)pH 4.5下对照中和每个经热处理的样品中脯氨酸的量的变化；(c)pH 5.5下对照中和每个经热处理的样品中半胱氨酸的量的变化；(d)pH 4.5下对照中和每个经热处理的样品中半胱氨酸的量的变化；(e)pH 5.5下对照中和每个经热处理的样品中蛋氨酸的量的变化；(f)pH 4.5下对照中和每个经热处理的样品中蛋氨酸的量的变化；(g)pH 5.5下对照中和每个经热处理的样品中苯丙氨酸的量的变化；(h)pH 4.5下对照中和每个经热处理的样品中苯丙氨酸的量的变化；(i)pH 5.5下对照中和每个经热处理的样品中总游离氨基酸的量的变化；(j)pH 4.5下对照中和每个经热处理的样品中总游离氨基酸的量的变化。所有值均为平均值±标准偏差，每个样品处理重复三次(n＝3)；和
图18示出了(a)pH 5.5下对照中和每个经热处理的样品中己醛的GC-MS/FID峰面积的变化；(b)pH 4.5下对照中和每个经热处理的样品中己醛的GC-MS/FID峰面积的变化；(c)pH5.5下对照中和每个经热处理的样品中糠醛的GC-MS/FID峰面积的变化；(d)pH 4.5下对照中和每个经热处理的样品中糠醛的GC-MS/FID峰面积的变化；(e)pH 5.5下对照中和每个经热处理的样品中2-戊基呋喃的GC-MS/FID峰面积的变化；(f)pH 4.5下对照中和每个经热处理的样品中2-戊基呋喃的GC-MS/FID峰面积的变化。所有值均为平均值±标准偏差，每个样品处理重复三次(n＝3)。
具体实施方式
如上所述，需要一种减少食物浪费并以更有用的方式使用肉基副产品的方法。本发明提供了一种利用这样的肉基副产品并将其转化为肉基调味料的方法。
总的来说，本发明提供了一种由肉基副产品形成具有高营养含量和可接受的风味特征的肉基调味料的方法。特别地，本发明的方法提供了肉基副产品的用途和将它们转化为肉基调味料使得方法不包括盐的添加，同时保持合适的风味特征并且能够在更短的时间段内实现转化。
根据第一方面，本发明提供了一种形成肉基调味料的方法，其包括用非嗜盐微生物发酵肉基水解产物以形成肉基调味料。
根据特别的方面，方法不包括盐的添加。特别地，方法不包括任何含氯化钠的盐的添加。这样，由该方法形成的肉基调味料远更健康，因为它包含降低或零水平的添加盐并因此降低肉基调味料的消费者患高血压和心血管疾病的风险。
就本发明的目的而言，肉基是指非海鲜的肉基产品。根据特别的方面，肉基水解产物可包含源自非海鲜的肉和/或非海鲜的副产品例如但不限于非海鲜的肉的血液、骨头、皮肤、肉碎屑和/或脂肪组织的肉基混合物的水解产物。非海鲜的肉可为但不限于猪肉、羊肉、牛肉、家禽或其组合。根据特别的方面，肉基水解产物可呈液体形式。
非嗜盐微生物可为任何合适的微生物。就本发明的目的而言，非嗜盐微生物定义为能够在低盐或不含盐的培养基中例如在包含≤0.2mol/L的盐浓度的培养基中生长的微生物。非嗜盐微生物可为但不限于非嗜盐酵母、非嗜盐乳酸菌或其组合。
根据特别的方面，非嗜盐微生物可为非嗜盐酵母。例如，非嗜盐酵母可为但不限于：戴尔有孢圆酵母(T.delbrueckii)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、克鲁维毕赤酵母(P.kluyveri)或其组合。特别地，非嗜盐酵母可为但不限于戴尔有孢圆酵母Prelude、酿酒酵母MERIT、克鲁维毕赤酵母FrootZen或其组合。甚至更特别地，非嗜盐酵母可为克鲁维毕赤酵母。
根据特别的方面，非嗜盐微生物可为非嗜盐乳酸菌。特别地，非嗜盐乳酸菌可为但不限于：益生乳酸菌、乳品乳酸菌或其组合。例如，非嗜盐乳酸菌可为但不限于：发酵乳杆菌(Lb.fermentum)、鼠李糖乳杆菌(Lb.rhamnosus)、植物乳杆菌(Lb.plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lb.acidophilus)、干酪乳杆菌(Lb.casei)、乳酸乳球菌乳脂亚种或其组合。甚至更特别地，非嗜盐乳酸菌为发酵乳杆菌。
根据另一个特别的方面，发酵可包括用非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌发酵肉基水解产物。例如，发酵可包括用非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌依次发酵肉基水解产物。特别地，发酵可包括用非嗜盐酵母发酵肉基水解产物，然后用非嗜盐乳酸菌发酵肉基水解产物。或者，发酵可包括用非嗜盐乳酸菌发酵肉基水解产物，然后用非嗜盐酵母发酵肉基水解产物。特别地，发酵可包括用非嗜盐乳酸菌发酵肉基水解产物，然后用非嗜盐酵母发酵肉基水解产物，其中非嗜盐乳酸菌可为发酵乳杆菌，非嗜盐酵母可为克鲁维毕赤酵母。
根据另一个特别的方面，发酵可包括用非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌的共接种发酵肉基水解产物。非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌可为如上所述。特别地，非嗜盐乳酸菌可为发酵乳杆菌，非嗜盐酵母可为克鲁维毕赤酵母。
发酵可包括用合适的量的非嗜盐微生物发酵肉基水解产物。根据特别的方面，发酵可包括添加非嗜盐微生物以在发酵期间获得至少1log CFU/mL的增加的活微生物计数。例如，添加的非嗜盐微生物的量可为至少4log CFU/mL。特别地，添加的非嗜盐微生物的量可为约5log CFU/mL至8log CFU/mL、6log CFU/mL至7log CFU/mL。甚至更特别地，添加的非嗜盐酵母的量可为5log CFU/mL至6log CFU/mL。甚至更特别地，添加的非嗜盐乳酸菌的量可为6log CFU/mL至7log CFU/mL。
发酵可包括在合适的条件下发酵肉基水解产物。发酵可包括将肉基水解产物发酵合适的时间段。例如，发酵可包括将肉基水解产物发酵1天至20天。特别地，发酵可包括发酵2天至18天、3天至15天、5天至12天、7天至10天、8天至9天。
根据特别的方面，当非嗜盐微生物为非嗜盐酵母时，发酵可持续1天至20天。特别地，发酵可持续2天至18天、3天至15天、4天至14天、5天至12天、6天至11天、7天至10天、8天至9天。
根据特别的方面，当非嗜盐微生物为非嗜盐乳酸菌时，发酵可持续1天至7天。特别地，发酵可持续1天至6天、2天至5天、3天至4天。甚至更特别地，发酵可持续1天至5天。
根据特别的方面，当非嗜盐微生物为非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌时，发酵可持续1天至25天。特别地，当发酵包括用非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌依次发酵肉基水解产物时，发酵可持续2天至25天。例如，发酵可持续3天至22天、5天至20天、6天至18天、7天至15天、8天至12天。甚至更特别地，发酵可持续6天至7天。
当发酵肉基水解产物包括非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌的共接种时，发酵可持续1天至20天。例如，发酵可持续2天至18天、3天至15天、4天至14天、5天至12天、6天至11天、7天至10天、8天至9天。甚至更特别地，发酵可持续5天至6天。
发酵可包括在合适的周期温度下发酵肉基水解产物。例如，发酵可包括在15℃至45℃的温度下发酵。
根据特别的方面，当非嗜盐微生物为非嗜盐酵母时，发酵可在15℃至40℃的温度下进行。例如，发酵可在17℃至38℃、18℃至35℃、20℃至32℃、22℃至30℃、25℃至28℃的温度下进行。甚至更特别地，温度可为20℃至35℃。
根据另一个特别的方面，当非嗜盐微生物为非嗜盐乳酸菌时，发酵可在15℃至45℃的温度下进行。例如，发酵可在16℃至40℃、17℃至38℃、18℃至35℃、20℃至32℃、22℃至30℃、25℃至28℃的温度下进行。甚至更特别地，温度可为25℃至40℃。
发酵还可包括向肉基水解产物中添加可发酵糖。可发酵糖可为任何合适的可发酵糖。例如，可发酵糖可为但不限于葡萄糖、果糖、乳糖或其组合。可添加任何合适的量的可发酵糖。例如，添加的可发酵糖的量可基于可发酵糖和肉基水解产物的总重量计为0.5重量％至5重量％。特别地，添加的可发酵糖的量可为0.5重量％至5重量％、1重量％至4重量％、2重量％至3重量％。甚至更特别地，所述量可基于葡萄糖和肉基水解产物的总重量计为1重量％至2重量％。
