CN109943521A

CN109943521A - 一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法

Info

Publication number: CN109943521A
Application number: CN201910307643.3A
Authority: CN
Inventors: 沈学怀; 潘孝成; 赵瑞宏; 张丹俊; 戴银; 胡晓苗; 候宏艳; 周学利; 朱林
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2019-06-28

Abstract

本发明涉及一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法。包括以下步骤：取新生仔猪小肠肠道，剪成肠断，纵向剖开，用磷酸盐缓冲液反复清洗；刮取肠腔面的肠上皮组织用DMEM/F12不完全培养基分散细胞团，离心清洗细胞；用DMEM/F12完全培养基悬浮细胞，调整细胞团密度，在37℃浓度5%二氧化碳气体条件下培养，得到生长成片细胞团；加入胰酶消化液，进行细胞纯化，纯化过程可反复进行，直至得到生长状态良好的仔猪肠道上皮细胞。本发明通过肠腔面的机械分离和纯化得到生长状态良好的仔猪肠道上皮细胞，所获得的肠道上皮细胞适用于猪流行性腹泻病毒培养，为研究猪流行性腹泻病毒感染对仔猪肠道上皮细胞的细胞和分子机制提供快速的技术方案。

Description

一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法。

背景技术

小肠上皮细胞是动物体内最重要的消化吸收细胞，在仔猪肠道营养吸收和肠道免疫调控发挥重要作用。猪的肠道上皮细胞分离培养成为深入研究小肠上皮细胞功能、病理和细胞分化的重要工具。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）主要引起仔猪的一种急性、高度传染性的肠道疾病，其特征性的临床症状为急性肠炎、水样腹泻、呕吐和脱水，各年龄段的猪均可感染，其中仔猪发病率及病死率极高，严重影响养猪业的发展。PEDV经口鼻感染后直接进入猪的消化系统，侵染的靶细胞就是猪的肠道上皮细胞，PEDV在肠道上皮细胞内增殖复制，破坏了上皮细胞的正常形态，导致细胞出现病理损伤。

长期以来，在研究猪的肠道上皮细胞的生物学功能、细胞增殖分化、物质吸收代谢和肠道免疫与病理研究等多采用肠道永生化或肿瘤化的细胞系，但是永生化或肿瘤化的细胞系，其生物学特征与正常的细胞有很大的差异，因此使用细胞系作为研究对象来解释正常细胞的生理特性，具有明显的不足。原代细胞是从动物个体的组织器官中分离，其生物学特性变化较少，更接近与体内的生长特性，是比细胞系更好的研究材料。

仔猪肠道上皮细胞原代培养中普遍存在三个问题，一是细胞分离后活性差，细胞增殖缓慢。二是肠道微生物很多，肠粘膜中的隐窝、绒毛很多，难以将肠道微生物完全去除，在分离培养过程中极易受到微生物污染，从而造成细胞培养失败。三是所获得的分离细胞中存在不同程度的成纤维细胞污染。肠道上皮细胞原代常用的是螯合物分离法和酶消化法。螯合物分离法和酶消化法可获得分离的单一肠道上皮细胞，但对细胞的损伤较大，分离后细胞的活性较低。例如一种公开号为CN 106676059A的发明专利公开了一种仔猪肠道上皮细胞分级分离方法，通过向肠道中灌注细胞分离液根据孵育时间由前至后收集的不同部位的上皮细胞，该方法的优点在于可以收集不同分化阶段的肠道上皮细胞用于研究。但该方法也存在以下不足之处，一是仔猪日龄的选择是0～70日龄，仔猪在采食初乳后肠道微生物就会大量的定植，想要在细胞分离过程中完全去除几乎是不可能达到的。二是该方法采取的肠断很长，达到60～90cm，并且需要在水浴中震荡，操作困难、繁琐，在水浴过程中也很有可能造成二次污染。三是该方法细胞分离液属于螯合剂长时间的处理会对分离细胞造成损伤，致使细胞的活性降低。低增殖活性的仔猪肠道上皮细胞无法满足猪流行性腹泻病毒的培养需要。

