CN114703216A

CN114703216A - 莴苣LsWOX3L基因在控制莴苣刺有无性状中的应用

Info

Publication number: CN114703216A
Application number: CN202210261017.7A
Authority: CN
Inventors: 陈炯炯; 孙培楠; 章成君; 俞国平
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-03-16
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2042-03-16
Also published as: CN114703216B

Abstract

本发明属于植物工程技术领域，公开了莴苣LsWOX3L基因在控制莴苣刺有无性状中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过CRISPR‑Cas9技术在茎和叶脉均多刺的莴苣中敲除LsWOX3L基因的结果表明，丢失功能的LsWOX3L基因能够使受体莴苣表型变为无刺。进一步分析表明在无刺的栽培莴苣中存在一个失活的CACTA‑like的转座子插入到LsWOX3L基因的第一个外显子上使该基因丧失原有功能。 LsWOX3L基因的克隆为研究植物的毛状体的发育调控开辟了新的方向，同时也为莴苣的品种选育提供了基因资源和理论指导。

Description

莴苣LsWOX3L基因在控制莴苣刺有无性状中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及莴苣LsWOX3L基因在控制莴苣刺有无性状中的应用，本发明的基因来源于莴苣QTL qSPN，位于莴苣的第5号染色体上。该基因控制莴苣刺有无的重要性状。

背景技术

莴苣(Lactuca sativa L.)是我国栽培的重要的经济作物之一，具有多样的栽培类型和丰富的营养及经济价值。莴苣起源于地中海沿岸，其野生种为Lactuca serriola。其野生种在进化为栽培种的过程中，有多种性状受到了驯化，包括分支减少、种子落粒性消失、苦味减少、茎部膨大等等。其中野生莴苣中大部分在茎部和叶脉富含大量的刺，该性状也是莴苣受驯化的重要性状之一。

野生莴苣大部分表皮存在多细胞木质化的毛状体—“刺”。其对莴苣具有保护作用，既可以防止动物及昆虫的取食还可以降低空气流通速度，降低水分蒸发，提高莴苣的抗旱性。由此可见，分离并利用控制莴苣刺形成的关键基因，不仅有助于阐明该性状在莴苣驯化机制，也可以为莴苣育种提供基因资源和理论支撑。

鉴于此，本发明利用图位克隆技术，分离了一个位于莴苣第5号染色体上，控制莴苣刺的QTL qSPN，该基因为LsWOX3L，编码一种WUSCHEL RELATED HOMEOBOX 3相关的转录因子。基于连锁分析、自然群体中等位基因的效应分析、莴苣遗传转化分析和相关分子生物学分析，证实了该基因在在控制莴苣茎刺性状上的生物学功能及其作用机理。

发明内容

本发明的目的在于提供了莴苣LsWOX3L基因在控制莴苣刺有无性状中的应用，所述莴苣LsWOX3L基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.3所示，对应的CDS序列为SEQ ID NO.2所示，基因全长为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种基于基因LsWOX3L分子标记的引物，所述引物为：TE-F：5’-CTGATGATGAGGAGGATAAAGGTG-3’和Gene-R：5’-TCTAAGCAAGCTTTGACTGC-3’，通过分子标记辅助选择方法，能够在苗期准确快捷的区分自然群体莴苣的表型。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明是利用图位克隆技术分离位于莴苣第5染色体的莴苣刺性状的QTL qSPN，并对候选基因进行生物学功能验证，将获得的该基因命名为LsWOX3L(在以下描述中，当出现QTL qSPN时，即为LsWOX3L基因)。

