CN1147582C

CN1147582C - 具有反应性环碳酸酯基固定化酶载体的合成方法

Info

Publication number: CN1147582C
Application number: CNB001052314A
Authority: CN
Inventors: 丁伦汉
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2000-04-06
Filing date: 2000-04-06
Publication date: 2004-04-28
Anticipated expiration: 2020-04-06
Also published as: CN1316514A

Abstract

本发明涉及制备含高反应活性功能基团——环碳酸酯基固定化酶载体的合成方法。其制备方法为(1)将水溶性烯类单体、碳酸乙烯撑酯单体、水溶性的多烯类交联剂和引发剂溶于水中，均匀混合后使单体溶解成为均相溶液；(2)将以上混合液加入到在惰性气体保护下的含有分散稳定剂的悬浮剂中并进行搅拌至水溶液分散成球形；(3)将过滤分离取出的共聚小球颗粒，分别用石油醚和水洗涤乙醇洗涤；(4)置于真空干燥箱中烘干至恒重即得成品。本发明的聚合反应中直接使用水溶液作为溶剂，不再使用有机溶剂，免去了需洗涤除去有机溶剂的麻烦。不仅操作方便，而且降低了生产成本，也有利于提高聚合产率。

Description

具有反应性环碳酸酯基固定化酶载体的合成方法

技术领域

本发明涉及制备一类含高反应活性功能基团——环碳酸酯基固定化酶载体的合成方法。

背景技术

环碳酸酯基能在很温和的条件下(低温，无催化剂)与蛋白质分子上的游离胺基结合，反应生成稳定的氨基甲酸酯，因此现有技术中环碳酸酯基被用来作为酶或其它含胺基物质如多肽、蛋白质、体细胞等的固定化载体的功能基。

1971年，美国化学会志C卷2767页[Barker.S.A.(J.Chem.Soc(C)，1971，276)]中报道了巴克等人采用氯代甲酸乙酯在干燥的有机溶剂中活化纤维素，在纤维素高分子骨架上产生环碳酸酯基团的方法。该方法中所使用的氯代甲酸乙酯毒性较大，而且要求反应溶剂严格除水，使操作较为困难。德国专利文献(Ger.Offen.3243591，1984)中则利用碳酸乙烯撑酯与亲水性烯类单体直接聚合的方法，同样也制备了性能相似的环碳酸酯基的固定化酶载体。所述聚合中所使用的碳酸乙烯撑酯单体在常温下为无色的结晶有机化合物，难溶于水，但可溶于大多数极性有机溶剂。因此，该方法中需首先将碳酸乙烯撑酯和乙烯基吡咯烷酮溶于二甲基甲酰胺有机溶剂中，并在石蜡油中进行悬浮聚合，然后再用水洗涤除去有机溶剂，从而得到珠状、含反应性环碳酸酯基的固定化酶载体。在上述载体制备过程中需要使用有机溶剂，不仅仅增加了载体的制造成本，还可能导致聚合过程中副反应较多，使聚合产率下降。另一方面，在洗涤除去有机溶剂过程中，一些有机溶剂可能残留在载体中不易彻底洗涤除尽，从而影响载体的使用性能；而且洗涤后的残液尚需要进一步分离、处理回收，否则将会导致环境污染。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种以水作为碳酸乙烯撑酯和其它亲水性共聚单体的溶剂来制备含环碳酸酯基固定化酶载体的合成方法。