根据特别的方面，方法还可包括在添加非嗜盐微生物之前热处理肉基水解产物。例如，热处理可包括肉基水解产物的温和巴氏杀菌或灭菌。热处理可延长肉基调味料的保质期并还可降低在形成肉基水解产物的方法期间污染的风险。特别地，热处理可在添加非嗜盐微生物之前除去不期望的微生物。
热处理可在合适的条件下进行。例如，热处理可在约60℃至90℃的温度下进行。特别地，温度可为约80℃至90℃。甚至更特别地，温度可为约85℃。
热处理可进行合适的时间段。进行热处理的时间可取决于进行热处理的温度。例如，热处理可持续–10分钟至45分钟。特别地，热处理可持续约–15分钟至20分钟。甚至更特别地，热处理可持续约15分钟。
方法还可包括在添加非嗜盐微生物之前冷却肉基水解产物，特别是如果该肉基水解产物经历过如上所述的热处理。特别地，冷却可包括将肉基水解产物冷却至环境温度，例如约25℃。
根据另一个特别的方面，方法还可包括在发酵之前在酶的存在下水解肉基混合物以形成肉基水解产物。
酶可为任何合适的水解酶。例如，酶可为但不限于蛋白酶。
肉基混合物可通过混合合适的量的肉副产品和蒸馏水来形成。例如，肉基混合物可通过以按重量计1:2的比率混合肉副产品和蒸馏水来形成。
水解可在任何合适的条件下进行。例如，水解可在合适的pH和温度下进行。
特别地，水解可在5.5至7.5的pH下进行。甚至更特别地，pH可为约5.5至6.5。可通过添加合适的量的酸来调节pH。例如，酸可为食品级酸。特别地，酸可为乳酸。
特别地，水解可在45℃至60℃的温度下进行。甚至更特别地，温度可为约45℃至55℃。
水解可持续合适的时间段。例如，水解可持续3小时至8小时。特别地，水解可持续3小时至8小时、4小时至7小时、5小时至6小时。甚至更特别地，水解可持续4小时至6小时。水解可通过使酶失活来终止。失活可通过任何合适的手段进行。
方法还可包括在发酵之后对肉基调味料进行热处理。热处理可在合适的条件下进行。特别地，热处理可通过美拉德反应进行。
根据特别的方面，热处理可在合适的温度下进行。例如，热处理可在90℃至121℃的温度下进行。特别地，热处理可在约95℃至120℃、98℃至115℃、100℃至112℃、105℃至110℃、106℃至108℃的温度下进行。甚至更特别地，温度可为90℃至100℃。
热处理可持续合适的时间段。例如，热处理可持续30分钟至120分钟。特别地，热处理可持续约35分钟至115分钟、40分钟至110分钟、45分钟至100分钟、50分钟至90分钟、55分钟至75分钟、60分钟至70分钟。甚至更特别地，热处理可持续45分钟至60分钟。
可在合适的pH下对肉基调味料进行热处理。例如，肉基调味料可在4至6的pH下。特别地，pH可为5.2至5.5。
热处理可消除肉基水解产物中的任何占主导地位的异味化合物如己醛。热处理的高温可促进挥发性化合物的生成，这些挥发性化合物可为经热处理的肉基调味料提供烤味和甜味韵调。
图1中示出了本发明的方法的示意图。特别地，图1示出了形成肉基调味料的一般方法，其包括：水解肉基混合物以形成肉基水解产物；将肉基水解产物发酵形成肉基调味料；和对肉基调味料进行热处理。
图2、3和4中分别示意性地呈现了根据本发明的特别的实施方案的水解、发酵和热处理。
根据本发明的方法可以是低浪费方法。换句话说，该方法产生的废物少，同时在制备肉基调味料时升级改造废弃的肉副产品。因此，本发明的方法克服了肉副产品浪费的问题并减少了食物浪费，另外，形成了增值且功能性的食品。该方法也简单，不涉及昂贵溶剂的使用，这使得该方法更容易放大。
此外，与有时可能涉及数月发酵的现有技术方法相比，该方法导致发酵时间的缩短。特别地，非嗜盐微生物发酵需要极少的化学品、反应时间并且生成的副产品也少。
根据第二方面，本发明提供了一种由第一方面的方法制备的肉基调味料。
根据第三方面，还提供了一种肉基调味料，其包含10mg/mL至45mg/mL的游离氨基酸。例如，肉基调味料可包含15mg/mL至40mg/mL、20mg/mL至35mg/mL、22mg/mL至30mg/mL、25mg/mL至28mg/mL的游离氨基酸。特别地，肉基调味料可包含30mg/mL至40mg/mL的游离氨基酸。甚至更特别地，肉基调味料可包含35mg/mL的游离氨基酸。
就本发明的目的而言，游离氨基酸定义为单个氨基酸，其不需要消化并更容易被身体吸收。此外，游离氨基酸可能已准备好生成蛋白质。
根据本发明的肉基调味料可具有低钠含量。例如，肉基调味料的钠含量可≤2重量％。
根据特别的方面，肉基调味料可具有低的碳水化合物含量。例如，肉基调味料的碳水化合物含量可≤1重量％。
鉴于低的钠和/或碳水化合物含量，以及高的游离氨基酸含量，该肉基调味料非常健康并提供良好的营养供人体吸收。
现已对本发明进行了一般性描述，通过参考以下实施方案将更容易理解本发明，该实施方案以示意的方式提供而非意在限制。
实施例
实施例1-从猪肉碎屑产生肉水解产物
图2中示意性地示出了酶促水解的过程。在
Figure BDA0003672000550000092
实验室瓶(德国Merck)中用蒸馏水悬浮解冻的碎原始猪肉碎屑(1:2，重量/体积)。均化后，先将混合物置于水浴(SW22，德国
Figure BDA0003672000550000093
)中30分钟以达到所需的温度。然后在此温度下使用1M乳酸(德国Merck)或1M氢氧化钠(NaOH)(德国Merck)溶液将混合物调节至所需的pH。随后，按特定的酶/底物比向每个瓶中添加一种类型的蛋白酶并立即均化。然后将所有经均化的瓶放回水浴中并在200rpm的振摇速率下孵育6小时。表1示出了根据初步实验结果对每种酶选择的孵育因子。
Figure BDA0003672000550000091
表1：使用四种蛋白酶进行猪肉碎屑水解的条件
在水解过程中，以0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时和6小时的时间间隔取出大约3.0mL水解产物加到新管中并立即放入85℃的水浴中达15分钟(Nilsang等人，2005)以终止酶反应。分析在每个时间点获得的水解产物以得到水解度(DH)，并进一步测定最终的水解产物以得到蛋白质回收率(PR)。
水解度和蛋白质回收率的测定
使用α-氨基氮(AN)与总氮(TN)之间的关系按下式计算每个样品的DH：
Figure BDA0003672000550000101
水解产物中存在的α-氨基氮的量通过改进的甲醛滴定法(Nilsang等人，2005)测定。记录可溶级分的体积并使用凯氏定氮法PR(％)测定上清液中的总蛋白质，使用下式计算：
Figure BDA0003672000550000102
(分子：上清液中的总蛋白质(g)分母：底物中的总蛋白质(g))
优化的实验设计
采用Box-Behnken设计来优化猪肉的水解以释放氨基酸。表2中示出了所测的参数和水平。
Figure BDA0003672000550000103
表2：猪肉碎屑的酶促水解的优化中使用的编码水平值
应用响应面法(RSM)方法来找出三个变量的最佳水平。研究的三个变量为温度(A)、E/S比率(B)和pH(C)。选择DH作为自变量组合的响应面。为了简化优化方程，表2中的E/S比率(B)以百分数(酶/底物：重量/重量)计算。据推测，估计的响应面DH可由以下二次方程(Dey和Dora，2014)描述：
Figure BDA0003672000550000104
其中Y为因变量(DH)，β0为常数，βi、βii、βij为由模型估计的系数。Xi和Xj为自变量的水平。它们分别表示A、B和C因子对响应的线性、二次和叉积影响。该模型评价了每个自变量对响应的影响。
氨基酸组成
通过使用尺寸为150mm x 3.9mm的Waters AccO-Tag Nova-Pak C18柱、与C18键合且粒度为直径4μm的二氧化硅基填充材料进行的HPLC对酶促水解产生的样品的游离氨基酸组成定量。使用Waters AccQ-Tag Ultra Chemistry Kit(爱尔兰，都柏林)用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)进行氨基基团的柱前衍生。进行衍生氨基酸的HPLC分析。
用于猪肉碎屑的酶促水解的蛋白酶的评价
图5中呈现了通过四种蛋白酶水解的水解过程中DH的演变和水解6小时后的PR。如图5(a)中所示，在水解6小时后，用Flavourzyme水解的猪肉具有45.49％的最高DH，该DH显著(P<0.05)高于其他蛋白酶的DH，其次是DH分别为25.40％、20.12％和19.27％的Alcalase、Protamex和Neutrase。图5(a)还示出，所有酶的DH均随时间增加，但在水解的后期，除了Flavourzyme外，增加的速率变慢。在每个采样点，Flavourzyme的DH在整个过程中均显著(P<0.05)高于其余的酶的DH。
