JP2022551595A - 肉ベースの調味料を形成する方法 - Google Patents
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Abstract
肉ベースの調味料を形成する方法であって、肉ベースの加水分解物を非親水性微生物で発酵させて、肉ベースの調味料を形成することを含み、塩の添加を含まない、方法が提供される。この方法から形成される、肉ベースの調味料も提供される。好ましい実施形態では、肉ベースは、豚肉及び牛肉などの非海産食品肉製品を指す。非親水性微生物は、非親水性酵母、非親水性乳酸菌又はそれらの組み合わせを含む。【選択図】図１
Description
技術分野
本発明は、肉ベースの調味料を形成する方法に関する。
本発明は、肉ベースの調味料を形成する方法に関する。
背景
動物の食肉処理場又は食肉製造業における副産物は、多くの場合、廃食品として廃棄されるか、又は動物飼料及び肥料などの低価値製品として再利用される。これらの肉ベースの副産物のほとんどは、脂質、タンパク質、ペプチド、遊離アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む、かなりの量の栄養素を含有する。
動物の食肉処理場又は食肉製造業における副産物は、多くの場合、廃食品として廃棄されるか、又は動物飼料及び肥料などの低価値製品として再利用される。これらの肉ベースの副産物のほとんどは、脂質、タンパク質、ペプチド、遊離アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む、かなりの量の栄養素を含有する。
したがって、食品廃棄物を削減し、それらを有用な製品に変換する必要がある。
発明の概要
本発明は、これらの問題に対処すること及び／又は肉ベースの調味料を形成する改善された方法を提供することを目的とする。
本発明は、これらの問題に対処すること及び／又は肉ベースの調味料を形成する改善された方法を提供することを目的とする。
第１の態様によれば、本発明は、肉ベースの調味料を形成する方法であって、肉ベースの加水分解物を非好塩性微生物で発酵させて、肉ベースの調味料を形成することを含む方法を提供する。特定の態様によれば、この方法は、塩の添加を含まない。
非好塩性微生物は、任意の適切な微生物であり得る。例えば、非好塩性微生物は、非好塩性酵母、非好塩性乳酸菌又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。
特定の態様によれば、非好塩性微生物は、非好塩性酵母であり得る。
特定の態様によれば、非好塩性微生物は、非好塩性乳酸菌であり得る。特に、非好塩性乳酸菌は、プロバイオティック乳酸菌、乳製品乳酸菌又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。
発酵させることは、肉ベースの加水分解物を適切な期間にわたって発酵させることを含み得る。例えば、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を１～２０日間にわたって発酵させることを含み得る。
発酵させることは、肉ベースの加水分解物を適切な温度で発酵させることを含み得る。例えば、発酵させることは、１５～４５℃の温度で発酵させることを含み得る。
特定の態様によれば、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母で１～２０日間にわたって発酵させることを含み得る。発酵させることは、１５～４０℃の温度で行われ得る。
別の特定の態様によれば、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性乳酸菌で１～７日間にわたって発酵させることを含み得る。発酵させることは、１５～４５℃の温度で行われ得る。
別の特定の態様によれば、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌で発酵させることを含み得る。例えば、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌で順次発酵させることを含み得るか、又は発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌の同時接種で発酵させることを含み得る。
発酵させることは、発酵性糖を添加することをさらに含み得る。
別の特定の態様によれば、方法は、発酵させることの前に、肉ベースの混合物を酵素の存在下で加水分解して、肉ベースの加水分解物を形成することをさらに含み得る。酵素は、任意の適切な加水分解酵素であり得る。例えば、酵素は、プロテアーゼであり得るが、これに限定されるものではない。
加水分解することは、適当な条件下で行われ得る。例えば、加水分解することは、適切なｐＨ及び温度で行われ得る。特に、加水分解することは、５．５～７．５のｐＨで行われ得る。特に、加水分解することは、４５～６０℃の温度で行われ得る。
方法は、発酵させることに続いて、肉ベースの調味料を熱処理することをさらに含み得る。熱処理することは、適切な条件下で行われ得る。例えば、熱処理することは、適切な温度及びｐＨで適切な期間にわたって行われ得る。特に、熱処理することは、９０～１２１℃の温度におけるものであり得る。特に、熱処理することは、３０～１２０分間にわたるものであり得る。特に、熱処理することは、４～６のｐＨにおけるものであり得る。
第２の態様によれば、本発明は、第１の態様の方法から調製される、肉ベースの調味料を提供する。
第３の態様によれば、１０～４５ｍｇ／ｍＬの遊離アミノ酸を含む、肉ベースの調味料も提供される。特に、肉ベースの調味料は、肉ベースの調味料の総重量に基づいて２重量％以下のナトリウム含有量を含み得る。
図面の簡単な説明
本発明を十分に理解し、容易に実用化するために、ここで、非限定的な例としてのみ、例示的な実施形態を説明し、その説明は、添付の例示的な図面を参照するものとする。
本発明を十分に理解し、容易に実用化するために、ここで、非限定的な例としてのみ、例示的な実施形態を説明し、その説明は、添付の例示的な図面を参照するものとする。
詳細な説明
上記で説明したように、食品の無駄を低減し、肉ベースの副産物をより有用な様式で使用する方法に対する必要性がある。本発明は、このような肉ベースの副産物を利用して、それらを肉ベースの調味料に変換するための方法を提供する。
上記で説明したように、食品の無駄を低減し、肉ベースの副産物をより有用な様式で使用する方法に対する必要性がある。本発明は、このような肉ベースの副産物を利用して、それらを肉ベースの調味料に変換するための方法を提供する。
概括的には、本発明は、肉ベースの副産物から、高い栄養素含有量及び許容可能な風味プロファイルを有する肉ベースの調味料を形成する方法を提供する。特に、本発明の方法は、肉ベースの副産物の使用を提供し、方法が食塩の添加を含まないようにそれらを肉ベースの調味料に変換し、適切な風味プロファイルを維持しながら、より短期間内に変換を達成できる。
第１の態様によれば、本発明は、肉ベースの調味料を形成する方法であって、肉ベースの加水分解物を非好塩性微生物で発酵させて、肉ベースの調味料を形成することを含む方法を提供する。
特定の態様によれば、この方法は、塩の添加を含まない。特に、この方法は、塩化ナトリウム含有塩の添加を含まない。このように、方法から形成される肉ベースの調味料は、添加塩のレベルが低減されているか又はゼロであるため、はるかに健康的であり、したがって肉ベースの調味料の消費者の高血圧及び心血管疾患のリスクが減少する。
本発明の目的では、肉ベースは、非海産食品肉ベースの製品を指す。特定の態様によれば、肉ベースの加水分解物は、血液、骨、皮膚、肉切り落とし及び／又は非海産食品肉の脂肪組織などであるが、これらに限定されるものではない、非海産食品肉及び／又は非海産食品副産物に由来する、肉ベースの混合物の加水分解物を含み得る。非海産食品肉は、豚肉、羊肉、牛肉、鶏肉又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。特定の態様によれば、肉ベースの加水分解物は、液体形態であり得る。
非好塩性微生物は、任意の適切な微生物であり得る。本発明の目的では、非好塩性微生物は、例えば、塩濃度が０．２モル／Ｌ以下の培地など、低塩含有培地又は無塩含有培地で増殖できる微生物として定義される。非好塩性微生物は、非好塩性酵母、非好塩性乳酸菌又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。
特定の態様によれば、非好塩性微生物は、非好塩性酵母であり得る。例えば、非好塩性酵母は、トルラスポラ・デルブルツキ（Torulaspora delbrueckii）（Ｔ．デルブルツキ（T. delbrueckii））、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae））、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）（Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri））又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。特に、非好塩性酵母は、Ｔ．デルブルツキ（T. delbrueckii）プレリュード、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）メリット、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）フロートゼン又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。さらに具体的には、非好塩性酵母は、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）であり得る。
特定の態様によれば、非好塩性微生物は、非好塩性乳酸菌であり得る。特に、非好塩性乳酸菌は、プロバイオティック乳酸菌、乳製品乳酸菌又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。例えば、非好塩性乳酸菌は、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）（Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum））、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）（Ｌｂ．ラムノサス（Lb. rhamnosus））、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）（Ｌｂ．プランタルム（Lb. plantarum）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）（Ｌｂ．アシドフィルス（Lb. acidophilus））、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）（Ｌｂ．カゼイ（Lb. casei））、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）クレモリス（cremoris）亜株又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。さらに具体的には、非好塩性乳酸菌は、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）である。
別の特定の態様によれば、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌で発酵させることを含み得る。例えば、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌で順次発酵させることを含み得る。特に、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母で発酵させ、それに続いて肉ベースの加水分解物を非好塩性乳酸菌で発酵させることを含み得る。代わりに、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性乳酸菌で発酵させ、それに続いて肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母で発酵させることを含み得る。特に、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性乳酸菌で発酵させ、それに続いて肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母で発酵させることを含み得、非好塩性乳酸菌は、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）であり得、非好塩性酵母は、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）であり得る。
別の特定の態様によれば、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌の同時接種で発酵させることを含み得る。非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌は、上述したようなものであり得る。特に、非好塩性乳酸菌は、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）であり得、非好塩性酵母は、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）であり得る。
発酵させることは、肉ベースの加水分解物を適量の非好塩性微生物で発酵させることを含み得る。特定の態様によれば、発酵させることは、非好塩性微生物を添加して、発酵中に少なくとも１対数ＣＦＵ／ｍＬの微生物の増加した生存数を得ることを含み得る。例えば、添加される非好塩性微生物の量は、少なくとも４対数ＣＦＵ／ｍＬであり得る。特に、添加される非好塩性微生物の量は、約５～８対数ＣＦＵ／ｍＬ、６～７対数ＣＦＵ／ｍＬであり得る。さらに具体的には、非好塩性酵母の添加量は、５～６対数ＣＦＵ／ｍＬであり得る。さらに具体的には、添加される非好塩性乳酸菌の量は、６～７対数ＣＦＵ／ｍＬであり得る。
