CN114703124A - 一种仔猪肠道组织体外培养方法 - Google Patents

一种仔猪肠道组织体外培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物科技领域，公开了一种仔猪肠道组织体外培养方法，所述方法具体为：将仔猪肠道组织切片后置于上凝固胶、下凝固胶之间，下凝固胶和培养基接触；每2～4天换一次培养基或者培养基变黄即更换；所述培养基的组分为：Neurobasal A培养基；100X规格的Penicillin&Streptomycin solution 1倍体积；100X规格的N2 1倍体积；100X规格的B27‑supplement 5倍体积；50ng/ml EGF；10μM Y27632；0.5μM LY2157299；10μM CHIR99021；10mM HEPES；1mM N‑acetylcysteine；1x Glutamax。通过本发明的方法，可成功实现仔猪肠道组织体外培养。

Description

一种仔猪肠道组织体外培养方法
技术领域
本发明涉及生物科技领域，尤其涉及一种仔猪肠道组织体外培养方法。
背景技术
早期断奶仔猪肠道等器官尚未发育成熟，导致其消化能力和抗逆能力较差，加上心理、营养与环境的突然转变，断奶仔猪表现为采食量下降、消化功能紊乱、腹泻、生长受阻等为主要特征的“早期断奶综合症”，给生猪养殖业带来重大经济损失，成为制约生猪规模化养殖的关键问题之一。同时肠道是动物机体重要的消化器官，也是机体抵御病原体入侵的第一道防线。仔猪肠道健康表现在肠道黏膜结构和功能正常，而各种应激会导致肠道黏膜和功能受损。在应激反应中动物机体为保证心、脑重要器官血液供应，通过复杂的神经-内分泌系统介导，调节全身血流重新分配，产生选择性内脏血管痉挛，如肠道缺血、缺氧等，进一步引起肠黏膜屏障受损、肠道细菌、内毒素群移位、炎性反应及多种细胞因子表达升高。因此探究仔猪肠道健康及营养调控是是动物营养学研究的热点问题之一。
目前针对仔猪肠道的研究主要是集中在2D细胞培养法（即单层细胞培养法）和3D类器官的技术培养法。2D细胞培养法主要是集中在对猪肠上皮细胞（IPEC-1和IPEC-J2），巨噬细胞等，这种方法能有效地进行定量分析、特征鉴定和标本复制等，能有效地研究细胞的信号通路，然而却不能准确反应动物体内的环境，也不能体现原始器官或者组织中细胞与细胞之间、细胞与基质之间很多复杂的生理反应，如受体表达、转录因子表达、细胞迁移和凋亡等；3D类器官技术主要是针对分离小肠隐窝或者小肠干细胞进行模拟的微型肠道（mini-gut），3D 培养技术能更好地模拟体内的微环境，更好的体现细胞的极化形态，以及细胞间、细胞与基质间的相互作用，需要借助matrigel等物质进行组织支架构建，缺失了原有形态，有些细胞如神经细胞缺失。本发明是直接通过从机体采取仔猪小肠组织，在培养板上直接进行培养，保持了组织中的细胞和其空间结构形态，能更加真实的反应机体内的情况，维持着小肠组织内的微环境结构。然而目前尚未见到仔猪肠道组织体外培养模型的构建和验证的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于：本发明首先提供一种采取仔猪肠道制备体外组织培养样本的技术。本发明通过从屠宰的仔猪中获得小肠组织，通过所述的方法，利用琼脂及切片技术制备用于小肠组织培养的切片。本发明不仅可以确保培养过程中的污染情况，同时也可以到达进一步研究的可能性模型。
本发明的另一个目的在于提供一种制备仔猪肠道组织体外培养的培养体系的方法。通过所述方法可以体外培养仔猪肠道组织。该方法可以在直接体外培养肠道组织，更加模拟体内环境，培养的肠道组织中含有大量的原有细胞，保持体内的微环境。本发明不仅可以为研究大型哺乳动物腹泻及肠道健康等提供了模型，也可以为机体天然免疫和炎症反应提供模型，还可以为深入探究营养素或相关基因在中发挥的调控作用提供研究工具。
本发明不作特殊说明的情况下：nM代表纳摩尔/升，μM代表微摩尔/升，mM代表毫摩尔/升，M代表摩尔/升；
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种仔猪肠道组织体外培养方法，所述方法具体为：将仔猪肠道组织切片后置于上凝固胶、下凝固胶之间，下凝固胶和培养基接触；每2～4天换一次培养基或者培养基变黄即更换；
所述培养基的组分为：
Neurobasal A 培养基
100X规格的Penicillin & Streptomycin solution 1倍体积；
100X规格的N2 1倍体积；
00X规格的B27-supplement 5倍体积；
50ng/ml EGF；
10μM Y27632；
0.5 μM LY2157299；
10 μM CHIR99021；
10mM HEPES；
1mM N-acetylcysteine；
1x Glutamax。
在上述的仔猪肠道组织体外培养方法中，所述上凝固胶、下凝固胶均由以下成分组成：
胶原collagen I、10倍体积的F12培养基、缓冲液；
胶原collagen I、10倍体积的F12培养基、缓冲液的重量比为8:1:1。
在上述的仔猪肠道组织体外培养方法中，所述缓冲液是由100mL无菌毫升水，0.05M NaOH，200 mM HEPES， 2.2 g NaHCO3的混合物组成。
在上述的仔猪肠道组织体外培养方法中，所述上凝固胶、下凝固胶的体积比为1:1～2。
在上述的仔猪肠道组织体外培养方法中，所述仔猪肠道组织切片的具体方法为：
采用振动切片机将仔猪肠道组织切成300~400 μm的薄片，切片机速度：1.3mm/s；振动幅度：1mm，放入Kerbs溶液，Kerbs溶液由如下成分组成：3倍体积Penicillin &Streptomycin solution和1倍体积的Gentamicin/ Amphotericin B solution（500X）；在体视显微镜下剥离掉琼脂，将组织放于凝固的胶上，在chamber下方加入500ul的如上所述的培养基。
与现有技术相比本发明的有益效果是：
①本发明提供了一种采取仔猪肠道制备组织体外培养样本的技术及制备仔猪肠道组织体外培养体系的方法；
②利用上述方法实现的仔猪肠道组织体外培养，更加模拟体内微环境，培养的肠道组织中含有大量的难以培养的原有细胞，这对研究肠道内各类细胞之间的互作具有重要意义；
③通过上述方法制备而成的仔猪肠道组织体外培养技术为研究大型哺乳动物肠道健康及营养调控等提供了体外模型。
附图说明
图1 为本发明实施例1提供的肠道组织培养操作步骤；
图2 为本发明实施例1提供的肠道组织培养的光学显微镜下形态学分析的照片；
图3为本发明实施例1提供的肠道组织培养的细胞蛋白marker染色结果；胆碱能神经元标记物Chat和ACE基因；