本发明通过利用多刺莴苣PI491245(https://www.wur.nl/)和栽培无刺栽培莴苣W111(袁焕然，生菜叶裂与茎刺性状的遗传定位)杂交获得F₁代杂交种后(图1)，进一步自交获得F₂代群体。利用F₂代群体，联合BSR-seq和图位克隆的方法，对控制莴苣刺有无的基因进行定位。对定位区间进行基因注释及候选基因分析，确定了候选基因，成功克隆了控制莴苣刺有无关键基因LsWOX3L，该基因为SEQ ID NO.1所示，CDS序列为SEQ ID NO.2所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.3所示。序列分析发现，无刺的栽培莴苣中存在一个失活的CACTA-like的转座子插入到LsWOX3L基因的第一个外显子上使该基因丧失原有功能，表型为无刺。LsWOX3L与其栽培莴苣中的等位基因区别就在于其序列在栽培莴苣基因组中是否存在转座子的插入。

莴苣LsWOX3L基因在控制莴苣刺有无性状中的应用，是将有刺莴苣中的LsWOX3L基因进行敲除，突变或者沉默，获得的转基因莴苣表现为无刺性状。

莴苣LsWOX3L基因分子标记引物在莴苣育种中的应用，是利用引物TE-F：5’-CTGATGATGAGGAGGATAAAGGTG-3’和Gene-R：5’-TCTAAGCAAGCTTTGACTGC-3’对待测植株的基因组进行检测，若能扩出1090bp的莴苣，则为无刺莴苣。

与现有技术相比，本发明具有以下优点

本发明在莴苣中克隆并证实了一个控制莴苣刺的QTL的基因qSPN，证实了莴苣刺的有无与LsWOX3L基因的序列多态性之间的关系。

本发明为解释莴苣的驯化提供了新基因，也为菊科作物如莴苣的表皮性状表型改良，提供了新基因。

本发明为莴苣从头驯化育种提供了功能标记。

LsWOX3L是一个调控莴苣刺的重要基因，具有专一性，通过其序列的变异正调控莴苣刺的有无。PI491245和W111之间的表型差异，是由于一个CACTA-like的TE插入到W111的第一个外显子上，改变LsWOX3L基因编码的氨基酸序列进而是该基因丧失原有的功能。

附图说明

图1为多刺野生莴苣PI491245和无刺栽培莴苣W11的表型示意图。

图2为莴苣5号染色体的约307Mb处有一个控制莴苣刺有无的遗传位点示意图。

图3为用于莴苣刺基因遗传定位的重组单株、标记以及基因模型示意图。

图4为利用TE引物和基因特异引物对自然群体的10株栽培无刺莴苣叶14株野生有刺莴苣的检测。

图5为在多刺莴苣中敲除LsWOX3L基因可以使其表型变为无刺

图6纯合敲除LsWOX3L基因的植株LsWOX3L-KO#1，LsWOX3L-KO#2与LsWOX3L基因核苷酸序列的对比。

具体实施方式

以下实施实例进一步定义本发明，并描述了qSPN的精细定位、克隆、功能验证、作用机理及分子标记开发的方法。根据以下的描述和实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出适当的完善和修改，以使其适用各种用途和条件。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规分子生物学技术。

实施例1：LsWOX3L基因的克隆

为分析莴苣刺的有无的遗传规律，本发明采用多刺莴苣PI491245与栽培无刺莴苣W111(图1)进行杂交获得F₁代杂交种F₁代杂交种自交获得F₂代群体。对214株F₂代群体中的每一个个体进行刺有无的表型统计分析，结果显示，有刺和无刺的分离比是167：47≈3：1(χ²＝0.39，p>0.05)，为单基因控制的性状。利用BSA+RNA-seq技术分析，将LsWOX3基因初定位到5号染色体的304.36Mb-311.96Mb(图2)。

本申请利用图位克隆的方法，开发一系列分子标记，利用F₂群体中的3500株个体，最终将基因定位于306.31Mb和307.31Mb之间，约1Mb的范围内(图3)。对该区间序列进行注释分析，该区间共编码10个基因，其中基因LG5467832在两个混池中存在序列变异，该基因编码一个WUSCHEL RELATED HOMEOBOX 3相关的转录因子。因此，我们将该基因作为候选基因，并将其命名为LsWOX3L。

