CN114736988A - 检测新冠病毒SARS-CoV-2的特异性引物、探针及基因芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测新冠病毒SARS‑CoV‑2的特异性引物、探针及基因芯片，属于分子生物学核酸检测技术，为了解决实现现场检测、并减少检测过程中出现的污染，提高病毒RNA检测灵敏性，特异性等的技术问题，本发明提供了一种用于检测新冠病毒SARS‑CoV‑2的探针和引物，连至专用基因芯片上，可实现对N基因低至到约4拷贝的检测灵敏度，实现了对S基因低至约1拷贝的检测灵敏度，可用于现场检测或家用检测。

Description

检测新冠病毒SARS-CoV-2的特异性引物、探针及基因芯片

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测新冠病毒SARS-CoV-2的特异性引物、探针及基因芯片。

背景技术

2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019,COVID-19)，是一种由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的肺炎，导致全球数千万人感染，百万人死亡。由于新冠病毒的人传人已经被临床数据证实，为了更好地避免交叉感染，急需要开发对新冠病毒的准确、灵敏、可现场操作的检测手段。2019年1月5日，新冠病毒的RNA基因序列被公布，为基于核酸序列的新冠病毒检测手段的研发鉴定了基础。其中逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，或者RT-PCR)检测法是最早被报导和应用的检测SARS-CoV-2病毒的有效手段。由于RT-PCR检测需要配备昂贵的实时荧光定量PCR仪器以及专业人员操作，RT-PCR法尚不是病毒的现场检测手段。

除了要尽量实现对病毒的现场检测，一个良好的检测技术还需要尽可能地增加检测灵敏度以减少假阴性结果，以及增加测结果的可靠性以减少假阳性结果。目前广泛使用RT-PCR法需要使用昂贵的实时荧光定量PCR仪器以及专业人员操作，而这些仪器一般只在大型医院和专业检测机构才会配备，因此无法实现现场检测，这就导致了疑似病人需要去人员集中的大型医院或者专业检测机构进行病毒检测，而目前已经证实新冠病毒能够人传人，这就大大增加了携带新冠病毒的疑似病人传染他人的几率，以及未携带新冠病毒的病人被他人感染的几率。因此，实现对病毒的现场检测极为重要。

RT-LAMP是一种对核酸进行恒温扩增的方法，用这种方法来检测新冠病毒RNA已经有类似报道，但其对新冠病毒检测的灵敏度还不够高，需病毒RNA在10拷贝左右才能检测出来。另外，RT-LAMP法需要在较高的温度下进行(60℃)，同时需要检测荧光，因此也需要价格不菲的能够精确控温和检测荧光的设备，尚不能实现真正意义上的现场检测。

目前基因编辑的方法也被应用于检测病毒RNA，但是基因编辑检测方法含多个步骤，操作更为繁琐；另外基因编辑法来检测病毒灵敏尚未达到单拷贝。

基于抗体的病毒检测方法结合侧流胶体金试纸条一般能够实现现场检测，但是基于抗体的检测方法其抗体的开发时间耗时较长需要数周乃至数月，难以在病毒爆发的初期被开发和应用；另外，抗体检测方法的灵敏度一般也不及核算检测方法。

目前有通过核酸恒温扩增(如ERA或RPA)对病毒核酸进行检测，但检测RNA病毒(例如新冠病毒SARS-CoV-2)比检测DNA病毒会更加困难，因为DNA通常可以直接被扩增，而RNA需要首先通过逆转录过程(reverse transcription或RT)，先将RNA逆转录为cDNA才能实现后续的指数扩增。然而RNA转录成cDNA的过程与后续cDNA的指数扩增过程所使用的反应条件(例如温度)和试剂(例如是否需要激活剂)通常存在不兼容或者不协调的难题。因此，往往需要将两部分别进行操作(或者强制性同锅进行，然而这样通常会大大降低扩增效果)。再加上ERA核酸扩增方法的灵敏度高，任何多的开管步骤都会大大增加对反应体系的污染和干扰的可能性，从而降低检测结果的可靠性，因此实现全程闭管地检测病毒RNA很重要。

