CN114717167B - 一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法及应用 - Google Patents

一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法及应用，所述制备方法包括以下步骤：将经过活化的乳酸菌菌种接种于种子培养基中培养，得到种子液；将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，在发酵稳定初期终止发酵，得到发酵液；发酵培养基中含有猪胆盐；将发酵液进行离心得到菌体；将菌体进行消化系统应激处理，得到经消化系统应激处理后的菌体；将经消化系统应激处理后的菌体稀释并涂布于平板上进行培养，筛选典型菌落；重复上述操作，得到乳酸菌。本发明通过发酵过程条件控制及连续经过消化系统应激反应来筛选菌体，提高乳酸菌对消化系统的耐受性。

Description

一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法及 应用
技术领域
本发明属于乳酸菌的生产技术领域，具体涉及一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法及应用。
背景技术
乳酸菌是人体肠道中重要的益生菌，具有维持和重建机体肠道微生态、抑制肠道病原菌、改善免疫、增强抗氧化能力等重要益生功能。然而，乳酸菌进入机体后，消化系统中口腔中的溶酶菌、胃酸环境（pH2.0~5.0）、小肠胆盐和胰酶环境（胆盐含量0.1~0.3%，胰酶含量0.1%）会抑制其活性或杀死乳酸菌，对其益生功能有较大影响。
因此，乳酸菌在肠道中发挥其益生功能首要条件是对消化系统中的溶菌酶、胃酸和胆盐具有一定的耐受性。消化系统对乳酸菌的应激是连续性的，消化道上一级引起的代谢变化会影响下一级的反应，因此乳酸菌对消化系统不同部位的耐受能力并不代表此乳酸菌可以到达肠道发挥其益生作用。
目前，对乳酸菌进行消化系统连续应激处理来筛选菌株，确保其稳定发挥益生功能方面的报道较少。
因此，如何提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法，使得制备得到的菌粉可以在机体发挥益生功能，成为目前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法。本发明通过发酵过程条件控制及连续经过消化系统应激反应来筛选菌体，提高植物乳杆菌对消化系统的耐受性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将经过活化的乳酸菌菌种接种于种子培养基中进行培养，得到种子液；
（2）将步骤（1）得到的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，在发酵稳定初期终止发酵，得到发酵液；所述发酵培养基中含有猪胆盐；
（3）将步骤（2）得到的发酵液进行离心，得到菌体；
（4）将步骤（3）得到的菌体进行消化系统应激处理，得到经消化系统应激处理后的菌体；
（5）将步骤（4）得到的经消化系统应激处理后的菌体稀释并涂布于平板上进行培养，筛选典型菌落；
（6）将步骤（5）得到的典型菌落重复步骤（1）-（5）的操作，得到在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌。在本发明中，所述乳酸菌包括植物乳杆菌和/或乳酸片球菌。
在本发明中，步骤（1）中，所述活化包括以下步骤：将-80℃保藏的乳酸菌菌种在MRS平板上划线，37±1℃培养48-72 h，挑选典型菌落，得到经过活化的乳酸菌菌种。
所述MRS平板的制备方法包括以下步骤：向MRS液体培养基添加琼脂，琼脂添加量为13-18 g/L，灭菌后倒平板备用。MRS液体培养基的成分如下所述。
在本发明中，步骤（1）中，所述培养包括一级种子培养和二级种子培养，具体包括以下步骤：
（a）一级种子培养：将经过活化的乳酸菌菌种接种于装有种子培养基的试管中，37±1℃培养10-20 h（例如可以是10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h等），得到所述一级种子液；
（b）二级种子培养：将步骤（a）得到的一级种子液按2-6%（例如可以是2%、3%、4%、5%、6%等）接种量接种于锥形瓶中，37±1℃培养9-15 h（例如可以是9 h、10 h、11 h、12 h、13 h、14 h、15 h等），得到二级种子液。
在本发明中，步骤（1）中，所述培养的温度为37±1℃；
所述种子培养基按质量浓度计包括以下组分：蛋白胨5-10 g/L（例如可以是5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L等）、酵母浸粉5-10 g/L（例如可以是5 g/L、6 g/L、7g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L等）、葡萄糖15-20 g/L（例如可以是15 g/L、16 g/L、17 g/L、18g/L、19 g/L、20 g/L等）、柠檬酸三铵2-5 g/L（例如可以是2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L等）、乙酸钠3-5 g/L（例如可以是3 g/L、4 g/L、5 g/L等）、磷酸氢二钾2-3 g/L（例如可以是2 g/L、3 g/L等）、硫酸镁0.2-0.5 g/L（例如可以是0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L等）、硫酸锰0.05-0.2 g/L（例如可以是0.05 g/L、0.1 g/L、0.15 g/L、0.2 g/L等）和吐温-80 0.8-1.2 g/L（例如可以是0.8 g/L、0.9 g/L、1 g/L、1.1 g/L、1.2 g/L等），所述种子培养基的溶剂为水，pH控制在6.6-7.0（例如可以是6.6、6.7、6.8、6.9、7.0等）。