图4为对比例1的肠道组织的培养结果；
图5为对比例2的肠道组织的培养结果；
图6为对比例3的肠道组织的培养结果；
图7为对比例4的肠道组织的培养结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试剂说明
Neurobasal A 培养基：Gibco（Thermo Fisher scientific）
Penicillin & Streptomycin solution：Gibco（Thermo Fisher scientific）
N2：Gibco（Thermo Fisher scientific）
B27-supplement：Gibco（Thermo Fisher scientific）
表皮生长因子EGF：货号PHG0311，Gibco
Y27632（ROCK 抑制剂）：S6390， Selleck
LY2157299（TGFβ receptor I (TβRI)抑制剂）：S2230，Selleck
CHIR99021（GSK-3α/β抑制剂）：S2924， Selleck
HEPES：货号15630080，Gibco（Thermo Fisher scientific）
N-acetylcysteine：货号A105422，阿拉丁
Glutamax：Gibco（Thermo Fisher scientific）
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1本发明涉及的仔猪肠道组织切片培养的构建及鉴定方法如下：
步骤1：仔猪肠道采集：从屠宰的仔猪上取出空肠前肠，使用含3%双抗的PBS清洗3-5遍，直至培养基上清液清亮无杂物，将其置于含1倍体积的Gentamicin/ Amphotericin Bsolution（500X）的Kerbs溶液（126 mM NaCl， 2.5 mM KCl， 2.5 mM CaCl2， 1.2 mMNaH2PO4， 1.2 mM MgCl2）的培养皿中。
步骤2：切片制备准备：取出高压灭菌后的剪刀，将肠道组织剪成小块，将肠道组织纵向插入8%琼脂中（约40℃，不烫手），放入4度冰箱中5-10min，使其凝固；琼脂凝固后将包含肠道组织的琼脂块切成小正方体，用520强力胶黏贴在振动切片机载物台上。
步骤3：切片制备：振动切片机切成300~400 μm的薄片（切片机速度：1.3mm/s；振动幅度：1mm），放入Kerbs溶液（3倍体积Penicillin & Streptomycin solution和1倍体积的Gentamicin/ Amphotericin B solution（500X））；在体视显微镜下剥离掉琼脂，将组织放于凝固的胶上，在chamber下方加入500ul的培养基。
步骤4：培养基制备：Neurobasal A 培养基，1倍体积的Penicillin &Streptomycin solution （100X），1倍体积的N2（100X），5倍体积的B27-supplement（100X），50ng/ml EGF， 10μM Y27632，0.5 μM LY2157299，10 μM CHIR99021，10mM HEPES，1mM N-acetylcysteine，1x Glutamax。
步骤5：凝固胶制备：将胶原collagen I，10倍体积的F12培养基和缓冲液按照8:1:1的比例混合，制成重组胶原凝胶，其中缓冲液是由100mL无菌毫升水，0.05 M NaOH， 200mM HEPES， 2.2 g NaHCO3的混合物组成。如果过酸可以适当调pH值到7.0。混匀后放入12孔的Transwell板上室中，每孔50-100μl，37℃培养箱放置15分钟，使其凝固，而后将制备好的组织切片放置在凝固胶上，并在组织切片上再放30-50μl凝固胶，37℃培养。
每3天换一次液或者培养基变黄换一次，期间显微镜观察生长状态（图2），21天后收集检测，做细胞蛋白染色（图3）。
对比例1
大体同实施例1，不同的地方在于，步骤1制备的培养基不同，本对比例的培养基如下：
Advanced DMEM/F12: 40~60% L-WRN cells培养上清液，该上清液为富含Wnt3α，R-spondins，Noggin蛋白因子的条件性培养基，1倍体积的Gentamicin/ Amphotericin Bsolution（500X）， 1%双抗，10ng/ml EGF， 10μM Y27632；
本对比例的培养基条件下神经元细胞生长状态不是很好，具体参考图4，难以达到正常的生理状态。
对比例2
大体同实施例1，不同的地方在于，步骤1制备的培养基不同，本对比例的培养基如下：
DMEM-F12 ：DMEM basic = 1:1，1倍的B-27，10 μM Y27632，10 μM SB202190，10ng/ml EGF，20ng/mL Recombinant bFGF；
本对比例的培养基条件下神经元细胞生长状态不是很好，具体参考图5，难以达到正常的生理状态。
对比例3
大体同实施例1，不同的地方在于，步骤1制备的培养基不同，本对比例的培养基如下：
Neurobasal A 培养基， 1倍体积的Penicillin & Streptomycin solution（100X）， 1倍体积的N2（100X），5倍体积的B27-supplement（100X），50ng/ml FGF， 10μMY27632，0.5 μM LY2157299，10 μM CHIR99021，10mM HEPES，1mM N-acetylcysteine，1xGlutamax。
本对比例的培养基条件下神经元细胞生长状态不是很好，具体参考图6，难以达到正常的生理状态。
对比例4
Neurobasal A 培养基， 1倍体积的Penicillin & Streptomycin solution（100X）， 1倍体积的N2（100X），5倍体积的B27-supplement（100X），50ng/ml EGF， 10μMY27632， 5 μM DMH1， 10 μM CHIR99021，10mM HEPES，1mM N-acetylcysteine，1xGlutamax。
本对比例的培养基条件下神经元细胞生长状态不是很好，具体参考图7，难以达到正常的生理状态。
综上所述：
通过上述研究可以发现：
1.必须在EGF（表皮生长因子），Y27632（抑制剂），LY2157299（TGF-β受体(TβR)的选择性ATP模拟抑制剂），CHIR99021（高特异性的糖原合酶激酶-3(GSK-3)抑制剂）同时存在的情况下，仔猪肠道组织才能较好的生长。
2.采用振动切片机可显著提高切片效果，相比于冷冻切片机需要冷冻破坏组织以及其他切片机无法切出理想薄片，本发明采用的切片方式切片均匀、薄。

