CN114689847A - 基于分子印迹的新型侧流层析试纸条、制备方法以及用于小分子物质硫二甘醇检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条、制备方法以及即时检测小分子物质硫二甘醇的方法。本发明侧流层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板。结合垫负载金纳米颗粒(纳米金颗粒)，小分子物质硫二甘醇与纳米金颗粒通过Au‑S键结合，合成小分子物质硫二甘醇的分子印迹聚合物作为检测线材料，来实现试纸条上小分子物质硫二甘醇的识别捕获，设计金属硫蛋白作为质控线材料，纳米金颗粒与金属硫蛋白可通过Au‑S键结合。所设计的侧流层析试纸条通过检测少量尿液样品即可视觉判断是否含有小分子物质硫二甘醇，并通过image J分析实现定量检测。利用本发明的新型侧流层析试纸条检测小分子物质小分子物质硫二甘醇，具有灵敏度高，特异性强等优点。

Description

基于分子印迹的新型侧流层析试纸条、制备方法以及用于小 分子物质硫二甘醇检测中的应用
技术领域
本发明属于新型侧流层析试纸条技术领域，具体涉及一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条以及用于小分子物质硫二甘醇检测中的应用。
背景技术
侧流层析分析技术因具有快速、灵敏、价格低廉和无需专业人员操作的优点，被广泛地应用于检测血液、尿液、唾液等样本中的生物标志物，在疾病诊断、食品和环境监测等领域发挥重要作用。在资源匮乏地区，如发展中国家和偏远地区，侧流层析分析技术可以极大地代替昂贵又大型的仪器设备，实现现场的即时检测。
现目前传统侧流层析分析技术大多可分为两种不同的类型，即侧向流动免疫分析(LFIA)和核酸侧向流动分析(NALFA)，前者用抗体作识别元件，后者用核酸作识别单位。LFA广泛用于大分子物质检测，而对小分子物质的检测较少，针对小分子检测的NALFA大多也仅限于以抗体和核酸适配体为识别单位，而有些小分子物质无抗体、无适配体进行特异性识别，故需开发新型侧流层析试纸条用于此类小分子物质的测定，比如针对小分子物质硫二甘醇的检测。
芥子气作为糜烂性毒剂，对皮肤、眼睛和呼吸道造成损伤，甚至致癌致死。芥子气在生物基质和环境中易水解成毒性较低的小分子物质硫二甘醇(小分子物质硫二甘醇)。因此，通过检测小分子物质硫二甘醇可以判断是否为芥子气中毒，为临床诊断提供依据。现有检测小分子物质硫二甘醇的方法主要包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)。其中，LC-MS可以最方便地分析小分子物质硫二甘醇，但该方法不适用于生物医学样品的痕量分析。小分子物质硫二甘醇也可以利用GC-MS分析，但峰形并不理想，分析浓度低于1ppm时需要进行衍生化，而且需要将小分子物质硫二甘醇修饰为挥发性更高和极性较小的衍生物，才能通过GC-MS进行定量和定性分析。这些检测手段不仅需要昂贵的仪器和试剂，还需要专业人员进行操作，很难实现对小分子物质硫二甘醇的现场即时检测。因此有必要探索将侧流层析分析技术应用于小分子物质硫二甘醇的检测领域。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条，本发明目的之二在于提供一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和支撑垫板，在支撑垫板上依次交接重叠粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上含有金纳米颗粒，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，检测线上包含分子印迹聚合物，质控线上包含金属硫蛋白，依次交接重叠部分1-2mm，检测线和质控线，距离4-6mm。
进一步，所述分子印迹聚合物的制备方法如下：将α-甲基丙烯酸加入硫二甘醇溶液中，超声后加入N，N′-亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵，超声并且温度达到40-45℃，得到中间产物，进一步将上述产物进行静置、冻干、索氏提取再冻干所得白色粉末即为分子印迹聚合物，所述分子印迹聚合物粒径为200-300nm。