在本发明中，步骤（2）中，所述接种的接种量为2-8%（例如可以是2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%等），所述发酵培养基按质量浓度计包括蛋白胨10-15 g/L（例如可以是10 g/L、11 g/L、12 g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L等）、酵母浸粉10-15 g/L（例如可以是10 g/L、11 g/L、12g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L等）、葡萄糖5-10 g/L（例如可以是5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L等）、麦芽糖14-18 g/L（例如可以是14 g/L、15 g/L、16 g/L、17 g/L、18 g/L等）、柠檬酸三铵2-4 g/L（例如可以是2 g/L、3 g/L、4 g/L等）、乙酸钠4-6 g/L（例如可以是4 g/L、5 g/L、6 g/L等）、磷酸氢二钾2-4 g/L（例如可以是2 g/L、3 g/L、4 g/L等）、硫酸镁0.4-0.6 g/L（例如可以是0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L等）、硫酸锰0.1-0.3 g/L（例如可以是0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L等）、吐温-80 0.8-1.2 g/L（例如可以是0.8 g/L、1 g/L、1.2 g/L等）和猪胆盐0.1-0.3 g/L（例如可以是0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L等），所述发酵培养基的溶剂为水，pH自然。
在本发明中，步骤（2）中，所述发酵培养的条件为：接种前pH为6.6-7.0（例如可以是6.6、6.7、6.8、6.9、7.0等）；
所述发酵包括第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段，所述第一发酵阶段为发酵开始至发酵后1.5-3.5 h（例如可以是1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h等），所述第一发酵阶段的pH为6.8-7.2（例如可以是6.8、6.9、7.0、7.1、7.2等）；所述第二发酵阶段为第一发酵阶段结束至对数末期，所述第二发酵阶段的pH为4.0-4.5（例如可以是4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5等）；所述第三发酵阶段为第二发酵阶段结束至第二发酵阶段结束后1-2 h（例如可以是1 h、1.5 h、2 h等），所述第三发酵阶段的pH为7.5-8.0（例如可以是7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0等）；
所述第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段中发酵培养的温度为37±1℃，搅拌速度40-80 r/min（例如可以是40 r/min、50 r/min、60 r/min、70 r/min、80 r/min等）。
首先，在发酵前期（第一发酵阶段）调节pH与口腔唾液酸度一致，随后（第二发酵阶段）控制发酵pH接近胃液酸度，发酵进入稳定期后（第三发酵阶段）调节pH与肠液酸度一致，使菌体连续经过不同酸度的应激，提高其对不同酸度的耐受能力。
在本发明中，步骤（4）中，所述消化应激处理包括依次进行的模拟唾液应激处理、模拟胃液应激处理和模拟肠液应激处理；所述模拟唾液应激处理的温度为37±1℃，时间为5-10 min（例如可以是5 min、6 min、7 min、8 min、9 min、10 min等）；所述模拟胃液应激处理的温度为37±1℃，时间为2-4 h（例如可以是2 h、3 h、4 h等）；所述模拟肠液应激处理的温度为37±1℃，时间为1-2 h（例如可以是1 h、1.5 h、2 h等）；所述菌体进行模拟唾液应激处理的初始浓度为108-1010 CFU/mL（例如可以是108 CFU/mL、2×108 CFU/mL、8×108 CFU/mL、9×108 CFU/mL、109 CFU/mL、2×109 CFU/mL、3×109 CFU/mL、4×109 CFU/mL、5×109CFU/mL、6×109 CFU/mL、7×109 CFU/mL、8×109 CFU/mL、9×109 CFU/mL、1010 CFU/mL等）。
在本发明中，所述模拟唾液应激处理中采用的模拟唾液按质量浓度计包括以下组分：氯化钾0.4 g/L、氯化钠0.4 g/L、一水合磷酸二氢钠0.8 g/L、氯化镁0.05 g/L、一水合氯化钙0.8 g/L和溶菌酶100 mg/L，所述溶菌酶的酶活≥5000 U/mg（例如可以是5000 U/mg、5500 U/mg、6000 U/mg、6500 U/mg、7000 U/mg、7500 U/mg、8000 U/mg等），所述模拟唾液的pH为6.8-7.2（例如可以是6.8、6.9、7.0、7.1、7.2等）；