另外，图5(b)示出，在水解6小时后，Flavourzyme取得了55.87％的最高PR，其次是分别为55.50％、53.00％和51.75％的Protamex、Alcalase和Neutrase。然而，在四种蛋白酶之间PR没有显著差异(P≥0.05)。使用RSM，选择Flavourzyme来产生富含氨基酸的猪肉水解产物。
使用RSM优化猪肉碎屑水解
如图5中所示，Flavourzyme是在猪肉碎屑水解中获得最高DH的最适合的蛋白酶。因此，将RSM应用于该蛋白酶并选择DH作为组合表3中的自变量的响应因子。
Figure BDA0003672000550000121
表3：Box-Behnken设计矩阵的编码水平组合和用Flavourzyme进行猪肉碎屑水解的因变量水解度(％DH)的响应
每个实验运行都以随机顺序独立地进行以减少响应中的系统误差。下面的二次模型是通过分析所获得的实验数据生成的。
Y＝47.77+0.8713A+1.68B+0.9475C-0.725AB+0.3675AC-0.7425BC-2.97A2-3.88B2-4.22C2 (4)
该方程与从实验获得的数据非常吻合，因为调整后的判定系数(Radj 2)为0.9644，这表明该方程可解释本研究中96.44％的变异性。模型的方差分析(ANOVA)在表4中示出。
来源 平方和 自由度 均方 F-值 P-值
模型 236.52 9 26.28 49.23 ＜0.0001
A-Temp 6.07 1 6.07 11.38 0.0119
B-ElS 22.48 1 22.48 42.11 0.0003
C-pH 7.18 1 7.18 13.45 0.0080
AB 2.10 1 2.1O 3.94 0.0876
AC 0.5402 1 O.5402 1.01 0.3479
BC 2.21 1 2.21 4.13 0.0816
A<sup>2</sup> 37.25 1 37.25 69.78 ＜0.0001
B<sup>2</sup> 63.53 1 63.53 119.01 ＜0.0001
C<sup>2</sup> 75.05 1 75.05 140.59 ＜0.0001
残差 3.74 7 O.5338
失拟 1.23 3 0.4088 0.6515 0.6225
纯误差 2.51 4 0.6276
总计 240.26 16
表4：DH响应的方差分析
模型的P(概率)值显著地低(P＜0.0001)，失拟不显著(P＝0.6225)。判定系数(R2＝0.9844)是期望的，反映了基于ANOVA结果的低的实验误差。酶底物比fB)在获得最大DH方面具有最显著的影响，而温度(A)和pH(C)也显著影响DH。另外，二次项(A2、B2和C2)对DH有着显著影响。
采用的最佳条件为温度(A)50.64℃，酶/底物比(B)6.58(重量/重量)，pH(C)6.10。在此条件下预测的最大DH为48.04％。此外，从实验获得的最大DH为48.79％，与模型预测值非常接近。总之，这个显著拟合(P＜0.001)模型表明酶促水解在很大程度上依赖于添加的酶的剂量，其次是反应pH和温度，如表4中所示。
猪肉碎屑和水，解产物的氨基酸分布
表5中呈现了冻干原始猪肉碎屑(0小时)、冻干非酶处理对照A(水浴中6小时但无85℃、15分钟的热处理)、冻干非酶处理对照B(水浴中6小时，有85℃、15分钟的热处理)和酶促水解物(6小时)的氨基酸组成。
对样品测定十九种氨基酸。酶促水解6小时后，所有氨基酸均显著增加(P＜0.05)，与原始样品和非酶处理的对照样品相比，增加了大约20倍，而大多数原始样品和对照样品在彼此之间几乎没有差异(P≥0.05)。这些表明Flavourzyme水解对蛋白水解的加速具有积极作用。所得结果证实酶促蛋白水解可生成大量低分子量含氮化合物，其包括肽和游离氨基酸。必需氨基酸如异亮氨酸+亮氨酸(15.79％)、赖氨酸(9.40％)、缬氨酸(5.95％)、苯丙氨酸(5.78％)和蛋氨酸(4.92％)占检测到的所有氨基酸的41.84％，甚至超过FAO/WHO(1990)推荐的婴幼儿参考值(40％)。
如表5中所示，所得水解产物具有高浓度的增味氨基酸，其包括谷氨酸(8.44％)、天冬氨酸(4.76％)、甘氨酸(1.97％)和丙氨酸(5.01％)，其占总氨基酸的20.18％。精氨酸占水解产物的总氨基酸的9.33％，其被归类为条件必需氨基酸，因为它牵涉到许多生理代谢，这包括蛋白质合成和能量转换(Morris，2005)。据报道，组氨酸和谷氨酰胺(7.69％)、色氨酸(2.00％)和蛋氨酸(4.92％)也表现出显著的抗氧化活性，与α-生育酚具有协同作用(Zhang等人，2017)。然而，含硫氨基酸胱氨酸占总氨基酸的百分数最少(0.57％)。
归纳起来，研究了四种微生物蛋白酶在水解猪肉碎屑中的有效性，其表明Flavourzyme提供最高的水解度(DH)。DH受水解条件的显著影响，其包括酶/底物比、温度、pH和反应时间。使用RSM获得的Flavourzyme的最佳条件分别为酶/底物比6.58(重量/重量)、温度50.64℃和pH 6.10，水解6小时产生48.04％的最大DH。富含游离氨基酸的猪肉水解产物可被加工成食品调味剂和/或营养补充剂，从而使得食品工业中的猪肉副产品如碎屑能够有效增值。
实施例2-用酵母发酵肉水解产物
发酵过程示意性地示于图3中。
酵母菌株和培养基
使用四种酵母菌株。易变假丝酵母NCYC1433购自National Collection of YeastCultures(英格兰，诺维奇)；戴尔有孢圆酵母Prelude、酿酒酵母MERIT.ferm和克鲁维毕赤酵母FrootZen得自Chr.Hansen(丹麦，赫斯霍尔姆)。将两铂环量的冻干酵母转移到20mL pH5.0的无菌酵母-麦芽(YM)肉汤中，该肉汤含有1％的葡萄糖、0.5％的细菌学蛋白胨、0.3％的酵母提取物和0.3％的麦芽提取物。将接种的酵母在30℃下静态孵育48小时。向每种培养物中添加无菌甘油(新加坡Merck)以达到30重量％的最终甘油浓度并在使用前将培养物保持在-80℃下。
Figure BDA0003672000550000151
用酵母发酵肉水解产物以2％(重量/重量)的比率向解冻的肉水解产物中添加葡萄糖(D-(+)-葡萄糖一水合物，≥99.0％，新加坡Merck)，并使用1M的乳酸将肉水解产物的最终pH调节至4.5±0.05。然后将混合物在85℃下巴氏杀菌15分钟并冷却至室温，并在接种前通过铺板验证巴氏杀菌的有效性。
将解冻的酵母培养物以10％(体积/体积)转移到YM肉汤中并在30℃下静态孵育48小时。使用相同的方法进行另一次传代培养并将获得的酵母培养物在4℃下以8000x g离心5分钟，并使用5mL 0.85重量％的盐水溶液洗涤沉淀物两次。
随后，将每种酵母沉淀物重新悬浮在经巴氏杀菌的肉水解产物中以调节至适宜的细胞浓度(105CFU/mL至106CFU/mL)。然后向30mL经巴氏杀菌的肉水解产物中添加3mL的每种重新悬浮的酵母培养物以获得105CFU/mL的最终接种细胞计数并彻底混合。接种的肉水解产物样品在30℃下静态孵育15天并定期取样。未接种的经巴氏杀菌的肉水解产物在相同条件下孵育作为对照。分析前将采集的样品保持在-20℃下。
酵母计数和pH测量
通过在0.1％(重量/体积)的无菌蛋白胨水(英国，贝辛斯托克Oxoid)中连续稀释进行细胞计数，然后铺展铺板到马铃薯葡萄糖琼脂(英国，贝辛斯托克Oxoid)上。除了孵育5天的菌株1433外，所有板均在30℃下孵育48小时。用pH计(瑞士，黑里绍Metrohm)测量pH。
总还原糖和有机酸的分析
在作了一些修改的情况下使用3,5-二硝基水杨酸(DNS)方法(Wood等人，2012)测定对照和发酵样品的总还原糖含量。将10μL发酵样品和190μL DNS试剂在离心管(新加坡Merck)中混合均匀。其后，将管在沸水浴中加热5分钟并在冰盒中冷却。将100μL反应样品移液到96-微量滴定板上并在540nm处读数。
