CN114686551B - 一种豌豆蛋白源dpp-iv抑制肽及其筛选方法 - Google Patents

一种豌豆蛋白源dpp-iv抑制肽及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种豌豆蛋白源DPP‑IV抑制肽及其筛选方法，属于食源性活性肽开发技术领域。本发明利用多肽组学与分子对接技术快速筛选DPP‑IV抑制肽，避免了因逐级分离纯化所导致的耗时费力的缺点。所得DPP IV抑制肽IPYWTY具有极高的DPP‑IV抑制活性，可用于制备治疗糖尿病的药物。

Description

一种豌豆蛋白源DPP-IV抑制肽及其筛选方法
技术领域
本发明涉及一种豌豆蛋白源DPP-IV抑制肽及其筛选方法，属于食源性活性肽开发技术领域。
背景技术
根据国际糖尿病联盟(IDF)的数据，2021年全球成年糖尿病患病率约为5.37亿，预计到2045年将达到7.84亿。其中，2型糖尿病(T2D)约占已确诊糖尿病的90％。T2D以高血糖为特征，可导致心血管疾病(中风、心肌梗死、高血压、心力衰竭等)、神经退行性疾病、肾病等一系列并发症。针对以上问题，许多抗糖尿病药物已被开发并用于T2D的治疗，其中DPP-IV抑制剂是最有前景的降糖药物之一。DPP-IV抑制剂通过抑制胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性胰岛素多肽(GIP)等激素的失活而产生降糖作用。GLP-1和GIP可有效刺激胰岛素的分泌，然而其易被DPP-IV降解而迅速失活，从而失去其调节血糖的功能。因此，抑制DPP-IV的活性有利于T2D的治疗。目前已有几种合成DPP-IV抑制剂(如:西格列丁、维格列丁等)获批并用于临床应用。然而，这些合成的DPP-IV抑制剂可能会导致一些不良反应，如胃肠道问题、尿路感染和严重的皮肤反应。此外，其高昂的价格也使得低收入人群难以承担。
作为一种天然、安全的补充剂，食源性DPP-IV抑制肽具有调节葡萄糖稳态的功能。目前，已从多种食品蛋白质中获得了大量高活性的DPP-IV抑制肽，表现出较好的降血糖效果。
但，传统的DPP-IV抑制肽鉴定方法是通过逐级分离纯化，如：超滤、色谱柱分离等手段获得纯度较高的肽段，再通过质谱对其结构进行鉴定，最后通过体外合成并进一步验证其DPP-IV抑制活性。这种方法操作复杂、耗时且费用高。因此，开发一种更加方便、高效、快速的DPP-IV抑制肽的鉴定方法以成为当务之急。
豌豆蛋白是一种低敏、营养且经济的蛋白质资源，通过酶解豌豆蛋白产生活性肽，具有良好的抗氧化、降血糖等生物活性。迄今为止，尚未发现关于豌豆蛋白源DPP-IV抑制肽的报道。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是现有食品源DPP-IV抑制肽的分离鉴定方法复杂、成本高，且无豌豆蛋白源的DPP-IV抑制肽。
[技术方案]
本发明提供一种从豌豆蛋白中筛选DPP-IV抑制肽的方法，是利用多肽组学与分子对接技术快速筛选DPP-IV抑制肽，主要包括以下步骤：
(1)利用蛋白酶水解豌豆蛋白产生豌豆肽
将豌豆蛋白粉与水混合，加热使豌豆蛋白受热变性，然后添加蛋白酶对豌豆蛋白进行水解，水解结束后，将豌豆蛋白水解液加热灭酶，然后冷却、离心，取上清冻干；
(2)将步骤(1)所得冻干物经Sephadex G-15进行分离，选择具有相对高的抑制DPP-IV能力的部分进行下一步的测序；
(3)通过多肽组学对步骤(2)分离得到的部分豌豆肽进行测序；
(4)利用分子对接技术从步骤(3)测序得到的豌豆肽中筛选高活性的DPP-IV抑制肽。
在本发明的实施方式中，所述豌豆蛋白粉是指去除豌豆中的淀粉与脂肪后的干燥的蛋白粉末。
在本发明的实施方式中，所述蛋白酶是复合蛋白酶，可以切割豌豆蛋白的多个位点。