因此有必要构建一种操作简单、高效、细胞活性强的仔猪肠道上皮细胞培养方法克服现有技术的不足。

发明内容

为了解决目前仔猪肠道上皮细胞分离过程中的不足，本发明提供一种操作简单易行、微生物污染风险小、细胞活性高，适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法。

一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备操作步骤如下：

（1）制备洁净肠断

取0日龄未吃初乳的新生仔猪小肠肠道50～60cm，将肠道剪成5～7cm的肠断，去除肠系膜，在磷酸盐缓冲液中将肠断纵向剖开，反复清洗肠断3～5遍，直至清洗液变成清亮，得到洁净肠断；

（2）制备接种细胞团

在DMEM/F12不完全培养基中，刮取肠断内面的上皮组织，将刮取物用移液枪头反复吹吸分散细胞团，离心收集细胞团，重复清洗3次，既得接种细胞团；

（3）细胞培养

调整接种细胞团密度为25cm²细胞瓶有150～200个细胞团块，在DMEM/F12完全培养基中培养，得到生长成片细胞团；

（4）细胞纯化

在生长成片细胞团中加入胰酶消化，用DMEM/F12完全培养基终止消化反应，用移液枪头轻轻吹打细胞面，并吸除含成纤维细胞的细胞液；利用成纤维细胞与生长成片细胞胰酶消化时间差实现纯化，得到生长状态良好的仔猪肠道上皮细胞。

进一步限定的技术方案如下：

步骤（1）中，所述新生仔猪为0日龄未吃初乳的新生仔猪。

步骤（1）中，所述磷酸盐缓冲液由下列物质：氯化钠8g/L、氯化钾0.4g/L、磷酸二氢钾0.06g/L、十二水合磷酸氢二钠0.08g/L、碳酸氢钠0.35g/L、头孢噻呋钠1g/L、庆大霉素50mg/L和蒸馏水配制而成，pH值为7.2～7.4，经0.22uL滤膜过滤除菌。

步骤（2）中，用2片玻璃载玻片的窄边对肠道内面进行刮取细胞团，用1mL移液枪头反复吹吸分散细胞团；转速1000r/min条件下离心5min，收集细胞团，用DMEM/F12不完全培养基反复清洗细胞团3次。

步骤（2）中，所述DMEM/F12不完全培养基由下列物质：DMEM/F12培养液500mL、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、15ng/mL表皮生长因子和5mL 100倍浓度胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂配制而成。

步骤（3）中，在DMEM/F12完全培养基中、温度37℃、浓度5%的CO₂气体的培养箱中，培养48h；更换细胞培养液，去除未贴壁细胞团；继续培养15～20天；得到生长成片细胞团。

步骤（3）或（4）中，DMEM/F12完全培养基由下列物质：DMEM/F12培养液500mL、25mL胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、15ng/mL表皮生长因子和5mL 100倍浓度胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂配制而成。

步骤（4）中，将25cm²细胞瓶中生长成片细胞团用3mL磷酸盐缓冲液润洗细胞贴壁面2次；在润洗后的生长成片细胞团中加入1mL浓度为 0.1%胰酶消化液，37℃条件下消化；消化过程中注意观察细胞形态，成纤维细胞消化1～2min变圆脱落，肠道上皮细胞在5～6min变圆脱落，在消化3min时，倾去消化液，加入DMEM/F12完全培养基2mL终止消化反应，用1mL移液枪头轻轻吹打细胞面，吸除含杂细胞的细胞液，再加入DMEM/F12完全培养基2mL继续培养，至此完成一次细胞纯化；如仍有成纤维细胞，可重复进行上述细胞纯化操作，直至得到生长状态良好的仔猪肠道上皮细胞。