进一步，所述α-甲基丙烯酸、硫二甘醇、N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵的摩尔比范围为54-59:48-49:26-29:50-52。
进一步，所述纳米金颗粒的制备方法如下：
(1)将HAuCl4与十六烷基三甲基溴化铵混合均匀，再加入硼氢化钠溶液还原，反应后得到浅棕色溶液a液；
(2)再将H2O、HAuCl4与十六烷基三甲基溴化铵混匀，加入抗坏血酸得b液，接着加入a液，将混合物静置得纳米金颗粒。
进一步，步骤(1)制得a液时HAuCl4与十六烷基三甲基溴化铵、硼氢化钠的摩尔比范围为4-5:2000-2500:1，步骤(2)中制得b液时H2O、HAuCl4与十六烷基三甲基溴化铵、抗坏血酸的摩尔比范围为200-211:1:190-195:29-30，a液和b液添加质量比例范围1:1825-2180。
进一步，所述纳米金颗粒粒径为15-20nm。
2.一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)将结合垫浸泡于4％的蔗糖溶液中30分钟，再将结合垫取出置于真空干燥箱中，在37℃下干燥12h，接着对纳米金颗粒进行离心处理，取1mL溶液于ep管中，在13000r 下离心20min，吸取900μL上清液弃去，将剩下液体混匀后负载于结合垫上，用量为40 μL/cm；
(2)将合成好的分子印迹聚合物用5％的蔗糖溶液溶解为10mg/mL，同时将0.05mol/L 的金属硫蛋白用6％的蔗糖溶液稀释成0.35mol/L，使用Biodot试纸条三维喷点平台将分子印迹聚合物以1μL/cm的速度喷涂至硝酸纤维素膜上的T线区域，将金属硫蛋白以0.6μL/cm 的速度喷涂至硝酸纤维素膜上的C线区域，再将硝酸纤维素膜置于真空干燥箱中，于25℃干燥1.5h，取出置于4℃冰箱中备用；
(3)将样品垫、负载了纳米金颗粒的结合垫、制备好的硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组合起来，用切割机将整板切割成试纸条。
3.一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条在检测小分子物质硫二甘醇中的应用。
进一步.利用基于分子印迹的新型侧流层析试纸条检测小分子物质硫二甘醇的方法，所述方法如下：
将待测溶液加入Triton溶液混合后滴加到所述试纸条样品垫上，肉眼观察检测线和质控线是否呈红色条带，实现可视化检测。
进一步，取检测后的试纸条图像，通过imageJ处理分析，实现定性检测。
进一步，在25℃、50-60％湿度下进行检测。
本发明的有益效果在于：
1.本发明首次提出了一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条用于小分子物质硫二甘醇的检测。由于某些小分子物质既没有抗体又没有核酸适配体，故有着模版分子空腔的分子印迹聚合物很适用于此类物质的侧流层析分析。以本发明靶物小分子物质硫二甘醇为例，分子印迹聚合物的空腔能与小分子物质硫二甘醇特异性识别、吸附，因此不仅使试纸条有较好的特异性也有令人满意的灵敏度。通过对模版分子的改变并选择合适的功能单体和交联剂，可以将此应用推及至更多小分子靶物的LFA设计。此外，制备的试纸条对小分子物质硫二甘醇显肉眼可观察的红色可实现现场即时检测，并通过手机和imageJ灰度值分析，实现小分子物质硫二甘醇的定量检测，这避免了昂贵设备、专业人员操作。本发明制备的的试纸条可在4℃下储存备用，操作方便。
2.为了证明基于分子印迹的新型侧流层析试纸条用于小分子物质硫二甘醇的检测的优势，申请人进行了线性、抗干扰等系列实验，据实验结果表明，所设计的新型侧流层析试纸条拥有令人满意的灵敏度和特异性，能实现对小分子物质硫二甘醇的定性定量检测。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为本发明基于分子印迹的侧流层析试纸条用于小分子物质硫二甘醇的检测的原理图；
图2为分子印迹聚合物与纳米金颗粒电镜表征(SEM)；
图3为本发明的可行性验证；
图4为试纸条的条件优化；
图5为试纸条检测小分子物质硫二甘醇的线性考察；
图6为试纸条检测小分子物质硫二甘醇的选择性考察；