关于假阴性检测结果，这一般是由于检测方法的灵敏度不足导致的，这让在初期被新冠病毒感染的病人难以得到及时诊断和治疗，因此增加检测手段的灵敏度很重要。另一方面假阳性的检测结果会让未携带新冠病毒的病人被误诊为新冠病毒感染者，因此在后续集中隔离期间也会大大增加他们后续被新冠病毒感染的风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题为如何实现既能全程闭管地检测RNA以达到尽可能避免对反应体系的污染，又能够将逆转录步骤同后续对cDNA的指数扩增实质性分开使逆转录步骤和后续恒温扩增步骤都在各自最优条件下进行，实现现场检测、提高病毒RNA检测灵敏性，特异性。

为了解决上述技术问题，本发明具体技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物，包括以下一种或多种引物和探针：

a.用于特异性检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因的exo探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，用于特异性检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；

b.用于特异性检测新冠病毒SARS-CoV-2S基因的exo探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，用于特异性检测新冠病毒SARS-CoV-2S基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

优选地，所述探针和引物由用于检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因的exo探针和引物与用于检测新冠病毒SARS-CoV-2S基因的exo探针和引物组成。

本发明第二方面提供了所述的探针和引物在制备检测新冠病毒SARS-CoV-2的基因检测芯片中的应用。

本发明第三方面提供了一种检测新冠病毒SARS-CoV-2的基因芯片，包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1或4所示任意一个或者两个寡核苷酸片段。

本发明第四方面提供了一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包括所述的基因芯片与扩增新冠病毒SARS-CoV-2基因的试剂；其中，扩增新冠病毒SARS-CoV-2基因的试剂包括SEQ ID NO：2～3和/或SEQ ID NO：5～6所示引物对。

优选地，所述试剂盒还含有阳性标准品，所述阳性标准品的制备方法为：

步骤1：将待测病毒RNA的全长或者部分片段所对应的DNA序列通过基因合成得到相应的DNA片段，再克隆到含T7启动子的质粒载体中；

步骤2：将步骤1制备好的含病毒基因的质粒载体用限制性内切酶将病毒基因片段的3’-端切断，纯化得到线性化后的质粒；

步骤3：利用T7转录酶对步骤2得到的线性化后的质粒进行体外转录，转录产物经纯化后得到待测病毒RNA的阳性标准品。

优选地，所述试剂盒当含有上述的探针和引物时：用于检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因或S基因的exo探针浓度均为120-150nM，引物的工作浓度均为400-500nM；当所述试剂盒含有用于检测N基因和S基因的探针和引物组合时，所述exo探针的工作浓度均为30nM，所述引物的工作浓度均为100nM。

本发明第五方面提供了一种检测病毒RNA的方法，所述方法为利用全程闭管RNA指数扩增法对病毒RNA进行检测；所述全程闭管RNA指数扩增法是指在同一个反应管中，在不开盖的条件下，分步完成逆转录RT与指数重组酶扩增ERA反应。

1)逆转录RT：在反应管中，将病毒RNA核酸样品、RNA酶抑制剂、探针及引物、检测试剂、不含ERA激活剂的RT-ERA反应试剂混合，将ERA激活剂加在反应管瓶盖内，将反应管合盖后，置于37℃条件下60s进行逆转录反应，得到cDNA；

2)指数重组酶扩增ERA反应：将步骤1)逆转录后的反应管离心，使瓶盖中的ERA激活剂与步骤1)中所得到的反应液混合，然后于40℃并保持4min，振荡后离心，将反应管置于40℃下保持26min，得到核酸扩增液；