细胞培养用25cm²细胞瓶经浓度为10ug/cm² I型胶原包被，使用前用磷酸盐缓冲液清洗细胞瓶2次。

利用制得的仔猪肠道上皮细胞进行猪流行性腹泻病毒培养的具体操作方法如下：

当纯化的仔猪肠道上皮细胞在25cm²细胞瓶内的铺壁率为80～90%时，用磷酸盐缓冲液润洗2次，加入猪流行性腹泻病毒液1mL和浓度0.1%的胰酶消化液10uL，孵育2～3h；孵育期间每隔10分钟左右摇晃细胞瓶，使病毒液均匀铺于细胞贴壁面，孵育结束吸出孵育液，加入6mL不完全DMEM/F12培养基和0.1%的胰酶消化液60uL继续培养3～4天，或出现明显的细胞病变，将细胞瓶取出，将细胞液和细胞进行反复冻融2次后收集猪流行性腹泻病毒液。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果体现在以下方面：

（1）本发明选取0日龄未吃初乳的仔猪作为肠道供体，肠道内尚未有微生物定植，可以有效减少肠道上皮细胞分离过程中的微生物污染。在同样操作条件下，比较了0日龄、10日龄和30日龄仔猪作为肠道供体动物后发现，10日龄和30日龄仔猪肠道进行肠道上皮细胞分离时均出现污染，并且日龄越大污染越严重，0日龄仔猪进行肠道细胞分离时未出现微生物污染。针对0日龄仔猪肠道中或操作中可能存在的细菌污染，发明中用于清洗肠道的磷酸盐缓冲液含有头孢噻呋钠和庆大霉素两种低毒高效抗生素，可有效抑杀细菌，增加细胞分离的成功率。

（2）采用MTT法比较本发明机械刮取肠道上皮组织和肠腔灌注0.1%胰蛋白酶消化液对分离肠道上皮细胞活性的影响，结果显示，机械刮取法较胰蛋白酶消化法所分离肠道上皮细胞的增殖活性显著提高。本发明采用机械刮取肠道上皮组织，避免了酶消化造成细胞活性的损伤，保证细胞的增殖活性。

（3）本发明操作过程简单，所需仪器设备少，经多次试验验证，能够快速制备活性较强、纯度较高、适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞。

附图说明

图1为仔猪肠道上皮细胞增殖活性（MTT法）测定结果图。

图2为不同日龄仔猪进行肠道上皮细胞分离的细胞污染率图。

图3为不同缓冲液清洗肠道上皮细胞分离的细胞污染率图。

图4为不同分离方法对仔猪肠道上皮细胞增殖活性的影响图。

图5为仔猪肠道上皮细胞培养不同阶段细胞状态图。

图6为仔猪肠道上皮细胞接种猪流行性腹泻病毒后病毒增殖免疫荧光检测图。

图7为常规RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒在所培养肠道上皮细胞的增殖情况图。

图8为仔猪肠道上皮细胞接种猪流行性腹泻病毒后不同阶段病毒增殖荧光定量RT-PCR检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。

实施例1

适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备操作步骤如下：

（1）选取0日龄为未吃初乳的新生仔猪2头，宰杀后消毒胴体，在超净工作台中取小肠肠断50cm，将肠断剪成5～7cm长度每段，放置于50mL 4℃预冷磷酸盐缓冲液中。将肠断转移至无菌培养皿中，仔细去除肠系膜后纵向剪开肠断，将剪开的肠断转移至100mL小烧杯中，用磷酸盐缓冲液反复清洗肠断4次，清洗过程中用灭菌眼科镊子反复搅拌。

（2）将清洗好的肠断转移至新的100mL烧杯中，加入不完全培养基，另准备一个无菌培养皿加入15mL不完全培养基，用无菌眼科镊子取一端肠断放于培养皿中，肠腔面向上放置，取2片玻璃载玻片，用玻璃载玻片的窄边进行操作，1片玻片固定肠断，另一片刮取肠腔面，如此反复直至肠道变薄，肠腔的绒毛面刮下，弃去刮取后的肠道，再进行下一个肠断的操作。