图7为试纸条检测小分子物质硫二甘醇的抗干扰能力考察。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
首先对以下实施例所使用的分子印迹聚合物进行合成，合成方案如下：将50μLα-甲基丙烯酸加入5mL 10mg/mL的小分子物质硫二甘醇溶液中，涡旋使物质混合均匀，在40℃下超声20分钟以上，再加入0.08g N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(N，N′-亚甲基双丙烯酰胺)和0.06g过硫酸铵((NH4)2S2O8)超声10min以上并且保持温度高于40℃。超声结束后得到白色凝胶果冻状产物，在4℃下静置过夜。次日将产物取出，冻干12h，得到白色粉末。接着进行索氏提取，于蒸馏瓶中加入20mL乙酸和180mL甲醇，再将白色粉末用滤纸包好，放入索氏提取器中，接好冷凝装置在提取器上端。采取油浴加热，控制温度在100℃左右，整个反应持续48h以上，最后得到白色膏状物质，冻干12h，得到的白色粉末即为分子印迹聚合物。
然后对以下实施例所使用的纳米金颗粒进行制备，具体方法如下：(1)金种子液的制备，将0.25mL 0.01mol/L的氯金酸溶液(HAuCl4)与9.75mL 0.1mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(十六烷基三甲基溴化铵)混合均匀，再快速加入新鲜制备的冰冷的0.6mL 0.01mol/L的硼氢化钠溶液(NaBH4)，在磁力搅拌器下剧烈搅拌，于50C下油浴加热反应2h左右，得到浅棕色溶液。(2)生长液的制备，将190mL的H2O、4mL 0.01mol/L的HAuCl4与9.75 mL0.1mol/L的十六烷基三甲基溴化铵混合均匀，再加入15mL 0.01mol/L的抗坏血酸，溶液从黄色变为无色。(3)最后在生长液中加入0.12mL的种子液，轻轻晃动锥形瓶，溶液由无色逐渐变为酒红色，将混合物静置24小时以上，放置超过两周的纳米金颗粒溶液变为橙红色溶液。
(一)侧流层析试纸条的制备和分子印迹聚合物与纳米金颗粒的SEM表征
首先将结合垫浸泡于4％的蔗糖溶液中30分钟，再将结合垫取出置于真空干燥箱中，在 37℃下干燥12h。接着对纳米金颗粒进行离心处理，取1mL溶液于ep管中，在13000r下离心20min，吸取900μL上清液弃去，将剩下液体混匀后负载于结合垫上，用量为40μL/cm。其次，将合成好的分子印迹聚合物用5％的蔗糖溶液溶解为10mg/mL，同时将0.05mol/L的金属硫蛋白用6％的蔗糖溶液稀释成0.35mol/L，使用Biodot试纸条三维喷点平台将分子印迹聚合物以1μL/cm的速度喷涂至硝酸纤维素膜(硝酸纤维素膜)上的T线区域，将金属硫蛋白以0.6μL/cm的速度喷涂至硝酸纤维素膜上的C线区域，再将硝酸纤维素膜置于真空干燥箱中，于25℃干燥1.5h，取出置于4℃冰箱中备用。将样品垫、负载了纳米金颗粒的结合垫、制备好的硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组合起来，用切割机将整板切割成4mm宽的试纸条，侧流层析试纸条如图1所示。
进一步对分子印迹聚合物、纳米金颗粒进行SEM表征，得到如图2所示表征图，如图2A所示，分子印迹聚合物具有规则的球形结构，平均粒径为200-300nm。如图2B所示，纳米金颗粒呈球状，平均粒径为15-20nm。
(二)侧流层析试纸条检测小分子物质硫二甘醇的可行性评估
本发明定性定量的方式是：小分子物质硫二甘醇与纳米金颗粒通过Au-S键结合，并在T 线被分子印迹聚合物s识别捕获，纳米金颗粒与C线的金属硫蛋白也可通过Au-S键结合，T、 C两线均产生肉眼可见的红色条带，从而实现可视化定性检测小分子物质硫二甘醇。使用手机拍照并通过电脑软件image J分析实现小分子物质硫二甘醇定量检测。
使用上述所制备的试纸条测定小分子物质硫二甘醇，可以看到加入样品15min之后，T、 C两线均会出现较明显的红色条带，如图3A所示，a为空白对照组，b为实验组。再使用imageJ进行数据处理，在这种情况下，测试线的颜色更深，灰度值更小。为了消除阴性对照(无分析物的缓冲液)的影响，通过以下方程计算了灰度值的变化：DG＝(GC-GT)/GC。其中GC为阴性对照T线的灰色值，GT为实验组T线的灰色值，DG为灰度值变化。从图3B所示，对照组与实验组的DG值有较大差异，实验组有较大信号升高。
