CN114686492A - 紫花苜蓿的MsbHLH115基因的应用和含有MsbHLH115基因的重组载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了紫花苜蓿的MsbHLH115基因的应用和含有MsbHLH115基因的重组载体，属于基因工程技术领域，本发明为了解决如何促进植物提前开花的问题，本发明提供了一种促进植物花期提前的方法，通过构建重组载体pBI121‑MsbHLH115，将重组载体转入到农杆菌中制备携带MsbHLH115基因的农杆菌，然后利用农杆菌介导的叶盘法得到携带MsbHLH115基因的转基因植物，通过培养携带MsbHLH115基因的转基因植物，发现此植物会提前开花，本发明的方法具有方便、快捷和耗时短的优点，利用该方法得到的植物的开花时间比野生型显著提前。

Description

紫花苜蓿的MsbHLH115基因的应用和含有MsbHLH115基因的重 组载体

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及紫花苜蓿的MsbHLH115基因的应用和含有MsbHLH115基因的重组载体。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种重要的多年生优质牧草豆科植物，抗逆性强，是优异的植物种质资源，蕴含丰富的有益基因。植物的花期受多种因素影响，尤其受到相关基因的调控。缩短从营养生长到生殖生长的准备阶段，能够缩短植物的种植成本，实现一年多熟，对于合理节约利用土地资源，在减少投入的基础上创造更高的经济价值具有重要的意义，对于在生长条件受气候限制的地区推广种植作物也具有应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了解决如何促进植物提前开花的技术问题，本发明为了解决上述技术问题，本发明提供了一种紫花苜蓿的MsbHLH115基因在促进植物提前开花中的应用。

进一步地限定，所述MsbHLH115基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地限定，所述的植物为烟草。

本发明还提供了一种含有MsbHLH115基因的重组载体，所述的重组载体为重组载体pBI121-MsbHLH115。

进一步地限定，紫花苜蓿的MsbHLH115基因在促进植物开花的方法，具体步骤如下：

(1)构建上述的重组载体pBI121-MsbHLH115；

(2)制备携带MsbHLH115基因的农杆菌：将步骤(1)得到的重组载体pBI121-MsbHLH115转入到农杆菌感受态中培养，得到携带MsbHLH115基因的农杆菌；

(3)制备携带MsbHLH115基因的植物：培养植物的种子达到苗期，然后对植物进行预培养处理，然后将步骤(2)中得到的农杆菌侵染预培养处理后的植物，然后经过芽诱导、生根诱导和移栽驯化，得到携带MsbHLH115基因的植物；

(4)培养携带MsbHLH115基因的植物：

进一步地限定，步骤(1)所述重组载体的构建方法为利用限制性内切酶分别酶切载体pMD18T-MsbHLH115和pBI121质粒，得到MsbHLH115基因的序列片段与pBI121质粒的酶切产物，然后将MsbHLH115基因的序列片段与pBI121质粒的酶切产物进行连接反应，连接反应的体系是：5μL的pBI121质粒酶切产物、3μL的MsbHLH115基因的序列片段、1μL的10×T4DNA连接缓冲液和1μL的T4 DNA连接酶，反应温度为16℃，反应时间为12h，获得重组载体pBI121-MsbHLH115。

进一步地限定，所述限制性内切酶为Xba I和BamHI。

进一步地限定，步骤(3)中植物的种子达到成苗期。

进一步地限定，步骤(3)中农杆菌侵染植物的步骤如下：

1)将携带重组载体pBI121-MsbHLH11的农杆菌涂布于含有卡那霉素、链霉素和利福平的YEB固体培养基上，在28℃条件下，培养48h；

2)利用1/2MS液体培养基重悬步骤1)得到的农杆菌的菌落，得到农杆菌的菌液，再用1/2MS将菌液稀释至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

3)取植物叶片，在步骤2)得到的农杆菌的菌液中侵染5min-7min，将植物叶片取出放置于无菌滤纸上，吸去附着的菌液，放置于MS1培养基上，在黑暗条件下培养2天。

进一步地限定，步骤(3)中预培养处理是将植物叶片切成1cm×1cm的方形，预培养48h。

有益效果：本发明使用的农杆菌介导的叶盘法利用1/2MS液体重悬菌落获得菌液，测定菌液浓度方便且耗时较短，并且本发明得到的携带MsbHLH115的植物的开花率高于野生型的植物，颜色鲜绿的烟草植株作为外植体时诱导愈伤组织的效率会显著高于幼嫩、黄化的烟草植株。