根据野生莴苣serriola参考基因组序列设计相关引物，CTAB法提取PI491245植株叶片总DNA，并测定DNA的质量和浓度(表1所示，ID:1)，获得的PCR产物送公司进行一代测序，测序结果为SEQ ID NO.1所示，CDS序列为SEQ ID NO.2所示，编码的蛋白质为SEQ IDNO.3所示。PCR扩增程序：95预变性1min，然后以95℃变性15s，变温内循环60℃5s、62℃5s、64℃5s、66℃5s、68℃5s、70℃5s后跳转到60℃循环2次，70℃1s后跳转到95℃循环20次；第二轮变温内循环95℃变性15s，继续变温内循环60℃5s、62℃5s、64℃5s、66℃5s、68℃5s、70℃5s后跳转到60℃循环4次，70℃1s后跳转到95℃循环18次；最后68℃最终延伸3min。PCR扩增体系如下

表1

实施例2：

基因LsWOX3L在调控莴苣刺有无中的应用，其应用过程如下：

本发明利用PI491245中的LsWOX3L基因的CDS序列，进行CRISPR-Cas9的gRNA设计。合成相关引物，在gRNA上加上相应的中间载体接头序列和BsaI的酶切接头序列，加了接头的gRNA为LsWOX3L-BsF所示，以pCBC-DT1T2(Xing et al.,2014)为模板进行四引物PCR扩增。PCR扩增程序：95℃预变性3min，然后以95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s,进行35个循环，最后72℃延伸5min。LsWOX3L-BsF/-BsR为正常引物浓度；LsWOX3L-F0/-R0稀释20倍(表1所示，所用引物ID:3)，最后一步将扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带纯化回收，连接至BsaI酶切后线性化的pHSE401之上。反应程序：37℃3min；16℃4min；前两步循环50次；50℃5min；80℃5min。连接后过夜转化，筛选约5个阳性克隆送至Tsingke公司进行测序。

PCR反应体系如下：

酶切连接体系如下：

结合其对应的gRNA和载体序列拼接后获得了一种LsWOX3L的CRISPR-Cas9的基因敲除载体，然后再用(表1所示，引物ID：4)所示的引物对得到的克隆进行测序，确定gRNA连接到载体上。该载体具备CaMV35S启动子连接的EGFP报告基因、多克隆位点和卡纳的筛选基因。

将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌GV3101介导的莴苣遗传转化体系导入到PI491245×W111的高世代F₇代纯合多刺材料中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有卡纳抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。(农杆菌介导的莴苣遗传转化体系参见：生菜散种与叶色性状的遗传分析及基因定位，贺淑萍硕士毕业论文)。

T0代获得2株敲除LsWOX3L转基因的莴苣家系，一株纯合编辑，另外一株杂合编辑。T0代自交获得T1代种子，纯合编辑植株在T1代全部植株茎叶表型表现为无刺，杂合编辑材料的T1代表型存在有刺和无刺的表型分离且有刺植株和无刺植株的数量接近3:1。证实了LsWOX3L的敲除可以通过影响莴苣刺的发育改变其表型，并对每个株系的敲除事件进行Sanger测序分析，LsWOX3L-KO#1(含有SEQ ID NO.4所示的突变序列)的编码序列存在一个碱基的插入，LsWOX3L-KO#2(含有SEQ ID NO.5所示的突变序列)的编码区丢失了168bp(图6)。证实了LsWOX3L的敲除可以通过影响莴苣刺的发育(图5)。