使用Toh和Liu(2017)中描述的方法制备发酵肉酱的有机酸提取物。在离心管中以1:1(体积/体积)的比率向样品中添加0.1％(体积/体积)H2SO4的等分试样并在4℃下储存1小时以让蛋白质沉淀。将管在4℃下以10000×g离心10分钟并在通过0.2-μm Minisart RC15注射过滤器(德国，哥廷根Sartorius)过滤后收集上清液。使用Supelcogel C-610H柱(美国，宾夕法尼亚州，贝尔丰特Supelco)通过高效液相色谱法(HPLC)进行有机酸分析。流动相为0.1％(体积/体积)H2SO4，并设置在40℃下0.4mL/min的流速下(Lee等人，2013)。在SPD-M20A光电二极管阵列检测器(日本东京Shimadzu)中于210nm处检测有机酸化合物，并用外标定量。
游离氨基酸的分析
使用丙烯腈(ACN)(新加坡Merck)沉淀蛋白质来提取发酵肉酱的游离氨基酸；将600μLACN、200μL蒸馏水和200μL样品在离心管中混合并在4℃下储存至少1小时。将样品在4℃下以10000×g离心10分钟并在通过0.2-μm Minisart RC 15注射过滤器(德国，哥廷根Sartorius)过滤后收集上清液。使用Waters AccQ-Tag Ultra Chemistry Kit(爱尔兰，都柏林)用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)进行氨基基团的柱前衍生。进行衍生氨基酸的HPLC分析。使用氨基酸标准混合物(美国，马萨诸塞州，沃尔瑟姆ThermoFisher Scientific)进行鉴定和定量。
挥发性化合物的分析
使用改进的方案(Vong和Liu，2017)进行发酵肉酱中挥发性化合物的提取和分析。在提取之前，将样品解冻并在60℃的水浴中热处理2分钟。挥发性化合物通过顶空固相微萃取(HS-SPME)与气相色谱-质谱联用法进行提取，并通过火焰离子化检测器(GC-MS/FID)半定量。
将5mL样品添加到带有聚四氟乙烯(PTFE)隔垫的20mL玻璃小瓶中。使用Combi Pal自动进样器(瑞士，茨温根CTC Analytics)，使用85-μm carboxen/聚二甲基硅氧烷SPME纤维(美国，宾夕法尼亚州，贝尔丰特Supelco，CAR/PDMS)在250rpm搅拌下于60℃提取顶空挥发性有机化合物，持续30分钟。提取的化合物在DB-FFAP毛细管柱(长60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm，美国，加利福尼亚州，圣克拉拉Agilent)上分离，使用氦气作为载气，流速为1.2mL/min(Agilent 5975C triple-axis MS和FID)。分离条件(Gao等人，2016)为：烘箱初始温度设置在40℃持续3分钟，然后以每分钟5℃的速率升至90℃，不保温，并以每分钟10℃的速率升至230℃，保温时间7分钟。
化合物的鉴定基于其质谱与NIST 8.0中的数据库和Wiley 275MS库的比较。化合物的验证基于其线性保留指数(LRI)值。使用其保留时间来计算每种化合物的LRI值。使用GC-FID峰面积来对挥发物半定量并计算化合物的每个主要基团以百分数表示的相对峰面积(RPA)。
统计分析
使用丙烯腈(ACN)(新加坡Merck)沉淀蛋白质来提取发酵肉酱的游离氨基酸。将600μLACN、200μL蒸馏水和200μL样品在离心管中混合并在4℃下储存至少1小时。将样品在4℃下以10000×g离心10分钟并在通过0.2-μm Minisart RC 15注射过滤器(德国，哥廷根Sartorius)过滤后收集上清液。
使用Waters AccQ-Tag Ultra Chemistry Kit(爱尔兰，都柏林)用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)进行氨基基团的柱前衍生。进行衍生氨基酸的HPLC分析。使用氨基酸标准混合物((美国，马萨诸塞州，沃尔瑟姆ThermoFisher Scientific)进行鉴定和定量。
酵母菌群和pH变化
如图6(a)中所示，葡萄酒酵母菌株Prelude、Merit和FrootZen的生长模式相似，到第1天，总细胞计数分别从大约6.0log CFU/mL增至7.71log CFU/mL、7.64log CFU/mL和7.34log CFU/mL。其后，到第15天，细胞计数分别逐渐下降至5.76log CFU/mL、6.59logCFU/mL和5.78log CFU/mL。相比之下，仅到第3天，酱油酵母1433的细胞计数从5.45logCFU/mL显著(P<0.05)增至7.22log CFU/mL并保持相对稳定直至第5天，此时细胞计数减至6.10log CFU/mL。这些结果表明，猪肉水解产物含有足够量的酵母可同化氮和微量营养素以支持酵母生长。
发酵期间肉酱pH变化的时间过程在图6(b)中示出。在整个发酵过程中，所有样品的pH值均略有下降，但在4.40至4.50之间变化。这是产生了少量酸(如图7中所示)和CO2的结果。
总还原糖和有机酸
肉酱发酵过程中总还原糖(主要为葡萄糖)和有机酸的变化在图7中呈现。如图7(a)中所示，所有酵母发酵样品中的总还原糖从24.38mg/mL(第0天)持续下降至1.0mg/mL(第15天)。在此实施例中，肉酱样品中的总还原糖主要为葡萄糖，其是酵母的主要碳源和能量源。糖的消耗是酵母生长速率和幅度的反映。糖消耗结果与图6(a)中示出的酵母细胞计数数据相关性很好，其中葡萄酒酵母积极消耗糖并从第0天至第1天增长最多，而在酱油酵母的情况下，主要的糖消耗发生在指数生长期的第1至第5天。
所有样品的有机酸变化在图7(b)至(g)中示意。柠檬酸和乳酸没有显著变化(P>0.05)(图7(b)和(f))，而苹果酸在第1天产生并保持稳定(图7(c))。在发酵过程中四种酵母菌株呈现出产生丙酮酸(图7(d))和乙酸(图7(g))的相似趋势，并且酱油酵母的乙酸产量明显高。琥珀酸增加或减少，取决于酵母(图7(e))。
一致的丙酮酸产生可能反映了酵母的持续发酵过程。衍生自丙酮酸盐的乙酰辅酶A(乙酰-CoA)可能已被酶促氧化为乙酸以再生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+氢(H)(NADH)并平衡氧化还原作用，而不是被还原为乙醇。如图7和8中所示，四种酵母的乙酸和乙醇产量似乎呈负相关。已知易变假丝酵母和克鲁维毕赤酵母更具氧化性并因此产生更多的乙酸。相比之下，酿酒酵母和戴尔有孢圆酵母更具发酵性并产生更多的乙醇。柠檬酸、苹果酸和琥珀酸是三羧酸循环(TCA循环)的中间体并且它们在发酵过程中的产生可能是酵母的生理和氧化还原状态的结果，尽管柠檬酸没有变化。总之，有机酸、尤其是乙酸的产生可能影响发酵肉酱的感官性质。
游离氨基酸分布
氨基酸不仅是发酵肉酱的味道属性的主要决定因素，也是酵母产生的香气化合物的前体。因此，测定并比较了不同样品的氨基酸分布。表6示出了对照和用四种酵母菌株发酵的样品的氨基酸浓度的变化。发酵15天后，发酵肉酱的总游离氨基酸浓度显著(P<0.05)降低。由菌株Merit发酵的肉酱的总氨基酸下降最多，几乎下降了三分之二，其次分别是菌株Prelude(50％)和FrootZen(45％)，而菌株1433下降最少(30％)。
对照中甜味氨基酸如甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)占总氨基酸的6％左右，而包括缬氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)在内的苦味氨基酸占近17％。发酵后，对于所有酵母而言，这些氨基酸的百分数几乎保持不变。另外，在对照和所有发酵肉酱中，导致酸味和鲜味的天冬氨酸(Asp)和谷氨酸盐(Glu)占大约13％。在传统的熟肉酱中，含硫化合物对导致“烤肉”香气特别重要。产生这些肉样风味化合物的主要途径为含硫氨基酸如半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)与还原糖之间的美拉德反应。在对照样品中发现Cys浓度低(5.09mg/L)并在用所有酵母发酵15天后减少了几乎一半。Met的量比Cys高四倍(21.63mg/L)并被葡萄酒酵母利用了50％，而酱油酵母1433仅使用了约33％的Met。
挥发性化合物
在第15天，在对照和由酵母1433、Prelude、Merit和FrootZen发酵的肉酱中分别鉴定出总共17和34、30、37、30种挥发性化合物。将这些挥发性化合物分为七组：酸类、乙醇、醇类(除乙醇外)、醛类、酮类、酯类和呋喃类，如图8中所示意。