発酵させることは、適切な条件下で肉ベースの加水分解物を発酵させることを含み得る。発酵させることは、肉ベースの加水分解物を適切な期間にわたって発酵させることを含み得る。例えば、発酵させることは、肉ベースの加水分解物を１～２０日間にわたって発酵させることを含み得る。特に、発酵させることは、２～１８日間、３～１５日間、５～１２日間、７～１０日間、８～９日間にわたって発酵させることを含み得る。
特定の態様によれば、非好塩性微生物が非好塩性酵母である場合、発酵させることは、１～２０日間にわたるものであり得る。特に、発酵させることは、２～１８日間、３～１５日間、４～１４日間、５～１２日間、６～１１日間、７～１０日間、８～９日間にわたるものであり得る。
特定の態様によれば、非好塩性微生物が非好塩性乳酸菌である場合、発酵させることは、１～７日間にわたるものであり得る。特に、発酵させることは、１～６日間、２～５日間、３～４日間にわたるものであり得る。さらに具体的には、発酵させることは、１～５日間にわたるものであり得る。
特定の態様によれば、非好塩性微生物が非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌である場合、発酵させることは、１～２５日間にわたるものであり得る。特に、発酵させることが、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌で順次発酵させることを含む場合、発酵させることは、２～２５日間にわたるものであり得る。例えば、発酵させることは、３～２２日間、５～２０日間、６～１８日間、７～１５日間、８～１２日間にわたるものであり得る。さらに具体的には、発酵させることは、６～７日間にわたるものであり得る。
肉ベースの加水分解物発酵させることが非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌の同時接種を含む場合、発酵させることは、１～２０日間にわたるものであり得る。例えば、発酵させることは、２～１８日間、３～１５日間、４～１４日間、５～１２日間、６～１１日間、７～１０日間、８～９日間にわたるものであり得る。さらに具体的には、発酵させることは、５～６日間にわたるものであり得る。
発酵させることは、肉ベースの加水分解物を適切な期間、温度で発酵させることを含み得る。例えば、発酵させることは、１５～４５℃の温度で発酵させることを含み得る。
特定の態様によれば、非好塩性微生物が非好塩性酵母である場合、発酵させることは、１５～４０℃の温度で行われ得る。例えば、発酵させることは、１７～３８℃、１８～３５℃、２０～３２℃、２２～３０℃、２５～２８℃の温度で行われ得る。さらに具体的には、温度は、２０～３５℃であり得る。
別の特定の態様によれば、非好塩性微生物が非好塩性乳酸菌である場合、発酵させることは、１５～４５℃の温度で行われ得る。例えば、発酵させることは、１６～４０℃、１７～３８℃、１８～３５℃、２０～３２℃、２２～３０℃、２５～２８℃の温度で行われ得る。さらに具体的には、温度は、２５～４０℃であり得る。
発酵させることは、肉ベースの加水分解物に発酵性糖を添加することをさらに含み得る。発酵性糖は、任意の適切な発酵性糖であり得る。例えば、発酵性糖は、グルコース、フルクトース、ラクトース又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。任意の適量の発酵性糖が付加され得る。例えば、添加される発酵性糖の量は、発酵性糖と肉ベースの加水分解物との総重量に基づいて０．５～５重量％であり得る。特に、発酵性糖類の添加量は、０．５～５重量％、１～４重量％、２～３重量％であり得る。さらに具体的には、量は、グルコースと肉ベースの加水分解物との総重量に基づいて１～２重量％であり得る。
特定の態様によれば、方法は、非好塩性微生物を添加する前に肉ベースの加水分解物を熱処理することをさらに含み得る。例えば、熱処理することは、肉ベースの加水分解物の穏やかな低温殺菌又は滅菌を含み得る。熱処理することは、肉ベースの調味料の貯蔵寿命を延長し得、肉ベースの加水分解物を形成する方法中の汚染の危険を低減し得る。特に、熱処理することは、非好塩性微生物を添加する前に望ましくない微生物を除去し得る。
熱処理することは、適切な条件下で実行され得る。例えば、熱処理することは、約６０～９０℃の温度で実行され得る。特に、温度は、約８０～９０℃であり得る。さらに具体的には、温度は、約８５℃であり得る。
熱処理することは、適切な期間にわたって実行され得る。熱処理が行われる時間は、熱処理が行われる温度に依存し得る。例えば、熱処理することは、１０～４５分間にわたるものであり得る。特に、熱処理することは、約１５～２０分間にわたるものであり得る。さらに具体的には、熱処理することは、約１５分間にわたるものであり得る。
この方法は、非好塩性微生物を添加する前に、特に肉ベースの加水分解物が上記のように熱処理を受ける場合に肉ベースの加水分解物を冷却することをさらに含み得る。特に、冷却は、肉ベースの加水分解物を例えば約２５℃などの周囲温度に冷却することを含み得る。
別の特定の態様によれば、方法は、発酵させることの前に、肉ベースの混合物を酵素の存在下で加水分解して、肉ベースの加水分解物を形成することをさらに含み得る。
酵素は、任意の適切な加水分解酵素であり得る。例えば、酵素は、プロテアーゼであり得るが、これに限定されるものではない。
肉ベースの混合物は、適量の肉副産物と蒸留水とを混合することによって形成され得る。例えば、肉ベースの混合物は、肉副産物と蒸留水とを１：２の重量比で混合することによって形成され得る。
加水分解することは、任意の適当な条件下で行われ得る。例えば、加水分解することは、適切なｐＨ及び温度で行われ得る。
特に、加水分解することは、５．５～７．５のｐＨで行われ得る。さらに具体的には、ｐＨは、約５．５～６．５であり得る。適量の酸を加えることによってｐＨが調整され得る。例えば、酸は、食品等級の酸であり得る。特に、酸は、乳酸であり得る。
特に、加水分解することは、４５～６０℃の温度で行われ得る。さらに具体的には、温度は、約４５～５５℃であり得る。
加水分解することは、適切な期間にわたって行われ得る。例えば、加水分解することは、３～８時間にわたって行われ得る。特に、加水分解することは、３～８時間、４～７時間、５～６時間にわたって行われ得る。さらに具体的には、加水分解することは、４～６時間にわたるものであり得る。加水分解することは、酵素を不活性化させることによって終了され得る。不活性化は、任意の適切な手段で行われ得る。
方法は、発酵させることに続いて、肉ベースの調味料を熱処理することをさらに含み得る。熱処理することは、適切な条件下で行われ得る。特に、熱処理することは、メイラード反応によるものであり得る。
特定の態様によれば、熱処理することは、適切な温度におけるものであり得る。例えば、熱処理することは、９０～１２１℃の温度におけるものであり得る。特に、熱処理することは、約９５～１２０℃、９８～１１５℃、１００～１１２℃、１０５～１１０℃、１０６～１０８℃の温度におけるものであり得る。さらに具体的には、温度は、９０～１００℃であり得る。
熱処理することは、適切な期間にわたって行われ得る。例えば、熱処理することは、３０～１２０分間にわたるものであり得る。特に、熱処理することは、約３５～１１５分間、４０～１１０分間、４５～１００分間、５０～９０分間、５５～７５分間、６０～７０分間にわたるものであり得る。さらに具体的には、熱処理することは、４５～６０分間にわたるものであり得る。
熱処理することは、肉ベースの調味料上において適切なｐＨで実施され得る。例えば、肉ベースの調味料は、４～６のｐＨであり得る。特に、ｐＨは、５．２～５．５であり得る。
熱処理することは、肉ベースの加水分解物中のヘキサナールなどの優勢なオフフレーバー化合物を除去し得る。熱処理の高温は、揮発性化合物の発生を促進し得、これは、熱処理された肉ベースの調味料にロースト感及び甘い風味を与え得る。
本発明の方法の概略図を図１に示す。特に、図１は、肉ベースの混合物を加水分解して肉ベースの加水分解物を形成することと；肉ベースの加水分解物を発酵させて肉ベースの調味料を形成することと；肉ベースの調味料を熱処理することとを含む、肉ベースの調味料を形成する一般的な方法を示す。
本発明の特定の実施形態による加水分解、発酵及び熱処理は、それぞれ図２、３及び４に概略的に示す。
本発明による方法は、低廃棄物法であり得る。換言すれば、この方法は、廃棄物をほとんど生成せず、同時に肉ベースの調味料を調製する際に廃棄物の肉副産物をアップサイクルする。したがって、本発明の方法は、肉副産物の無駄の問題を克服し、食品の無駄を低減し、さらに付加価値のある機能的な食品を形成する。この方法は、簡単でもあり、高価な溶剤を使用しないために方法のスケールアップが容易である。
さらに、この方法は、ときに数ヶ月間の発酵を伴うこともある従来技術の方法と比較して発酵時間の短縮をもたらす。特に、非好塩性微生物発酵は、最小限の化学物質、反応時間を必要とし、副産物をほとんど生成しない。
第２の態様によれば、本発明は、第１の態様の方法から調製される、肉ベースの調味料を提供する。
第３の態様によれば、１０～４５ｍｇ／ｍＬの遊離アミノ酸を含む、肉ベースの調味料も提供される。例えば、肉ベースの調味料は、１５～４０ｍｇ／ｍＬ、２０～３５ｍｇ／ｍＬ、２２～３０ｍｇ／ｍＬ、２５～２８ｍｇ／ｍＬの遊離アミノ酸を含み得る。特に、肉ベースの調味料は、３０～４０ｍｇ／ｍＬの遊離アミノ酸を含み得る。さらに具体的には、肉ベースの調味料は、３５ｍｇ／ｍＬの遊離アミノ酸を含み得る。
本発明の目的では、遊離アミノ酸は、消化の必要がなく、体内への吸収がより可能な単一アミノ酸として定義される。さらに、遊離アミノ酸は、タンパク質発生の準備ができていてもよい。
本発明による肉ベースの調味料は、低ナトリウム含有量を有し得る。例えば、肉ベースの調味料のナトリウム含有量は、２重量％以下であり得る。
特定の態様によれば、肉ベースの調味料は、低炭水化物含有量を有し得る。例えば、肉ベースの調味料の炭水化物含有量は、１重量％以下であり得る。
ナトリウム及び／又は炭水化物の含有量が少なく、遊離アミノ酸の含有量が高いという観点から、肉ベースの調味料は、非常に健康的であり、人体の吸収のための優れた栄養を提供する。
ここで、本発明を一般的に説明したが、これは、例示として提供され、限定することを意図しない以下の実施形態を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
実施例
実施例１ － 豚肉切り落としからの肉加水分解物の製造
酵素加水分解のプロセスを図２に概略的に示す。解凍したみじん切り豚生肉切り落としをデュラン（登録商標）ラボラトリーボトル（メルク、独国）内で蒸留水に懸濁（１：２、ｗ／ｖ）した。均質化した後、混合物を最初に水浴（ＳＷ２２、ユラボ（登録商標）、独国）に３０分間入れて、所望の温度に到達させた。次に、１Ｍ乳酸（メルク、独国）又は１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（メルク、独国）溶液を使用して、混合物をこの温度で所望のｐＨに調整した。引き続いて、各ボトルに１種類のプロテアーゼを特定の酵素／基質比に従って添加し、即座に均質化した。次に、均質化した全てのボトルを水浴に戻し、２００ｒｐｍの振盪速度で６時間インキュベートした。表１は、予備的な実験結果に従った各酵素のインキュベーション要素の選択を示す。
実施例１ － 豚肉切り落としからの肉加水分解物の製造
酵素加水分解のプロセスを図２に概略的に示す。解凍したみじん切り豚生肉切り落としをデュラン（登録商標）ラボラトリーボトル（メルク、独国）内で蒸留水に懸濁（１：２、ｗ／ｖ）した。均質化した後、混合物を最初に水浴（ＳＷ２２、ユラボ（登録商標）、独国）に３０分間入れて、所望の温度に到達させた。次に、１Ｍ乳酸（メルク、独国）又は１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（メルク、独国）溶液を使用して、混合物をこの温度で所望のｐＨに調整した。引き続いて、各ボトルに１種類のプロテアーゼを特定の酵素／基質比に従って添加し、即座に均質化した。次に、均質化した全てのボトルを水浴に戻し、２００ｒｐｍの振盪速度で６時間インキュベートした。表１は、予備的な実験結果に従った各酵素のインキュベーション要素の選択を示す。
加水分解プロセス中、約３．０ｍＬの加水分解物を取り出して新しいチューブに入れ、即座に８５℃の水浴に１５分間入れて（Nilsang et al., 2005）、０、１、２、３、４、５及び６時間の時間間隔で酵素反応を終了させた。各時点で得られた加水分解物を加水分解度（ＤＨ）について分析し、最終的な加水分解物生成物をタンパク質回収率（ＰＲ）についてさらに判定した。
加水分解度及びタンパク質回収率の判定
各サンプルのＤＨは、以下の式に従い、α－アミノ窒素（ＡＮ）と総窒素（ＴＮ）との関係を使用して計算した。
各サンプルのＤＨは、以下の式に従い、α－アミノ窒素（ＡＮ）と総窒素（ＴＮ）との関係を使用して計算した。
加水分解物中に存在するα－アミノ窒素の量は、修正ホルムアルデヒド滴定法によって判定した（Nilsang et al., 2005）。可溶性画分の体積を記録して、上清中の総タンパク質を、ケルダール法ＰＲ（％）を用い、以下の式を使用して計算した。
最適化のための実験設計
ボックス－ベンケン設計を採用し、豚肉の加水分解によるアミノ酸の放出を最適化した。判定されたパラメーター及びレベルを表２に示す。
ボックス－ベンケン設計を採用し、豚肉の加水分解によるアミノ酸の放出を最適化した。判定されたパラメーター及びレベルを表２に示す。
応答曲面法（ＲＳＭ）法を適用して、３つの変数の最適レベルを同定した。検討した３つの変数は、温度（Ａ）、Ｅ／Ｓ比（Ｂ）及びｐＨ（Ｃ）であった。独立変数の組み合わせの応答曲面としてＤＨを選択した。最適化式を簡略化するため、表２のＥ／Ｓ比（Ｂ）は、％（酵素／基質：ｗ／ｗ）として計算した。推定された応答曲面ＤＨは、以下の２次方程式によって記述され得ると仮定される（Dey & Dora, 2014）。
式中、Ｙは、従属変数（ＤＨ）であり、β０は、定数であり、βｉ、βｉｉ、βｉｊは、モデルによって推定される係数である。Ｘｉ及びＸｊは、独立変数のレベルである。これらは、応答に対するＡ、Ｂ及びＣ因子の線形効果、二次効果及び外積効果をそれぞれ表す。モデルは、応答に対する各独立変数の効果を評価した。