所述模拟胃液应激处理中采用的模拟胃液按质量浓度计包括以下组分：氯化钠2g/L和胃蛋白酶12 g/L，所述胃蛋白酶的酶活≥2500 U/mg（例如可以是2500 U/mg、3000 U/mg、3500 U/mg、4000 U/mg、4500 U/mg、5000 U/mg、5500 U/mg等），所述模拟胃液的pH为2-4（例如可以是2、3、4等）；
所述模拟肠液应激处理中采用的模拟肠液按质量浓度计包括以下组分：磷酸二氢钾7 g/L、猪胆盐1-3 g/L（例如可以是1 g/L、2 g/L、3 g/L等）和胰蛋白酶（USP）40 g/L，所述模拟肠液的pH为7-8（例如可以是7、7.5、8等）。
菌体连续经过模拟唾液、模拟胃液和模拟肠液的应激，最终在MRS平板上筛选能经受消化系统应激的菌体。
在本发明中，步骤（6）中，所述步骤（1）-（5）的重复次数为20-30次（例如可以是20次、22次、24次、26次、28次、30次等）。
在本发明中，通过发酵过程条件控制及连续经过消化系统应激反应来筛选菌体，提高乳酸菌对消化系统的耐受性。首先，在发酵前期调节pH与口腔唾液酸度一致，随后控制发酵pH接近胃液酸度，发酵进入稳定期后调节pH与肠液酸度一致，使菌体连续经过不同酸度的应激，提高其对不同酸度的耐受能力。其次，通过将收集的菌体连续经过模拟唾液、模拟胃液和模拟肠液的应激，最终在MRS平板上筛选能经受消化系统应激的菌体。
第二方面，本发明提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌菌粉，所述在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌菌粉是由包括以下步骤的制备方法制得：将采用第一方面所述的制备方法制备得到的在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌继续培养，再依次经过离心、乳化和冻干，得到在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌菌粉。
在本发明中，所述乳化包括以下步骤：将离心得到的菌体和保护剂按照质量比为1:(0.5-1.5)（其中，“0.5-1.5”可以是0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5等）的比例混合，得到乳化液；所述保护剂按质量百分含量计包括海藻糖10-20%（例如可以是10%、12%、14%、16%、18%、20%等）、麦芽糖2-5%（例如可以是2%、3%、4%、5%等）、脱脂乳2-5%（例如可以是2%、3%、4%、5%等）、甘油2-4%（例如可以是2%、3%、4%等）、谷氨酸钠2-4%（例如可以是2%、3%、4%等）和抗环血酸0.5-1%（例如可以是0.5%、0.7%、1%等），所述保护剂的溶剂为水。
其中，所述继续培养包括二级种子扩增培养和发酵培养；所述二级种子扩增培养采用的种子培养基和发酵培养采用的发酵培养基的组成同前所述。
发酵培养的条件为：接种前控制发酵培养基的pH为6.4-6.8（例如可以是6.4、6.5、6.6、6.7、6.8等），发酵过程控制pH 4.5-5.0（例如可以是4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5等），发酵温度37±1℃，搅拌速度40-80 r/min（例如可以是40 r/min、50 r/min、60 r/min、70 r/min、80 r/min等），发酵至稳定初期停止发酵，降温至20℃以下。
第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的制备方法制备得到的在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌或根据第二方面所述的在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌菌粉在制备在人体消化系统内具有高耐受性的益生菌产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过发酵过程条件控制及连续经过消化系统应激反应来筛选菌体，提高乳酸菌对消化系统的耐受性。本发明提供的乳酸菌可以用于制备在人体消化系统内具有高耐受性的益生菌产品。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中，所有菌株均由微康益生菌（苏州）股份有限公司提供，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。植物乳杆菌Lp90保藏编号为CGMCC No.10453，保藏日期为2015年01月27日；乳酸片球菌PA53保藏号为CGMCC No . 18798，保藏日期为2019年11月04日；鼠李糖乳杆菌GG ATCC53103分离自丹麦科汉森有限公司的菌粉。
实施例1
本实施例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，所述植物乳杆菌菌粉的制备方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：
将-80℃保藏的植物乳杆菌菌种在MRS平板上划线，37℃培养48 h。
（2）将菌体二级种子培养后进行发酵培养，二级种子培养和发酵培养分别为：