3)通过专用基因芯片对N/S基因exo探针进行偶联，并加入步骤2)得到的核酸扩增液进行检测。

优选地，所述病毒为新冠病毒SARS-CoV-2；所述检测试剂为所述的探针和引物。

优选地，步骤1)所述ERA激活剂为Mg(OAc)₂。

优选地，步骤1)所述RT-ERA(逆转录-指数重组酶扩增)反应试剂还包括额外加入的RNase酶抑制剂、核酸酶(exo探针用exonuclease III)。

优选地，在50μl反应体系中所额外加入的酶的量为：RNA酶抑制剂为5U，exonuclease III酶为100U。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

1.本发明开发的全程闭管RNA指数扩增法可以方便与基因芯片搭配，使用读取设备，基层的诊所和医院就能够配备，从而可以实现现场检测；检测方法中的核酸扩增时间为30min，比RT-PCR法需要两小时左右更节省时间。另外，本发明中还设计了偶联基因芯片的探针，检测2-3min内出结果，进而实现家用快速检测，有助于避免人与人之间的交叉传播，有助于控制新冠病毒爆发。超灵敏现场检测以及最大可能地避免污染以保障检测结果的可靠性。

2.本发明使用exo探针可实现了对N基因低至到1ag(约4拷贝)的检测灵敏度，实现了对S基因低至1拷贝(0.05拷贝/μl，约20微升样品)的检测灵敏度，单拷贝检测灵敏度也是病毒RNA检测的极限灵敏度，检测手段为电场信号检测，此为基因芯片检测目前为止的最高灵敏度。

附图说明

图1全程闭管RNA指数扩增法(WEPEAR)实现对病毒核酸RNA的超灵敏现场检测示意图；A)RT-ERA扩增示意图；B)WEPEAR工作原理示意图；

图2通过对线性化的含T7启动子的质粒进行体外转录，得到单条带的SARS-CoV-2的N基因片段(A)和S基因片段(B)，ladder为DNAmarker，N-RNA代表转录后得到的N基因片段；S-RNA代表转录后得到的S基因片段。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

本发明开发了一种全程闭管RNA指数扩增法(WEPEAR法，即whole-courseencapsulated procedure for exponential amplification from RNA)，该方法结合了RT-ERA(reverse transcription exponential recombinase amplification)核酸扩增实现了对新冠病毒RNA的超灵敏(可以达到单拷贝灵敏度)现场检测，如图1所示。

本发明术语“exo探针”，反应中需用exo酶激活，例如exonuclease III，因而叫做exo探针；

实施例1：用T7转录酶制备SARS-CoV-2新冠病毒的N和S基因片段作为阳性对照品。

将新冠病毒S和N基因序列提交至朗晶生物科技(中国上海)进行基因合成。

合成的新冠病毒N基因序列为SEQ ID No.7：

CATATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGTAAAAGCTT。

合成的新冠病毒S基因序列为SEQ ID No.8：

CATATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATAAAAGCTT。

分别将上述N基因与S基因克隆到含有NdeI和HindIII酶切位点的pET-28a(+)载体中。获得的质粒分别命名为pET-28(+)_SARS-CoV-2_N和pET-28(+)_SARS-CoV-2_S。随后使用HindIII限制性内切酶将载体线性化，步骤如下：

在50μl的反应体系中，加入40μl的pET-28(+)_SARS-CoV-2_N或pET-28(+)_SARSCoV-2_S质粒溶液，5μl的HindIII和5μl的10×CutSmart缓冲液，所有操作在冰上进行。随后将反应溶液置于37℃反应4小时以完成质粒线性化，之后使用琼脂糖胶电泳来验证实验结果确保线性化成功，随后使用胶回收纯化试剂盒(诺唯赞#DC301)将线性化的质粒纯化。

接下来使用诺唯赞(#TR101-01)的T7转录试剂盒进行体外转录。在20μl的反应体系中，加入8μl上述制备的线性化质粒，2μl的10×缓冲液，2μl的ATP，2μl的GTP，2μl的UTP，2μl的CTP以及2μl的T7 RNA聚合酶混合物(含有T7 RNA聚合酶以及其它的必要成分)。于37℃反应4小时至过夜。接下来在反应管中加入1μl的DNase I(试剂盒中含有)并将反应管在37℃继续孵育15min以完全降解线性质粒模板。将20μl的转录反应液用超纯水稀释到150μl，运用先达基因RNA快速纯化试剂盒(#NR202-50T)纯化后得到SARS-CoV-2新冠病毒的N和S基因片段，即SARS-CoV-2的RNA阳性对照品。琼脂糖胶电泳验证可发现有相应长度的单条带(图2)。