实施例3：

LsWOX3L分子标记的引物在作为莴苣育种分子标记辅助选择中的应用，其应用过程如下：

LsWOX3L基因的第一个外显子上(ATG下游99bp处)插入了1个长5316bp的失活的CACTA转座子(以下简称：TE)是引起自然栽培群体中莴苣无刺变异的重要功能位点，因此根据该位点设计分子标记引物。利用转座子引物(TE-F：5’-ctgatgatgaggaggataaa ggtg-3’)和基因特异引物(Gene-R：5’-tctaagcaagctttgactgc-3’)组合检测TE插入的存在(扩增出的片段长度1090bp)，

对24株自然群体材料进行检测(图4)，其中10株栽培无刺莴苣(泳道2、3、4、5、6、8、12、13、17、19)，14株野生有刺莴苣(泳道1、7、9、10、11、14、15、16、18、20、21、22、23、24)。以转座子插入的等位基因作为优异的等位变异，它是控制莴苣无刺的功能位点之一，可应用于分子标记育种，予以选择保留。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 莴苣LsWOX3L基因在控制莴苣刺有无性状中的应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4856

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttactggaat atcaaaaaca tttttactca aatttatttt aaatctgaaa aaaaaaaaca 60

attcttaaaa aaatcatttt ttctcgtatt tcatgttttt gtttttttta aaaaaaatga 120

atacaaatcc aatcctaaat caatacactt ctattcacaa acgaaatgtt tcttcaaaaa 180

acctaatact aatccaatcc aatcacaaat gagtacacat caacttacaa ataatttaat 240

gcctttttca tcaattgaaa ataaaaaaat gtaaaagtta tcatttcttc ataaaatgaa 300

tacctctaat cataaataga tacactcact cacatgaata cactactatt cataaataaa 360

tacaaccaat cacatatgaa tacactggta ttcacaaatg aatacactga tatatatata 420

tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tataaataaa tacacactct 480

atcataaaat gaatacactg ttatttataa ataaatacac tcattcacat gaatacacta 540

ttattcttaa aagcctgatt ttgatcttgt ttgctggaaa cttattgttc ttctgatgca 600

ttagatgtac ttcgctctat gaaaaagttg tccaagttgg ttgtgccaag atttagagga 660

ttggtaggat cagagtcctt gttgttgaaa ctattatctg gttttttagg ctcatcacgc 720

catgaaattt gcatgtctag aagcttagat aaagttacta tatcttctgt aggactctgg 780

cctccatgta ctccatttcc ttcagccaaa gatccaattc tatcctaaaa ttaatgtaaa 840

tagttaaaca aatgagtaca ttacaagtaa ataagaggct cataaaacag atctgaaatc 900

tagttagttt aaaggtattg atgacatgat ttgaaagcaa ataagaagtt aactaagtaa 960

tcacccatat tatgttggat ttcaaaagta atgttgatga aattaaagca agtaaagaga 1020

aaaaccctaa ctgatctatg taagttcaag gattgaagta gccagttata accattggtt 1080

caattgaagg ggatagggtt aggttggagg tccttcttct ggtgttcccc acagtatatg 1140

aaaatcattg acgataagcc tctcggaagc ttcccttaac aatatttgca tctcaggttc 1200

ggcggagacg agtctaaggt agatatacat gcctcaacgg tcagggaagt tgacgtcgct 1260

gcaaccatct tcggcgacgc tttcgttggc ggggcaagcg cagctgaagg aggcggcggc 1320

gttgtagatt gatgttcttg tgattagggc tacgaaaacc gtttgagagg gggatgaata 1380

aggagacgac aatctttaat agaaataaga gtgggaatga gaaattatag gattgacttg 1440

aagtttgttg tggaagaatt gtattgggct atacaaacgg tgagagtaga acaggaatac 1500

acgcgtccaa aagaactatg cgtgaattgc acgcccaaat ttcaagttga gggttgacat 1560

gtgctgattt ggtaaaatct taaaatccat aaaaatatca acacaattct aagaaaattc 1620

ctcatgaaat ctcacaaccc aatttactcc atttctaaga catagggttt atatatatat 1680

atatatatat atatatatat atatatatat atagagagag agagagagag agagagagag 1740

caatagagag ggagagagag agagagagag agagagaggt agattccatt gagagtaaaa 1800

atagaataga gatcttgaga ttcaactcca gccacatatt tcaactttgc cgctttaacc 1860

ctccggcata caggtgcgac aagcctgtta taatcataaa tgattatata gcgtcgttcg 1920

ttcctttctc ctacgccacc atcttcacca ccacaactgc caccgccact gccactacta 1980

ccacctttga caccaccagg ctccaccact atcacctccg ccacttaaac caccgtcacc 2040

tctgttacta ccacctcttc tgccaccaac tgtcataatc atatatgatt actcattctg 2100

tgaacagaca tacatgtgta atcatttatg attaggcata catgttgttg ctagtatgct 2160

ggagcgttaa agcggcaaat gaaaaatata tggctcgggt tgaatatgaa gatctctact 2220

tcttttttta atctcaagtg aaccgtaccc tatatatata tatatatata tatatatata 2280

tatatatata tatatatata tatatataga gagagagaga gagagagatt ggtttcgttg 2340

agattaaaaa taaaatagag atcttgagat tcaacctcag ccagatattt caagtctgtc 2400

ggtttaaccc tccggtgtac cgacgcgtct agcctgttat gatcataaaa gattatatag 2460

cgtcgtccat tcttttcttc tccgccacca tccacaccac aacaaccgcc atcgtgacca 2520

ccacaaccac gacctctgac accagtcgac cccaccacta tcaccttcgt ctctctctct 2580

ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctatatat atatatatat atatatatat 2640