本发明的目的由以下方式来完成。

本发明所述制备具有反应性环碳酸酯基固定化酶载体的合成方法，其特征在于其合成步骤为：

(1)将水溶性烯类单体、碳酸乙烯撑酯单体、水溶性的多烯类交联剂和引发剂溶

于水中，均匀混合后使单体溶解成为均相溶液，其中水的重量是水溶性烯类

单体重量的2～10倍；碳酸乙烯撑酯单体占水溶性烯类单体重量10％～

150％；水溶性的多烯类交联剂占碳酸乙烯撑酯和水溶性烯类单体总量的3％

～30％；引发剂的用量是单体总量的0.2～2％。

(2)将以上混合液加入到在惰性气体保护下的含有分散稳定剂的悬浮剂中并进行

搅拌至水溶液分散成球形，其中分散稳定剂为悬浮剂的重量的0.1％～1％，

其搅拌速度为100～1000转/分钟；然后在15～40℃范围内保温1～8小时，

再升温至60～80℃范围内保温1～6小时，则产生细度为40目～200目的共

聚小球颗粒。

(3)将过滤分离取出的共聚小球颗粒，分别用2～4倍体积比的石油醚和水各洗涤

2～4次，再用相同体积比的乙醇洗涤一次。

(4)再将洗涤的小颗粒置于真空干燥箱中烘干至恒重即得成品，烘箱温度控制在

50～70℃内。

在上述过程中，所述的水溶性烯类单体是丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸-β-羟乙酯、乙烯基吡咯烷酮、丙烯酸、甲基丙烯酸、多元醇(甲基)丙烯酸酯等水溶性烯类单体中的任一种或多种的混合物；所述的交联剂为N，N-二甲基双丙烯酰胺、聚乙二醇双丙烯酸酯等水溶性多烯类单体中的任一种或多种的混合物；所述的悬浮剂为液体石蜡等其它烃类溶剂或硅油；所述的聚合反应引发剂是过氧化物引发剂及其对应的还原剂，例如过硫酸盐——亚硫酸盐或硫代硫酸盐复合引发剂等；所述的分散稳定剂是油包水型乳化剂，例如乳化剂FM或司盘乳化剂(Span)等。

本发明将通常情况下很难溶于水的碳酸乙烯撑酯，溶解在含有丙烯酰胺等水溶性烯类单体的水溶液中，由于此时的水溶性烯类单体一方面作为载体的亲水性改性剂，同时又起到了碳酸乙烯撑酯的助溶剂作，因此使碳酸乙烯撑酯在该溶液中的溶解度显著增加，并能够在该反应中与水溶性多烯类交联剂发生聚合反应得到所需产品。相比现有技术，本发明的聚合反应中直接使用水溶液作为溶剂，不再使用有机溶剂，免去了需洗涤除去有机溶剂的麻烦。不仅操作方便，而且降低了生产成本，也有利于提高聚合产率。

本发明的聚合反应中采用氧化还原引发剂来引发聚合，避免了因聚合温度较高而可能导致碳酸乙烯撑酯在水溶液中分解，使聚合反应能够顺利进行，从而获得理想产率和性能的聚合载体。