（3）将含有肠上皮组织的不完全培养基转移至15mL灭菌离心管中，用1mL移液枪头反复吹吸30次后，1000r/min离心5min，弃去离心上清液，反复清洗肠上皮组织3次，最后一次加入完全培养基分散细胞团。

（4）调整细胞团密度为每个25cm²细胞瓶有150～200个细胞团块，加入DMEM/F12完全培养基4mL，37℃ 5%CO₂培养箱中培养48h后更换细胞培养液继续培养。

由图1可见，显微镜观察细胞不同阶段的生长情况，MTT法检测细胞增殖情况，细胞在接种4天后开始快速增殖，在第16天细胞铺满贴壁面，细胞开始进入平台期。

实施例2

不同日龄仔猪在肠道上皮细胞分离时的细胞污染率

选取0日龄、10日龄和30日龄仔猪仔猪各1头，宰杀后消毒胴体，在超净工作台中取小肠肠断50cm，将肠断剪成5～7cm长度每段，放置，50mL 4℃预冷磷酸盐缓冲液中。将肠断转移至无菌培养皿中，仔细去除肠系膜后纵向剪开肠断，将剪开的肠断转移至100mL小烧杯中，用磷酸盐缓冲液反复清洗肠断4次，清洗过程中用灭菌眼科镊子反复搅拌。肠道上皮组织刮取、细胞团清洗和细胞接种与实施例1相同，每组细胞团接种20个25cm²的细胞瓶。分离细胞团在37℃ 5%CO₂培养箱中培养3天，观察不同日龄仔猪进行肠道上皮细胞分离的污染情况。结果显示，采用10日龄和30日龄仔猪肠道分离细胞的污染率分别为80%和100%，0日龄仔猪肠道上皮细胞分离的细胞未出现污染，见图2。

实施例3

不同种类缓冲液对仔猪上皮细胞分离时细胞污染率的影响

选取0日龄为未吃初乳的新生仔猪1头，宰杀后消毒胴体，在超净工作台中取小肠肠断50cm，将肠断剪成5～7cm长度每段，放置于50mL 4℃预冷0.01M PBS中，随机选取一半量的肠断放置于50mL 4℃预冷本发明所述含抗生素磷酸盐缓冲液中，将肠断分为抗生素磷酸盐缓冲液组和PBS组。含抗生素磷酸盐缓冲液组操作与实施例1中完全相同；PBS组操作时用PBS替代含抗生素磷酸盐缓冲液，其余操作与实施例1中完全相同，每组接种20个25cm²的细胞瓶。两组分离细胞团在37℃ 5%CO₂培养箱中培养3天，观察PBS组和含抗生素磷酸盐缓冲液组进行肠道上皮细胞分离时的污染情况。结果显示，含抗生素磷酸盐缓冲液组未出现细胞污染，PBS组的细胞污染率为10%，见图3。结果提示，即使采用0日龄未吃初乳的肠道进行肠道上皮细胞的分离时，由于仔猪与外界环境的接触仍有可能存在少量的微生物污染，因此在清洗肠道的磷酸盐缓冲液加入低毒高效抗生素是防止污染所必须的。

实施例4

不同分离方式对仔猪肠道上皮增殖活性的影响

选取0日龄为未吃初乳的新生仔猪1头，宰杀后消毒胴体，在超净工作台中取小肠肠断50cm。分别采用本发明所述机械刮取法和酶消化法进行仔猪肠道上皮的分离。机械刮取法的操作与与实施例1中完全相同。酶消化法操作如下，将仔猪肠断剪成10cm长度每段，共2段，放置于50mL 4℃预冷磷酸盐缓冲液中，向肠管灌注10mL磷酸盐缓冲液，止血钳夹住肠管两端，反复震荡冲洗5分钟，重复清洗操作3次。冲洗完成后倾去清洗液，用消毒棉线扎住肠管一端，从另一端灌注10mL 37℃预热的0.1%的胰酶消化液，用棉线封闭肠管后放入装有37℃预热的30mL磷酸盐缓冲液的烧杯中，放置于37℃水浴振荡器中孵育40分钟，孵育时震荡的速度为60转/分钟。孵育结束后收集细胞消化液，转速为1000转/分钟离心5分钟，收集细胞沉淀，用DMEM/F12不完全培养基清洗细胞沉淀后，用DMEM/F12完全培养基分撒细胞后进行肠道上皮细胞培养。采用MTT法测定两种不同分离方法获得仔猪肠道上皮细胞的增殖活性。结果显示，本发明所述机械刮取法分离的仔猪肠道上皮细胞增殖活性明显高于酶消化法分离的肠道上皮细胞，见图4。