在对照中鉴定出的主要化合物属于醛类组和呋喃类组，RPA分别为67.11％和24.21％(图8(d)和(g))。这两组中占主导地位的化合物分别为己醛和2-戊基呋喃。己醛通常与和脂质氧化相关的青草、草本和豆样风味相联系，并常被确定为是酸败的开始。己醛和其他脂族醛如戊醛、庚醛、辛醛和壬醛的主导地位很可能与肉中不饱和脂质的氧化有关，这种氧化会在6小时的酶促水解中发生。然而，2-戊基呋喃很可能天然存在于生猪肉中，因为已知它是由哺乳动物代谢产生的。己醛和2-戊基呋喃的主导地位很可能会给非发酵猪肉碎屑水解产物带来整体上不受欢迎的青草和“纸板样”风味。
Figure BDA0003672000550000201
在用不同酵母发酵的肉酱之间观察到挥发特性的明显差异。一般来说，乙醇和属于挥发性酸类、其他醇类和酯类的挥发性化合物在发酵后显著(P<0.05)增加，而醛类和呋喃类在发酵后显著(P<0.05)减少，如图8中所示。在氨基酸的分解代谢过程中，产生α-酮酸，其然后脱羧形成醛类，接着还原为醇类和/或氧化为羧酸类，但酱油酵母只产生异戊酸。酯类的增加是由于醇类与活化酸类(酰基Co-As)之间的反应。呋喃类的减少主要与2-戊基呋喃化合物的还原有关。
产生大量的酯类，主要为乙醇、带支链的醇和脂族醇的乙酰基酯和脂肪酰基酯。如图8中所示，在四种酵母菌株中，菌株FrootZen产生的酯类的量最高，而菌株1433产生的酯类的量最少。由菌株FrootZen产生的占主导地位的酯类包括乙酸异戊酯、乙酸异丁酯和乙酸2-苯乙酯，而这些酯类在由菌株1433产生的水解产物中以微量检测到或不产生。这些酯类由醇与乙酰-CoA或脂肪酰基-CoA之间在酵母中的醇乙酰Co-A或脂肪酰基转移酶的催化下的缩合酶促产生，通常赋予水果风味韵调。菌株FrootZen产生的强烈香蕉样和花香气味与其他酵母不同。
一些酵母产生若干酮类并很可能是酵母经由β-氧化的脂肪酸代谢的产物。菌株1433产生的酮类的量最高，而菌株FrootZen不产生酮类。丙酮是主要的酮并仅由菌株1433产生。
归纳起来，使用了一种酱油酵母(易变假丝酵母)和三种葡萄酒酵母(酿酒酵母、戴尔有孢圆酵母和克鲁维毕赤酵母)来发酵猪肉碎屑水解产物。所有酵母均生长良好并利用来自猪肉碎屑水解产物的葡萄糖和游离氨基酸来产生令人愉悦的果味和酯化合物。由脂质氧化产生的不合需要的异味醛大多被还原为醇类。特别地，克鲁维毕赤酵母FrootZen产生了显著较高的量的酯类并呈现非常强的“香蕉样”气味，而易变假丝酵母1433产生了更多的酮化合物。这些发现证实，酵母是用于生产新型调味料的有效肉水解产物转换器。
实施例3-用乳酸菌(LAB)发酵肉水解产物
发酵过程示意性地示于图3中。
细菌培养物和培养基
本研究中使用了六种乳酸菌(LAB)菌株：发酵乳杆菌PCC和鼠李糖乳杆菌GG得自Chr.Hansen(丹麦，赫斯霍尔姆)；植物乳杆菌299V得自Probi(瑞典，隆德)；乳酸乳球菌乳脂亚种DSM20069购自DSMZ(德国，不伦瑞克)；嗜酸乳杆菌NCFM获得自Danisco(丹麦，哥本哈根)；干酪乳杆菌Shirota分离自Yakult益生菌培养乳饮料(日本Yakult Honsha)。
将两铂环量的冻干LAB培养物转移到20mL无菌De Man、Rogosa和Sharpe(MRS)肉汤(英国，贝辛斯托克Oxoid)中并在37℃下静态孵育24小时。使用前将培养物保存在-80℃的30％无菌甘油(新加坡Merck)中。
用LAB发酵肉水解产物
向肉水解产物中添加葡萄糖(2％(重量/重量)的D-(+)-葡萄糖一水合物)(≥99.0％，新加坡Merck)，然后在85℃下巴氏杀菌15分钟。通过铺板验证巴氏杀菌的有效性。每种LAB培养物以10％(体积/体积)的比率在MRS肉汤中活化一次并传代培养一次，并在37℃下孵育24小时。离心(8000×g，5分钟，4℃)后用5mL 0.85重量％的盐水溶液洗涤两次来获得细菌沉淀物。
将细胞沉淀物重新悬浮在5mL经巴氏杀菌的肉水解产物中以调节至107CFU/mL的所需细胞浓度。向30mL肉水解产物中接种3mL的每种细菌悬浮液并彻底混合。接种的肉水解产物在静态条件下于37℃下孵育4天，每24小时取样一次。未接种的肉水解产物在相同条件下处理作为对照。分析前将发酵样品保持在-20℃下。
细菌计数和pH测量
通过在0.1％(重量/体积)的无菌蛋白胨水(英国，贝辛斯托克Oxoid)中连续稀释进行细胞计数，然后铺展铺板到马铃薯葡萄糖琼脂(英国，贝辛斯托克Oxoid)上。所有板均在30℃下孵育48小时。用pH计(瑞士，黑里绍Metrohm)测量pH。
总还原糖和有机酸的分析
在作了一些修改的情况下使用3,5-二硝基水杨酸(DNS)方法(Wood等人，2012)测定对照和发酵样品的总还原糖含量。将10μL发酵样品和190μL DNS试剂在离心管(新加坡Merck)中混合均匀。其后，将管在沸水浴中加热5分钟并在冰盒中冷却。将100μL反应样品移液到96-微量滴定板上并在540nm处读数。
使用Toh和Liu(2017)中描述的方法制备发酵肉酱的有机酸提取物。在离心管中以1:1(体积/体积)的比率向样品中添加0.1％(体积/体积)H2SO4的等分试样并在4℃下储存1小时以让蛋白质沉淀。将管在4℃下以10000×g离心10分钟并在通过0.2-μm Minisart RC15注射过滤器(德国，哥廷根Sartorius)过滤后收集上清液。使用Supelcogel C-610H柱(美国，宾夕法尼亚州，贝尔丰特Supelco)通过高效液相色谱法(HPLC)进行有机酸分析。流动相为0.1％(体积/体积)H2SO4，并设置在40℃下0.4mL/min的流速下(Lee等人，2013)。在SPD-M20A光电二极管阵列检测器(Shimadzu，日本东京)中于210nm处检测有机酸化合物，并用外标定量。
游离氨基酸的分析
使用丙烯腈(ACN)(新加坡Merck)沉淀蛋白质来提取发酵肉酱的游离氨基酸；将600μLACN、200μL蒸馏水和200μL样品在离心管中混合并在4℃下储存至少1小时。将样品在4℃下以10000×g离心10分钟并在通过0.2-μm Minisart RC 15注射过滤器(德国，哥廷根Sartorius)过滤后收集上清液。使用Waters AccQ-Tag Ultra Chemistry Kit(爱尔兰，都柏林)用AQC进行氨基基团的柱前衍生。进行衍生氨基酸的HPLC分析。使用氨基酸标准混合物(美国，马萨诸塞州，沃尔瑟姆ThermoFisher Scientific)进行鉴定和定量。
挥发性化合物的分析
使用改进的方案(Vong和Liu，2017)进行发酵肉酱中挥发性化合物的提取和分析。在提取之前，将样品解冻并在60℃的水浴中热处理2分钟。通过HS-SPME与GC-MS/FID联用来提取挥发性化合物。
将5mL样品添加到带有PTFE隔垫的20mL玻璃小瓶中。使用Combi Pal自动进样器(瑞士，茨温根CTC Analytics)，使用85-μm carboxen/聚二甲基硅氧烷SPME纤维(美国，宾夕法尼亚州，贝尔丰特Supelco，CAR/PDMS)在250rpm搅拌下于60℃提取顶空挥发性有机化合物，持续30分钟。提取的化合物在DB-FFAP毛细管柱(长60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm，美国，加利福尼亚州，圣克拉拉Agilent)上分离，使用氦气作为载气，流速为1.2mL/min(Agilent 5975C triple-axis MS和FID)。分离条件(Gao等人，2016)为：烘箱初始温度设置在40℃持续3分钟，然后以每分钟5℃的速率升至90℃，不保温，并以每分钟10℃的速率升至230℃，保温时间7分钟。
化合物的鉴定基于其质谱与NIST 8.0中的数据库和Wiley 275MS库的比较。化合物的验证基于其LRI值。使用其保留时间来计算每种化合物的LRI值。使用GC-FID峰面积来对挥发物半定量并计算化合物的每个主要基团以百分数表示的相对峰面积(RPA)。
统计分析
使用丙烯腈(ACN)(新加坡Merck)沉淀蛋白质来提取发酵肉酱的游离氨基酸。将600μLACN、200μL蒸馏水和200μL样品在离心管中混合并在4℃下储存至少1小时。将样品在4℃下以10000×g离心10分钟并在通过0.2-μm Minisart RC 15注射过滤器(德国，哥廷根Sartorius)过滤后收集上清液。
使用Waters AccQ-Tag Ultra Chemistry Kit(爱尔兰，都柏林)用AQC进行氨基基团的柱前衍生。进行衍生氨基酸的HPLC分析。使用氨基酸标准混合物(美国，马萨诸塞州，沃尔瑟姆ThermoFisher Scientific)进行鉴定和定量。
LAB生长和pH变化