具体实施方式

下面给出实施例，并通过实施例作出进一步的说明。

实施例1

(1)在装有搅拌器、球型冷凝管并通氮气保护的100毫升三口瓶中，加入50毫升

液体石蜡，0.04毫升乳化剂FM；

(2)将1.25克碳酸乙烯撑酯，1.25克丙烯酰胺(水溶性烯类单体)，0.75克N，N-

二甲基双丙烯酰胺(交联剂)，0.025克过硫酸钾(引发剂)，0.025克亚硫酸

氢钠(助引发剂)和5毫升水配制成的混合溶液加入到上述三口瓶中并启动

搅拌器，控制搅拌速度为300转/分钟，使水溶液分散成球，先维持水浴30℃

反应6小时，再升温至60℃反应4小时，然后停止反应。

(3)过滤除去液体石蜡，小球分别用石油醚和水各洗涤三次，再用乙醇洗涤一次。

然后置于真空干燥机中烘干至恒重，得粒径为60～120目白色球状颗粒，产率

96％。

经固定化胰蛋白酶实验表明，该活性小球蛋白结合量为232mg/g，固定化胰蛋白酶的酶活性为203U/g(原酶活性为5.5U/mg)。

实施例2

(1)在同实施例1的三口瓶中，加入50毫升液体石蜡，0.02毫升乳化剂Span-80，

(2)向瓶中加入由1.25克碳酸乙烯撑酯，1.25克丙烯酸-β-羟乙酯，0.125克N，N-

二甲基双丙烯酰胺，0.025克过硫酸钾，0.025克硫代硫酸钠和10毫升水配

制成的溶液，控制搅拌速度为800转/分钟，使水溶液分散成球，先维持水浴

30℃反应6小时，再升温至60℃反应4小时，然后停止反应。

(3)同实施例1(3)，得白色球状颗粒，粒径为80～200目，产率94％。

经固定化胰蛋白酶实验表明，该活性小球蛋白结合量为113mg/g，固定化胰蛋白酶的酶活性为118U/g(原酶活性为5.5U/mg)。

实施例3

(1)在同实施例1三口瓶中，加入50毫升液体石蜡，0.05毫升乳化剂FM。

(2)向瓶中加入由0.25克碳酸乙烯撑酯，2.00克甲基丙烯酸，0.25克N，N-二甲

基双丙烯酰胺，0.010克过硫酸钾，0.010克硫代硫酸钠和9毫升水配制成的

溶液并搅拌，搅拌速度为400转/分钟，使水溶液分散成球，先维持水浴30℃

反应2小时，再升温至60℃反应2小时，然后停止反应。

(3)在同实施例1(3)，得白色球状颗粒，粒径为80～150目，产率90％。

经固定化胰蛋白酶实验表明，该活性小球蛋白结合量为178mg/g，固定化胰蛋白酶的酶活性为188U/g(原酶活性为5.5U/mg)。

实施例4

(1)在同实施例1三口瓶中，加入50毫升硅油，0.03毫升乳化剂FM

(2)向瓶中加入由1.50克碳酸乙烯撑酯，1.00克乙烯基吡咯烷酮，0.5克聚乙二

醇双丙烯酸酯，0.025克过硫酸钾，0.025克亚硫酸氢钠和5毫升水配制成的

溶液并启动搅拌，搅拌速度为150转/分钟，使水溶液分散成球，先维持水浴

45℃反应8小时，再升温至75℃反应1小时，然后停止反应。

(3)在同实施例1(3)，得白色球状颗粒，粒径为60～140目，产率96％。

经固定化胰蛋白酶实验表明，该活性小球蛋白结合量为186mg/g，固定化胰蛋白酶的酶活性为126U/g(原酶活性为5.5U/mg)。

实施例5

(1)在在同实施例1三口瓶中加入50毫升液体石蜡，0.01毫升乳化剂FM。

(2)然后向瓶中加入由0.75克碳酸乙烯撑酯，1.00克甲基丙烯酸-β-羟乙酯，0.75

克丙烯酸，0.125克N，N-二甲基双丙烯酰胺，0.025克过硫酸钾，0.025克亚

硫酸氢钠和3毫升水配制成的溶液，控制搅拌速度为500转/分钟，使水溶液

分散成球，先维持水浴30℃反应6小时，再升温至60℃反应4小时，然后

停止反应。

(3)在同实施例1(3)，得白色球状颗粒，粒径为80～150目左右，产率92％。

经固定化胰蛋白酶实验表明，该活性小球蛋白结合量为211mg/g，固定化胰蛋白酶的酶活性为196U/g(原酶活性为5.5U/mg)。

实施例6

(1)在同实施例1三口瓶中加入50毫升液体石蜡，0.04毫升乳化剂FM

(2)向瓶中加入由0.5克碳酸乙烯撑酯，2.0克丙烯酸葡萄糖酯，0.125克N，N-二

甲基双丙烯酰胺，0.025克过硫酸钾，0.025克亚硫酸氢钠和4毫升水配制成

的溶液，控制搅拌速度为500转/分钟，使水溶液分散成球，先维持水浴30℃

反应6小时，再升温至60℃反应4小时，然后停止反应。

(3)在同实施例1(3)，得白色球状颗粒，粒径为100～200目，产率96％。

经固定化胰蛋白酶实验表明，该活性小球蛋白结合量为110mg/g，固定化胰蛋白酶的酶活性为95U/g(原酶活性为5.5U/mg)。

Claims

1.一种具有反应性环碳酸酯基固定化酶载体的合成方法，其特征在于其合成步骤为：

(1)将水溶性烯类单体、碳酸乙烯撑酯单体、水溶性的多烯类交联剂和引发剂溶于水中，均匀混合后使单体溶解成为均相溶液，其中水的重量是水溶性烯类单体重量的2～10倍；碳酸乙烯撑酯单体占水溶性烯类单体重量10％～150％；水溶性的多烯类交联剂占碳酸乙烯撑酯和水溶性烯类单体总量的3％～30％；引发剂的用量是单体总量的0.2～2％；

(2)将以上混合液加入到在惰性气体保护下的含有分散稳定剂的悬浮剂中并进行搅拌至水溶液分散成球形，其中分散稳定剂为悬浮剂重量的0.1％～1％，其搅拌速度为100～1000转/分钟；然后在15～40℃范围内保温1～8小时，再升温至60～80℃范围内保温1～6小时，则产生细度为40目～200目的共聚小球颗粒；

(3)将过滤分离取出的共聚小球颗粒，分别用2～4倍体积比的石油醚和水各洗涤2～4次，再用相同体积比的乙醇洗涤一次；

(4)再将洗涤的小颗粒置于真空干燥箱中烘干至恒重即得成品，烘箱温度控制在50～70℃内；

在上述过程中，所述的水溶性烯类单体是丙烯酰胺、甲基丙烯酸-β-羟乙酯、乙烯基吡咯烷酮、丙烯酸、甲基丙烯酸、多元醇(甲基)丙烯酸酯水溶性烯类单体中的任一种或多种的混合物；所述的水溶性的多烯类交联剂为N，N-二甲基双丙烯酰胺、聚乙二醇双丙烯酰胺水溶性多烯类交联剂中的任一种或多种的混合物；所述的悬浮剂为液体石蜡或硅油；所述的引发剂是过硫酸盐——亚硫酸盐或硫代硫酸盐复合引发剂；所述的分散稳定剂是油包水型乳化剂。