实施例5

所述适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞纯化方法包括如下步骤:

待分离肠道上皮细胞生长成片后进行纯化，用磷酸盐缓冲液润洗细胞2次，加入1mL浓度为 0.1%胰酶消化液，37℃条件下消化，消化过程中使用显微镜观察细胞形态。

待一般成纤维细胞变圆脱落，而肠道上皮细胞在仍然贴壁时（约3分钟），倾去消化液，加入DMEM/F12完全培养基2mL终止消化反应，用1mL移液枪头轻轻吹打细胞面，吸除含杂细胞的细胞液，加入完全培养基继续培养。

观察细胞纯化效果，如有必要可在一次纯化2天后再次进行纯化，直至达到猪流行性腹泻病毒培养要求。参见图5，图5中A～D分别为细胞纯化后第1、第5、第10、第15天观察细胞生长情况，结果显示，细胞纯化后第1天仔猪肠道上皮细胞呈现长梭形或多边形，细胞形态单一，纯度较高，纯化后第5天细胞成片向外延伸生长，纯化后第10天细胞生长连接成片，第15天细胞铺满贴壁面后形成肠道上皮细胞典型的“铺路石状”形态。

实施例6

适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞病毒接种的具体操作步骤如下：

待细胞铺壁80～90%时用磷酸盐缓冲液润洗细胞2次加入猪流行性腹泻病毒液1mL和0.1%胰酶消化液10uL，孵育2～3h后吸出病毒液，磷酸盐缓冲液润洗细胞2次，加入DMEM/F12不完全培养基6mL、0.1%胰酶消化液60uL继续培养3～4天，或出现明显的细胞病变。PEDV接种仔猪肠道上皮细胞3天后，0.01MPBS润洗细胞2遍，4%多聚甲醛固定细胞，以PEDV单克隆抗体为一抗，以 FITC荧光标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行PEDV免疫荧光检测。另外，培养不同时间收集细胞后提取细胞RNA，经反转录为cDNA，根据Genbank公布的猪流行性腹泻病毒M基因序列设计的特异性上、下游引物序列：上游引物：5’-TTGGTGGTCTTTCAATCCTG- 3’，下游引物：5’-CTGAGTAGTCGCCGTGTTTT- 3’，产物大小为299bp。分别进行常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒在本发明所分离仔猪肠道上皮细胞上的增殖情况。结果显示，猪流行性腹泻病毒可以在本发明所分离仔猪肠道上皮细胞上复制增殖。

参见图6，免疫荧光法检测猪流行性腹泻病毒在所培养肠道上皮细胞的感染情况，图6中A为未接种PEDV的仔猪肠道上皮细胞，图6中B为接种PEDV 3天的仔猪肠道上皮细胞，免疫荧光检测结果显示接种PEDV的仔猪肠道上皮细胞有明亮的荧光反应，而未接种PEDV的细胞无荧光反应。

参见图7，常规RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒在所培养肠道上皮细胞的增殖情况，结果显示，PCR结果出现299bp的PEDV M基因特异性条带，并且随着接毒时间的延长，PEDV病毒增殖的越多，PCR产物的条带越明亮（参见图7中，1为阴性对照；2为接种1天；3为接种2天；4为接种3天；5为接种4天；6为接种5天；M为DL 2 000 Marker）。