アミノ酸組成
酵素加水分解によって生成されたサンプルの遊離アミノ酸組成は、１５０×３．９ｍｍ寸法のWaters AccO-Tag Nova-Pak C18カラム、Ｃ１８が結合した直径４μｍの粒度を有するシリカベースの充填剤を使用して実施されたＨＰＬＣによって定量化した。ウォーターズAccQ-Tagウルトラケミストリーキット（ダブリン、アイルランド）を使用して、６－アミノキノリル－Ｎヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いたアミノ基のプレカラム誘導体化を実施した。誘導体化されたアミノ酸のＨＰＬＣ分析を実施した。
酵素加水分解によって生成されたサンプルの遊離アミノ酸組成は、１５０×３．９ｍｍ寸法のWaters AccO-Tag Nova-Pak C18カラム、Ｃ１８が結合した直径４μｍの粒度を有するシリカベースの充填剤を使用して実施されたＨＰＬＣによって定量化した。ウォーターズAccQ-Tagウルトラケミストリーキット（ダブリン、アイルランド）を使用して、６－アミノキノリル－Ｎヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いたアミノ基のプレカラム誘導体化を実施した。誘導体化されたアミノ酸のＨＰＬＣ分析を実施した。
豚肉切り落としの酵素加水分解のためのプロテアーゼの評価
加水分解中のＤＨの推移及び４種類のプロテアーゼによる６時間の加水分解後のＰＲを図５に提示する。図５（ａ）に示すように、６時間の加水分解後、フレーバーザイムを用いて加水分解した豚肉のＤＨが４５．４９％と最も高く、他のプロテアーゼのＤＨよりも有意に（Ｐ＜０．０５）高く、アルカラーゼ、プロタメックス及びニュートラーゼがそれぞれ２５．４０％、２０．１２％及び１９．２７％のＤＨでそれに続いた。図５（ａ）は、全ての酵素のＤＨが経時的に増加したことも示すが、フレーバーザイムを除いて、加水分解後の段階で増加の速度が遅くなった。各サンプリング点において、フレーバーザイムのＤＨは、プロセス全体を通して残りの酵素のＤＨよりも有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。
加水分解中のＤＨの推移及び４種類のプロテアーゼによる６時間の加水分解後のＰＲを図５に提示する。図５（ａ）に示すように、６時間の加水分解後、フレーバーザイムを用いて加水分解した豚肉のＤＨが４５．４９％と最も高く、他のプロテアーゼのＤＨよりも有意に（Ｐ＜０．０５）高く、アルカラーゼ、プロタメックス及びニュートラーゼがそれぞれ２５．４０％、２０．１２％及び１９．２７％のＤＨでそれに続いた。図５（ａ）は、全ての酵素のＤＨが経時的に増加したことも示すが、フレーバーザイムを除いて、加水分解後の段階で増加の速度が遅くなった。各サンプリング点において、フレーバーザイムのＤＨは、プロセス全体を通して残りの酵素のＤＨよりも有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。
さらに、図５（ｂ）は、フレーバーザイムが６時間の加水分解後に５５．８７％の最高のＰＲを達成し、プロタメックス、アルカラーゼ及びニュートラーゼがそれぞれ５５．５０％、５３．００％及び５１．７５％でそれに続いたことを示す。しかし、４種類のプロテアーゼ間でＰＲに有意差はなかった（Ｐ≧０．０５）。ＲＳＭを用いてアミノ酸が豊富な豚肉加水分解物を生成するために、フレーバーザイムを選択した。
ＲＳＭ用いた豚肉切り落としの加水分解の最適化
図５に示すように、フレーバーザイムは、豚肉切り落としの加水分解で最高のＤＨを得るのに最も適したプロテアーゼである。したがって、ＲＳＭをこのプロテアーゼに適用し、ＤＨを表３の独立変数を組み合わせる際の応答因子として選択した。
図５に示すように、フレーバーザイムは、豚肉切り落としの加水分解で最高のＤＨを得るのに最も適したプロテアーゼである。したがって、ＲＳＭをこのプロテアーゼに適用し、ＤＨを表３の独立変数を組み合わせる際の応答因子として選択した。
各実験の実行は、応答の系統的エラーを低減するためにランダムな順序で独立して実施した。以下の二次モデルは、得られた実験データを分析することによって生成された。
Ｙ＝４７．７７＋０．８７１３Ａ＋１．６８Ｂ＋０．９４７５Ｃ－０．７２５ＡＢ＋０．３６７５ＡＣ－０．７４２５ＢＣ－２．９７Ａ２－３．８８Ｂ２－４．２２Ｃ２ （４）
Ｙ＝４７．７７＋０．８７１３Ａ＋１．６８Ｂ＋０．９４７５Ｃ－０．７２５ＡＢ＋０．３６７５ＡＣ－０．７４２５ＢＣ－２．９７Ａ２－３．８８Ｂ２－４．２２Ｃ２ （４）
式は、補正決定係数（Ｒａｄｊ
２）が０．９６４４であることから、実験から得られたデータと良好な適合性を示し、この式が本研究の変動の９６．４４％を説明できることが示唆された。モデルの分散分析（ＡＮＯＶＡ）を表４に示す。
モデルのＰ（確率）値は、有意に（Ｐ＜０．０００１）低く、有意でない（Ｐ＝０．６２２５）適合性の欠如があった。判定された係数（Ｒ２＝０．９８４４）は、ＡＮＯＶＡの結果に基づく低い実験誤差を反映し、望ましいものであった。酵素と基質との比率（Ｂ）は、最大ＤＨを得るのに最も重要な影響を有し、温度（Ａ）及びｐＨ（Ｃ）もＤＨに著しく影響した。さらに、二次項（Ａ２、Ｂ２及びＣ２）は、ＤＨに大きい影響を及ぼした。
採用された最適条件は、５０．６４℃の温度（Ａ）、６．５８（ｗ／ｗ）の酵素／基質比（Ｂ）及び６．１０のｐＨ（Ｃ）であった。この条件下で予測される最大ＤＨは、４８．０４％である。さらに、実験から得られた最大ＤＨは、モデルの予測値に非常に近い値である４８．７９％であった。全体として、この有意に（Ｐ＜０．００１）適合したモデルは、表４に見られるように、酵素加水分解は、添加した酵素の用量に大きく依存し、次に反応ｐＨ及び温度に依存することを示唆した。
豚肉切り落とし及び加水分解物のアミノ酸プロファイル
凍結乾燥豚生肉切り落とし（０時間）、凍結乾燥非酵素処理対照Ａ（水浴中６時間、ただし８５℃、１５分間熱処理なし）、凍結乾燥非酵素処理対照Ｂ（水浴中６時間、８５℃、１５分間熱処理）及び酵素加水分解物（６時間）のアミノ酸組成を表５に示す。
凍結乾燥豚生肉切り落とし（０時間）、凍結乾燥非酵素処理対照Ａ（水浴中６時間、ただし８５℃、１５分間熱処理なし）、凍結乾燥非酵素処理対照Ｂ（水浴中６時間、８５℃、１５分間熱処理）及び酵素加水分解物（６時間）のアミノ酸組成を表５に示す。
サンプルについて、１９種類のアミノ酸を測定した。全てのアミノ酸は、６時間の酵素加水分解後、生サンプル及び非酵素処理対照サンプルと比較して約２０倍だけ有意に（Ｐ＜０．０５）増加した一方、生サンプル及び対照サンプルの大多数は、互いにほとんど違いを示さなかった（Ｐ≧０．０５）。これらは、フレーバーザイム加水分解が、タンパク質分解の加速に好ましい効果を有することを示す。得られた結果は、酵素的タンパク質分解が、ペプチド及び遊離アミノ酸を含む低分子量窒素化合物を大量に生成し得ることを立証する。イソロイシン＋ロイシン（１５．７９％）、リジン（９．４０％）、バリン（５．９５％）、フェニルアラニン（５．７８％）及びメチオニン（４．９２％）などの必須アミノ酸は、検出された全てのアミノ酸の４１．８４％を占め、ＦＡＯ／ＷＨＯ（１９９０）が推奨する乳幼児の基準値（４０％）さえ超える。
表５に見られるように、得られた加水分解物は、グルタミン酸（８．４４％）、アスパラギン酸（４．７６％）、グリシン（１．９７％）、アラニン（５．０１％）などの呈味性アミノ酸を高濃度で有し、それらは、総アミノ酸の２０．１８％を占めていた。加水分解物の総アミノ酸の９．３３％を構成するアルギニンは、タンパク質合成及びエネルギー変換を含む多くの生理学的代謝を伴うため、条件付き必須アミノ酸として分類される（Morris, 2005）。ヒスチジン及びグルタミン（７．６９％）、トリプトファン（２．００％）並びにメチオニン（４．９２％）は、α－トコフェロールとの相乗効果を有する顕著な抗酸化活性を示すことも報告された（Zhang et al., 2017）。しかし、含硫アミノ酸であるシスチンは、総アミノ酸中で最も少ない百分率（０．５７％）を占めていた。
要約すると、豚肉切り落としの加水分解における４種類の微生物プロテアーゼの有効性が検討され、フレーバーザイムが最も高い加水分解度（ＤＨ）を提供することが示された。ＤＨは、酵素／基質比、温度、ｐＨ及び反応時間を含む加水分解条件によって著しく影響された。フレーバーザイムのＲＳＭを用いて得られた最適条件は、６時間の加水分解で酵素／基質比、温度及びｐＨがそれぞれ６．５８（ｗ／ｗ）、５０．６４℃及び６．１０であり、最大ＤＨである４８．０４％がもたらされた。遊離アミノ酸に富む豚加水分解物は、食品香料及び／又は栄養補助食品に加工され得、食品産業における切り落としなどの豚肉副産物の効果的な価値化を可能にする。
実施例２ － 酵母を用いた肉加水分解物の発酵
発酵プロセスを図３に概略的に示す。
発酵プロセスを図３に概略的に示す。
酵母株及び培養培地
４つの酵母株を使用した。カンジダ・バーサチルス（Candida versatilis）ＮＣＹＣ１４３３は、イーストカルチャーナショナルコレクション（ノリッジ、英国）から購入し；トルラスポラ・デルブルツキ（Torulaspora delbrueckii）プレリュード、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）MERIT.ferm及びピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）フロートゼンは、クリスチャンハンセン（ヘルスホルム、デンマーク）から入手した。ｐＨ５．０であり、１％グルコース、０．５％細菌ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキスを含有する２０ｍＬの滅菌酵母麦芽（ＹＭ）ブロスに白金耳２つ分の凍結乾燥酵母を移し入れた。接種した酵母を３０℃で４８時間、静置培養した。滅菌グリセロール（メルク、シンガポール）を各培養物に添加して、３０重量％の最終グリセロール濃度を得て、培養物を使用前に－８０℃で保存した。
４つの酵母株を使用した。カンジダ・バーサチルス（Candida versatilis）ＮＣＹＣ１４３３は、イーストカルチャーナショナルコレクション（ノリッジ、英国）から購入し；トルラスポラ・デルブルツキ（Torulaspora delbrueckii）プレリュード、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）MERIT.ferm及びピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）フロートゼンは、クリスチャンハンセン（ヘルスホルム、デンマーク）から入手した。ｐＨ５．０であり、１％グルコース、０．５％細菌ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキスを含有する２０ｍＬの滅菌酵母麦芽（ＹＭ）ブロスに白金耳２つ分の凍結乾燥酵母を移し入れた。接種した酵母を３０℃で４８時間、静置培養した。滅菌グリセロール（メルク、シンガポール）を各培養物に添加して、３０重量％の最終グリセロール濃度を得て、培養物を使用前に－８０℃で保存した。
酵母を用いた肉加水分解物の発酵
解凍した肉加水分解物にグルコース（Ｄ－（＋）－グルコース一水和物、９９．０％以上、メルク、シンガポール）を２％（ｗ／ｗ）の比率で添加し、１Ｍの乳酸を使用して肉加水分解物の最終ｐＨを４．５±０．０５に調整した。次に、混合物を８５℃で１５分間低温殺菌して室温まで冷却し、接種前にプレーティングすることによって低温殺菌の有効性を検証した。
解凍した肉加水分解物にグルコース（Ｄ－（＋）－グルコース一水和物、９９．０％以上、メルク、シンガポール）を２％（ｗ／ｗ）の比率で添加し、１Ｍの乳酸を使用して肉加水分解物の最終ｐＨを４．５±０．０５に調整した。次に、混合物を８５℃で１５分間低温殺菌して室温まで冷却し、接種前にプレーティングすることによって低温殺菌の有効性を検証した。
解凍した酵母培養物を１０％（ｖ／ｖ）のＹＭブロスに移し入れ、３０℃で４８時間静置培養した。同じ方法を用いて別の継代培養を行い、得られた酵母培養物を８０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、５ｍＬの０．８５重量％食塩水を使用してペレットを２回洗浄した。
引き続いて、各酵母ペレットを低温殺菌した肉加水分解物に再懸濁して、適切な細胞濃度（１０５～１０６ＣＦＵ／ｍＬ）に調整した。次に、再懸濁した各酵母培養物３ｍＬを、低温殺菌した肉加水分解物３０ｍＬに添加して、１０５ＣＦＵ／ｍＬの最終接種細胞数を得て、完全に混合した。接種した食肉加水分解物サンプルは、定期的にサンプリングを行いながら、３０℃で１５日間静置培養した。未接種の低温殺菌肉加水分解物を同一条件下でインキュベートし、対照として供した。採取したサンプルは、分析前に－２０℃で保存した。
酵母計数及びｐＨ測定
細胞計数は、０．１％（ｗ／ｖ）滅菌ペプトン水（オクソイド、ベイジングストーク、英国）で連続希釈して、ポテトデキストロース寒天培地（オクソイド、ベイジングストーク、英国）にスプレッドプレーティングして実施した。５日間培養した１４３３株を除いて、全てのプレートを３０℃で４８時間培養した。ｐＨは、ｐＨメーター（メトローム、ヘリザウ、スイス）を用いて測定した。
細胞計数は、０．１％（ｗ／ｖ）滅菌ペプトン水（オクソイド、ベイジングストーク、英国）で連続希釈して、ポテトデキストロース寒天培地（オクソイド、ベイジングストーク、英国）にスプレッドプレーティングして実施した。５日間培養した１４３３株を除いて、全てのプレートを３０℃で４８時間培養した。ｐＨは、ｐＨメーター（メトローム、ヘリザウ、スイス）を用いて測定した。
総還元糖及び有機酸の分析
対照及び発酵サンプルの総還元糖含有量は、いくつかの修正を加えた３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法（Wood et al., 2012）を用いて判定した。１０μＬの発酵サンプル及び１９０μＬのＤＮＳ試薬を遠心分離管（メルク、シンガポール）内で均等に混合した。その後、チューブを沸騰水浴中で５分間加熱し、アイスボックス内で冷却した。反応したサンプルの１００μＬを９６マイクロタイタープレートにピペットで移し、５４０ｎｍで読み取った。
