CN114686417B - 高效抑制肝癌的细胞囊泡制剂、其制备方法及其应用 - Google Patents

高效抑制肝癌的细胞囊泡制剂、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高效抑制肝癌的细胞囊泡制剂、其制备方法及其应用。本发明所述细胞囊泡制剂是源自正常肝前体细胞凋亡所分泌的囊泡，其能特异被具有干性特征的肝癌起始细胞摄取，有效抑制肝癌的发生，促进具有干性特征的肝癌起始细胞的死亡，没有致瘤性。本发明还提供了所述细胞囊泡的制备方法。本发明为预防肝癌发生和复发提供了有效的途径。

Description

高效抑制肝癌的细胞囊泡制剂、其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤学领域；更具体地，本发明涉及高效抑制肝癌(包括肝癌复发)的细胞囊泡制剂、其制备方法及其应用。
背景技术
肝癌是全球最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率也呈逐年上升趋势。早期肝癌以手术切除为主，晚期肝癌以化疗药物为主。近来年，随着对肝癌发生发展机制研究的不断深入，大家逐渐认识到，肝脏炎症微环境中的肝癌起始细胞是导致肝癌发生和复发的根源。肝癌起始细胞是一群具有干性特征的细胞。
一旦发生肝癌的复发，临床上采用多种后续手段。包括：再次手术切除，手术可以处理复发肝癌，但因为复发后的肝癌往往有很多个，再次手术很难大面积切除肝脏，也很难切除干净；微创治疗，例如采用肝动脉化疗栓塞术等；化学消融，通常是在B超或CT的引导下，向肝癌里注射无水酒精，使细胞迅速脱水、蛋白质变性凝固，从而杀死肝癌细胞，但这种方法目前应用比较少了；物理消融，包括射频消融和微波消融，也是在B超或CT引导下，通过穿刺针的产热作用，将肝癌细胞杀死；以及比较常用但疗效不同的放化疗等。
传统的治疗方案，尽管可能一定程度地提高了患者的生存率和生活质量，但是，本领域还需要开发新的治疗手段或辅助治疗手段，以期进一步地进行抑制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效抑制肝癌(包括肝癌复发)的细胞囊泡制剂、其制备方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种制备用于抑制肝癌的细胞囊泡的方法，包括：(1)培养肝前体细胞，获得肝前体细胞培养物；(2)对所述肝前体细胞培养物进行凋亡处理，获得含有凋亡细胞的培养物；和，(3)从所述含有凋亡细胞的培养物中获得或分离细胞囊泡。
在一个优选例中，所述方法的步骤(2)中，所述的凋亡处理包括：以肿瘤化疗药物处理所述细胞培养物；或以肿瘤放疗射线照射所述细胞培养物。
在另一优选例中，所述方法的步骤(2)中，所述的肿瘤化疗药物包括：阿霉素；较佳地，所述阿霉素在细胞培养物中的终浓度为50～200μg/ml；较佳地为80～120μg/ml，更佳地为100±10μg/ml(如100±5μg/ml，100±3μg/ml， 100±2μg/ml)。
在另一优选例中，所述的肿瘤放疗射线包括：放射性同位素产生的γ射线、α射线、β射线，X射线、电子线、质子束及其他粒子束等，或其组合。较佳地，所述肿瘤放疗射线为γ射线。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述的分离细胞囊泡包括：获取培养物上清，离心去除细胞及碎片，之后再离心分离所述细胞囊泡；较佳地，在1000 ±100g离心10±2min，之后以14000g±1000g离心2±0.5min，去除沉淀后，再以14000±1000g离心60±10min，收获沉淀，其中包括细胞囊泡。
在另一优选例中，从培养物上清分离所述细胞囊泡的方法包括：在1000 ±50g离心10±1min，之后以14000g±500g离心2±0.2min，去除沉淀后，再以14000±50g离心60±5min，收获沉淀，其中包括细胞囊泡。
在另一优选例中，离心分离所述细胞囊泡时，在低温条件下进行，所述的低温优选地为0～8℃，如2～6℃，更具体如3℃、4℃、5℃。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肝癌的细胞囊泡，其来自于肝前体细胞，为肝前体细胞在凋亡状态下产生的细胞囊泡。