①一级种子培养：挑选平板典型菌落接种于装有种子培养基的试管中，38℃培养13 h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以2%接种到装有200 mL种子培养基的300 mL三角瓶中，38℃培养10 h；
③发酵培养：将二级种子液以2%接种量接种到装有4 L发酵培养基的5 L发酵罐中，发酵培养，得到发酵液；
上述一级种子培养和二级种子培养所采用的种子培养基包括以下成分：蛋白胨8g/L、酵母浸粉10 g/L、葡萄糖18 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.1 g/L和吐温-80 1 g/L，溶剂为水，pH控制在6.8。
上述发酵培养中所采用的发酵培养基包括以下成分：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉12g/L、葡萄糖7 g/L、麦芽糖14 g/L、柠檬酸三铵3 g/L、乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸锰0.2 g/L、吐温-80 1 g/L和猪胆盐0.2 g/L，溶剂为水，pH自然。
上述发酵的条件为：接种前培养基pH调至6.6；
所述发酵包括第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段，所述第一发酵阶段为发酵开始至发酵后3 h，所述第一发酵阶段的pH为7.0；所述第二发酵阶段为第一发酵阶段结束至对数末期，所述第二发酵阶段的pH为4.2；所述第三发酵阶段为第二发酵阶段结束至第二发酵阶段结束后1 h，所述第三发酵阶段的pH为7.9；
所述第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段中发酵培养的温度为37℃，搅拌速度60 r/min。
（3）将步骤（2）得到的发酵液进行离心，收集菌体；
（4）将步骤（3）得到的菌体进行模拟消化系统应激：
①模拟唾液应激：菌体加入模拟唾液中，37℃应激处理6 min，离心，弃上清；所述菌体进行模拟唾液应激处理的初始浓度为109 CFU/mL。
②模拟胃液应激：将①所得菌体加入模拟胃液，37℃应激处理3 h，离心，弃上清；
③模拟肠液应激：将②所得菌体加入模拟肠液，37℃应激处理2 h，离心，弃上清；
上述所述的模拟唾液、模拟胃液和模拟肠液的配置方法如下。
模拟唾液：称取0.04 g KCl、0.04 g NaCl、0.08 g NaH2PO4·H2O、0.005 g MgCl2和0.08 g CaCl2·H2O溶于80 mL水中，搅拌使其充分溶解，用盐酸溶液调节pH至6.8，加入10mg溶菌酶（酶活≥5000 U/mg），在容量瓶中加水定容至100 mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装-20℃保存，一个月内使用。
模拟胃液：称取0.2g NaCl，加入80 mL水，用盐酸溶液调节pH至3.0，加入1.2 g胃蛋白酶（酶活≥2500 U/mg），在容量瓶中加水定容至100 mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装-20℃保存，一个月内使用。
模拟肠液：称取0.7g KH2PO4溶于25 mL水中，搅拌使其完全溶解，加入19 mL 0.2mol/L NaOH溶液和40 mL水，加入0.15 g猪胆盐，加入4.0 g胰蛋白酶（USP），用0.2 mol/LNaOH溶液调节pH至7.5，加水定容至100 mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装-20℃保存，一个月内使用。
（5）将经过步骤（4）消化系统应激的菌体稀释涂布于MRS平板，培养72 h，计算活菌数，筛选典型菌落；
（6）重复步骤（2）-（5）的操作30次；
（7）将步骤（6）筛选得到的菌体进行二级种子扩培后发酵培养：
①一级种子培养：将平板单菌落接种至装有种子培养基的试管，38℃培养14 h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以2%接种到装有200 mL种子培养基的300 mL三角瓶中，38℃培养10 h；
③发酵培养：将二级种子液以2%接种量接种到装有4 L发酵培养基的5 L发酵罐中，38℃培养，得到发酵液；
上述种子培养基和发酵培养基的组成同步骤（2）所述。
上述发酵培养的条件相关控制点：接种前培养基pH调至6.5，发酵过程控制pH5.0，发酵温度37℃，搅拌速度60 r/min，培养至稳定初期停止发酵，降温至20℃以下。
（8）离心、乳化、冻干：
①离心：将步骤（7）得到的发酵液6500 rpm离心15 min，收集菌体；
②乳化：菌体与保护剂按照质量比1:1混合均匀，制成乳化液；
上述所述保护剂按质量百分含量计包括海藻糖15%、麦芽糖3%、脱脂乳2%、甘油3%、谷氨酸钠2%和抗环血酸0.5%，溶剂为纯水。
③冻干：将乳化液在冻干机中冻干，收集菌粉。
实施例2
本实施例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，所述植物乳杆菌菌粉的制备方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：
将-80℃保藏的植物乳杆菌菌种在MRS平板上划线，37℃培养48 h。
（2）将菌体二级种子培养后进行发酵培养，二级种子培养和发酵培养分别为：
①一级种子培养：挑选平板典型菌落接种于装有种子培养基的试管中，37℃培养13 h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以4%接种到装有200 mL种子培养基的300 mL三角瓶中，37℃培养10 h；