対照及び発酵サンプルの総還元糖含有量は、いくつかの修正を加えた３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法（Wood et al., 2012）を用いて判定した。１０μＬの発酵サンプル及び１９０μＬのＤＮＳ試薬を遠心分離管（メルク、シンガポール）内で均等に混合した。その後、チューブを沸騰水浴中で５分間加熱し、アイスボックス内で冷却した。反応したサンプルの１００μＬを９６マイクロタイタープレートにピペットで移し、５４０ｎｍで読み取った。
発酵肉ソースの有機酸抽出物は、Toh and Liu (2017)に記載されている方法を使用して調製した。遠心分離管内において、サンプルに０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４のアリコートを１：１（ｖ／ｖ）の比率で添加し、４℃で１時間保存してタンパク質を沈殿させた。チューブを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による有機酸分析は、スペルコゲルＣ－６１０Ｈカラム（スペルコ、ベルフォンテ、ペンシルベニア州、米国）を使用して実施した。移動相は、０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４であり、４０℃で０．４ｍＬ／分の流量に設定した（Lee et. al., 2013）。有機酸化合物は、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ光ダイオードアレイ検出器（島津製作所、京都、日本）内で２１０ｎｍで検出し、外部標準を用いて定量化した。
遊離アミノ酸の分析
発酵肉ソースの遊離アミノ酸は、アクリロニトリル（ＡＣＮ）（メルク、シンガポール）を使用して抽出し、タンパク質を沈殿させた。６００μＬのＡＣＮ、２００μＬの蒸留水及び２００μＬのサンプルを遠心分離管内で混合し、４℃で少なくとも１時間保存した。サンプルを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。ウォーターズAccQ-Tagウルトラケミストリーキット（ダブリン、アイルランド）を使用して、６－アミノキノリル－Ｎヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いたアミノ基のプレカラム誘導体化を実施した。誘導体化されたアミノ酸のＨＰＬＣ分析を実施した。アミノ酸標準混合物（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を同定及び定量に使用した。
発酵肉ソースの遊離アミノ酸は、アクリロニトリル（ＡＣＮ）（メルク、シンガポール）を使用して抽出し、タンパク質を沈殿させた。６００μＬのＡＣＮ、２００μＬの蒸留水及び２００μＬのサンプルを遠心分離管内で混合し、４℃で少なくとも１時間保存した。サンプルを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。ウォーターズAccQ-Tagウルトラケミストリーキット（ダブリン、アイルランド）を使用して、６－アミノキノリル－Ｎヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いたアミノ基のプレカラム誘導体化を実施した。誘導体化されたアミノ酸のＨＰＬＣ分析を実施した。アミノ酸標準混合物（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を同定及び定量に使用した。
揮発性化合物の分析
発酵肉ソース中の揮発性化合物の抽出と分析は、修正されたプロトコル（Vong and Liu, 2017）を使用して実施した。抽出前にサンプルを解凍し、６０℃の水浴内で２分間熱処理した。揮発性化合物は、ガスクロマトグラフィー質量分析計と組み合わせたヘッドスペース固相マイクロ抽出法（ＨＳ－ＳＰＭＥ）で抽出し、火炎イオン化検出器（ＧＣ－ＭＳ／ＦＩＤ）で半定量化した。
発酵肉ソース中の揮発性化合物の抽出と分析は、修正されたプロトコル（Vong and Liu, 2017）を使用して実施した。抽出前にサンプルを解凍し、６０℃の水浴内で２分間熱処理した。揮発性化合物は、ガスクロマトグラフィー質量分析計と組み合わせたヘッドスペース固相マイクロ抽出法（ＨＳ－ＳＰＭＥ）で抽出し、火炎イオン化検出器（ＧＣ－ＭＳ／ＦＩＤ）で半定量化した。
５ｍＬのサンプルをポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）中隔付きの２０ｍＬガラスバイアルに入れた。８５μｍのカルボキセン／ポリジメチルシロキサンＳＰＭＥファイバー（ＣＡＲ／ＰＤＭＳ、スペルコ、ベルフォンテ、ペンシルベニア州、米国）を用いて、コンビパルオートサンプラー（ＣＴＣアナリティクス、ツヴィンゲン、スイス）を使用して２５０ｒｐｍの撹拌下で６０℃３０分間、ヘッドスペース揮発性有機物を抽出した。抽出化合物は、ＤＢ－ＦＦＡＰキャピラリーカラム（長さ６０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ、アジレント、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）上でヘリウムをキャリアガスとして用い、流速１．２ｍＬ／ｍｉｎで分離した（アジレント５９７５Ｃ三軸ＭＳ及びＦＩＤ）。分離条件（Gao et al., 2016）：オーブンの初期温度を４０℃で３分間設定し、次に保持せずに毎分５℃の速度で９０℃に上昇させ、保持時間７分間で毎分１０℃の速度で２３０℃に上昇させる。
化合物の同定は、それらの質量スペクトルと、NIST 8.0及びWiley 275 MSライブラリのデータベースとの比較に基づいていた。化合物の検証は、それらの線形保持指数（ＬＲＩ）値に基づいていた。各化合物のＬＲＩ値は、その保持時間を用いて計算した。ＧＣ－ＦＩＤのピーク面積を使用して揮発成分を半定量化し、主要な化合物群毎に百分率で表された相対ピーク面積（ＲＰＡ）を計算した。
統計解析
発酵肉ソースの遊離アミノ酸は、アクリロニトリル（ＡＣＮ）（メルク、シンガポール）使用して抽出し、タンパク質を沈殿させた。６００μＬのＡＣＮ、２００μＬの蒸留水及び２００μＬのサンプルを遠心分離管内で混合し、４℃で少なくとも１時間保存した。サンプルを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。
発酵肉ソースの遊離アミノ酸は、アクリロニトリル（ＡＣＮ）（メルク、シンガポール）使用して抽出し、タンパク質を沈殿させた。６００μＬのＡＣＮ、２００μＬの蒸留水及び２００μＬのサンプルを遠心分離管内で混合し、４℃で少なくとも１時間保存した。サンプルを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。
ウォーターズAccQ-Tagウルトラケミストリーキット（ダブリン、アイルランド）を使用して、６－アミノキノリル－Ｎヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いたアミノ基のプレカラム誘導体化を実施した。誘導体化されたアミノ酸のＨＰＬＣ分析を実施した。アミノ酸標準混合物（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を同定及び定量に使用した。
酵母個体数及びｐＨ変化
図６（ａ）に示すように、増殖パターンは、ワイン酵母株プレリュード、メリット及びフロートゼンについて類似しており、総細胞数は、１日目までにそれぞれ約６．０対数ＣＦＵ／ｍＬから７．７１、７．６４及び７．３４対数ＣＦＵ／ｍＬに増加した。その後、細胞数は、１５日目までにそれぞれ５．７６、６．５９及び５．７８対数ＣＦＵ／ｍＬまで徐々に低下した。対照的に、醤油酵母１４３３の細胞数は、３日目までに５．４５対数ＣＦＵ／ｍＬから７．２２対数ＣＦＵ／ｍＬに有意に（Ｐ＜０．０５）増加し、細胞数が６．１０対数ＣＦＵ／ｍＬに減少する５日目まで比較的安定していた。これらの結果は、豚肉加水分解物が、酵母の増殖をサポートするのに十分な量の酵母同化可能窒素及び微量栄養素を含有含していたことを示した。
図６（ａ）に示すように、増殖パターンは、ワイン酵母株プレリュード、メリット及びフロートゼンについて類似しており、総細胞数は、１日目までにそれぞれ約６．０対数ＣＦＵ／ｍＬから７．７１、７．６４及び７．３４対数ＣＦＵ／ｍＬに増加した。その後、細胞数は、１５日目までにそれぞれ５．７６、６．５９及び５．７８対数ＣＦＵ／ｍＬまで徐々に低下した。対照的に、醤油酵母１４３３の細胞数は、３日目までに５．４５対数ＣＦＵ／ｍＬから７．２２対数ＣＦＵ／ｍＬに有意に（Ｐ＜０．０５）増加し、細胞数が６．１０対数ＣＦＵ／ｍＬに減少する５日目まで比較的安定していた。これらの結果は、豚肉加水分解物が、酵母の増殖をサポートするのに十分な量の酵母同化可能窒素及び微量栄養素を含有含していたことを示した。
発酵中の肉ソースのｐＨ変化の時間経過を図６（ｂ）に示す。全てのサンプルのｐＨ値は、わずかに低下したが、発酵全体を通して４．４０～４．５０で変動した。これは、図７に見られるように、少量の酸及びＣＯ２が生成された結果であった。
総還元糖及び有機酸
肉ソース発酵中の総還元糖（主にグルコース）及び有機酸の変化を図７に示す。図７（ａ）に見られるように、全ての酵母発酵サンプルの総還元糖は、２４．３８ｍｇ／ｍＬ（０日目）から１．０ｍｇ／ｍＬ（１５日目）に継続的に減少した。実施例では、肉ソースサンプル中の総還元糖は、主にグルコースであり、これは、酵母の主要な炭素及びエネルギー源として機能した。糖の消費量は、酵母の増殖の速度及び規模を反映していた。糖消費の結果は、図６（ａ）に示される酵母細胞数データと良好に相関しており、そこでは、ワイン酵母は、積極的に糖を消費して、０日目～１日目に最も増殖した一方、醤油酵母の場合、主な糖消費量は、対数期の１日目～５日目に発生した。
肉ソース発酵中の総還元糖（主にグルコース）及び有機酸の変化を図７に示す。図７（ａ）に見られるように、全ての酵母発酵サンプルの総還元糖は、２４．３８ｍｇ／ｍＬ（０日目）から１．０ｍｇ／ｍＬ（１５日目）に継続的に減少した。実施例では、肉ソースサンプル中の総還元糖は、主にグルコースであり、これは、酵母の主要な炭素及びエネルギー源として機能した。糖の消費量は、酵母の増殖の速度及び規模を反映していた。糖消費の結果は、図６（ａ）に示される酵母細胞数データと良好に相関しており、そこでは、ワイン酵母は、積極的に糖を消費して、０日目～１日目に最も増殖した一方、醤油酵母の場合、主な糖消費量は、対数期の１日目～５日目に発生した。
全てのサンプルの有機酸の変化を図７（ｂ）～（ｇ）に示す。クエン酸及び乳酸は、有意な変化を示さなかった（Ｐ＞０．０５）（図７（ｂ）及び（ｆ））一方、リンゴ酸は、１日目までに生成され、安定したままであった（図７（ｃ））。４つの酵母株は、発酵中にピルビン酸（図７（ｄ））及び酢酸（図７（ｇ））を産生する同様の傾向を示し、醤油酵母による酢酸産生は、著しく高かった。コハク酸は、酵母に応じて増加又は減少した（図７（ｅ））。
一貫したピルビン酸の産生は、酵母の継続的な発酵過程を反映し得る。ピルビン酸に由来するアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）＋水素（Ｈ）（ＮＡＤＨ）を再生し、酸化還元の平衡を保つために、エタノールに還元される代わりに、酢酸に酵素的に酸化され得る。図７及び図８に見られるように、４種類の酵母による酢酸及びエタノールの産生量は、逆相関しているように見えた。Ｃ．バーサチルス（C. versatilis）及びＰ．クルイベリ（P. kluyveri）は、より酸化的であり、したがってより多くの酢酸を産生することが知られている。対照的に、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）及びＴ．デルブルツキ（T. delbrueckii）は、より発酵性が高く、より多くのエタノールを産生する。クエン酸、リンゴ酸及びコハク酸は、トリカルボン酸回路（ＴＣＡ回路）の中間体であり、発酵中のそれらの生成は、酵母の生理学的及び酸化還元状態の結果であり得るが、クエン酸に変化はなかった。全体として、有機酸、特に酢酸の生成は、発酵肉ソースの感覚特性に影響を与え得る。
遊離アミノ酸プロファイル
アミノ酸は、発酵肉ソースの味の属性の主要な決定因子であるだけでなく、酵母によって生成される香気化合物の前駆体でもある。そのため、異なるサンプルのアミノ酸プロファイルを判定し、比較した。表６は、対照と、４つの酵母株を用いて発酵させたサンプとのアミノ酸濃度の変化を示す。発酵肉ソースの総遊離アミノ酸濃度は、１５日間の発酵後に有意（Ｐ＜０．０５）に減少した。メリット株を用いて発酵させた肉ソースの総アミノ酸が最も減少してほぼ３分の２だけ減少し、プレリュード株（５０％）及びフロートゼン株（４５％）がそれに続き、１４３３株が最も減少しなかった（３０％）。
アミノ酸は、発酵肉ソースの味の属性の主要な決定因子であるだけでなく、酵母によって生成される香気化合物の前駆体でもある。そのため、異なるサンプルのアミノ酸プロファイルを判定し、比較した。表６は、対照と、４つの酵母株を用いて発酵させたサンプとのアミノ酸濃度の変化を示す。発酵肉ソースの総遊離アミノ酸濃度は、１５日間の発酵後に有意（Ｐ＜０．０５）に減少した。メリット株を用いて発酵させた肉ソースの総アミノ酸が最も減少してほぼ３分の２だけ減少し、プレリュード株（５０％）及びフロートゼン株（４５％）がそれに続き、１４３３株が最も減少しなかった（３０％）。
グリシン（Ｇｌｙ）及びアラニン（Ａｌａ）などの甘味のあるアミノ酸は、対照の総アミノ酸の約６％を占めていた一方、バリン（Ｖａｌ）及びロイシン（Ｌｅｕ）などの苦味のあるアミノ酸は、１７％近くを占めていた。発酵後、これらのアミノ酸の百分率は、全ての酵母でほぼ無変化であった。さらに、酸味及びうま味に寄与するアスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）は、対照及び全ての発酵肉ソースの約１３％を占めていた。従来の調理肉ソースでは、含硫化合物が「ロースト肉感」の香りに貢献するために特に重要である。これらの肉様の風味化合物を生成する主な経路は、システイン（Ｃｙｓ）及びメチオニン（Ｍｅｔ）などの含硫アミノ酸と還元糖との間のメイラード反応である。Ｃｙｓは、対照サンプル中に低濃度で検出され（５．０９ｍｇ／Ｌ）、全ての酵母で１５日間の発酵後にほぼ半分に減少した。Ｍｅｔの量は、Ｃｙｓ（２１．６３ｍｇ／Ｌ）よりも４倍高く、ワイン酵母によって５０％使用されたが、醤油酵母１４３３は、Ｍｅｔの約３３％のみを使用した。