实施例2用exo探针偶联基因芯片，并检测新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的N基因或S基因。

关于通过用exo探针检测核酸扩增产物，需要设计正向引物、反向引物、以及exo探针，正向和反向引物的长度为33bp左右(30-35bp)，能够扩增100-200bp长度的片段。exo探针可与基因片段中间部分互补结合。exo探针本身不具有作为引物的功能。当不存在核酸扩增子情况下，exo探针处于单链状态，当核酸扩增子中有互补序列，则发生结合反应形成杂交双链，从而带来电场差异，从而实现检测。

本实施例中所使用的引物和探针序列和结如下：

N基因exo正向引物:tttggtggaccctcagattcaactggcagtaac，SEQ ID No.2；

N基因exo反向引物:gaatttaaggtcttccttgccatgttgagtgag，SEQ ID No.3；

N基因exo探针:tattattgggtaaaccttggggccgacgttgtt，SEQ ID No.1；

S基因exo正向引物:gtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaac，SEQ ID No.5；

S基因exo反向引物:cattggaaaagaaaggtaagaacaagtcctgag，SEQ ID No.6；

S基因exo探针:cctgcatacactaattctttcacacgtggtg，SEQ ID No.4。

本实施例用exo探针和芯片流程实现“样品进-结果出”地对SARS-CoV-2的N基因或S基因超灵敏现场检测。RT-ERA反应使用的是来自先达基因公司GenDx Biotech Co.,Ltd.的RT-基础型核酸扩增试剂盒(#KS102)。在50μl的反应体系中，将2.5μl的exo正向引物(10μM)，2.5μl的exo反向引物(10μM)，15μl的exo荧光探针(200μM)，1μl的murine RNase抑制剂(5U/μl)(Vazyme，#R301-01)，1μl的RNA样本，20μl的超纯水，以及0.5μl的200U/μl的exonuclease III(thermo scientific，#EN0191)依次加进20μl的DA溶解液中，得到约48μl的反应液，再用移液器将此反应液加入干粉反应管中。干粉反应管含有除Mg(OAc)₂以外RT-ERA反应所需的所有其它组分。接着将2μl的Mg(OAc)₂激活剂加入反应管盖内，然后轻轻将反应管盖好，由于表面张力的缘故，Mg(OAc)₂会留在盖子内而不会流进反应液里。将此反应管置于37℃反应60s使逆转录过程发生，病毒RNA被转录为cDNA，接下来将反应管短暂离心，Mg(OAc)₂激活剂在离心力作用下被收集到反应管底并与48μl的反应液混合，将反应管振荡并离心，此时Mg(OAc)₂与反应体系均匀混合开始激活核酸扩增反应。首先将反应管在40℃温热4min实现预反应，接下来将PCR管子再振荡混匀并短暂离心，将反应管置于40℃继续反应26min，核酸扩增反应结束。一般情况下也需要同时设置一个不含病毒RNA的核酸扩增反应作为阴性对照以排除可能发生的假阳性结果。接下来，将反应管样品进行不断稀释，直至计算核酸RNA至1ag，进入基因芯片上样，检测结合电场信号，发现依然可以检测出差异。结果表明，低至1ag的核酸样品可以被快速方便地检测出来，因而这是一个快速、超灵敏的现场检测方案。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京伯诺生物科技有限公司

<120> 检测新冠病毒SARS-CoV-2的特异性引物、探针及基因芯片

<130> P210010

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tattattggg taaaccttgg ggccgacgtt gtt 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

tttggtggac cctcagattc aactggcagt aac 33

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gaatttaagg tcttccttgc catgttgagt gag 33