(三)条件优化实验
影响侧流层析试纸条检测效果的因素有很多，为了改善试纸条性能，我们进行了以下优化。
首先试纸条所用的样品稀释液对实验影响较大，合理使用可以改善试纸条流动不均匀和背景信号过高的问题，如图4A所示，当选用0.3％的Triton溶液时，DG值最大，0.4％的Triton 溶液下的DG值略微下降，而0.5％的Triton溶液会带走分子印迹聚合物。因纳米金颗粒是本发明最主要的显色条件，故对其用量进行了优化。本发明对纳米金颗粒的处理方式是离心浓缩，故分别吸取750m、800m、850m、900m、950m上清液，如图4B所示，最优纳米金颗粒浓度对应的是吸取了900m的。高浓度的纳米金颗粒会增加背景信号，低浓度的纳米金颗粒即便在靶物存在的情况下依然不能带来较大颜色信号。随后我们对反应时间也进行了考察，如图4C所示，15min下DG值最大。因分子印迹聚合物颗粒较大，不能如蛋白一样很好地吸附在硝酸纤维素膜上，Triton是一种表面活性剂，故更长的反应时间反而会导致分子印迹聚合物被Triton带走。同时我们也考察了分子印迹聚合物的用量对实验效果的影响，如图4D所示，10mg/mL的分子印迹聚合物是最优的分子印迹聚合物用量。低浓度的分子印迹聚合物捕获纳米金颗粒-小分子物质硫二甘醇的量少，故DG值差异小；高浓度的分子印迹聚合物非特异吸附较明显，导致空白对照组的G值也会较大，相应的DG值差异也比较小。与此同时，在进行本发明的研究时，也发现了温度湿度对实验的影响，低温会导致纳米金颗粒中的十六烷基三甲基溴化铵析出，再次加热溶解也会影响后续实验，会影响液体流通和纳米金颗粒与小分子物质硫二甘醇、金属硫蛋白的结合。湿度过大也会影响纳米金颗粒与蛋白的结合，导致C线不明显。故简单探索下，25℃以上是较好的反应温度和纳米金颗粒的储存温度，50-60％的湿度下对蛋白与纳米金颗粒结合影响小。
(4)试纸条检测小分子物质硫二甘醇的线性
我们考察了试纸条的性能，灰度值和小分子物质硫二甘醇浓度呈一个正相关的关系。在优化好的实验条件下，如图5A所示，DG值与小分子物质硫二甘醇浓度是线性关系，线性范围为10-2-104ng/mL(R2＝0.9820)，线性方程为DG＝0.03692logc+0.1648，检测限(LOD， S/N＝3)为0.411pg/mL。本试纸条不仅可实现对小分子物质小分子物质硫二甘醇的现场即时检测，而且有较低的检测限。如图5B所示，人肉眼观察试纸条也可以较容易地辨别出小分子物质硫二甘醇的有无，且也不难看出，检测低浓度和高浓度的小分子物质硫二甘醇的试纸条的T线也有较明显的差异。
(5)试纸条检测小分子物质硫二甘醇的选择性
我们考察了试纸条的选择性，在相同的实验条件下检测了一些小分子物质硫二甘醇类似物(浓度均为100ng/mL)。实验结果表明，我们所设计的试纸条对小分子物质硫二甘醇的响应最强，对谷氨酰胺、半胱氨酸响应明显较低，对蛋氨酸、苯丙氨酸和γ-氨基丁酸的响应非常弱。这表明本发明的侧流层析试纸条有较好的选择性，能特异性检测小分子物质硫二甘醇，这归功于分子印迹聚合物与小分子物质硫二甘醇的特异性结合。
(6)试纸条检测小分子物质硫二甘醇的抗干扰能力
结合生物基质和环境，我们考察了以下离子、氨基酸和尿液成分对小分子物质硫二甘醇检测的干扰程度。
在小分子物质硫二甘醇的样品液中加入Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+、Ba2+和Al3+以及尿酸、尿素、天冬氨酸、亮氨酸和葡萄糖溶液，小分子物质硫二甘醇终浓度为100ng/mL，其他物质终浓度为1mg/mL。经过试纸条检测，DG值无明显变化，证明本发明的抗干扰能力较好。
由以上实施例及试验验证可充分说明本发明所设计的新型侧流层析试纸条拥有很好的灵敏度和特异性，能实现对小分子物质硫二甘醇的定性定量检测。
最后，以上是结合具体的实施例对本发明的详细说明，但并不意味本发明限定于此，对于熟悉此技术领域的专业人员来说，可以做出多样化的改动或者变型，故本发明的保护范围以权利要求书所限定的范围为准。

Claims (10)