在本发明的某些实施方式中，步骤(1)可采用如下实施条件：将豌豆蛋白粉与蒸馏水按1:20(w/v)的比例混合，预热10分钟中途持续搅拌，以确保豌豆蛋白完全受热变性；待豌豆蛋白溶液冷却至室温后，添加Protamex(酶底比：5 000U/g蛋白)于pH 7.0、55℃条件下水解3h。在水解过程中，使用1mol/L的NaOH或HCl来维持溶液的pH值恒定；水解后，将豌豆蛋白水解液煮沸10分钟，终止水解反应；待冷却至4℃，于8 000g离心20min，取上清冻干后于-20℃保存，以备下一步分离纯化。
在本发明的某些实施方式中，步骤(2)通过Sephadex G-15对豌豆肽进行初步分离，选择分离纯化后的高活性的组分F2进行下一步的测序，以提高筛选结果的准确度同时减少筛选过程的工作量。具体可采用如下实施条件：将60mg冻干后的豌豆蛋白水解液的上清冻干物分散于3mL去离子水中，过0.45μM滤膜，用Sephadex G-15柱分离；以流速30mL/h的超纯水洗脱，每管收集3mL洗脱馏分，选择DPP-IV抑制活性高的馏分用于进一步的测序分析。
在本发明的某些实施方式中，步骤(4)可具体采用如下步骤：
①DPP-IV酶PDB文件准备：从蛋白质数据库中检索DPP-IV酶的蛋白质晶体结构(代码：1WCY)，从1WCY中去除多余的配体diprotin A与H2O以便进行后续的对接实验；
②测序后的多肽依次与1WCY对接后获得Vina Score，DPP-IV结合位点被定义为包含15个以内的蛋白质残基的球体；
③根据Vina Score筛选结合能较低的多肽，并将已公开序列的DPP IV抑制肽排除，剩余的多肽确定为潜能DPP IV抑制肽，通过体外固相合成并验证其DPP IV抑制活性。所述结合能的值越低表示相应多肽的DPP-IV抑制活性越强。所述体外固相合成具体是多肽化学合成方法(Fmoc固相合成法)。所述验证DPP IV抑制活性具体是筛选后的多肽经合成后，使用底物化学法测定其DPP IV抑制活性的强弱以验证筛选结果。
本发明提供豌豆源DPP-IV抑制肽，其氨基酸序列是IPYWTY、IPYWT、LPNYN或LAFPGSS，优选IPYWTY，所述IPYWTY能够以极低的浓度抑制DPP-IV活性，其IC50为11.04μM，低于大多数目前已被鉴定的DPP-IV抑制肽，甚至与阳性对照diprotin A的抑制活性(IC50＝3.2μM)接近。
[有益效果]
本发明通过分子对接的虚拟筛选方法快速有效地从豌豆蛋白中鉴定得到高活性DPP-IV抑制肽。
本发明创造性地将多肽组学与分子对接相结合构建出一种快速筛选DPP-IV抑制肽的方法，避免了因逐级分离纯化所导致的耗时费力的缺点。首先，通过多肽组学对高活性组分F2中的所含肽段进行高通量测序，得到其全部肽段的序列。其次，利用分子对接技术将以上多肽依次与DPP-IV进行对接，并对其Vina Score(结合能)进行排序，理论上VinaScore越低，多肽的DPP-IV抑制活性越强。最后，选择Vina Score较低的多肽进行体外合成并验证其活性。
本发明有效地从豌豆蛋白中鉴定出高活性DPP IV抑制肽IPYWTY。IPYWTY与DPP IV的作用模式为竞争性抑制，且具有极高的DPP-IV抑制活性，其IC50为11.04μM(9.3μg/ml)。分子对接结果显示，IPYWTY与DPP IV活性口袋中的Ser630、Val546、Trp629、Asn562、Asp545和Lys554六个残基形成氢键，与Gly628、Ser552、Tyr547、Try662、Val656、Tyr666、Tyr631、Arg125和Gly741九个残基形成疏水相互作用。其中，IPYWTY的N端残基IPY与S1口袋的Tyr547、Tyr631、Try662、Val656、Tyr666形成疏水相互作用是其抑制能力的关键。后续选择此方法进行虚筛可重点关注多肽与DPP-IV结构中S1口袋所形成的疏水相互作用强弱来预断其DPP-IV抑制活性。
附图说明
图1 IPYWTY二级质谱图
图2 IPYWTY分子结构示意图
图3 IPYWTY与DPP-IV分子对接及其相互作用力分析图