揮発性化合物
１５日目に酵母１４３３、プレリュード、メリット及びフロートゼンで発酵させた対照及び肉ソースから、それぞれ合計１７及び３４種類、３０、３７、３０種類の揮発性化合物が同定された。揮発性化合物は、図８に示すように、酸、エタノール、アルコール（エタノールを除く）、アルデヒド、ケトン、エステル及びフランの７つのグループに分類される。
１５日目に酵母１４３３、プレリュード、メリット及びフロートゼンで発酵させた対照及び肉ソースから、それぞれ合計１７及び３４種類、３０、３７、３０種類の揮発性化合物が同定された。揮発性化合物は、図８に示すように、酸、エタノール、アルコール（エタノールを除く）、アルデヒド、ケトン、エステル及びフランの７つのグループに分類される。
対照中で同定された主な化合物は、アルデヒド及びフランのグループに属し、ＲＰＡは、それぞれ６７．１１％と２４．２１％であった（図８（ｄ）及び（ｇ））。これらの２つのグループ中の優勢な化合物は、それぞれヘキサナール及び２－ペンチルフランであった。ヘキサナールは、脂質の酸化に伴う青臭さ、薬草様、豆様風味に関連していることが多く、多くの場合に酸敗の始まりと判断される。ヘキサナール並びにペンタナール、ヘプタナール、オクタナール及びノナナールなどの他の脂肪族アルデヒドの優位性は、６時間の酵素加水分解中に起こったであろう肉中の不飽和脂質の酸化に関連している可能性が高かった。しかし、２－ペンチルフランは、哺乳類の代謝によって産生されることが知られているため、豚生肉に自然に存在する可能性が高かった。ヘキサナール及び２－ペンチルフランの優位性は、非発酵豚肉切り落とし加水分解物に、全体的に望ましくない草様及び「ボール紙様」風味を与えた可能性が高かった。
異なる酵母で発酵させた肉ソース間では、揮発性プロファイルに顕著な違いが観察された。一般に、図８に見られるように、発酵後、エタノールと、揮発性酸、他のアルコール及びエステルに属する揮発性化合物とは、有意（Ｐ＜０．０５）に増加した一方、アルデヒド及びフランは、有意に（Ｐ＜０．０５）死去した。アミノ酸の異化作用中、α－ケト酸が生成され、次に脱炭酸されてアルデヒドが形成し、アルコールへの還元及び／又はカルボン酸への酸化がそれに続いたが、醤油酵母ではイソ吉草酸のみが生成した。エステルの増加は、アルコールと活性化酸（アシルＣｏ－Ａｓ）との間の反応に起因する。フランの減少は、主に２－ペンチルフラン化合物の減少と関連していた。
主にエタノール、分岐鎖アルコール及び脂肪族アルコールのアセチルエステル並びに脂肪アシルエステルである多数のエステルが生成された。図８に見られるように、４つの酵母株の中で、フロートゼン株が最も多くのエステルを産生した一方、１４３３株は、最も少ない量を産生した。フロートゼン株によって産生された優勢なエステルには、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル及び酢酸２－フェニルエチルが含まれていた一方、これらのエステルは、１４３３株では微量に検出されるか又は生成されなかった。これらのエステルは、アルコールと、酵母のアルコールアセチルＣｏ－Ａ又は脂肪アシルトランスフェラーゼによって触媒されるアセチルＣｏＡ又は脂肪アシルＣｏＡとの間の縮合によって酵素的に生成され、一般に果物香を付与する。フロートゼン株が産生する強いバナナ様の花様香は、他の酵母と一線を画している。
いくつかのケトンが一部の酵母によって産生され、これらは、酵母によるβ酸化を介した脂肪酸代謝の産物である可能性が高かった。１４３３株が最も多くのケトンを産生した一方、フロートゼン株ではケトンが産生されなかった。アセトンは、主要なケトンであり、１４３３株によってのみ産生された。
要約すると、１種類の醤油酵母（Ｃ．バーサチルス（C. versatilis））と、３種類のワイン酵母（Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｔ．デルブルツキ（T. delbrueckii）及びＰ．クルイベリ（P. kluyveri））とを使用して、豚肉切り落とし加水分解物を発酵させた。全ての酵母が良好に増殖し、豚肉切り落とし加水分解物からのグルコース及び遊離アミノ酸を利用して、心地よいフルーティーな化合物及びエステル化合物を産生した。脂質の酸化から生成される望ましくない異臭のアルデヒドは、ほとんどがアルコールに還元された。特に、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）フロートゼンが顕著に大量のエステルを産生して、非常に強い「バナナ様」の匂いを呈した一方、Ｃ．バーサチルス（C. versatilis）１４３３は、より多くのケトン化合物を産生した。これらの発見は、酵母が新規調味料の生産のための肉加水分解物の効果的な変換体であることを示す。
実施例３ － 乳酸菌（ＬＡＢ）を用いた肉加水分解物の発酵
発酵プロセスを図３に概略的に示す。
発酵プロセスを図３に概略的に示す。
細菌培養及び培地
本研究では、６種類の乳酸菌（ＬＡＢ）株を使用した：ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）ＰＣＣ及びＬｂ．ラムノサス（Lb. rhamnosus）ＧＧは、クリスチャンハンセン（ヘルスホルム、デンマーク）から入手した；Ｌｂ．プランタルム（Lb. plantarum）２９９Ｖは、プロビ（ルンド、スウェーデン）から入手した；ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）クレモリス（cremoris）亜株ＤＳＭ２００６９は、ＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、独国）から購入した；Ｌｂ．アシドフィルス（Lb. acidophilus）ＮＣＦＭは、ダニスコ（コペンハーゲン、デンマーク）から得た；Ｌｂ．カゼイ・シロタ（Lb. casei Shirota）は、ヤクルトプロバイオティック培養乳飲料（ヤクルト本社、日本）から単離した。
本研究では、６種類の乳酸菌（ＬＡＢ）株を使用した：ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）ＰＣＣ及びＬｂ．ラムノサス（Lb. rhamnosus）ＧＧは、クリスチャンハンセン（ヘルスホルム、デンマーク）から入手した；Ｌｂ．プランタルム（Lb. plantarum）２９９Ｖは、プロビ（ルンド、スウェーデン）から入手した；ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）クレモリス（cremoris）亜株ＤＳＭ２００６９は、ＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、独国）から購入した；Ｌｂ．アシドフィルス（Lb. acidophilus）ＮＣＦＭは、ダニスコ（コペンハーゲン、デンマーク）から得た；Ｌｂ．カゼイ・シロタ（Lb. casei Shirota）は、ヤクルトプロバイオティック培養乳飲料（ヤクルト本社、日本）から単離した。
２０ｍＬの滅菌済みデマン・ロゴサ・シャープ（ＭＲＳ）ブロス（オクソイド、ベイジングストーク、英国）に白金耳２つ分の凍結乾燥ＬＡＢ培養物を移し入れ、３７℃で２４時間静置培養した。培養物は、使用前に－８０℃で３０％滅菌グリセロール（メルク、シンガポール）中に保存した。
ＬＡＢを用いた肉加水分解物の発酵
グルコース（２％（ｗ／ｗ）のＤ－（＋）－グルコース一水和物）（９９．０％以上、メルク、シンガポール）を肉加水分解物に添加し、８５℃で１５分間の低温殺菌がそれに続いた。低温殺菌の有効性は、プレーティングによって検証した。各ＬＡＢ培養物を１回活性化し、ＭＲＳブロスで１０％（ｖ／ｖ）の比率で１回継代培養し、３７℃で２４時間培養した。細菌ペレットは、遠心分離（８０００×ｇで５分間、４℃）後、５ｍＬの０．８５重量％生理食塩水で２回洗浄することによって得た。
グルコース（２％（ｗ／ｗ）のＤ－（＋）－グルコース一水和物）（９９．０％以上、メルク、シンガポール）を肉加水分解物に添加し、８５℃で１５分間の低温殺菌がそれに続いた。低温殺菌の有効性は、プレーティングによって検証した。各ＬＡＢ培養物を１回活性化し、ＭＲＳブロスで１０％（ｖ／ｖ）の比率で１回継代培養し、３７℃で２４時間培養した。細菌ペレットは、遠心分離（８０００×ｇで５分間、４℃）後、５ｍＬの０．８５重量％生理食塩水で２回洗浄することによって得た。
細菌ペレットは、５ｍＬの低温殺菌肉加水分解物に再懸濁して、１０７ＣＦＵ／ｍＬの望ましい細胞濃度に調節した。各細菌懸濁液３ｍＬを３０ｍＬの肉加水分解物に接種し、完全に混合した。接種した肉加水分解物は、２４時間毎にサンプリングしながら静的条件下で３７℃において４日間培養した。対照として、未接種肉加水分解物を同一条件下で処理した。発酵サンプルは、分析前に－２０℃で保存した。
細菌計数及びｐＨ測定
細胞計数は、０．１％（ｗ／ｖ）滅菌ペプトン水（オクソイド、ベイジングストーク、英国）で連続希釈して、ポテトデキストロース寒天培地（オクソイド、ベイジングストーク、英国）にスプレッドプレーティングして実施した。全てのプレートは、３０℃で４８時間培養した。ｐＨは、ｐＨメーター（メトローム、ヘリザウ、スイス）を用いて測定した。
細胞計数は、０．１％（ｗ／ｖ）滅菌ペプトン水（オクソイド、ベイジングストーク、英国）で連続希釈して、ポテトデキストロース寒天培地（オクソイド、ベイジングストーク、英国）にスプレッドプレーティングして実施した。全てのプレートは、３０℃で４８時間培養した。ｐＨは、ｐＨメーター（メトローム、ヘリザウ、スイス）を用いて測定した。
総還元糖及び有機酸の分析
対照及び発酵サンプルの総還元糖含有量は、いくつかの修正を加えた３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法（Wood et al., 2012）を用いて判定した。１０μＬの発酵サンプル及び１９０μＬのＤＮＳ試薬を遠心分離管（メルク、シンガポール）内で均等に混合した。その後、チューブを沸騰水浴中で５分間加熱し、アイスボックス内で冷却した。反応したサンプルの１００μＬを９６マイクロタイタープレートにピペットで移し、５４０ｎｍで読み取った。
対照及び発酵サンプルの総還元糖含有量は、いくつかの修正を加えた３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法（Wood et al., 2012）を用いて判定した。１０μＬの発酵サンプル及び１９０μＬのＤＮＳ試薬を遠心分離管（メルク、シンガポール）内で均等に混合した。その後、チューブを沸騰水浴中で５分間加熱し、アイスボックス内で冷却した。反応したサンプルの１００μＬを９６マイクロタイタープレートにピペットで移し、５４０ｎｍで読み取った。
発酵肉ソースの有機酸抽出物は、Toh and Liu (2017)に記載されている方法を使用して調製した。遠心分離管内において、サンプルに０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４のアリコートを１：１（ｖ／ｖ）の比率で添加し、４℃で１時間保存してタンパク質を沈殿させた。チューブを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による有機酸分析は、スペルコゲルＣ－６１０Ｈカラム（スペルコ、ベルフォンテ、ペンシルベニア州、米国）を使用して実施した。移動相は、０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４であり、４０℃で０．４ｍＬ／分の流量に設定した（Lee et. al., 2013）。有機酸化合物は、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ光ダイオードアレイ検出器（島津製作所、京都、日本）内で２１０ｎｍで検出し、外部標準を用いて定量化した。
遊離アミノ酸の分析
発酵肉ソースの遊離アミノ酸は、アクリロニトリル（ＡＣＮ）（メルク、シンガポール）を使用して抽出し、タンパク質を沈殿させた。６００μＬのＡＣＮ、２００μＬの蒸留水及び２００μＬのサンプルを遠心分離管内で混合し、４℃で少なくとも１時間保存した。サンプルを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。ウォーターズAccQ-Tagウルトラケミストリーキット（ダブリン、アイルランド）を使用して、ＡＱＣを用いたアミノ基のプレカラム誘導体化を実施した。誘導体化されたアミノ酸のＨＰＬＣ分析を実施した。アミノ酸標準混合物（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を同定及び定量に使用した。
発酵肉ソースの遊離アミノ酸は、アクリロニトリル（ＡＣＮ）（メルク、シンガポール）を使用して抽出し、タンパク質を沈殿させた。６００μＬのＡＣＮ、２００μＬの蒸留水及び２００μＬのサンプルを遠心分離管内で混合し、４℃で少なくとも１時間保存した。サンプルを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。ウォーターズAccQ-Tagウルトラケミストリーキット（ダブリン、アイルランド）を使用して、ＡＱＣを用いたアミノ基のプレカラム誘導体化を実施した。誘導体化されたアミノ酸のＨＰＬＣ分析を実施した。アミノ酸標準混合物（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を同定及び定量に使用した。
揮発性化合物の分析
発酵肉ソース中の揮発性化合物の抽出と分析は、修正されたプロトコル（Vong and Liu, 2017）を使用して実施した。抽出前にサンプルを解凍し、６０℃の水浴内で２分間熱処理した。揮発性化合物は、ＧＣ－ＭＳ／ＦＩＤと組み合わせたＨＳ－ＳＰＭＥによって抽出した。
発酵肉ソース中の揮発性化合物の抽出と分析は、修正されたプロトコル（Vong and Liu, 2017）を使用して実施した。抽出前にサンプルを解凍し、６０℃の水浴内で２分間熱処理した。揮発性化合物は、ＧＣ－ＭＳ／ＦＩＤと組み合わせたＨＳ－ＳＰＭＥによって抽出した。