③发酵培养：将二级种子液以2%接种量接种到装有4 L发酵培养基的5 L发酵罐中，发酵培养，得到发酵液；
上述一级种子培养和二级种子培养所采用的种子培养基包括以下成分：蛋白胨9g/L、酵母浸粉8 g/L、葡萄糖17 g/L、柠檬酸三铵4 g/L、乙酸钠3 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸锰0.15 g/L和吐温-80 1.1 g/L，溶剂为水，pH控制在6.9。
上述发酵培养中所采用的发酵培养基包括以下成分：蛋白胨13 g/L、酵母浸粉14g/L、葡萄糖8 g/L、麦芽糖16 g/L、柠檬酸三铵4 g/L、乙酸钠6 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、硫酸镁0.6 g/L、硫酸锰0.3 g/L、吐温-80 0.9 g/L和猪胆盐0.3 g/L，溶剂为水，pH自然。
上述发酵的条件为：接种前培养基pH调至6.8；
所述发酵包括第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段，所述第一发酵阶段为发酵开始至发酵后2.5 h，所述第一发酵阶段的pH为7.1；所述第二发酵阶段为第一发酵阶段结束至对数末期，所述第二发酵阶段的pH为4.3；所述第三发酵阶段为第二发酵阶段结束至第二发酵阶段结束后1.2 h，所述第三发酵阶段的pH为7.8；
所述第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段中发酵培养的温度为37℃，搅拌速度70 r/min。
（3）将步骤（2）得到的发酵液进行离心，收集菌体；
（4）将步骤（3）得到的菌体进行模拟消化系统应激：
①模拟唾液应激：菌体加入模拟唾液中，37℃应激处理8 min，离心，弃上清；所述菌体进行模拟唾液应激处理的初始浓度为1.1×109 CFU/mL。
②模拟胃液应激：将①所得菌体加入模拟胃液，37℃应激处理3.5 h，离心，弃上清；
③模拟肠液应激：将②所得菌体加入模拟肠液，37℃应激处理1.5 h，离心，弃上清；
上述所述的模拟唾液、模拟胃液和模拟肠液的配置方法同实施例1。
（5）将经过步骤（4）消化系统应激的菌体稀释涂布于MRS平板，培养72 h，计算活菌数，筛选典型菌落；
（6）重复步骤（2）-（5）的操作28次；
（7）将步骤（6）筛选得到的菌体进行二级种子扩培后发酵培养：
①一级种子培养：将平板单菌落接种至装有种子培养基的试管，38℃培养13 h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以4%接种到装有200 mL种子培养基的300 mL三角瓶中，38℃培养12 h；
③发酵培养：将二级种子液以4%接种量接种到装有4 L发酵培养基的5 L发酵罐中，38℃培养，得到发酵液；
上述种子培养基和发酵培养基的组成同步骤（2）所述。
上述发酵培养的条件相关控制点：接种前培养基pH调至6.5，发酵过程控制pH5.0，发酵温度37℃，搅拌速度60 r/min，培养至稳定初期停止发酵，降温至20℃以下。
（8）离心、乳化、冻干：
①离心：将步骤（7）得到的发酵液6400 rpm离心14 min，收集菌体；
②乳化：菌体与保护剂按照质量比1:0.9混合均匀，制成乳化液；
上述所述保护剂按质量百分含量计包括海藻糖20%、麦芽糖2%、脱脂乳3%、甘油2%、谷氨酸钠3%和抗环血酸0.6%，溶剂为纯水。
③冻干：将乳化液在冻干机中冻干，收集菌粉。
实施例3
本实施例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，所述植物乳杆菌菌粉的制备方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：
将-80℃保藏的植物乳杆菌菌种在MRS平板上划线，37℃培养48 h。
（2）将菌体二级种子培养后进行发酵培养，二级种子培养和发酵培养分别为：
①一级种子培养：挑选平板典型菌落接种于装有种子培养基的试管中，38℃培养16 h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以5%接种到装有200 mL种子培养基的300 mL三角瓶中，38℃培养13 h；
③发酵培养：将二级种子液以6%接种量接种到装有4 L发酵培养基的5 L发酵罐中，发酵培养，得到发酵液；
上述一级种子培养和二级种子培养所采用的种子培养基包括以下成分：蛋白胨10g/L、酵母浸粉6 g/L、葡萄糖19 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、硫酸镁0.3 g/L、硫酸锰0.09 g/L和吐温-80 0.9 g/L，溶剂为水，pH控制在6.8。
上述发酵培养中所采用的发酵培养基包括以下成分：蛋白胨11 g/L、酵母浸粉12g/L、葡萄糖6 g/L、麦芽糖14 g/L、柠檬酸三铵3 g/L、乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、硫酸镁0.45 g/L、硫酸锰0.15 g/L、吐温-80 1.1 g/L和猪胆盐0.18 g/L，溶剂为水，pH自然。
上述发酵的条件为：接种前培养基pH调至6.7；
所述发酵包括第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段，所述第一发酵阶段为发酵开始至发酵后2.3 h，所述第一发酵阶段的pH为6.9；所述第二发酵阶段为第一发酵阶段结束至对数末期，所述第二发酵阶段的pH为4.1；所述第三发酵阶段为第二发酵阶段结束至第二发酵阶段结束后2 h，所述第三发酵阶段的pH为8；