图4 IPYWTY的DPP-IV活性抑制率
具体实施方式
下述实施例所用豌豆蛋白粉是去除豌豆淀粉与脂肪后的干燥蛋白粉末，购自于镇江荣海生物科技有限公司。
下述实施例所用复合蛋白酶购自于诺维信(中国)生物技术有限公司，活力是15000U/g。
实施例1从豌豆蛋白中分离鉴定DPP IV抑制肽的方法
(1)利用蛋白酶水解豌豆蛋白产生豌豆肽
具体地，将豌豆蛋白粉与蒸馏水按1:20(g：L)的比例混合，预热10分钟，预热过程中持续搅拌，以确保豌豆蛋白完全受热变性；待豌豆蛋白溶液冷却至室温后，添加复合蛋白酶Protamex(酶底比：5 000U/g蛋白)于pH 7.0、55℃条件下水解3h，在水解过程中，使用1mol/L的NaOH溶液或HCl溶液来维持溶液的pH值恒定；水解结束后，将豌豆蛋白水解液煮沸10分钟，终止水解反应；冷却至4℃，于8 000g离心20min，取上清冻干后于-20℃保存，以备进一步分析。
(2)通过Sephadex G-15对豌豆肽进行初步分离，选择高活性的F2组分进行下一步的测序
具体地，将60mg步骤(1)得到的冻干物分散于3mL去离子水中，过0.45μM滤膜，用Sephadex G-15柱分离；以30mL/h的速度用超纯水洗脱，每管收集3mL馏分样品。测定每个样品在280nm处的吸光度，将不同样品的吸光值作图分析。按出峰时间将所收集的馏分分为两个组分(F1与F2)，并选择DPP-IV抑制活性高的F2组分进行冻干，于-20℃保存，以备进一步分析。
(3)通过多肽组学对F2组分中的豌豆肽进行测序
具体地，将F2组分经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。整套系统为串联EASY-nanoLC 1200的Q ExactiveTM Plus质谱仪。共上样5μL样品(分析柱：Acclaim PepMapC18,75μm x 25cm)，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV。流动相A相：0.1％甲酸水溶液；B相：含0.1％甲酸的ACN溶液，多肽洗脱梯度为:0-3min,2％-6％B；3-42min,6％--20％b；42～47min,20％～35％B；47-48min,35％-100％B；48-60min，保持100％B。质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：(1)MS:扫描范围(m/z)＝200-1800；分辨率＝70,000；AGC target＝3e6；最大注入时间＝50ms；扫描电荷＝1-6；(2)HCD-MS/MS(top 20):分辨率＝17,500；隔离窗口＝2m/z；AGCtarget＝1e5；最大注入时间＝45ms；碰撞能量＝28,动态排除时间＝30s。串联质谱图经过PEAKS Studio version 10.6分析。PEAKS DB对uniprot-Pisum sativum数据库(version202108,2357entries)搜库，设置None酶解。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.02Da，母离子质量容许误差：7ppm，最大漏切数：2，可变修饰：Oxidation(M)15.99，Deamidation(NQ)0.98。蛋白卡值为：-10lgP≥0，至少含1unique peptide；肽段卡值为：-10lgP≥20。经多肽组学对F2组分中的豌豆肽进行测序后共鉴定得到543条多肽。
(4)利用分子对接技术从(3)中已鉴定的543条多肽中筛选高活性的DPP-IV抑制肽，主要包括如下步骤：
①DPP-IV酶PDB文件准备：从蛋白质数据库中检索DPP-IV酶的蛋白质晶体结构(代码：1WCY)，从1WCY中去除多余的配体diprotin A与H2O以便于后续的对接实验；