atatatatat atatatatat atatatattc tctctctctc tctctgtgtg tgtgtgtgta 2700

tatatatata tatatatata tatataatat atatatatat atatatatat atatattaag 2760

aaaaaaaggt tgcatggctg catttatcga ccttgtcgta ataccatgct cattaacttt 2820

tatttgagtc aacaaaggac atgcaaacaa attaggaaca tggaatcatc cacctatgca 2880

ttaacctctc tataaatatc acttatactc gacaatattc cttaaaacaa acacgtgttt 2940

gcctttttaa ggaaaacaaa aagagtctac aaagatccat ataaagtaac agtgtgaaaa 3000

atgtcttcgg tgtctgtgaa agaggtaaca agcagcagcg gtgggggaaa cagcagatgg 3060

catcccacgc cggatcagtt gatgttgtta caaggaatgt atagaggcgg cctgaaaact 3120

ccatctgcaa ctcaagtaca gcaaataaca gaaagattat ccagtttcgg caacatacaa 3180

ggcaagaatg tcttttactg gtttcaaaat cgcaaagctc gcgagcgaca aaagcttcgg 3240

aagaagttca tgaatttgtt ccagcaacat cacctttatc ctcctcatca tcagcccggt 3300

cttcctcttc atcacgtaat tattcaactc ctttattaat tatattactt tagaaaaaaa 3360

aattagtagt cattcaatta taagtttatc atttatgctc acgatatata tatatatata 3420

tatatatata tatatatata tatatatata tatctgattt ttctaatctg ggtttaggtt 3480

agtggacttg aagattcatc aagctggaag ggggatctcc catctgctca aacctgcaat 3540

ctcatgtgcg attgtcgatt tgtgactatg atgatgatgg atcatggtgg tacagctcca 3600

tattgcacaa gagtaccacc caaaacccta caactcttcc cggtcacaac cactatctcc 3660

gctgatctca aacaagacga tcagtccagc aatctctagc ccaattttga ctttgttata 3720

tctttgttga aagtgtttaa gactatggta gtgaaagatg aaaagcagtt agggtatcga 3780

tcctagggtt agctagggtt aattaggact agggtttcag aataagttgt gggtttctgt 3840

gatgtcacca ggtctttgca tgtcaaggca ttgatactag taatatatat ctaatattat 3900

tgcctaataa cctagcattc agtattttat tcttgatgaa aactgaggcg tctttttcac 3960

aatcttggag tatgcaccgg catttgcaaa ccttctattt tgttggtttc gtatgatgtg 4020

tgtttttgaa ttgttagaca cagcaaacga caaactctgc agatacatag tacctaaggt 4080

tggtggttta gatggttatt actcactagt acgtacgtgc tttatgattt gcatatatag 4140

acaagtcttc acacggtcag cagtaattta attctcttaa aaagatattt tatgtaacta 4200

ctacggtttt aattgtataa atttaaggaa gaagttcgta tatattttta ataaacatca 4260

aactattata tttgtccttt aatatttaaa tatcatatat atctttaata aactttcaaa 4320

atatcatatt tatttaaaaa aaattaaaaa tatttttata attatttatt ggagtttaaa 4380