附图说明

图1为pBI121载体图；

图2为验证阳性转基因烟草的PCR结果图，其中M是DL200，0是空白对照，-是阴性对照，1-10是检测的转基因烟草；

图3为阳性转基因烟草组织的图片，其中，A是愈伤组织，B是Km抗性芽，C是抗性烟草芽的生根培养，D是生根的烟草；

图4为阳性转基因烟草与野生型的开花图，其中，A和B是转基因阳性烟草，C是野生型烟草。

具体实施例

实验材料：野生型烟草种子(Nicotiana tabacum L.cv.SR-1)由本实验室保存。

试验试剂：胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒、PCR试剂盒和载体连接试剂盒都是购自TAKARA生物公司。质粒提取试剂盒购自AXYGEN生物公司。

实施例1.构建含有MsbHLH115基因的方法

构建pBI121-MsbHLH115重组载体的具体步骤如下：

利用XbaI和BamHI限制性内切酶分别酶切载体pMD18T-MsbHLH115和pBI121质粒，得到MsbHLH115基因的序列片段与pBI121质粒(载体图如图1所示)的酶切产物，然后将MsbHLH115基因的序列片段与pBI121质粒的酶切产物进行连接反应，连接反应的体系是：5μL的pBI121质粒酶切产物、3μL的MsbHLH115基因的序列片段、1μL的10×T4 DNA LigaseBuffer和1μL的T4 DNA连接酶，反应温度为16℃，反应时间为12h，获得重组载体pBI121-MsbHLH115。

实施例2.紫花苜蓿的MsbHLH115基因在促进植物开花中的应用

通过构建含有紫花苜蓿MsbHLH115基因的重组载体pBI121-MsbHLH115，并将重组载体载体转入农杆菌中与植物小苗共同培养，得到转基因植物小苗，并且转基因植物提早开花，具体步骤如下：

(1)构建重组载体pBI121-MsbHLH115：参照实施例1的方法得到重组载体pBI121-MsbHLH115；

(2)制备携带MsbHLH115基因的农杆菌：将步骤(1)得到的pBI121-MsbHLH115载体转入到农杆菌感受态中培养，得到携带MsbHLH115基因的农杆菌；

(3)制备携带MsbHLH115基因的植物：培养植物的种子达到苗期，然后对植物进行预培养处理，然后将步骤(2)中得到的携带MsbHLH115基因的农杆菌侵染预培养处理后的植物，然后经过芽诱导、生根诱导和移栽驯化，得到携带MsbHLH115基因的植物；

(4)培养携带MsbHLH115基因的植物：

利用实验验证实验效果：

1.提取紫花苜蓿RNA的方法(试剂盒购自天根生化科技有限公司)：

(1)将0.1g紫花苜蓿全株放入经液氮预冷的研钵中，研磨至细碎的粉末状。

(2)将粉末转移到1.5mL的无菌离心管中，加入450μLRL(确认是否加入β-巯基乙醇)。

(3)将所有液体转移至过滤柱中，12000rpm离心5min，小心吸取上清至新的RNase-Free的离心管中。

(4)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

(5)向吸附柱中加入350μL去蛋白液，12000rpm离心60s，弃滤液，将吸附柱放回收集管中。

(6)配制DNase工作液：取10μL的DNaseⅠ反应液中加入70μLRDD溶液，轻柔混匀。

(7)将80μLDNase工作液加入到吸附柱滤膜上，静置15min。

(8)向离心吸附柱中加入350μL去蛋白液，12000rpm离心60s，弃滤液，将吸附柱放回收集管中。

(9)向离心吸附柱中加入300μL漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心60s，弃滤液，将吸附柱放回收集管中。

(10)重复步骤(9)。

(11)12000rpm离心2min，弃滤液，将吸附柱置于室温放置5min，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液。

(12)将离心吸附柱转移至RNase-free收集管中，加入30μLRNA洗液静置1-2min，12000rpm离心2min，收集管中即为RNA样品，-80℃保存。

2.紫花苜蓿RNA反转录得到cDNA的方法

以上述步骤1提取的RNA为模板，利用反转录PCR的方法获得cDNA，反应过程为：

(1)制备反应液Ⅰ：

(2)将反应液Ⅰ混合后置于65℃水浴5min，水浴后迅速放入冰中。

(3)制备反应液Ⅱ：

反应程序：30℃10min；42℃20min；99℃5min；

引物序列：MsbHLH115 F如SEQ ID NO.1所示，即:5’-ATGGATATGGATTCCAC-3’；

MsbHLH115 R如SEQ ID NO.2所示，即5’-TTAAGCAACTGGAGGTC-3’；

然后进行PCR扩增程序：94℃5min，30个循环的程序为94℃30s，55℃30s，72℃2min30s，最后72℃10min；然后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；