②543条多肽依次与1WCY对接后获得Vina Score，DPP-IV结合位点被定义为包含15个以内的蛋白质残基的球体；
③根据Vina Score筛选结合能较低的多肽，并将现有技术已公开序列的DPP IV抑制肽排除，剩余的多肽确定为潜能DPP IV抑制肽，通过体外固相合成并验证其DPP IV抑制活性，
具体地，总共筛选出8条多肽，其Vina Score小于-9.4；8条多肽经体外固相合成后对其DPP IV抑制活性进行验证。
表1
序号 多肽序列 Vina score
1 FPFFEGT -9.4
2 LAFPGSAQE -9.4
3 IADMFP -9.6
4 IPYWT -9.6
5 IPYWTY -9.8
6 LPNYNSRA -10.2
7 LAFPGSS -11.3
8 LPNYN -12
实施例2 DPP IV抑制肽的活性检测方法
在96孔酶标板中，将25μL多肽样品(溶解在pH 8.0，100mmol/L Tris-HCl缓冲液中)与25μL Gly-Pro-PNA(1.6mmol/L)混合，在37℃孵育10min，加入50μL DPP-Ⅳ(8U/L)溶液启动反应，37℃反应60min，然后添加100μL乙酸钠缓冲液(1mol/L，pH 4.0)终止反应，于405nm处测量吸光度。以Tris-HCl缓冲液代替DPP-Ⅳ溶液作为空白组，以Tris-HCl缓冲液代替多肽样品作为对照组。DPP-Ⅳ抑制率计算公式为：
其中，Ac、Ab、As分别为对照组、空白组、样品组的吸光度。
如表2所示，有4条多肽(IPYWTY、IPYWT、LPNYN和LAFPGSS)的DPP-IV抑制活性较强，其IC50均小于100μM，其中，IPYWTY的DPP-IV抑制活性最强(IC50＝11.04μM)，与阳性对照diprotin A(IC50＝3.2μM)相当。
表2
序号 多肽序列 IC50(uM)
1 FPFFEGT 207.82
2 LAFPGSAQE 224.35
3 IADMFP 254.16
4 IPYWT 18.29
5 IPYWTY 11.04
6 LPNYNSRA >500
7 LAFPGSS 87.33
8 LPNYN 81.62
实施例3 DPP IV抑制肽IPYWTY
(1)IPYWTY的结构分析
如图1所示，IPYWTY的二级质谱图由实施例2步骤(3)中的多肽组学分析得到。
如图2所示，IPYWTY的分结构式由chemdraw与auto dock得到。
(2)IPYWTY与DPP-IV分子对接
如图3所示，IPYWTY与DPP IV活性口袋中的Ser630、Val546、Trp629、Asn562、Asp545和Lys554六个残基形成氢键，与Gly628、Ser552、Tyr547、Try662、Val656、Tyr666、Tyr631、Arg125和Gly741九个残基形成疏水相互作用。其中，IPYWTY的N端残基IPY与S1口袋的Tyr547、Tyr631、Try662、Val656、Tyr666形成疏水相互作用是其抑制能力的关键。后续选择此方法进行虚筛可重点关注多肽与DPP-IV结构中S1口袋所形成的疏水相互作用强弱来预断其DPP-IV抑制活性。
(3)IPYWTY的DPP-IV IC50
将多肽样品IPYWTY配成不同浓度的溶液测定其DPP-IV抑制率并作图分析，计算其DPP-IV半抑制浓度(IC50)，即DPP-IV活性抑制率达到50％时所需的多肽浓度。如图4所示，多肽样品IPYWTY的DPP-IV IC50值为11.04μM(9.27μg/mL)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.DPP-IV抑制肽，其特征在于，氨基酸序列是IPYWTY、IPYWT、LPNYN或LAFPGSS。
2.权利要求1所述DPP-IV抑制肽在制备非疾病治疗用途的DPP-IV抑制剂中的应用。
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