atcattatag ttataagata ttttaaaata cctattatac cgctactttt attttgtcgg 4440

aataaatgaa tcaaatatca caattaacat aaaaataaat aaataaataa ataaaaatac 4500

tctgggaaac acaaacaaac ggctggcttt ccttttttct cttccaattc gttgagaaag 4560

cttttaacca aaaacatgta taatggaggc ttcgtcaaac aaatgtttaa tcccctttca 4620

tatgcttcct aagagcaaac ataaaaatct acaatcctaa tctagacttt ttcccactca 4680

ttgtcatata aaatggagaa ttgatttccc actcatcttc atataaaatg gggaatcaat 4740

ttcatttact tctgatcaag attattttat tttgtttttt ccatgaagta ccatcaacgg 4800

gacaaagcat cgtaccatct ttagatcgtc cggtactata tcaaaacata tattta 4856

<210> 2

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcttcgg tgtctgtgaa agaggtaaca agcagcagcg gtgggggaaa cagcagatgg 60

catcccacgc cggatcagtt gatgttgtta aaaggaatgt atagaggcgg cctgaaaact 120

ccatctgcaa ctcaagtaca gcaaataaca gaaagattat ccagtttcgg caacatacaa 180

ggcaagaatg tcttttactg gtttcaaaat cgcaaagctc gcgagcgaca aaagcttcgg 240

aagaagttca tgaatttgtt ccagcaacat cacctttatc ctcctcatca tcagcccggt 300

cttcctcttc atcacgttag tggacttgaa gatgcatcaa gctggaaggg ggatctccca 360

tctgctcaaa cctgcaatct catgtgcgat tgtcgatttg tgactatgat gatgatggat 420

catggtggta cagctccata ttgcacaaga gtaccaccca aaaccctaca actcttcccg 480

gtcacaacca ctatctccgc tgatctcaaa caagacgatc agtccagcaa tctctag 537

<210> 3

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Ser Val Ser Val Lys Glu Val Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Asn Ser Arg Trp His Pro Thr Pro Asp Gln Leu Met Leu Leu Lys Gly

20 25 30

Met Tyr Arg Gly Gly Leu Lys Thr Pro Ser Ala Thr Gln Val Gln Gln

35 40 45

Ile Thr Glu Arg Leu Ser Ser Phe Gly Asn Ile Gln Gly Lys Asn Val

50 55 60

Phe Tyr Trp Phe Gln Asn Arg Lys Ala Arg Glu Arg Gln Lys Leu Arg

65 70 75 80

Lys Lys Phe Met Asn Leu Phe Gln Gln His His Leu Tyr Pro Pro His

85 90 95

His Gln Pro Gly Leu Pro Leu His His Val Ser Gly Leu Glu Asp Ala

100 105 110

Ser Ser Trp Lys Gly Asp Leu Pro Ser Ala Gln Thr Cys Asn Leu Met

115 120 125

Cys Asp Cys Arg Phe Val Thr Met Met Met Met Asp His Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Pro Tyr Cys Thr Arg Val Pro Pro Lys Thr Leu Gln Leu Phe Pro