所有LAB在猪肉碎屑水解产物中均生长良好，细胞计数增加了1.5log CFU/mL至2.0log CFU/mL，如图9中所示意。图9(a)示出了菌株GG和Shirota的类似生长趋势。这两个菌株的细胞计数在24小时内分别从7.06log CFU/mL和7.39log CFU/mL增至8.64log CFU/mL和9.24log CFU/mL并保持稳定直到发酵结束。另一方面，菌株PCC、299V、DSM20069和NCFM的细胞计数在24小时内从大约7.50CFU/mL增至8.8CFU/mL，到第4天逐渐下降至7.3logCFU/mL左右。
如图9(b)中所示，所有LAB发酵水解产物的pH在24小时内均显著(P<0.05)下降，到第4天达到大约3.8，菌株PCC除外，其pH降至仅4.3。
总还原糖和有机酸的变化
如图10(a)中所示，所有LAB发酵水解产物的总还原糖含量在4天后均显著(P<0.05)下降，但糖利用率随LAB而异。菌株PCC消耗添加的葡萄糖最快，其次是菌株Shirota、GG和NCFM。特别地，菌株PCC和Shirota几乎用尽了培养基中所有可用的葡萄糖，到第4天，葡萄糖从20.98mg/mL分别降低至仅1.23mg/mL和2.46mg/mL。在其他LAB发酵的水解产物中，残留葡萄糖的显著水平保持在<10mg/mL下。
图10(b)至(f)中示出了对照和发酵样品的有机酸组成，其包括柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸、乳酸和乙酸。总的来说，所有LAB菌株呈现出相似的有机酸变化模式：在第4天，琥珀酸、乳酸和乙酸显著(P<0.05)增加而柠檬酸显著(P<0.05)减少。然而，丙酮酸显示出无变化。正如预期的那样，所有菌株均显示出乳酸的明显增加，从第0天的2mg/mL左右到第4天的平均15mg/mL，因为乳酸是同型发酵和异型发酵LAB的主要最终产物。如上文所讨论的，作为异型发酵，菌株PCC从葡萄糖产生了最低的量的乳酸，但乙酸的量最高。
游离氨基酸的变化
在未发酵猪肉碎屑水解产物中测定了总共19种类型的氨基酸并呈现在表7中。由六种LAB发酵的水解产物的总氨基酸浓度彼此差异显著(P<0.05)，或增加或减少，具体取决于LAB。与未发酵的对照相比，由菌株DSM20069发酵的水解产物的总氨基酸增加了1.7倍，为539.08mg/L，其次是分别为504.83mg/L、363.63mg/L和335.86mg/L的菌株NCFM、PCC和Shirota。相比之下，菌株299V发酵的水解产物中的总氨基酸减少了超过2.5倍，为126.05mg/L，其次是菌株GG，为219.14mg/L。
最终的总氨基酸浓度为被LAB消耗和产生的氨基酸的净平衡，具体取决于它们的蛋白水解活性和自溶(氨基酸的释放)。由菌株DSM20069和NCFM的显著氨基酸产生表明它们与菌株PCC和Shirota相比具有更强的蛋白水解活性。菌株DSM20069是一种乳球菌菌株并因此预期具有较高的蛋白水解活性。另一方面，菌株NCFM为嗜酸乳杆菌的益生菌菌株，最初是从人类胃肠道分离出的，因此其较高的蛋白水解活性令人惊奇。
另外，LAB自溶的差异可能部分解释了不同的氨基酸形成水平。另一方面，菌株299V和GG的显著总氨基酸减少表明它们的蛋白水解活性和/或自溶较弱，同时消耗更大，从而导致氨基酸水平的下降。肠道友好的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌能够分解代谢几乎所有种类的氨基酸而产生氨、羧酸类(如乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、异戊酸盐)、有机酸类、酚类化合物和气态化合物(如二氧化碳、氢气、硫化氢和甲烷)。
有趣的是，虽然其氨基酸总量增加，但由菌株PCC发酵的水解产物中精氨酸的浓度显著(P<0.05)降低至10.04mg/L。LAB对精氨酸的利用对于LAB和味道两者来说都是合乎需要的，因为还已知精氨酸具有极苦和令人不愉快的味道。精氨酸经由精氨酸脱亚胺酶途径的分解代谢生成有利于细菌存活的三磷酸腺苷(ATP)和氨。另一方面，由Shirota菌株发酵的水解产物中的谷氨酸显著(P<0.05)增加，从28.17mg/L增至34.00mg/L，而总游离氨基酸浓度几乎没有变化。虽然干酪乳杆菌中谷氨酸的产生和分解代谢途径尚不清楚，但谷氨酸的量的增加可能有助于肉酱的“鲜味”风味。除此之外，由菌株DSM20069和NCFM发酵的肉酱中色氨酸的浓度保持不变，但总氨基酸显著增加(P<0.05)。这可能是由于这两种菌株对色氨酸的利用。然而，含硫氨基酸半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)的浓度对于在美拉德反应后产生“肉味”气味至关重要，对于所有未发酵和发酵的样品，它们仅占测得的氨基酸总量的大约0.9％和4％。
Figure BDA0003672000550000261
挥发性化合物
在第4天，在对照和由菌株PCC、299V、DSM20069、GG、NCFM和Shirota发酵的肉酱中分别鉴定出总共19、16、20、19、20、23和17种挥发性化合物。将鉴定出的化合物分为五组：酸类、醇类、醛类、酮类和呋喃类，每组的峰面积小计(106)汇总在图11中。
在对照中检测到的主要挥发性风味化合物主要为脂族醛类和呋喃类，RPA分别占80.90％和10.42％(图11(c)和(e))。特别地，单是己醛就占对照中检测到的总挥发性化合物的57.22％。发出酸败气味的脂族醛类很可能来自猪肉脂质在6小时水解过程中的氧化，而呋喃类则来自发酵前的热处理。
在所有发酵的水解产物中，总醛类减少至低水平，而总酸类、醇类和酮类水平实质性地(P<0.05)增加。到第24小时，总呋喃水平增加，然后随着时间减少至低于初始值的水平，消耗呋喃类的菌株PCC除外(图11)。很可能的是，醇类(对于菌株PCC，除乙醇外)源自醛的酶促还原而羧酸类(对于菌株PCC，除乙酸外)由醛类的化学和酶促氧化形成。然而，就醇类和羧酸类的形成而言，在异型发酵LAB菌株PCC与其他同型发酵LAB之间没有明显的关系，这表明两组LAB具有相似水平的醇和醛脱氢酶活性。总酮类在很大程度上由上述柠檬酸分解代谢生成的2,3-丁二酮(双乙酰)和乙偶姻贡献。六种LAB之间在醛还原方面几乎没有差异。然而，LAB之间在总羧酸类、总醇类、总呋喃类(菌株PCC除外)和总酮类的形成方面存在明显的差别，其中菌株NCFM产生的总醇类的量最少而菌株PCC形成的总酮类的量最少。另一方面，菌株PCC产生的总醇类(主要是乙醇)的量最高而菌株NCFM形成的总酮类(主要是双乙酰和乙偶姻)的水平最高。
除了3-甲基丁醛和苯甲醛外，很少有源于氨基酸的挥发物，3-甲基丁醛和苯甲醛均可以化学和/或生物方式形成。LAB之间在这些挥发物的形成或降解方面存在明显的大的差异。例如，只有菌株GG既产生2,3-丁二酮又产生乙偶姻；菌株DSM20069和299V仅产生乙偶姻，但所有LAB都降解柠檬酸。
归纳起来，使用了五种益生菌LAB和一种乳球菌LAB来发酵猪肉碎屑水解产物。所有LAB在补充了葡萄糖的水解产物中生长良好。主要的代谢终产物为乳酸和乙酸。一些LAB产生的氨基酸比消耗的多，而另一些LAB消耗的氨基酸比产生的多。会给未发酵的水解产物赋予异味的主要脂质衍生醛在很大程度上被LAB转化为相应的醇类和酸类，从而有效地改善了风味。然而，很少发现氨基酸衍生的挥发物。乳酸和乙酸的产生与醛类的还原一起可带来新型液体猪肉生物调味产品的开发。
实施例4-用酵母和乳酸菌(LAB)的共培养物发酵肉水解产物
发酵过程示意性地示于图3中。
进行在猪肉水解产物发酵中发酵乳杆菌和克鲁维毕赤酵母的同时和依次接种，并研究微生物活力、物理化学变化和挥发物产生。
本实验中制备了五种类型的接种样品：(i)未接种的猪肉水解产物作为对照；(ii)用单一的发酵乳杆菌培养物接种的猪肉水解产物；(iii)用单一的克鲁维毕赤酵母培养物接种的猪肉水解产物；(iv)用发酵乳杆菌和克鲁维毕赤酵母共接种的猪肉水解产物；(v)先用发酵乳杆菌接种直至培养基的pH降至4.5、然后添加克鲁维毕赤酵母的猪肉水解产物。
为了活化冷冻的微生物培养物，将发酵乳杆菌和克鲁维毕赤酵母储用培养物以10％(体积/体积)的比率转移到MRS肉汤(调节至pH 5.0)和YM肉汤中，分别在30℃下48小时和在37℃下24小时。在离心(8000×g，5分钟，4℃)并用5mL 0.85重量％的盐水溶液洗涤两次后，将每个菌株的细胞沉淀物重新悬浮在5ml经巴氏杀菌的猪肉水解产物中以确保发酵之前猪肉水解产物中的初始接种物细胞计数对于发酵乳杆菌为约107而对于克鲁维毕赤酵母为约105。如下添加接种物：对于单一培养物接种，向30mL猪肉水解产物中转移0.3mL发酵乳杆菌或克鲁维毕赤酵母培养物悬浮液；对于共接种，一开始就向猪肉水解产物中添加0.3mL发酵乳杆菌和0.3mL克鲁维毕赤酵母培养物悬浮液；对于依次接种，在第0天向猪肉水解产物接种0.3mL发酵乳杆菌培养物悬浮液并于37℃下静态孵育24小时，其后在第1天接着向培养基中添加0.3mL克鲁维毕赤酵母培养物悬浮液。