在一个优选例中，所述的细胞囊泡由前面任一所述的方法制备获得。
在本发明的另一方面，提供所述的细胞囊泡在制备抑制肝癌的药物组合物中的应用。
在一个优选例中，所述的药物组合物还用于：减少肝癌患者的体重降低。
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于：靶向和清除具有干性特征的肝癌起始细胞。
在另一优选例中，所述的肝癌包括：复发性肝癌或原发性肝癌。
在另一优选例中，所述的肝癌是具有干性特征的肝癌起始细胞形成的肝癌。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肝癌的药物组合物，其包括前面所述的细胞囊泡，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为一种联合用药的制剂，其中还包括：肿瘤化疗药物，放疗药物(例如在放疗前后由医师建议使用的药物)，辅助治疗药物，营养制剂等。
在本发明的另一方面，提供一种制备用于抑制肝癌的药物组合物的方法，包括以所述的方法制备细胞囊泡，将所述细胞囊泡与药学上可接受的载体混合。
在本发明的另一方面，提供一种药盒，其中包括所述的药物组合物；或其中包括前面述的细胞囊泡。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A、施用阿霉素的大鼠肝癌细胞产生的红色荧光细胞囊泡 (apoLTC-MPs)的荧光显微镜图；
图1B、施用阿霉素的大鼠肝细胞产生的红色荧光细胞囊泡(apoHep-MPs) 的荧光显微镜图；
图1C、施用阿霉素的肝前体细胞产生的红色荧光细胞囊泡(apoHPC-MPs) 的荧光显微镜图。
图2A、施用阿霉素的大鼠肝癌细胞、大鼠肝细胞、肝前体细胞分别产生的细胞囊泡的粒径分布；
图2B、施用阿霉素的大鼠肝癌细胞、大鼠肝细胞、肝前体细胞分别产生的细胞囊泡的zeta电势。
图3、施用阿霉素的大鼠肝癌细胞、大鼠肝细胞、肝前体细胞后产生的细胞囊泡分别经脾注射大鼠，以注射生理盐水为对照组，获得的各组肝癌发生情况。箭头处表示肝癌病灶。
图4、大鼠具有干性特征的肝癌起始细胞对施用阿霉素的大鼠肝癌细胞、大鼠肝细胞、肝前体细胞后分别产生的细胞囊泡的摄取情况比较，以注射生理盐水的大鼠的CK19阳性的肝癌起始细胞为对照组。
图5、免疫组化观察凋亡的大鼠肝前体细胞、凋亡的大鼠肝细胞、凋亡的大鼠肝癌细胞来源的囊泡对于清除具有干性特征的肝癌起始细胞的作用。
图6A、凋亡的大鼠肝前体细胞、凋亡的大鼠肝细胞、凋亡的大鼠肝癌细胞来源的囊泡给药大鼠后的ALT含量测定结果，以生理盐水处理组为对照；
图6B、凋亡的大鼠肝前体细胞、凋亡的大鼠肝细胞、凋亡的大鼠肝癌细胞来源的囊泡给药大鼠后的AST含量测定结果，以生理盐水处理组为对照；
图6C、凋亡的大鼠肝前体细胞、凋亡的大鼠肝细胞、凋亡的大鼠肝癌细胞来源的囊泡给药大鼠后的肌酐含量测定结果，以生理盐水处理组为对照；
图6D、凋亡的大鼠肝前体细胞、凋亡的大鼠肝细胞、凋亡的大鼠肝癌细胞来源的囊泡给药大鼠后，大鼠的体重监测结果，以生理盐水处理组为对照。
图7、没有经过阿霉素处理的大鼠肝前体细胞产生的细胞囊泡、单纯的阿霉素化疗药治疗组、经过阿霉素诱导大鼠肝前体细胞凋亡所产生的细胞囊泡、和阿霉素与大鼠肝前体细胞产生的细胞囊泡直接混合注射大鼠体内对于肝癌抑制的效果测定，以生理盐水处理组为对照。箭头处表示肝癌病灶。
图8A、γ放射源照射诱导的肝前体细胞凋亡产生的细胞囊泡抑制肝癌发生的情况，以生理盐水处理组为对照。
图8B、γ放射源照射诱导的肝前体细胞凋亡产生的细胞囊泡注射实验大鼠后，ALT和AST肝损伤指标的测定结果。箭头处表示肝癌病灶。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，源自凋亡的正常肝前体细胞(Hepatic ProgenitorCells，HPCs)的细胞囊泡作为靶向载体，其能靶向具有干性特征的肝癌起始细胞，且能有效地清除肝癌起始细胞，同时没有毒副作用。因此，本发明人基于此以及其它方面，提出了本发明。
术语