５ｍＬのサンプルをＰＴＦＥ中隔付きの２０ｍＬガラスバイアルに入れた。８５μｍのカルボキセン／ポリジメチルシロキサンＳＰＭＥファイバー（ＣＡＲ／ＰＤＭＳ、スペルコ、ベルフォンテ、ペンシルベニア州、米国）を用いて、コンビパルオートサンプラー（ＣＴＣアナリティクス、ツヴィンゲン、スイス）を使用して２５０ｒｐｍの撹拌下で６０℃において３０分間、ヘッドスペース揮発性有機物を抽出した。抽出化合物は、ＤＢ－ＦＦＡＰキャピラリーカラム（長さ６０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ、アジレント、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）上でヘリウムをキャリアガスとして用い、流速１．２ｍＬ／ｍｉｎで分離した（アジレント５９７５Ｃ三軸ＭＳ及びＦＩＤ）。分離条件（Gao et al., 2016）：オーブンの初期温度を４０℃で３分間設定し、次に保持せずに毎分５℃の速度で９０℃に上昇させ、保持時間７分間で毎分１０℃の速度で２３０℃に上昇させる。
化合物の同定は、それらの質量スペクトルと、NIST 8.0及びWiley 275 MSライブラリのデータベースとの比較に基づいていた。化合物の検証は、それらのＬＲＩ値に基づいた。各化合物のＬＲＩ値は、その保持時間を用いて計算した。ＧＣ－ＦＩＤのピーク面積を使用して揮発成分を半定量化し、主要な化合物群毎に百分率で表された相対ピーク面積（ＲＰＡ）を計算した。
統計解析
発酵肉ソースの遊離アミノ酸は、アクリロニトリル（ＡＣＮ）（メルク、シンガポール）使用して抽出し、タンパク質を沈殿させた。６００μＬのＡＣＮ、２００μＬの蒸留水及び２００μＬのサンプルを遠心分離管内で混合し、４℃で少なくとも１時間保存した。サンプルを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。
発酵肉ソースの遊離アミノ酸は、アクリロニトリル（ＡＣＮ）（メルク、シンガポール）使用して抽出し、タンパク質を沈殿させた。６００μＬのＡＣＮ、２００μＬの蒸留水及び２００μＬのサンプルを遠心分離管内で混合し、４℃で少なくとも１時間保存した。サンプルを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、０．２μｍのミニザルトＲＣ１５シリンジフィルター（ザルトリウス、ゲッティンゲン、独国）を通して濾過した後、上清を回収した。
ウォーターズAccQ-Tagウルトラケミストリーキット（ダブリン、アイルランド）を使用して、ＡＱＣを用いたアミノ基のプレカラム誘導体化を実施した。誘導体化されたアミノ酸のＨＰＬＣ分析を実施した。アミノ酸標準混合物（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を同定及び定量に使用した。
ＬＡＢ増殖及びｐＨ変化
図９に示すように、全てのＬＡＢは、豚肉切り落とし加水分解物中で良好に増殖し、細胞数が１．５～２．０対数ＣＦＵ／ｍＬだけ増加した。図９（ａ）は、ＧＧ株及びシロタ株の同様の増殖傾向を示す。これらの２つの株の細胞数は、それぞれ７．０６及び７．３９対数ＣＦＵ／ｍＬから８．６４及び９．２４対数ＣＦＵ／ｍＬに２４時間で増加し、発酵が終了するまで安定したままでであった。他方、ＰＣＣ、２９９Ｖ、ＤＳＭ２００６９及びＮＣＦＭ株の細胞数は、２４時間で約７．５０対数ＣＦＵ／ｍＬから８．８ＣＦＵ／ｍＬに増加し、４日目までに約７．３対数ＣＦＵ／ｍＬに徐々に減少した。
図９に示すように、全てのＬＡＢは、豚肉切り落とし加水分解物中で良好に増殖し、細胞数が１．５～２．０対数ＣＦＵ／ｍＬだけ増加した。図９（ａ）は、ＧＧ株及びシロタ株の同様の増殖傾向を示す。これらの２つの株の細胞数は、それぞれ７．０６及び７．３９対数ＣＦＵ／ｍＬから８．６４及び９．２４対数ＣＦＵ／ｍＬに２４時間で増加し、発酵が終了するまで安定したままでであった。他方、ＰＣＣ、２９９Ｖ、ＤＳＭ２００６９及びＮＣＦＭ株の細胞数は、２４時間で約７．５０対数ＣＦＵ／ｍＬから８．８ＣＦＵ／ｍＬに増加し、４日目までに約７．３対数ＣＦＵ／ｍＬに徐々に減少した。
図９（ｂ）に示すように、全てのＬＡＢ発酵加水分解物のｐＨは、２４時間で有意に（Ｐ＜０．０５）低下し、ｐＨがわずか４．３に低下したＰＣＣ株を除いて、４日目までに約３．８に達した。
総還元糖及び有機酸の変化
図１０（ａ）に示すように、全てのＬＡＢ発酵加水分解物の総還元糖含有量は、４日後に有意に（Ｐ＜０．０５）減少したが、糖の利用率は、ＬＡＢによって変動した。ＰＣＣ株は、添加されたグルコースを最も急速に消費し、次にシロタ株、ＧＧ株及びＮＣＦＭ株がそれに続いた。特に、ＰＣＣ株及びシロタ株は、培地で利用可能な全てグルコースをほぼ使い果たし、４日目までにグルコースを２０．９８ｍｇ／ｍＬからそれぞれわずか１．２３及び２．４６ｍｇ／ｍＬに減少させた。他のＬＡＢ発酵加水分解物では、有意なレベルの残留グルコースは、１０ｍｇ／ｍＬ未満にとどまった。
図１０（ａ）に示すように、全てのＬＡＢ発酵加水分解物の総還元糖含有量は、４日後に有意に（Ｐ＜０．０５）減少したが、糖の利用率は、ＬＡＢによって変動した。ＰＣＣ株は、添加されたグルコースを最も急速に消費し、次にシロタ株、ＧＧ株及びＮＣＦＭ株がそれに続いた。特に、ＰＣＣ株及びシロタ株は、培地で利用可能な全てグルコースをほぼ使い果たし、４日目までにグルコースを２０．９８ｍｇ／ｍＬからそれぞれわずか１．２３及び２．４６ｍｇ／ｍＬに減少させた。他のＬＡＢ発酵加水分解物では、有意なレベルの残留グルコースは、１０ｍｇ／ｍＬ未満にとどまった。
対照試料並びに発酵サンプルのクエン酸、ピルビン酸、コハク酸、乳酸及び酢酸を含む有機酸組成を図１０（ｂ）～（ｆ）に示す。一般に、全てのＬＡＢ株は、有機酸の変化について同様のパターンを示した。コハク酸、乳酸及び酢酸は、有意に（Ｐ＜０．０５）増加したが、クエン酸は、４日目に有意に（Ｐ＜０．０５）減少した。しかし、ピルビン酸は、変化を示さなかった。予測通り、乳酸は、ホモ発酵及びヘテロ発酵ＬＡＢの両方の主要な最終産物であるため、全ての株は、０日目の約２ｍｇ／ｍＬから４日目の平均１５ｍｇ／ｍＬまで乳酸の顕著な増加を示した。上記で考察されたように、ヘテロ発酵性であるＰＣＣ株は、グルコースから最も少ない量の乳酸を産生したが、最も多い量の酢酸を産生した。
遊離アミノ酸の変化
未発酵豚肉切り落とし加水分解物中で合計１９種類のアミノ酸を測定し、表７に示す。６種類のＬＡＢによって発酵された加水分解物の総アミノ酸濃度は、ＬＡＢに応じて増加又は減少し、互いに有意に（Ｐ＜０．０５）異なっていた。ＤＳＭ２００６９株によって発酵された加水分解物の総アミノ酸は、未発酵対照と比較して５３９．０８ｍｇ／Ｌで１．７倍増加し、ＮＣＦＭ、ＰＣＣ及びシロタ株がそれぞれ５０４．８３、３６３．６３及び３３５．８６ｍｇ／Ｌでそれに続いた。対照的に、２９９Ｖ株の発酵加水分解物の総アミノ酸は、１２６．０５ｍｇ／Ｌで２．５倍を超えて減少し、２１９．１４ｍｇ／ＬのＧＧ株がそれに続いた。
未発酵豚肉切り落とし加水分解物中で合計１９種類のアミノ酸を測定し、表７に示す。６種類のＬＡＢによって発酵された加水分解物の総アミノ酸濃度は、ＬＡＢに応じて増加又は減少し、互いに有意に（Ｐ＜０．０５）異なっていた。ＤＳＭ２００６９株によって発酵された加水分解物の総アミノ酸は、未発酵対照と比較して５３９．０８ｍｇ／Ｌで１．７倍増加し、ＮＣＦＭ、ＰＣＣ及びシロタ株がそれぞれ５０４．８３、３６３．６３及び３３５．８６ｍｇ／Ｌでそれに続いた。対照的に、２９９Ｖ株の発酵加水分解物の総アミノ酸は、１２６．０５ｍｇ／Ｌで２．５倍を超えて減少し、２１９．１４ｍｇ／ＬのＧＧ株がそれに続いた。
最終的な総アミノ酸濃度は、それらのタンパク質分解活性及び自己消化（アミノ酸の放出）に応じて、ＬＡＢによる消費及び産生の正味のバランスであった。ＤＳＭ２００６９株及びＮＣＦＭ株によるアミノ酸の顕著な産生は、ＰＣＣ株及びシロタ株と比較して、それらのより強力なタンパク質分解活性を示唆する。ＤＳＭ２００６９株は、乳製品のラクトコッカス株であるため、より高いタンパク質分解活性が予測された。他方、ＮＣＦＭ株は、元々、ヒトの胃腸管から分離されたＬｂ．アシドフィルス（Lb. acidophilus）のプロバイオティッ株であり、したがって、その高いタンパク質分解活性は、驚くべきものであった。
さらに、ＬＡＢ自己消化の違いは、アミノ酸形成のレベルの違いを部分的に説明し得る。他方、２９９Ｖ株及びＧＧ株による総アミノ酸の有意な減少は、アミノ酸レベルの低下をもたらす、それらのより弱いタンパク質分解活性及び／又はより強い消費と組み合わさった自己消化を示唆する。腸に優しいＬｂ．プランタルム（Lb. plantarum）及びＬｂ．ラムノサス（Lb. rhamnosus）は、ほぼ全ての種類のアミノ酸を異化して、アンモニア、カルボン酸（酢酸、プロピオン酸、吉草酸、イソ吉草酸など）、有機酸、フェノール化合物及び気体化合物（二酸化炭素、水素、硫化水素及びメタンなど）を産生し得る。
興味深いことに、ＰＣＣ株によって発酵された加水分解物中のアルギニンの濃度は、アミノ酸の総量が増加したにもかかわらず、１０．０４ｍｇ／Ｌに有意（Ｐ＜０．０５）に減少した。アルギニンは、非常に苦くて不快な味があることも知られているため、ＬＡＢによるアルギニンの利用は、ＬＡＢ及び味覚の両方にとって望ましい。アルギニンデイミナーゼ経路を介したアルギニンの異化作用は、細菌の生存に有益なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びアンモニアを生成する。他方、シロタ株によって発酵された加水分解物中のグルタミン酸は、２８．１７ｍｇ／Ｌから３４．００ｍｇ／Ｌに有意に（Ｐ＜０．０５）増加した一方、遊離アミノ酸の総濃度は、ほぼ無変化であった。Ｌ．カゼイ（L. casei）におけるグルタミン酸の産生及び異化経路は、不明確であるが、グルタミン酸の量の増加は、肉ソースの「うま味」風味に寄与し得る。さらに、トリプトファンの濃度は、ＤＳＭ２００６９株及びＮＣＦＭ株によって発酵された肉ソースで変化がないままであったが、総アミノ酸は、有意に（Ｐ＜０．０５）増加した。これは、これらの２つの株によるトリプトファンの利用に起因する可能性がある。しかし、メイラード反応後の「肉感の」匂いの生成に極めて重要な硫黄アミノ酸であるシステイン（Ｃｙｓ）及びメチオニン（Ｍｅｔ）の濃度は、全ての未発酵及び発酵サンプルについて、判定された総アミノ酸の約０．９％及び４％のみを占めていた。
揮発性化合物
４日目に、合計１９、１６、２０、１９、２０、２３及び１７種類の揮発性化合物が、対照及びＰＣＣ、２９９Ｖ、ＤＳＭ２００６９、ＧＧ、ＮＣＦＭ及びシロタ株によって発酵された肉ソースでそれぞれ同定された。同定された化合物は、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、フランの５つのグループに分けられ、各グループの小計ピーク面積（１０６）が図１１に要約される。
４日目に、合計１９、１６、２０、１９、２０、２３及び１７種類の揮発性化合物が、対照及びＰＣＣ、２９９Ｖ、ＤＳＭ２００６９、ＧＧ、ＮＣＦＭ及びシロタ株によって発酵された肉ソースでそれぞれ同定された。同定された化合物は、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、フランの５つのグループに分けられ、各グループの小計ピーク面積（１０６）が図１１に要約される。
対照中で検出された主な揮発性風味化合物は、主に脂肪族アルデヒド及びフランであり、それぞれ８０．９０％及び１０．４２％のＲＰＡを占めていた（図１１（ｃ）及び（ｅ））。特に、ヘキサナール単独で、対照中で検出された総揮発性化合物の５７．２２％を占めていた。酸敗臭を放つ脂肪族アルデヒドは、６時間の加水分解中の豚肉脂質の酸化から生じ、フランは、発酵前に適用された熱処理から生じた可能性が高かった。
全ての発酵加水分解物において、総アルデヒドは、低いレベルに減少したが、総酸、アルコール及びケトンレベルは、有意に（Ｐ＜０．０５）増加した。総フランレベルは、２４時間までに増加し、次にフランを消費したＰＣＣ株を除いて経時的に初期値を下回るレベルまで減少した（図１１）。アルコール（ＰＣＣ株のエタノールを除く）は、アルデヒドの酵素的還元に由来し、カルボン酸（ＰＣＣ株の酢酸を除く）は、アルデヒドの化学的及び酵素的酸化から形成された可能性が高かった。しかし、アルコールとカルボン酸の形成に関して、ヘテロ発酵ＬＡＢ株ＰＣＣと他のホモ発酵ＬＡＢとの間に明確な関係はなく、ＬＡＢの両方のグループが同様のレベルのアルコール及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有することが示唆される。総ケトンは、主に、上記で考察されたクエン酸異化作用から生成された２，３－ブタンジオン（ジアセチル）及びアセトインによって寄与された。６種類のＬＡＢ間でアルデヒド還元にほとんど違いはなかった。しかし、総カルボン酸、総アルコール、総フラン（ＰＣＣ株を除く）及び総ケトンの形成には、ＬＡＢ間で顕著な違いがあり、ＮＣＦＭ株は、最小量の総アルコールを産生し、ＰＣＣ株は、最小量の総ケトンを形成する。他方、ＰＣＣ株は、最高量の総アルコール（主にエタノール）を産生し、ＮＣＦＭ株は、最高レベルの総ケトン（主にジアセチル及びアセトイン）を形成した。
いずれも化学的及び／又は生物学的に形成され得る３－メチルブタナール及びベンズアルデヒドを除いて、アミノ酸に由来する揮発性物質は、ほとんどなかった。ＬＡＢ間において、これらの揮発性物質の形成又は分解に明らかな大きい違いがあった。例えば、ＧＧ株のみが２，３－ブタンジオンとアセトインの両方を産生し；ＤＳＭ２００６９株及び２９９Ｖ株は、アセトインのみを産生したが、全てのＬＡＢは、クエン酸を分解した。
要約すると、５つのプロバイオティックＬＡＢ及び１つのラクトコッカス株ＬＡＢを使用して、豚肉切り落とし加水分解物を発酵させた。全てのＬＡＢは、グルコースを添加した加水分解物で良好に増殖した。主要な代謝最終産物は、乳酸及び酢酸であった。一部のＬＡＢは、消費するよりも多くのアミノ酸を産生したが、他のＬＡＢは、産生するよりも多くを消費した。未発酵加水分解物に異臭を付与し得る主要な脂質由来のアルデヒドは、ＬＡＢにより、主に対応するアルコールと酸に変換され、風味を効果的に改善した。しかし、アミノ酸由来の揮発性物質は、非常にわずかにのみ見られた。乳酸及び酢酸の産生並びにアルデヒドの還元は、新規液体豚肉バイオフレーバリング製品の開発につながる可能性がある。