1.一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和支撑垫板，在支撑垫板上依次交接重叠粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上含有金纳米颗粒，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，检测线上包含分子印迹聚合物，质控线上包含金属硫蛋白，依次交接重叠部分1-2mm，检测线和质控线，距离4-6mm。
2.根据权利要求1所述一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条，其特征在于，所述分子印迹聚合物的制备方法如下：将α-甲基丙烯酸加入硫二甘醇溶液中，超声后加入N，N′-亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵，超声并且温度达到40-45℃，得到中间产物，进一步将上述产物进行静置、冻干、索氏提取再冻干所得白色粉末即为分子印迹聚合物，所述分子印迹聚合物粒径为200-300nm。
3.权利要求2所述一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条，其特征在于，所述α-甲基丙烯酸、硫二甘醇、N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵的摩尔比范围为54-59:48-49:26-29:50-52。
4.根据权利要求1所述一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条，其特征在于，所述纳米金颗粒的制备方法如下：
(1)将HAuCl4与十六烷基三甲基溴化铵混合均匀，再加入硼氢化钠溶液还原，反应后得到浅棕色溶液a液；
(2)再将H2O、HAuCl4与十六烷基三甲基溴化铵混匀，加入抗坏血酸得b液，接着加入a液，将混合物静置得纳米金颗粒。
5.根据权利要求4所述一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条，其特征在于，步骤(1)制得a液时HAuCl4与十六烷基三甲基溴化铵、硼氢化钠的摩尔比范围为4-5:2000-2500:1，步骤(2)中制得b液时H2O、HAuCl4与十六烷基三甲基溴化铵、抗坏血酸的摩尔比范围为200-211:1:190-195:29-30，a液和b液添加质量比例范围1:1825-2180。
6.根据权利要求4所述一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条，其特征在于，所述纳米金颗粒粒径为15-20nm。
7.一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将结合垫浸泡于4％的蔗糖溶液中30分钟，再将结合垫取出置于真空干燥箱中，在37℃下干燥12h，接着对纳米金颗粒进行离心处理，取1mL溶液于ep管中，在13000r下离心20min，吸取900μL上清液弃去，将剩下液体混匀后负载于结合垫上，用量为40μL/cm；
(2)将合成好的分子印迹聚合物用5％的蔗糖溶液溶解为10mg/mL，同时将0.05mol/L的金属硫蛋白用6％的蔗糖溶液稀释成0.35mol/L，使用Biodot试纸条三维喷点平台将分子印迹聚合物以1μL/cm的速度喷涂至硝酸纤维素膜上的T线区域，将金属硫蛋白以0.6μL/cm的速度喷涂至硝酸纤维素膜上的C线区域，再将硝酸纤维素膜置于真空干燥箱中，于25℃干燥1.5h，取出置于4℃冰箱中备用；
(3)将样品垫、负载了纳米金颗粒的结合垫、制备好的硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组合起来，用切割机将整板切割成试纸条。
8.一种基于分子印迹的新型侧流层析试纸条在检测小分子物质硫二甘醇中的应用。
9.利用基于分子印迹的新型侧流层析试纸条检测小分子物质硫二甘醇的方法，其特征于，所述方法如下：
将待测溶液加入Triton溶液混合后滴加到所述试纸条样品垫上，肉眼观察检测线和质控线是否呈红色条带，实现可视化检测；进一步取检测后的试纸条图像，通过imageJ处理分析，实现定性检测。
10.根据权利要求9所述利用基于分子印迹的新型侧流层析试纸条检测小分子物质硫二甘醇的方法，其特征于,在25℃、50-60％湿度下进行检测。
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