参见图8，实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒在所培养肠道上皮细胞的增殖情况，结果显示，图8中A为实时荧光定量RT-PCR扩增产物的熔解曲线，曲线为单个特异峰，表明扩增产物单一，产物Tm值为86.0℃，与检测时设定的阳性对照Tm值一致，为PEDV M基因的特异性扩增产物。图8中B所示为PEDV接种仔猪肠道上皮细胞后病毒增殖量与接种时间的变化，结果显示，随着接毒时间的延长PEDV病毒的拷贝数逐渐增加，表明PEDV可以很好在本发明所分离仔猪肠道上皮细胞上进行复制增殖。

Claims

1.一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）制备洁净肠断

（2）制备接种细胞团

（3）细胞培养

调整接种细胞团密度为25cm²细胞瓶有150～200个细胞团块，在DMEM/F12完全培养基中培养15～20天，得到生长成片细胞团；

（4）细胞纯化

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述新生仔猪为0日龄未吃初乳的新生仔猪。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述磷酸盐缓冲液由下列物质：氯化钠8g/L、氯化钾0.4g/L、磷酸二氢钾0.06g/L、十二水合磷酸氢二钠0.08g/L、碳酸氢钠0.35g/L、头孢噻呋钠1g/L、庆大霉素50mg/L和蒸馏水配制而成，pH值为7.2～7.4，经0.22uL滤膜过滤除菌。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，用2片玻璃载玻片的窄边对肠道内面进行刮取细胞团，用1mL移液枪头反复吹吸分散细胞团；转速1000r/min条件下离心5min，收集细胞团，用DMEM/F12不完全培养基反复清洗细胞团3次。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述DMEM/F12不完全培养基由下列物质：DMEM/F12培养液500mL、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、15ng/mL表皮生长因子和5mL 100倍浓度胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂配制而成。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，在DMEM/F12完全培养基中、温度37℃、浓度5%的CO₂气体的培养箱中，培养48h；更换细胞培养液，去除未贴壁细胞团；继续培养15～20天；得到生长成片细胞团。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）或（4）中，DMEM/F12完全培养基由下列物质：DMEM/F12培养液500mL、25mL胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、15ng/mL表皮生长因子和5mL 100倍浓度胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂配制而成。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，将25cm²细胞瓶中生长成片细胞团用3mL磷酸盐缓冲液润洗细胞贴壁面2次；在润洗后的生长成片细胞团中加入1mL浓度为 0.1%胰酶消化液，37℃条件下消化；消化过程中注意观察细胞形态，成纤维细胞消化1～2min变圆脱落，肠道上皮细胞在5～6min变圆脱落，在消化3min时，倾去消化液，加入DMEM/F12完全培养基2mL终止消化反应，用1mL移液枪头轻轻吹打细胞面，吸除含杂细胞的细胞液，再加入DMEM/F12完全培养基5mL继续培养，至此完成一次细胞纯化；如仍有成纤维细胞，可重复进行上述细胞纯化操作，直至得到生长状态良好的仔猪肠道上皮细胞。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：细胞培养用25cm²细胞瓶经浓度为10ug/cm² I型胶原包被，使用前用磷酸盐缓冲液清洗细胞瓶2次。

10.利用权利要求1制得的仔猪肠道上皮细胞进行猪流行性腹泻病毒培养的方法，其特征在于具体操作如下：

当纯化的仔猪肠道上皮细胞在25cm²细胞瓶内的铺壁率为80～90%时，用磷酸盐缓冲液润洗2次，加入猪流行性腹泻病毒液1mL和浓度0.1%的胰酶消化液10uL，孵育2～3h；孵育期间每隔10分钟摇晃细胞瓶，使病毒液均匀铺于细胞贴壁面，孵育结束吸出孵育液，加入6mL不完全DMEM/F12培养基和0.1%的胰酶消化液60uL继续培养3～4天，或出现明显的细胞病变，将细胞瓶取出，将细胞液和细胞进行反复冻融2次后收集猪流行性腹泻病毒液。