Claims (5)

1.一种仔猪肠道组织体外培养方法，其特征在于，所述方法具体为：将仔猪肠道组织切片后置于上凝固胶、下凝固胶之间，下凝固胶和培养基接触；每2～4天换一次培养基或者培养基变黄即更换；
所述培养基的组分为：
Neurobasal A 培养基
100X规格的Penicillin & Streptomycin solution 1倍体积；
100X规格的N2 1倍体积；
00X规格的B27-supplement 5倍体积；
50ng/ml EGF；
10μM Y27632；
0.5 μM LY2157299；
10 μM CHIR99021；
10mM HEPES；
1mM N-acetylcysteine；
1x Glutamax。
2.根据权利要求1所述的仔猪肠道组织体外培养方法，其特征在于，所述上凝固胶、下凝固胶均由以下成分组成：
胶原collagen I、10倍体积的F12培养基、缓冲液；
胶原collagen I、10倍体积的F12培养基、缓冲液的重量比为8:1:1。
3.根据权利要求2所述的仔猪肠道组织体外培养方法，其特征在于，所述缓冲液是由100mL无菌毫升水，0.05 M NaOH，200 mM HEPES， 2.2 g NaHCO3的混合物组成。
4.根据权利要求1所述的仔猪肠道组织体外培养方法，其特征在于，所述上凝固胶、下凝固胶的体积比为1:1～2。
5.根据权利要求1所述的仔猪肠道组织体外培养方法，其特征在于，所述仔猪肠道组织切片的具体方法为：
采用振动切片机将仔猪肠道组织切成300~400 μm的薄片，切片机速度：1.3mm/s；振动幅度：1mm，放入Kerbs溶液，Kerbs溶液由如下成分组成：3倍体积Penicillin &Streptomycin solution和1倍体积的Gentamicin/ Amphotericin B solution（500X）；在体视显微镜下剥离掉琼脂，将组织放于凝固的胶上。
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