接种后，轻轻摇动以使样品混合并在30℃下静态孵育5天(对于依次接种，发酵6天)。未接种的猪肉水解产物也在30℃下孵育作为对照。每24小时对所有类型的猪肉水解产物取样用于细胞计数和pH测定。然后在进行其他分析之前将所有样品保持在-20℃下。
酵母或发酵乳杆菌的计数通过将样品10倍稀释于0.1％(重量/体积)的蛋白胨水(英国，贝辛斯托克)中、然后在选择性琼脂上铺板来进行。酵母细胞计数通过将稀释的样品铺展铺板到两份完全一样的补充有100ppm氯霉素(德国Merck)的马铃薯葡萄糖琼脂(英国，贝辛斯托克Oxoid，PDA)上并将板在30℃下孵育48小时来测定，而LAB细胞计数通过在含有500ppm纳他霉素(丹麦，哥本哈根Danisco A/S，
Figure BDA0003672000550000281
)的MRS琼脂(英国，贝辛斯托克Oxoid)上倾倒铺板、然后在37℃下孵育24小时来计数。用pH计(瑞士，黑里绍Metrohm)直接测量所有样品的pH变化。
发酵乳杆菌和克鲁维毕赤酵母在猪肉水解产物中单一培养和共培养中的生长
在猪肉水解产物发酵过程中，无论接种顺序如何，都观察到在发酵乳杆菌和克鲁维毕赤酵母之间存在拮抗关系。对于共接种和依次接种(图12(c)和(d))，克鲁维毕赤酵母的细胞计数显著(P<0.05)下降，分别从第1天的6.80log CFU/mL左右降至第5天的5.98logCFU/mL和6.04log CFU/mL，而单一克鲁维毕赤酵母培养物中的细胞计数在接种后第5天保持在6.45log CFU/mL(图12(b))。另一方面，发酵乳杆菌的存活在依次接种的培养物中增强，在第1天达到8.82log CFU/mL的峰值计数并在第6天保持了8.16log CFU/mL的细胞计数(图12(d))。然而，在共接种培养物和单一培养物中观察到相似的发酵乳杆菌生长模式，在其中，它们的细胞计数分别从8.80log CFU/mL左右减少至7.55log CFU/mL和7.72log CFU/mL的最终计数(图12(a)和(c))。
猪肉水解产物发酵中葡萄糖和有机酸的变化
在接种5天后，所有发酵样品中的葡萄糖含量均降至检测不到的水平(图13(a))。由于发酵乳杆菌和克鲁维毕赤酵母利用葡萄糖来繁殖和产生乙醇和/或乳酸、乙酸，故这些糖的消耗是预期的。
对于单一培养物接种，发酵乳杆菌在第1天显示出其最高葡萄糖消耗率，为每天11.19mg/mL，而克鲁维毕赤酵母在第2天显示出其最高葡萄糖消耗率，为每天18.12mg/mL。在混合接种模型中，小于1.0mg/mL的残余葡萄糖在共接种中在第2天发现，而在依次接种中在第4天(接种克鲁维毕赤酵母后3天)发现。
猪肉水解产物发酵中游离氨基酸的变化
测定不同接种方法的氨基酸分布并在表8中比较。在所有样品中，大多数游离氨基酸在发酵5天后总体是恒定的，有轻微波动。共接种与依次接种之间在氨基酸利用方面未观察到显著差异(P≥0.05)。一般来说，单一的克鲁维毕赤酵母消耗最大的量的氨基酸并在猪肉水解产物中产生大范围的挥发性化合物。发酵乳杆菌显示出蛋白水解活性并因此增加总氨基酸的量，但这些影响不是统计学显著的(P≥0.05)。
Figure BDA0003672000550000301
发酵乳杆菌和克鲁维毕赤酵母的共接种和依次接种对挥发性化合物的形成的影响
如图14(a)至(i)中所示，由发酵乳杆菌、克鲁维毕赤酵母共接种和依次接种发酵的猪肉水解产物的乙醇、乙酸、己醛、1-己醇、乙酸异戊酯、乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸2-苯乙酯、苯乙醇的挥发性化合物分布与未发酵的对照样品完全不同。
酯类是克鲁维毕赤酵母共发酵和依次发酵样品中丰度最高的化合物，而醇类是发酵乳杆菌发酵样品中的主要化合物。
己醛是未发酵猪肉水解产物中占主导地位的挥发性化合物，其次是2-戊基呋喃和1-戊醇。这些占主导地位的化合物赋予对照样品整体上不受欢迎的青草、草本和豆样风味。
在由发酵乳杆菌发酵的样品中鉴定出大量的醇类和酸类挥发性化合物。如图14(a)和(b)中所示，在发酵乳杆菌发酵中，丙酮酸盐由糖酵解形成并随后通过丙酮酸盐脱氢酶复合物转化为乙酰-CoA以产生乙酸盐和乙醇，因此发现在发酵过程中乙醇和乙酸的浓度逐渐增加。此外，还发现了1-己醇(图14(d))和己酸，其主要衍生自猪肉水解产物中己醛的酶促还原和氧化。总之，在发酵乳杆菌发酵的猪肉水解产物中这些鉴定出的挥发性化合物使得其具有新鲜的酸味。
归纳起来，在这两种培养物之间观察到拮抗关系，因为在发酵乳杆菌的存在下克鲁维毕赤酵母在接种后仅增殖一天并降至原始水平，而与其相应的单一培养物相比，发酵乳杆菌在两种接种方法中均受到激励。这两种接种方法之间在葡萄糖、有机酸和氨基酸的最终含量方面没有显著性差异(P<0.05)。然而，接种顺序对挥发性化合物的形成有影响，因为在依次接种中检测到更多的酯类。
实施例5-pH、木糖添加和温度对经热处理的猪肉碎屑水解产物的颜色和风味化合 物的影响
图4中示意性地示出了肉酱的热处理过程。
研究了pH、木糖和温度对经热处理的猪肉碎屑水解产物中颜色和香气化合物分布的发展变化的影响。向经酶促水解的猪肉水解产物中添加不同的量(0g/100mL、0.5g/100mL、1.5g/100mL、2.5g/100mL、3.5g/100mL)的木糖，将pH调节至5.5或4.5，然后在90℃、95℃或100℃下热处理60分钟。
颜色
表9和10中示出了对照和加热样品的颜色变化。无论温度和pH如何，所有加热样品均显示出ΔE的增加。L*值(亮度)和a*值(绿色为负，红色为正)随着糖含量的增加而升高。b*值(负为蓝色，正为黄色)在较低的糖含量下增大但在较高的糖含量下稳定或减小，具体取决于温度。在pH 5.5下，三种无糖样品A90-0、A95-0和A100-0分别具有2.26、1.34和2.98的最低ΔE值。这三种无糖样品保持淡黄的透明色，与未经加热的对照相比没有显示出可见的颜色变化。样品A100-35显示出23.50的最高ΔE值，具有透明的深棕色，但与样品A90-35和A95-35相比没有显著的色差，即使每个样品观察到不同的ΔE。在B组样品(pH为4.5)中发现了类似的趋势，其中在具有透明的深棕色的样品B100-35中发现了25.05的最高ΔE。
样品名<sup>#</sup> pH 添加的糖(g/100mL) 温度(℃) 时间(分钟)
A0 5.5 0 0 0
A90-0 5.5 0 90 60
A90-5 5.5 0.5 90 60
A90-15 5.5 1.5 90 60
A90-25 5.5 2.5 90 60
A90-35 5.5 3.5 90 60
A95-0 5.5 0 95 60
A95-5 5.5 0.5 95 60
A95-15 5.5 1.5 95 60
A95-25 5.5 2.5 95 60
A95-35 5.5 3.5 95 60
A100-0 5.5 0 100 60
A100-5 5.5 0.5 100 60
A100-15 5.5 1.5 100 60
A100-25 5.5 2.5 100 60
A100-35 5.5 3.5 100 60
B0 4.5 0 0 0
B90-0 4.5 0 90 60
B90-5 4.5 0.5 90 60
B90-15 4.5 1.5 90 60
B90-25 4.5 2.5 90 60
B90-35 4.5 3.5 90 60
B95-0 4.5 0 95 60
B95-5 4.5 0.5 95 60
B95-15 4.5 1.5 95 60
B95-25 4.5 2.5 95 60
B95-35 4.5 3.5 95 60
B100-0 4.5 0 100 60
B100-5 4.5 0.5 100 60
B100-15 4.5 1.5 100 60
B100-25 4.5 2.5 100 60
B100-35 4.5 3.5 100 60
#对于数据采集，每个样品处理重复三次(n＝3)。
表9：猪肉水解产物样品的热处理条件
Figure BDA0003672000550000331