胶回收目标基因条带：采用DNA凝胶回收试剂盒回收上述PCR扩增得到的目标基因片段MsbHLH115(紫花苜蓿bHLH115)序列如SEQ ID NO.3所示。

3.构建载体pMD18T-MsbHLH115的方法

(1)反应体系：1μL的pMD18-T vector、2μL的上述步骤2得到的Ms bHLH115序列、2μL的ddH₂O、5μL的Solution I(TAKARA)，反应温度16℃，反应时间12h以上，得到载体pMD18T-MsbHLH115。

(2)将步骤(1)得到的载体pMD18T-MsbHLH115利用热激法转入到大肠杆菌感受态中，具体方法如下：

大肠杆菌感受态从-80℃冰箱中取出后迅速放到冰上，待其溶化后加入10μL的连接产物，冰浴30min；

取出后快速放于42℃水浴热激1min 30s后，迅速插入冰中，冰浴2min。加入450μLLB液体培养基，置于200rpm摇床，37℃，振荡1h；

取出离心管，4000rpm离心3min，弃上清350μL，重悬剩余菌体，在含有Amp的固体LB培养基的平板上进行涂布；37℃培养箱中倒置培养，过夜培养；挑取培养基上的单菌落进行鉴定，挑取阳性菌落进行扩增培养，利用质粒提取试剂盒提取pMD18T-MsbHLH115质粒。

4.构建重组载体pBI121-MsbHLH115的方法

(1)提取pMD18T-MsbHLH115和pBI121的质粒：通过质粒提取试剂盒提取pMD18T-MsbHLH115和pBI121的质粒；

(2)对pMD18T-MsbHLH115和pBI121的质粒进行酶切：采用XbaI限制性内切酶和BamHI限制性内切酶对pBI121的质粒DNA进行双酶切，双酶切的反应体系为：50μL的pBI121质粒、10μL的10×M Buffer(TAKARA)、2μL的Xba I限制性内切酶、2μL的BamHI限制性内切酶和10μL的BSA，得到pBI121质粒的酶切产物。

采用Xba I限制性内切酶和BamHI限制性内切酶对pMD18T-MsbHLH115的质粒DNA进行双酶切，双酶切的反应体系为：50μL的pMD18T-MsbHLH115的质粒、10μL的10μL的10×MBuffer、2.5μL的Xba I限制性内切酶、2.5μL的BamHI限制性内切酶和5μL的BSA和30μL的ddH₂O，得到MsbHLH115的序列片段。

(3)采用DNA凝胶回收试剂盒回收MsbHLH115的序列片段和pBI121质粒的酶切产物；表达载体pBI121与MsbHLH115的的序列片段连接，连接时的反应体系为：5μL的pBI121的质粒酶切产物、3μL的MsbHLH115的序列片段、1μL的10×T4 DNALigase Buffer和1μL的T4DNA Ligase；反应条件是：反应温度16℃，反应时间12h-16h得到连接产物。

连接产物利用热激法转入到大肠杆菌感受态中，具体步骤如下：

大肠杆菌感受态从-80℃冰箱中取出后迅速放到冰上，待其溶化后加入10μL的连接产物，冰浴30min；

取出后快速放于42℃水浴热激1min 30s后，迅速插入冰中，冰浴2min。加入450μLLB液体培养基，置于200rpm摇床，37℃，振荡1h；

取出离心管，4000rpm离心3min，弃上清350μL，重悬剩余菌体，在含有Amp的固体LB培养基的平板上进行涂布；37℃培养箱中倒置培养，过夜；挑取培养基上的单菌落进行鉴定；

(4)重组质粒的鉴定

菌落PCR鉴定，用含有Xba I和BamHI酶切位点的MsbHLH115基因引物进行PCR鉴定，反应体系为：7.35μL的ddH₂O、1μL的10×PCR Buffer(TAKARA)、0.8μL的dNTPMix(2.5mmol/L)、0.4μL的MsbHLH115-Xba I(10μmol/L)、0.4μL的MsbHLH115-BamH I(10μmol/L)、0.05μL的rTaq DNApolymerase(5U/μL)和1μL的检测的菌落样本。

单菌落反应程序：(30循环)