所述第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段中发酵培养的温度为37℃，搅拌速度75 r/min。
（3）将步骤（2）得到的发酵液进行离心，收集菌体；
（4）将步骤（3）得到的菌体进行模拟消化系统应激：
①模拟唾液应激：菌体加入模拟唾液中，37℃应激处理9 min，离心，弃上清；所述菌体进行模拟唾液应激处理的初始浓度为1.2×109 CFU/mL。
②模拟胃液应激：将①所得菌体加入模拟胃液，37℃应激处理4 h，离心，弃上清；
③模拟肠液应激：将②所得菌体加入模拟肠液，37℃应激处理1.2 h，离心，弃上清；
上述所述的模拟唾液、模拟胃液和模拟肠液的配置方法同实施例1。
（5）将经过步骤（4）消化系统应激的菌体稀释涂布于MRS平板，培养72 h，计算活菌数，筛选典型菌落；
（6）重复步骤（2）-（5）的操作27次；
（7）将步骤（6）筛选得到的菌体进行二级种子扩培后发酵培养：
①一级种子培养：将平板单菌落接种至装有种子培养基的试管，38℃培养13 h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以5%接种到装有200 mL种子培养基的300 mL三角瓶中，38℃培养10 h；
③发酵培养：将二级种子液以5%接种量接种到装有4 L发酵培养基的5 L发酵罐中，38℃培养，得到发酵液；
上述种子培养基和发酵培养基的组成同步骤（2）所述。
上述发酵培养的条件相关控制点：接种前培养基pH调至6.4，发酵过程控制pH4.7，发酵温度37℃，搅拌速度60 r/min，培养至稳定初期，降温至20℃以下停止发酵。
（8）离心、乳化、冻干：
①离心：将步骤（7）得到的发酵液6500 rpm离心15 min，收集菌体；
②乳化：菌体与保护剂按照质量比1:1.2混合均匀，制成乳化液；
上述所述保护剂按质量百分含量计包括海藻糖18%、麦芽糖4%、脱脂乳4%、甘油3%、谷氨酸钠3.5%和抗环血酸0.7%，溶剂为纯水。
③冻干：将乳化液在冻干机中冻干，收集菌粉。
实施例4-9
实施例4-9分别提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（6）中分别重复5次、10次、15次、20次、25次和35次步骤（2）-（5）的操作，其他步骤同实施例1。
实施例10
本实施例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段的pH均为5，其他步骤同实施例1。
实施例11
本实施例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段的pH均为7，其他步骤同实施例1。
实施例12
本实施例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段的pH均为4.2，其他步骤同实施例1。
实施例13
本实施例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段的pH均为7.9，其他步骤同实施例1。
实施例14-16
实施例14-16分别提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（4）中，分别缺少模拟唾液应激、模拟胃液应激和模拟肠液应激的示例，其他步骤同实施例1。
实施例17
实施例17提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（7）中，发酵培养基中不含有猪胆盐，发酵培养基中其他组分及含量同实施例1，其他步骤同实施例1。
实施例18
本实施例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸片球菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（1）中，将植物乳杆菌的菌种替换为乳酸片球菌的菌种，其他步骤同实施例1。
对比例1
本对比例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，发酵培养基中不含有猪胆盐，发酵培养基中其他组分及含量同实施例1，其他步骤同实施例1。
对比例2
本对比例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）和步骤（7）中，发酵培养基中均不含有猪胆盐，发酵培养基中其他组分及含量同实施例1，其他步骤同实施例1。
对比例3
本对比例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的植物乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，不经过（2）-（6）步骤，步骤（7）采用步骤（1）筛选得到的平板典型单菌落，其他步骤同实施例1。
对比例4
本对比例提供一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸片球菌菌粉，与实施例18的区别仅在于，不经过（2）-（6）步骤，步骤（7）采用步骤（1）筛选得到的平板典型单菌落，其他步骤同实施例18。
测试例1
耐人体消化系统测试a：
测试样本：实施例1-17和对比例1-3提供的植物乳杆菌菌粉、实施例18和对比例4提供的乳酸片球菌菌粉。
测试方法：将测试样本中提供的菌粉依次模拟唾液应激、模拟胃液应激和模拟肠液应激（方法如下所示），对最终的菌体进行稀释涂布，计算存活率。