#所有值均为平均值±标准偏差，每个样品处理重复三次(n＝3)。同一列中不同的字母(大写字母或小写字母)指示彼此之间存在显著的差异(P<0.05)。
“pH-前”是指热处理之前样品所调节至的pH。
表10：对照和经热处理猪肉水解产物的颜色变化
pH
如图15中所示，样品的pH在热处理过程中降低。在样品A100-35和B100-35中发现每组中的最低pH分别为4.86和4.35。美拉德反应期间降低的pH反映了氨基基团的消耗和有机酸类的形成。在许多研究中，降低的pH也是褐变过程的指示。
还原糖/木糖含量
在热处理之前，原始的猪肉水解产物中的总糖含量处于痕量水平，故添加还原糖(木糖)以促进美拉德反应。如图16中所示，木糖还原通常发生在热处理过程中，与温度、pH和糖的量无关。在pH 5.5下，发现样品A90-15中的糖还原最少，为2.18mg/mL，而发现样品A100-35中的糖还原最多，为5.75mg/mL(图16(a))。在pH 4.5下，对于样品B90-35，该数字为2.48mg/mL，而对于样品B100-35，该数字为5.85mg/mL(图16(b))。这些结果表明，在不同条件下处理的样品之间在糖消耗方面几乎没有差异。
游离氨基酸
水解产物的游离氨基酸在经热处理的样品中风味和色素化合物的形成方面起着重要作用。本发明的一个目的在于开发一种新型肉酱，其具有反映熟肉的肉香和甜香的美味风味。如图17中所示，存在含硫氨基酸如半胱氨酸(Cys)和其他重要前体如脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)，它们与熟土豆、蔬菜样、烤制和蜂蜜样甜气味的形成相关联。
如图17(i)和(j)中所示，对于pH 4.5和pH 5.5的样品，热处理后氨基酸的总量没有显示出显著变化，保持在大约300mg/10mL下。
挥发性化合物
为了了解猪肉水解产物的美拉德反应中风味化合物的形成，我们总结了对照和经热处理样品中发现的挥发性化合物。这些挥发性化合物分为五组：酸类、醇类、醛类、酮类和呋喃类。三种鉴定出的占主导地位的化合物为己醛、糠醛和2-戊基呋喃(图18)。
对于pH 5.5和pH 4.5的对照，己醛RPA占29％和28％，热处理后其显著减少(图18(a)和(b))。样品A100-35中检测到的最低己烯醛峰面积为9.44×106，样品B100-35中检测到的最低己烯醛峰面积为7.94×106，RPA分别占每个样品的1.9％和1.2％。己醛是一种脂族醛，会发出未经处理的猪肉水解产物的陈腐和青草气味。
与己醛相反，热处理后糠醛的量显著增加(图18(c)和(d))。对于pH 5.5和pH 4.5的对照，糠醛的峰面积仅为4.13×106和9.14×106，RPA分别占2.4％和3.5％。在经热处理的样品中，在A100-35(111.67×106)和B100-35(361.74×106)中发现了最高的峰面积，RPA占38.8％和55.7％，与对照相比分别增加了27倍和40倍左右。糠醛是在戊糖的存在下美拉德反应中产生的中间体(不含硫)，并给出强烈的烤土豆、辛辣和烧焦韵调。糠醛的形成要么来自Amadori化合物的烯醇化，要么来自糖的脱水，这两种反应均可在酸性和高温条件下增强。在肉类烹饪过程中，糠醛常与由半胱氨酸分解形成的硫化氢反应产生2-呋喃甲硫醇，其为产品提供强烈而遥远的“烤肉”香气(Xu等人，2011)。然而，在本研究中没有检测到2-呋喃甲硫醇，这可能是由于猪肉水解产物中可利用的Cys的浓度低。
与对照相比，经热处理的样品中2-戊基呋喃的水平显著增加，在样品A100-5中发现最高峰面积，为272.50×106，RPA占57.1％(图18(e)和(f))。有趣的是，热处理中2-戊基呋喃的形成与糖含量和温度无关。2-戊基呋喃通常由亚油酸的氧化形成并赋予食物果味、花香、黄油、青草和豆样韵调。尽管热处理中产生的2-戊基呋喃不直接赋予期望的“肉样”气味，但它已被认为是导致一些酱汁产品的整体明火烤肉或烤肉气味的一个因素。
归纳起来，热处理消除了猪肉水解产物中占主导地位的异味化合物己醛，并且较高的温度和木糖含量促进了糠醛和2-戊基呋喃的生成，其具有烤味和甜味韵调。热处理过程中在pH 4.5下检测到更多的糠醛。然而，没有检测到期望的美味“肉样”含硫和含氮香气化合物，这可能是由于猪肉水解产物中半胱氨酸/胱氨酸的水平不足。
尽管前面的描述已描述了示例性实施方案，但相关领域技术人员应理解，可在不偏离本发明的情况下作出许多改变。
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Claims (24)

1.一种形成肉基调味料的方法，所述方法包括用非嗜盐微生物发酵肉基水解产物以形成肉基调味料，其中所述方法不包括盐的添加。
2.根据权利要求1所述的方法，其中非嗜盐微生物包含非嗜盐酵母、非嗜盐乳酸菌或其组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中非嗜盐乳酸菌为益生乳酸菌、乳品乳酸菌或其组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中发酵包括发酵肉基水解产物达1天至20天。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中发酵包括在15℃至45℃的温度下发酵。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中非嗜盐微生物为非嗜盐酵母并且发酵包括发酵肉基水解产物达1天至20天。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中非嗜盐微生物为非嗜盐乳酸菌并且发酵包括发酵肉基水解产物达1天至7天。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中非嗜盐微生物为非嗜盐酵母并且发酵包括在15℃至40℃的温度下发酵肉基水解产物。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中非嗜盐微生物为非嗜盐乳酸菌并且发酵包括在15℃至45℃的温度下发酵肉基水解产物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中发酵包括用酵母和乳酸菌发酵肉基水解产物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中发酵包括用酵母和乳酸菌依次发酵肉基水解产物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中发酵包括用非嗜盐酵母和非嗜盐乳酸菌的共接种发酵肉基水解产物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中发酵包括添加可发酵糖。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在发酵之前在酶的存在下水解肉基混合物以形成肉基水解产物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中酶为蛋白酶。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中水解包括在5.5至7.5的pH下水解。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中水解包括在45℃至60℃的温度下水解。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在发酵之后对肉基调味料进行热处理。
19.根据权利要求18所述的方法，其中热处理包括在90℃至121℃的温度下对肉基调味料进行热处理。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中热处理包括对肉基调味料进行热处理达30分钟至120分钟。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中热处理包括在4至6的pH下热处理。
22.一种肉基调味料，所述肉基调味料由根据前述权利要求中任一项所述的方法制成。
23.一种肉基调味料，所述肉基调味料包含10mg/mL至45mg/mL的游离氨基酸浓度。
24.根据权利要求23所述的肉基调味料，其中肉基调味料包含基于肉基调味料的总重量计≤2重量％的钠含量。
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