将阳性的菌落进行扩增培养，用质粒提取试剂盒提取重组的pBI121-MsbHLH115的质粒，然后进行酶切验证，验证的反应体系为：5μL的pBI121-MsbHLH115重组质粒、1μL的10×T Buffer(TAKARA)、1μL的BSA、0.5μL的XbaI内切酶、0.5μL的BamHI内切酶、2μL的ddH₂O，pBI121表达载体和MsbHLH115基因条带分离，双酶切成功，载体构建成功。

5.制备携带MsbHLH115基因的农杆菌的方法

(1)利用冻融法转化重组质粒pBI121-MsbHLH115，具体方法如下：

①取-80℃保存的农杆菌感受态细胞置于冰中融化。

②将10μLpBI121-MsbHLH115重组质粒加入到100μL农杆菌感受态细胞(GV3101)中，用手拨打管底混匀。

③依次置于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

④加入700μL无抗生素的YEB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h。

⑤6000rmp离心1min收菌，留取100μL上清重悬菌块，将菌液涂布于含有(Km)卡那霉素(50mg/mL)+(Str)链霉素(50mg/mL)+(Rif)利福平(50mg/mL)的YEB固体培养基上，倒置放于28℃培养箱中暗培养2-3d。

鉴定转化后的农杆菌；其鉴定方式为：挑取生长较为均匀的单菌落，用基因特异性引物进行菌落PCR扩增；鉴定的反应体系为：待检测的菌落、1μL的10×Buffer(TAKARA)、0.8μL的dNTPMix、0.4μL的MsbHLH115-F、0.4μL的MsbHLH115-R、0.05μL的rTaq和7.35μL的ddH₂O；反应条件为：①94℃、5min；②94℃、30s；③55℃、30s；④72℃、2min30 s；⑤72℃、10min；⑥4℃、1h；①～⑥循环30次；鉴定为阳性的菌落扩增培养。

6.制备携带MsbHLH115基因的植物的方法

预培养处理植物苗：

(1)将野生型烟草种子置于灭菌的离心管中，用75％的酒精消毒3min，灭菌水冲洗6-8遍。

(2)再用1mL 10％的次氯酸钠处理5min，灭菌水冲洗6-8遍。

(3)将处理好的种子均匀的铺于MS固体培养基上，培养置长出小苗。

(4)将小苗移入装有MS固体培养基的瓶中，继续培养长到成苗期，叶片用于侵染实验。

(5)将烟草叶片切成1cm×1cm左右的方形，预培养48h。

活化上述的步骤5中得到的阳性农杆菌：在超净工作台中将pBI121-MsbHLH115阳性菌涂布于含有Km、Str、Rif的YEB固体培养基上，28℃，倒置培养48h，然后用1/2MS液体培养基重悬菌落后得到菌液，再用1/2MS将菌液稀释至OD₆₀₀约为0.4-0.6左右。将上述所用菌液转移至50mL锥形瓶中用于侵染烟草。

取出上述步骤中预培养的叶片，在菌液中侵染6min，其间不断颠倒，以保证叶片充分接触到菌液，将叶片取出放置于无菌滤纸上，吸去附着的菌液，将叶片背面向上，放置于MS1的培养基上，暗培养2d。

芽诱导：将叶片转移至MS2培养基上进行芽诱导，每3天更换一次培养基，连续3次后，每2周更换一次培养基。

生根诱导：待分化的小芽长至2cm左右，将分化的小芽切下，转移至MS3培养基中，进行生根培养。

移栽驯化：将生根后的烟草幼苗转移至土中进行培养。

鉴定阳性植物的方法：对Km抗性植株进行PCR鉴定，以水和野生型烟草DNA为模板分别为空白对照和阴性对照，对10株抗性苗进行PCR鉴定，其中7号、10号泳道显示扩增出约780bp左右的片段，可初步证明获得两株转MsbHLH115基因阳性苗。可初步证明MsbHLH115已转入烟草中，部分PCR鉴定结果如图2所示。

如图3所示，通过农杆菌介导的叶盘法将MsbHLH115基因对烟草进行遗传转化，可获得MsbHLH115基因的抗性植株。

7.培养携带MsbHLH115基因的植物，统计植物开花的情况：

将得到的转基因烟草菌株的花期进行统计，结果显示：选取长势一致的野生型和转基因烟草进行表型观察，在80d后观察野生型和转基因品系的开花表型。野生型烟草一般在株高达到100cm后开花，而转MsbHLH115基因烟草品系在株高达到50cm时开花。由图4可以看出，野生型烟草没有开花，而转基因烟草MsbHLH115-1、MsbHLH115-2开花，说明转基因烟草开花时间明显早于野生型烟草。转基因品系的烟草从种植到开花期较野生型烟草缩短约2个月时间。