①模拟唾液应激：菌体加入模拟唾液中，37℃应激处理6 min，离心，弃上清；所述菌体进行模拟唾液应激处理的初始浓度为109 CFU/mL。
②模拟胃液应激：将①所得菌体加入模拟胃液，37℃应激处理3 h，离心，弃上清；
③模拟肠液应激：将②所得菌体加入模拟肠液，37℃应激处理2 h，离心，弃上清；
上述所述的模拟唾液、模拟胃液和模拟肠液的配置方法如下。
模拟唾液：称取0.04 g KCl、0.04 g NaCl、0.08 g NaH2PO4·H2O、0.005 g MgCl2和0.08 g CaCl2·H2O溶于80 mL水中，搅拌使其充分溶解，用盐酸溶液调节pH至6.8，加入10mg溶菌酶（酶活≥5000 U/mg），在容量瓶中加水定容至100 mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装-20℃保存，一个月内使用。
模拟胃液：称取0.2g NaCl，加入80 mL水，用盐酸溶液调节pH至3.0，加入1.2 g胃蛋白酶（酶活≥2500 U/mg），在容量瓶中加水定容至100 mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装-20℃保存，一个月内使用。
模拟肠液：称取0.7g KH2PO4溶于25 mL水中，搅拌使其完全溶解，加入19 mL 0.2mol/L NaOH溶液和40 mL水，加入0.15 g猪胆盐，加入4.0 g胰蛋白酶（USP），用0.2 mol/LNaOH溶液调节pH至7.5，加水定容至100 mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装-20℃保存，一个月内使用。
测试结果如下表1所示：
表1
Figure 619930DEST_PATH_IMAGE001
由上表1数据可知，采用本发明提供的制备方法制备得到的菌体在人体消化系统内具有高耐受性。
通过实施例1和实施例4-9的对比可知，筛选过程中随着筛选次数的增加，菌体存活率得到提升，当筛选达到20-30次以后，菌体存活率提升趋势趋于平缓。
通过实施例1和实施例10-13的对比可知，步骤（2）发酵培养过程中只有通过控制第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段的pH分别接近唾液、胃液和肠液的pH，才能获得在人体消化系统内具有高耐受性的菌。
通过实施例1和实施例14-16的对比可知，分别缺少模拟唾液应激、模拟胃液应激和模拟肠液应激，会影响菌的耐受性。
通过实施例1和实施例17的对比可知，步骤（7）发酵培养基中不含有猪胆盐会影响菌的耐受性。
通过实施例1、实施例18和对比例4的对比可知，本发明提供的制备方法既适用于植物乳杆菌，又适用于乳酸片球菌。
通过实施例1和对比例1-2的对比可知，步骤（2）发酵培养基中不含有猪胆盐会影响菌的耐受性。
通过实施例1和对比例3的对比可知，不经过（2）-（6）步骤，会严重影响菌的耐受性。
耐人体消化系统测试b：
测试样本：实施例1-9提供的植物乳杆菌（步骤（6）得到植物乳杆菌）。
测试方法：将实施例1-9筛选出的菌种经过连续传代培养50代后制备成菌粉，测定其耐人体消化系统能力，测试方法同耐人体消化系统测试a，测试结果同表2。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE002
由表2数据可知，筛选5次、10次、15次后的菌体再经过继续培养50代后菌粉的存活率明显降低，筛选20次、25次和35次后的菌体经过继续培养50代后菌粉的存活率下降不明显。
测试例2
抗氧化测试：
测试样本：实施例1-17和对比例1-3提供的植物乳杆菌菌粉、实施例18和对比例4提供的乳酸片球菌菌粉。
测试方法：将菌粉溶解于生理盐水制成菌悬液，稀释至109 CFU/mL，以DPPH自由基清除率和抗脂质氧化能力来评价抗氧化能力。以LGG菌粉为参照组。
DPPH自由基清除率测试方法：取2 mL待测菌悬液，加入2 mL DPPH溶液（用无水乙醇溶解配制DPPH溶液，终浓度为0.4 mmol/L），混合均匀，然后置于室温避光反应30 min，然后8000 r/min离心10 min，取上清部分，测定样品在波长517 nm处的吸光度A样品，重复测定3次取平均值。空白组样品以等体积无水乙醇样品代替DPPH无水乙醇溶液，对照组以等体积生理盐水代替样品溶液，并以等体积生理盐水和无水乙醇混合液空白调零。清除率按以下公式计数：其中A对照为对照组吸光度，A样品为样品组吸光度，A空白为空白组吸光度。DPPH清除率计算公式如下所示：
Figure 678016DEST_PATH_IMAGE003
。
抗脂质氧化能力测试方法：0.1 mL亚油酸和0.2 mL吐温混合，纯水稀释至20 mL。0.5 mL磷酸盐缓冲液、1 mL亚油酸乳状液、0.2 mL硫酸亚铁（0.01%，m/v）、0.02 mL的抗坏血酸钠（0.01%，m/v）和0.4 mL乳酸菌生理盐水菌悬液充分混合，37℃孵育12 h，得到反应溶液。2 mL上述反应溶液、0.2 mL三氯乙酸（4%，m/v）、2 mL硫代巴比妥酸（0.8%，m/v）和0.2 mL二叔丁基对甲酚（0.4%，m/v）充分混合，100℃条件下反应30 min，然后冰上降温，加入2 mL丁醇进行提取。测定在532 nm下测定提取液的吸光值；重复测定3次取平均值，空白组样品以生理盐水代替菌悬液。按照以下公式进行计算亚油酸过氧化抑制率：
Figure 926595DEST_PATH_IMAGE004
。
DPPH清除率测试结果和亚油酸过氧化抑制率测试结果如下表3所示：