実施例４ － 酵母及び乳酸菌（ＬＡＢ）の共培養を用いた肉加水分解物の発酵
発酵プロセスを図３に概略的に示す。
発酵プロセスを図３に概略的に示す。
豚肉加水分解物発酵において、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）の同時及び順次接種を実施し、微生物の生存率、物理化学的変化及び揮発性物質の生成を検討した。
この実験では、５種類の接種サンプルを準備した：（ｉ）対照としての未接種豚肉加水分解物；（ｉｉ）Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）の単独培養物を接種した豚肉加水分解物；（ｉｉｉ）Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）の単独培養物を接種した豚肉加水分解物；（ｉｖ）Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）及びＰ．クルイベリ（P. kluyveri）を同時接種した豚肉加水分解物；（ｖ）Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）を最初に接種し、培地のｐＨが４．５になった後、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）を添加した豚肉加水分解物。
Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）及びＰ．クルイベリ（P. kluyveri）ストック培養物をＭＲＳブロス（ｐＨ５．０に調整）及びＹＭブロスに１０％（ｖ／ｖ）の比率で移し入れ、それぞれ３０℃で４８時間及び３７℃で２４時間、凍結微生物培養物を活性化した。遠心分離（８０００×ｇで５分間、４℃）及び５ｍＬの０．８５重量％食塩水での２回の洗浄後、各株の細胞ペレットを５ｍｌの低温殺菌豚肉加水分解物に再懸濁し、発酵前の豚肉加水分解物の初期接種細胞数がＬ．ファーメンタム（L. fermentum）では約１０７個、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）では１０５個であることを確実にした。接種材料は、以下のように添加した：単独培養物接種の場合、０．３ｍＬのＬ．ファーメンタム（L. fermentum）又はＰ．クルイベリ（P. kluyveri）培養懸濁液を３０ｍＬの豚肉加水分解物に移し入れた；同時接種では、開始時に０．３ｍＬのＬ．ファーメンタム（L. fermentum）及び０．３ｍＬのＰ．クルイベリ（P. kluyveri）培養懸濁液を豚肉加水分解物に添加した；順次接種では、０日目に０．３ｍＬのＬ．ファーメンタム（L. fermentum）培養懸濁を豚肉加水分解物に接種して、３７℃で２４時間静置培養し、その後、引き続いて１日目に０．３ｍＬのＰ．クルイベリ（P. kluyveri）培養懸濁液を培地に添加した。
接種後、サンプルを穏やかに振盪しながら混合し、３０℃で５日間静置培養した（順次接種では６日間の発酵）。未接種の豚肉加水分解物も対照として３０℃でインキュベートした。細胞計数及びｐＨ測定のために、全て種類の豚肉加水分解物を２４時間毎にサンプリングした。次に、他の分析前に全てのサンプルを－２０℃で保存した。
酵母又はＬ．ファーメンタム（L. fermentum）の計数は、サンプルを０．１％（ｗ／ｖ）ペプトン水（ベイジングストーク、英国）で１０倍に希釈し、それに続く選択的寒天培地上でプレーティングすることによって実施した。酵母細胞数は、希釈したサンプルを、１００ｐｐｍクロラムフェニコール（メルク、独国）を添加した二連のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ、オクソイド、ベイジングストーク、英国）上にスプレッドプレーティングし、プレートを３０℃で４８時間培養することによって判定した一方、ＬＡＢ細胞数は、５００ｐｐｍのナタマイシン（ナタマックス（登録商標）、ダニスコＡ／Ｓ、コペンハーゲン、デンマーク）を含有するＭＲＳ寒天（オクソイド、ベイジングストーク、英国）を用いてポアプレーティングし、３７℃で２４時間培養することによって数え上げた。全てのサンプルのｐＨ変化は、ｐＨメーター（メトローム、ヘリザウ、スイス）を用いて直接測定した。
豚肉加水分解物の単培養及び共培養におけるＬ．ファーメンタム（L. fermentum）及びＰ．クルイベリ（P. kluyveri）の増殖
Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）とＰ．クルイベリ（P. kluyveri）との間の拮抗関係は、接種順序に関係なく、豚肉加水分解物発酵中に観察された。Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）の細胞数は、同時接種及び順次接種でそれぞれ１日目の約６．８０対数ＣＦＵ／ｍＬから５日目の５．９８及び６．０４対数ＣＦＵ／ｍＬに有意に（Ｐ＜０．０５）減少した（図１２（ｃ）及び（ｄ））一方、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）の単独培養では、接種後５日目の細胞数は、６．４５対数ＣＦＵ／ｍＬにとどまった（図１２（ｂ））。他方、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）の生存率は、順次接種培養で向上し、１日目で８．８２対数ＣＦＵ／ｍＬのピークカウントに達し、６日目で８．１６対数ＣＦＵ／ｍＬの細胞数を維持した（図１２（ｄ））。しかし、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）の同様の増殖パターンは、同時接種培養物及び単独培養物で観察され、それらの細胞数は、それぞれ約８．８０対数ＣＦＵ／ｍＬから最終数７．５５及び７．７２対数ＣＦＵ／ｍＬに減少した（図１２（ａ）及び（ｃ））。
Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）とＰ．クルイベリ（P. kluyveri）との間の拮抗関係は、接種順序に関係なく、豚肉加水分解物発酵中に観察された。Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）の細胞数は、同時接種及び順次接種でそれぞれ１日目の約６．８０対数ＣＦＵ／ｍＬから５日目の５．９８及び６．０４対数ＣＦＵ／ｍＬに有意に（Ｐ＜０．０５）減少した（図１２（ｃ）及び（ｄ））一方、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）の単独培養では、接種後５日目の細胞数は、６．４５対数ＣＦＵ／ｍＬにとどまった（図１２（ｂ））。他方、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）の生存率は、順次接種培養で向上し、１日目で８．８２対数ＣＦＵ／ｍＬのピークカウントに達し、６日目で８．１６対数ＣＦＵ／ｍＬの細胞数を維持した（図１２（ｄ））。しかし、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）の同様の増殖パターンは、同時接種培養物及び単独培養物で観察され、それらの細胞数は、それぞれ約８．８０対数ＣＦＵ／ｍＬから最終数７．５５及び７．７２対数ＣＦＵ／ｍＬに減少した（図１２（ａ）及び（ｃ））。
豚肉加水分解物発酵中のグルコース及び有機酸の変化
全ての発酵サンプル中のグルコース含有量は、接種の５日後、検出不能なレベルまで減少した（図１３（ａ））。Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）及びＰ．クルイベリ（P. kluyveri）は、増殖並びにエタノール及び／又は乳酸、酢酸の産生のためにグルコースを利用するため、これらの糖の枯渇が予想された。
全ての発酵サンプル中のグルコース含有量は、接種の５日後、検出不能なレベルまで減少した（図１３（ａ））。Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）及びＰ．クルイベリ（P. kluyveri）は、増殖並びにエタノール及び／又は乳酸、酢酸の産生のためにグルコースを利用するため、これらの糖の枯渇が予想された。
単独培養物接種の場合、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）が１日目に１日当たり１１．１９ｍｇ／ｍＬの最高のグルコース消費率を示した一方、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）では、２日目に１日当たり１８．１２ｍｇ／ｍＬであった。混合接種モデルでは、同時接種の２日目に１．０ｍｇ／ｍＬ未満の残留グルコースが検出されたが、順次接種では、４日目（Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）の接種から３日後）であった。
豚肉加水分解物発酵中の遊離アミノ酸の変化
異なる接種方法のアミノ酸プロファイルを判定し、表８で比較した。全てのサンプルの遊離アミノ酸のほとんどは、一般的に一定であり、５日間の発酵後にわずかな変動があった。同時接種と順次接種との間でアミノ酸利用に有意差（Ｐ≧０．０５）は観察されなかった。一般に、単一のＰ．クルイベリ（P. kluyveri）は、最も多くのアミノ酸を消費し、豚肉加水分解物中に多種の揮発性化合物を生成した。Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）は、タンパク質分解活性を示し、それによって総アミノ酸量が増加したが、これらの効果は、統計的に有意でなかった（Ｐ≧０．０５）。
異なる接種方法のアミノ酸プロファイルを判定し、表８で比較した。全てのサンプルの遊離アミノ酸のほとんどは、一般的に一定であり、５日間の発酵後にわずかな変動があった。同時接種と順次接種との間でアミノ酸利用に有意差（Ｐ≧０．０５）は観察されなかった。一般に、単一のＰ．クルイベリ（P. kluyveri）は、最も多くのアミノ酸を消費し、豚肉加水分解物中に多種の揮発性化合物を生成した。Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）は、タンパク質分解活性を示し、それによって総アミノ酸量が増加したが、これらの効果は、統計的に有意でなかった（Ｐ≧０．０５）。
揮発性化合物の形成に対するＬ．ファーメンタム（L. fermentum）及びＰ．クルイベリ（P. kluyveri）の同時接種及び順次接種の影響
図１４（ａ）～（ｉ）に見られるように、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）の同時接種及び順次接種によって発酵された豚肉加水分解物のエタノール、酢酸、ヘキサナール、１－ヘキサノール、酢酸イソアミル、酢酸エチル、酢酸ヘキシル、２－フェニルエチル酢酸、フェニルエチルアルコールの揮発性化合物プロファイルは、未発酵対照サンプルと全く異なっていた。
図１４（ａ）～（ｉ）に見られるように、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）の同時接種及び順次接種によって発酵された豚肉加水分解物のエタノール、酢酸、ヘキサナール、１－ヘキサノール、酢酸イソアミル、酢酸エチル、酢酸ヘキシル、２－フェニルエチル酢酸、フェニルエチルアルコールの揮発性化合物プロファイルは、未発酵対照サンプルと全く異なっていた。
Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）の同時発酵及び連続発酵サンプルではエステルが最も豊富な化合物であり、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）発酵サンプルではアルコールが主要な化合物であった。
未発酵豚肉加水分解物では、ヘキサナールが優勢な揮発性化合物であり、２－ペンチルフランと１－ペンタノールがそれに続いた。これらの優勢な化合物は、対照サンプルに全体的に望ましくない草様、薬草様及び豆様フレーバーを与えた。
Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）によって発酵されたサンプル中では、大量のアルコール及び酸揮発性化合物が同定された。図１４（ａ）及び（ｂ）に示すように、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）発酵では、解糖からピルビン酸が形成され、引き続いてピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体によってアセチルＣｏＡに変換されて、酢酸及びエタノールが生成するため、発酵中にエタノール及び酢酸の濃度が徐々に増加していることが分かった。さらに、１－ヘキサノール（図１４（ｄ））及びヘキサン酸が見いだされ、これらは、主に豚肉加水分解物中のヘキサナールの酵素的還元及び酸化に由来する。全体として、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）発酵豚肉加水分解物中のこれらの同定された揮発性化合物は、新鮮な酸味のある臭いを与える。
要約すると、Ｐ．クルイベリ（P. kluyveri）は、接種後１日間のみ増殖し、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）の存在下では元のレベルまで低下する一方、後者は、いずれの接種方法でもそれぞれの単独培養と比較して刺激されたことから、これらの２つの培養物間に拮抗関係が観察された。これらの２つの接種方法間でグルコース、有機酸及びアミノ酸の最終的な含有量に有意差（Ｐ＜０．０５）はなかった。しかし、順次接種でより多くのエステルが検出されたため、接種順序は、揮発性化合物の形成に影響を及ぼした。
実施例５ － 熱処理された豚肉切り落とし加水分解物の色及び風味化合物に対するｐＨ、キシロース添加及び温度の影響
肉ソースの熱処理プロセスを図４に概略的に示す。
肉ソースの熱処理プロセスを図４に概略的に示す。
熱処理された豚肉切り落とし加水分解物の色及び芳香化合物プロファイルの発生に対するｐＨ、キシロース及び温度の影響を検討した。ｐＨを５．５又は４．５に調整した酵素加水分解豚肉加水分解物に、９０、９５又は１００℃で６０分間熱処理する前に異なる量（０、０．５、１．５、２．５、３．５ｇ／１００ｍＬ）のキシロースを添加した。