SEQUENCE LISTING

<110> 哈尔滨师范大学

<120> 紫花苜蓿的MsbHLH115基因的应用和含有MsbHLH115基因的重组载体

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> MsbHLH115 F

<400> 1

atggatatgg attccac 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> MsbHLH115 R

<400> 2

ttaagcaact ggaggtc 17

<210> 3

<211> 780

<212> DNA

<213> MsbHLH115基因

<400> 3

atggatatgg attccacagg tggttcctcc atttggctct atgattatgg ctatgatgat 60

atatctattt ctgctgctga tttcatggct tctgactctt ctgctgctcc tgctttcacc 120

tggatgcctc agcctcagtc tcaaactcat atcatcaacc ctccttcctc ccatatgagc 180

ttggaaatgg attactcact tgattcaact gtaatggaaa gtaacccttc aaagcgcatg 240

gaaatggaat attcactgga ttcaactgta ctggaaaacg gcccttcaaa gcggttaagg 300

acggaatcat atgcatctag ctccaaggca ggtcgtgaga aagtgcgaag ggataaattg 360

aatgacaggt ttatggaatt gagttctgtc ttagagcccg atacgctgcc caaaacagac 420

aaggtaagcc tattaaatga tgcggttcga gtggtgaccc aattaagaaa tgaagctgag 480

aggctcaagg aaaggaatga tgaattgcgc gaaaaagtta aagaacttaa ggctgagaag 540

aaagagcttc gtgatgagaa aaataagctg aagctagaca aagaaaagtt ggaacagcaa 600

gtcaaattag caagtgtaca gtccagcttc ctctccaatg ccatggctgc taaaggacaa 660

actgctaacc acaagctgat gcctttcatt ggttatcctg gaatttcaat gtggcagttt 720

atgtcacctg ctacagttga tacatcacaa gatcacctgc ttcgacctcc agttgcttaa 780

Claims (10)

1.紫花苜蓿的MsbHLH115基因在促进植物提前开花中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MsbHLH115基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物为烟草。

4.一种含有MsbHLH115基因的重组载体，其特征在于，所述的重组载体为重组载体pBI121-MsbHLH115。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，紫花苜蓿的MsbHLH115基因在促进植物提前开花的方法，具体步骤如下：

(1)构建权利要求4所述的重组载体；

(2)制备携带MsbHLH115基因的农杆菌：将步骤(1)得到的重组载体pBI121-MsbHLH115转入到农杆菌感受态中培养，得到携带MsbHLH115基因的农杆菌；

(3)制备携带MsbHLH115基因的植物：培养植物的种子达到苗期，然后对植物进行预培养处理，然后将步骤(2)中得到的农杆菌侵染预培养处理后的植物，然后经过芽诱导、生根诱导和移栽驯化，得到携带MsbHLH115基因的植物；

(4)培养携带MsbHLH115基因的植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述重组载体的构建方法为利用限制性内切酶分别酶切载体pMD18T-MsbHLH115和pBI121质粒，得到MsbHLH115基因的序列片段与pBI121质粒的酶切产物，然后将MsbHLH115基因的序列片段与pBI121质粒的酶切产物进行连接反应，连接反应的体系是：5μL的pBI121质粒酶切产物、3μL的MsbHLH115基因的序列片段、1μL的10×T4 DNA连接缓冲液和1μL的T4 DNA连接酶，反应温度为16℃，反应时间为12h，获得重组载体pBI121-MsbHLH115。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述限制性内切酶为Xba I和BamH I。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)中植物的种子达到成苗期。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)中农杆菌侵染植物的步骤如下：

1)将携带重组载体pBI121-MsbHLH11的农杆菌涂布于含有卡那霉素、链霉素和利福平的YEB固体培养基上，在28℃条件下，培养48h；

2)利用1/2MS液体培养基重悬步骤1)得到的农杆菌的菌落，得到农杆菌的菌液，再用1/2MS将菌液稀释至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

3)取植物叶片，在步骤2)得到的农杆菌的菌液中侵染5min-7min，将植物叶片取出放置于无菌滤纸上，吸去附着的菌液，放置于MS1培养基上，在黑暗条件下培养2天。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)中预培养处理是将植物叶片切成1cm×1cm的方形，预培养48h。

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