145 150 155 160

Val Thr Thr Thr Ile Ser Ala Asp Leu Lys Gln Asp Asp Gln Ser Ser

165 170 175

Asn Leu

<210> 4

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtcttcgg tgtctgtgaa agaggtaaca agcagcagcg gtgggggaaa cagcagatgg 60

catcccacgc cggatcagtt gatgttgtta aaaggaatgt atagaaggcg gcctgaaaac 120

tccatctgca actcaagtac agcaaataac agaaagatta tccagtttcg gcaacataca 180

aggcaagaat gtcttttact ggtttcaaaa tcgcaaagct cgcgagcgac aaaagcttcg 240

gaagaagttc atgaatttgt tccagcaaca tcacctttat cctcctcatc atcagcccgg 300

tcttcctctt catcacgtaa ttattcaact cctttattaa ttatattact ttagaaaaaa 360

aaattagtag tcattcaatt ataagtttat catttatgct cacgatatat atatatatat 420

atatatatat atatatatat atatatatat atatctgatt tttctaatct gggtttaggt 480

tagtggactt gaagatgcat caagctggaa gggggatctc ccatctgctc aaacctgcaa 540

tctcatgtgc gattgtcgat ttgtgactat gatgatgatg gatcatggtg gtacagctcc 600

atattgcaca agagtaccac ccaaaaccct acaactcttc ccggtcacaa ccactatctc 660

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<210> 5

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtcttcgg tgtctgtgaa agaggtaaca agcagcagcg gtgggggaaa cagcagatgg 60

catcccacgc cggatcagtt catgaatttg ttccagcaac atcaccttta tcctcctcat 120

catcagcccg gtcttcctct tcatcacgta attattcaac tcctttatta attatattac 180

tttagaaaaa aaaattagta gtcattcaat tataagttta tcatttatgc tcacgatata 240

tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatctgat ttttctaatc 300

tgggtttagg ttagtggact tgaagattca tcaagctgga agggggatct cccatctgct 360

caaacctgca atctcatgtg cgattgtcga tttgtgacta tgatgatgat ggatcatggt 420

ggtacagctc catattgcac aagagtacca cccaaaaccc tacaactctt cccggtcaca 480

accactatct ccgctgatct caaacaagac gatcagtcca gcaatctcta g 531

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcctgatttt gatcttgttt gctggaaac 29

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccacaactt attctgaaac cctagtc 27

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtcttcgg tgtctgtgaa ag 22

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctagagattg ctggactgat cgt 23

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atatatggtc tcgattgtac aaggaatgta tagagggtt 39

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtacaagga atgtatagag ggttttagag ctagaaatag c 41

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aacggctgat gatgaggagg atcaatctct tagtcgactc tac 43

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

attattggtc tcgaaacggc tgatgatgag gaggatcaa 39

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtcccagga ttagaatgat taggc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agccctcttc tttcgatcca tcaac 25

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctgatgatga ggaggataaa ggtg 24

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tctaagcaag ctttgactgc 20

Claims

1.编码SEQ ID NO.3所示的蛋白的基因或SEQ ID NO.3所示蛋白在控制莴苣刺的有无中的应用。

2.根据权利要求所述的应用，所述的基因为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

3.分子标记引物在莴苣育种中的应用，所述引物为TE-F：5’-CTGATGATGAGGAGGATAAAGGTG-3’和Gene-R：5’- TCTAAGCAAGCTTTGACTGC-3’。

4.根据权利要求1所述的应用，应用过程包括将有刺莴苣中的编码SEQ ID NO.3所示的蛋白的基因进行敲除，沉默或突变。

5.根据权利要求1所述的应用，应用后获得的莴苣含有SEQ ID NO.2所示基因或SEQ IDNO.3所示蛋白。