色
対照及び加熱されたサンプルの色変化を表９及び１０に示す。全ての加熱されたサンプルは、温度及びｐＨに関係なく、ΔＥの増加を示した。Ｌ＊値（明度）及びａ＊値（緑色度が負、赤色度が正）は、糖度が高くなるにつれて上昇した。ｂ＊値（青色度が負、黄色度が正）は、糖度が低いと増加したが、糖度が高いと温度に応じて安定化又は減少した。ｐＨ５．５では、３つの無糖サンプルＡ９０－０、Ａ９５－０及びＡ１００－０のΔＥ値は、それぞれ２．２６、１．３４及び２．９８と最低であった。これらの３つの無糖サンプルは、黄色がかった透明な色を維持し、非加熱対照と比較して目に見える色の変化を示さなかった。サンプルＡ１００－３５は、２３．５０の最高のΔＥ値を示し、透明な暗褐色であったが、サンプルＡ９０－３５及びＡ９５－３５と比較して顕著な色の違いはなく、各サンプルで異なるΔＥが観察された。同様の傾向は、グループＢのサンプル（ｐＨ４．５）でも見られ、２５．０５の最高のΔＥは、透明な暗褐色のサンプルＢ１００－３５で見られた。
対照及び加熱されたサンプルの色変化を表９及び１０に示す。全ての加熱されたサンプルは、温度及びｐＨに関係なく、ΔＥの増加を示した。Ｌ＊値（明度）及びａ＊値（緑色度が負、赤色度が正）は、糖度が高くなるにつれて上昇した。ｂ＊値（青色度が負、黄色度が正）は、糖度が低いと増加したが、糖度が高いと温度に応じて安定化又は減少した。ｐＨ５．５では、３つの無糖サンプルＡ９０－０、Ａ９５－０及びＡ１００－０のΔＥ値は、それぞれ２．２６、１．３４及び２．９８と最低であった。これらの３つの無糖サンプルは、黄色がかった透明な色を維持し、非加熱対照と比較して目に見える色の変化を示さなかった。サンプルＡ１００－３５は、２３．５０の最高のΔＥ値を示し、透明な暗褐色であったが、サンプルＡ９０－３５及びＡ９５－３５と比較して顕著な色の違いはなく、各サンプルで異なるΔＥが観察された。同様の傾向は、グループＢのサンプル（ｐＨ４．５）でも見られ、２５．０５の最高のΔＥは、透明な暗褐色のサンプルＢ１００－３５で見られた。
ｐＨ
図１５に示すように、サンプルのｐＨは、熱処理中に低下した。各グループの最低ｐＨは、サンプルＡ１００－３５及びＢ１００－３５でそれぞれ４．８６及び４．３５であることが分かった。メイラード反応中のｐＨの低下は、アミノ基の枯渇及び有機酸の形成を反映する。多くの研究では、ｐＨの低下は、褐変過程の指標でもある。
図１５に示すように、サンプルのｐＨは、熱処理中に低下した。各グループの最低ｐＨは、サンプルＡ１００－３５及びＢ１００－３５でそれぞれ４．８６及び４．３５であることが分かった。メイラード反応中のｐＨの低下は、アミノ基の枯渇及び有機酸の形成を反映する。多くの研究では、ｐＨの低下は、褐変過程の指標でもある。
還元糖／キシロース含有量
熱処理前に、元の豚肉加水分解物の総糖含有量は、微量であったため、メイラード反応を増強するために還元糖（キシロース）を添加した。図１６に示すように、キシロースの還元は、温度、ｐＨ及び糖の量に関係なく、一般的に熱処理中に発生した。ｐＨ５．５では、サンプルＡ９０－１５で２．１８ｍｇ／ｍＬと最小の糖減少が見られた一方、サンプルＡ１００－３５で５．７５ｍｇ／ｍＬと最大の糖減少が見られた（図１６（ａ））。ｐＨ４．５では、数値は、サンプルＢ９０－３５で２．４８ｍｇ／ｍＬ、サンプルＢ１００－３５で５．８５ｍｇ／ｍＬであった（図１６（ｂ））。これらの結果は、異なる条件下で処理されたサンプル間で糖消費量にほとんど違いがないことを示した。
熱処理前に、元の豚肉加水分解物の総糖含有量は、微量であったため、メイラード反応を増強するために還元糖（キシロース）を添加した。図１６に示すように、キシロースの還元は、温度、ｐＨ及び糖の量に関係なく、一般的に熱処理中に発生した。ｐＨ５．５では、サンプルＡ９０－１５で２．１８ｍｇ／ｍＬと最小の糖減少が見られた一方、サンプルＡ１００－３５で５．７５ｍｇ／ｍＬと最大の糖減少が見られた（図１６（ａ））。ｐＨ４．５では、数値は、サンプルＢ９０－３５で２．４８ｍｇ／ｍＬ、サンプルＢ１００－３５で５．８５ｍｇ／ｍＬであった（図１６（ｂ））。これらの結果は、異なる条件下で処理されたサンプル間で糖消費量にほとんど違いがないことを示した。
遊離アミノ酸
加水分解物の遊離アミノ酸は、熱処理サンプルにおける風味及び色素化合物の形成に重要な役割を果たした。本発明の目的は、十分に調理された肉の肉感及び甘い香りを反映した、香ばしい風味を有する新規の肉ソースを開発することである。図１７に見られるように、システイン（Ｃｙｓ）などの含硫アミノ酸並びに調理済みポテト、野菜様、ロースト感及び蜂蜜様の甘い香りの形成に関連するプロリン（Ｐｒｏ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）などの他の重要な前駆体が存在する。
加水分解物の遊離アミノ酸は、熱処理サンプルにおける風味及び色素化合物の形成に重要な役割を果たした。本発明の目的は、十分に調理された肉の肉感及び甘い香りを反映した、香ばしい風味を有する新規の肉ソースを開発することである。図１７に見られるように、システイン（Ｃｙｓ）などの含硫アミノ酸並びに調理済みポテト、野菜様、ロースト感及び蜂蜜様の甘い香りの形成に関連するプロリン（Ｐｒｏ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）などの他の重要な前駆体が存在する。
図１７（ｉ）及び（ｊ）に示すように、アミノ酸の総量は、ｐＨ４．５及びｐＨ５．５の両方のサンプルで熱処理後に有意な変化を示さず、約３００ｍｇ／１０ｍＬに維持された。
揮発性化合物
豚肉加水分解物のメイラード反応における香味化合物形成を理解するために、対照及び熱処理サンプルに見られる揮発性化合物を要約する。揮発性化合物は、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン及びフランの５つの主要なグループに分けられた。同定された３つの優勢な化合物は、ヘキサナール、フルフラール及び２－ペンチルフランであった（図１８）。
豚肉加水分解物のメイラード反応における香味化合物形成を理解するために、対照及び熱処理サンプルに見られる揮発性化合物を要約する。揮発性化合物は、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン及びフランの５つの主要なグループに分けられた。同定された３つの優勢な化合物は、ヘキサナール、フルフラール及び２－ペンチルフランであった（図１８）。
ヘキサナールは、ｐＨ５．５及びｐＨ４．５の対照で２９％及び２８％のＲＰＡを占め、熱処理後に大幅に減少した（図１８（ａ）及び（ｂ））。検出されたヘキセナールの最低ピーク面積は、サンプルＡ１００－３５で９．４４×１０６、サンプルＢ１００－３５で７．９４×１０６であり、各サンプルのＲＰＡは、１．９％及び１．２％であった。ヘキサナールは脂肪族アルデヒドであり、それは、未処理の豚加水分解物の酸敗臭及び青草臭を放つ。
ヘキサナールとは対照的に、フルフラールの量は、熱処理後に有意に増加した（図１８（ｃ）及び（ｄ））。フルフラールのピーク面積は、ｐＨ５．５及びｐＨ４．５対照でわずか４．１３×１０６及び９．１４×１０６であり、それぞれ２．４％及び３．５％のＲＰＡを占めていた。熱処理サンプルでは、Ａ１００－３５（１１１．６７×１０６）及びＢ１００－３５（３６１．７４×１０６）で最も高いピーク面積が見られ、３８．８％及び５５．７％のＲＰＡを占め、対照と比較してそれぞれ約２７倍及び４０倍に増加した。フルフラールは、ペントースの存在下においてメイラード反応で生成される中間体（硫黄なし）であり、強いベイクドポテト、スパイシー及び焦げた香りを与える。フルフラールの形成は、アマドリ化合物のエノール化又は糖の脱水のいずれかによるものであり、これらの反応は、いずれも酸性及び高温条件で増強され得る。肉の調理中、フルフラールは、システイン分解から形成される硫化水素と反応することが多く、製品に強くて遠い「ロースト肉」の香りを与える、２－フランメタンチオールを生成する（Xu et al.,2011）。しかし、本研究では、２－フランメタンチオールは、検出されず、これは、豚肉加水分解物中で利用可能なＣｙｓの濃度が低いことに起因し得る。
２－ペンチルフランのレベルは、対照と比較して熱処理サンプルで有意に増加し、サンプルＡ１００－５で最も高いピーク面積が２７２．５０×１０６であり、５７．１％のＲＰＡを占めた（図１８（ｅ）及び（ｆ））。興味深いことに、熱処理中の２－ペンチルフランの形成は、糖含有量及び温度と相関関係がなかった。２－ペンチルフランは、通常、リノール酸の酸化から形成され、食品に果物様、花様、バター、草様、豆様の香りを与える。熱処理中に生成された２－ペンチルフランは、望ましい「肉様の」臭いを直接与えなかったが、一部のソース製品の炙り肉又はロースト肉の全体的な臭いの原因として認識されている。
要約すると、熱処理は、豚肉加水分解物中の優勢なオフフレーバー化合物であるヘキサナールを除去し、より高い温度及びキシロース含有量は、ロースト感及び甘い風味を有するフルフラール及び２－ペンチルフランの生成を促進した。熱処理中、ｐＨ４．５でより多くのフルフラールが検出された。しかし、望ましい風味のある「肉様の」硫黄含有及び窒素含有の芳香化合物は、検出されず、これは、豚肉加水分解物中のシステイン／シスチンのレベルが不十分であることに起因し得る。
前述の説明は、例示的な実施形態を説明している一方、本発明から逸脱することなく多くの変形形態がなされ得ることは、関係する技術における当業者によって理解されるであろう。
参考文献
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Claims (24)
- 肉ベースの調味料を形成する方法であって、肉ベースの加水分解物を非好塩性微生物で発酵させて、前記肉ベースの調味料を形成することを含み、塩の添加を含まない、方法。
- 前記非好塩性微生物は、非好塩性酵母、非好塩性乳酸菌又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記非好塩性乳酸菌は、プロバイオティック乳酸菌、乳製品乳酸菌又はそれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
- 前記発酵させることは、肉ベースの加水分解物を１～２０日間にわたって発酵させることを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 発酵させることは、１５～４５℃の温度で発酵させることを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非好塩性微生物は、非好塩性酵母であり、及び前記発酵させることは、肉ベースの加水分解物を１～２０日間にわたって発酵させることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非好塩性微生物は、非好塩性乳酸菌であり、及び前記発酵させることは、肉ベースの加水分解物を１～７日間にわたって発酵させることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非好塩性微生物は、非好塩性酵母であり、及び前記発酵させることは、肉ベースの加水分解物を１５～４０℃の温度で発酵させることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非好塩性微生物は、非好塩性乳酸菌であり、及び前記発酵させることは、肉ベースの加水分解物を１５～４５℃の温度で発酵させることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵させることは、肉ベースの加水分解物を酵母及び乳酸菌で発酵させることを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵させることは、肉ベースの加水分解物を酵母及び乳酸菌で順次発酵させることを含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記発酵させることは、肉ベースの加水分解物を非好塩性酵母及び非好塩性乳酸菌の同時接種で発酵させることを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記発酵させることは、発酵性糖を添加することを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵させることの前に、肉ベースの混合物を酵素の存在下で加水分解して、肉ベースの加水分解物を形成することをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素は、プロテアーゼである、請求項１４に記載の方法。
- 前記加水分解することは、５．５～７．５のｐＨで加水分解することを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
- 前記加水分解することは、４５～６０℃の温度で加水分解することを含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵させることに続いて、前記肉ベースの調味料を熱処理することをさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記熱処理することは、前記肉ベースの調味料を９０～１２１℃の温度で熱処理することを含む、請求項１８に記載の方法。
- 前記熱処理することは、前記肉ベースの調味料を３０～１２０分間にわたって熱処理することを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
- 前記熱処理することは、４～６のｐＨで熱処理することを含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法から調製される、肉ベースの調味料。
- １０～４５ｍｇ／ｍＬの遊離アミノ酸濃度を含む、肉ベースの調味料。
- 前記肉ベースの調味料の総重量に基づいて２重量％以下のナトリウム含有量を含む、請求項２３に記載の肉ベースの調味料。
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