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cctgcataca ctaattcttt cacacgtggt g 31

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc agaac 35

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

cattggaaaa gaaaggtaag aacaagtcct gag 33

<210> 7

<211> 315

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2 N

<400> 7

catatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac gtttggtgga 60

ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg atcaaaacaa 120

cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct cactcaacat 180

ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac caatagcagt 240

ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg tggtgacggt 300

aaaatgtaaa agctt 315

<210> 8

<211> 267

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2 S

<400> 8

catatgtttg tttttcttgt tttattgcca ctagtctcta gtcagtgtgt taatcttaca 60

accagaactc aattaccccc tgcatacact aattctttca cacgtggtgt ttattaccct 120

gacaaagttt tcagatcctc agttttacat tcaactcagg acttgttctt acctttcttt 180

tccaatgtta cttggttcca tgctatacat gtctctggga ccaatggtac taagaggttt 240

gataaccctg tcctaccata aaagctt 267

Claims (10)

1.一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物，其特征在于，包括以下一种或多种引物和探针：

a.用于特异性检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因的exo探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，用于特异性检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；

b.用于特异性检测新冠病毒SARS-CoV-2S基因的exo探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，用于特异性检测新冠病毒SARS-CoV-2S基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

2.如权利要求1所示的探针和引物，其特征在于，所述探针和引物由用于检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因的exo探针和引物与用于检测新冠病毒SARS-CoV-2S基因的exo探针和引物组成。

3.权利要求1所述的探针和引物在制备检测新冠病毒SARS-CoV-2的基因检测芯片中的应用。

4.一种检测新冠病毒SARS-CoV-2的基因芯片，其特征在于，包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1或4所示任意一个或者两个寡核苷酸片段。

5.一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述的基因芯片与扩增新冠病毒SARS-CoV-2基因的试剂；其中，扩增新冠病毒SARS-CoV-2基因的试剂包括SEQ ID NO：2～3和/或SEQ ID NO：5～6所示引物对。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性标准品，所述阳性标准品的制备方法为：

步骤1：将待测病毒RNA的全长或者部分片段所对应的DNA序列通过基因合成得到相应的DNA片段，再克隆到含T7启动子的质粒载体中；

步骤2：将步骤1制备好的含病毒基因的质粒载体用限制性内切酶将病毒基因片段的3’-端切断，纯化得到线性化后的质粒；

步骤3：利用T7转录酶对步骤2得到的线性化后的质粒进行体外转录，转录产物经纯化后得到待测病毒RNA的阳性标准品。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒当含有权利要求1所述的探针和引物时：用于检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因或S基因的exo探针浓度均为120-150nM，引物的工作浓度均为400-500nM；当所述试剂盒含有权利要求2所述的探针和引物组合时，用于检测N基因和S基因的exo探针的工作浓度均为30nM，引物的工作浓度均为100nM。

8.一种检测病毒RNA的方法，其特征在于，所述方法为利用全程闭管RNA指数扩增法对病毒RNA进行检测；所述全程闭管RNA指数扩增法是指在同一个反应管中，在不开盖的条件下，分步完成逆转录RT与指数重组酶扩增ERA反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤如下：

1)逆转录RT：在反应管中，将病毒RNA核酸样品、RNA酶抑制剂、探针及引物、检测试剂、不含ERA激活剂的RT-ERA反应试剂混合，将ERA激活剂加在反应管瓶盖内，将反应管合盖后，置于37℃条件下60s进行逆转录反应，得到cDNA；

2)指数重组酶扩增ERA反应：将步骤1)逆转录后的反应管离心，使瓶盖中的ERA激活剂与步骤1)中所得到的反应液混合，然后于40℃并保持4min，振荡后离心，将反应管置于40℃下保持26min，得到核酸扩增液；

3)通过专用基因芯片对N/S基因exo探针进行偶联，并加入步骤2)得到的核酸扩增液进行检测。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述病毒为新冠病毒SARS-CoV-2；所述检测试剂为权利要求1或2任一项所述的探针和引物。

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