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由上述表3数据可知，采用本发明提供的制备方法得到的乳酸菌具有优异的DPPH清除和脂质过氧化抑制能力。
通过实施例1和实施例4-9的对比可知，筛选过程中随着筛选次数的增加，菌体抗氧化性能得到提升，当筛选达到20-30次以后，菌体抗氧化性能提升趋势趋于平缓。
通过实施例1和实施例10-13的对比可知，步骤（2）发酵培养过程中不控制第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段的pH分别接近唾液、胃液和肠液的pH，获得的菌体抗氧化能力较弱。
通过实施例1和实施例14-16的对比可知，分别缺少模拟唾液应激、模拟胃液应激和模拟肠液应激，会影响菌的抗氧化性。
通过实施例1和实施例17的对比可知，步骤（7）发酵培养基中不含有猪胆盐会影响菌的抗氧化性。
通过实施例1、实施例18和对比例4的对比可知，本发明提供的制备方法既适用于植物乳杆菌，又适用于乳酸片球菌。
通过实施例1和对比例1-2的对比可知，步骤（2）发酵培养基中不含有猪胆盐会影响菌的抗氧化性。
通过实施例1和对比例3的对比可知，不经过（2）-（6）步骤，会严重影响菌的抗氧化性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法及应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (3)

1.一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将经过活化的乳酸菌菌种接种于种子培养基中进行培养，得到种子液；
（2）将步骤（1）得到的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，在发酵稳定初期终止发酵，得到发酵液；所述发酵培养基中含有猪胆盐；
（3）将步骤（2）得到的发酵液进行离心，得到菌体；
（4）将步骤（3）得到的菌体进行消化系统应激处理，得到经消化系统应激处理后的菌体；
（5）将步骤（4）得到的经消化系统应激处理后的菌体稀释并涂布于平板上进行培养，筛选典型菌落；
（6）将步骤（5）得到的典型菌落重复步骤（1）-（5）的操作，得到在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌；
步骤（2）中，所述发酵培养的条件为：接种前pH为6.6-7.0；
所述发酵包括第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段，所述第一发酵阶段为发酵开始至发酵开始后1.5-3.5 h，所述第一发酵阶段的pH为6.8-7.2；所述第二发酵阶段为第一发酵阶段结束至对数末期，所述第二发酵阶段的pH为4.0-4.5；所述第三发酵阶段为第二发酵阶段结束至第二发酵阶段结束后1-2 h，所述第三发酵阶段的pH为7.5-8.0；
所述第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段中发酵培养的温度为37±1℃，搅拌速度40-80 r/min；
步骤（4）中，所述消化系统应激处理包括依次进行的模拟唾液应激处理、模拟胃液应激处理和模拟肠液应激处理；所述模拟唾液应激处理的温度为37±1℃，时间为5-10 min；所述模拟胃液应激处理的温度为37±1℃，时间为2-4 h；所述模拟肠液应激处理的温度为37±1℃，时间为1-2 h；所述菌体进行模拟唾液应激处理的初始浓度为108-1010 CFU/mL；
所述模拟唾液应激处理中采用的模拟唾液按质量浓度计包括以下组分：氯化钾0.4 g/L、氯化钠0.4 g/L、一水合磷酸二氢钠0.8 g/L、氯化镁0.05 g/L、一水合氯化钙0.8 g/L和溶菌酶100 mg/L，所述溶菌酶的酶活≥5000 U/mg，所述模拟唾液的pH为6.8-7.2；
所述模拟胃液应激处理中采用的模拟胃液按质量浓度计包括以下组分：氯化钠2 g/L和胃蛋白酶12 g/L，所述胃蛋白酶的酶活≥2500 U/mg，所述模拟胃液的pH为2-4；
所述模拟肠液应激处理中采用的模拟肠液按质量浓度计包括以下组分：磷酸二氢钾7g/L、猪胆盐1-3 g/L和胰蛋白酶40 g/L，所述模拟肠液的pH为7-8；
步骤（6）中，所述步骤（1）-（5）的重复次数为20-30次。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述培养的温度为37±1℃；
所述种子培养基按质量浓度计包括以下组分：蛋白胨5-10 g/L、酵母浸粉5-10 g/L、葡萄糖15-20 g/L、柠檬酸三铵2-5 g/L、乙酸钠3-5 g/L、磷酸氢二钾2-3 g/L、硫酸镁0.2-0.5g/L、硫酸锰0.05-0.2 g/L和吐温-80 0.8-1.2 g/L，所述种子培养基的溶剂为水，pH控制在6.6-7.0。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述接种的接种量为2-8%，所述发酵培养基按质量浓度计包括蛋白胨10-15 g/L、酵母浸粉10-15 g/L、葡萄糖5-10g/L、麦芽糖14-18 g/L、柠檬酸三铵2-4 g/L、乙酸钠4-6 g/L、磷酸氢二钾2-4 g/L、硫酸镁0.4-0.6 g/L、硫酸锰0.1-0.3 g/L、吐温-80 0.8-1.2 g/L和猪胆盐0.1-0.3 g/L，所述发酵培养基的溶剂为水，pH自然。
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