如本发明所用，所述的“(细胞)囊泡”、“(细胞)微泡”、“Extracellular vesicles(EVs)”可互换使用，是指细胞释放的纳米级膜囊泡，其包裹有可溶性蛋白，脂质，RNA，DNA等细胞成分，根据不同的处理以及细胞种类，囊泡及其表面物是不同的。囊泡中包含各种成分的种类和数量的多样性取决于其来源的细胞，但可能受到生理压力或其他因素的影响，例如诱导细胞凋亡等的刺激条件下，囊泡内的成分很大程度上区别于正常生理条件下细胞分泌的囊泡成分。
如本发明所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。
如本发明所用，“治疗”(treatment或treat)一词此处是包含对一哺乳动物(特别是人类)进行预防性(例如，预防性药物(prophylactic))、治疗性(curative) 或舒减性(palliative)治疗；且包含(1)预防、治疗或减缓一个体罹患一疾病(例如癌症)，其中该个体为罹患该疾病的高风险族群，或是已罹患该疾病而尚未确诊断定；(2)抑制一疾病(例如抑制其发生)；或是(3)减轻一疾病(例如减轻与该疾病相关的征状)。
如本发明所用，“个体”或“受试者”(subject)是指包含人类的动物，其可接受本发明的囊泡或囊泡制剂的治疗。
如本发明所用，“有效量(Effective Amount)”是指一药剂(本发明中为囊泡或囊泡制剂)的用量足以产生所需的疗效反应。有效量也包括所述药剂治疗利益效果超越其毒性或有害影响的情形。药剂的有效量不是必然能够治愈疾病或病症，但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生，或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量分成一、二或更多剂，而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量取决于多种因素，例如欲治疗的个体的特定状况、生理条件(如:体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如有)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将治疗有效量表示成活性成分的总重量，例如以克、毫克或微克来表示；或表示成活性成分重量相对于体重的比例，例如表示为每公斤体重多少毫克(mg/kg)。或者是，可将有效量表示成活性成分(如本发明的囊泡或囊泡制剂)的浓度，例如摩尔浓度、重量浓度、体积浓度、重量摩尔浓度、摩尔分率、重量分率及混合比值。本领域技术人员可依据动物模式的剂量来计算药剂(如本发明的囊泡或囊泡制剂)的人体等效剂量(human equivalent dose,HED)。举例来说，本领域技术人员可依据美国食品药物管理局(FDA)所公告的“估算成人健康志愿者在初始临床治疗测式的最大安全起始剂量”(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials forTherapeutics in Adult Healthy Volunteers)来估算人体使用的最高安全剂量。
肝前体细胞来源的囊泡及其制备
细胞是由细胞膜包裹细胞内容物构成。细胞在生理和病理条件下能分泌细胞囊泡，作为细胞间通讯的重要方式。当细胞受到外来信号刺激(例如：化疗药物等刺激)能大量分泌包裹特定细胞内容物的细胞囊泡。通常情况下，细胞囊泡粒径大小在100～1000nm之间。
本领域中，肿瘤细胞和肿瘤干细胞来源的载药囊泡已被开发，其能有效杀伤肿瘤细胞或肿瘤干细胞。但是，一些研究结果也表明，肿瘤细胞及肿瘤干细胞来源的囊泡有肿瘤细胞污染的可能，存在安全隐患。
为了改变这一问题，本发明人针对多种多样的细胞，利用不同的药物或处理方法进行处理，观测其是否能够产生囊泡以及所产生囊泡是否有利于疾病的防治作用。在广泛试验后，本发明人发现，凋亡的正常肝前体细胞来源的微泡具有特定的生物活性，可以有效地靶向和抑制体内具有干性特征的肝癌起始细胞，从而能有效抑制肝癌发生，以及抑制肝癌的复发。本发明中，所运用的肝前体细胞为正常干细胞。
在肝脏炎症微环境中存在肝癌起始细胞，肝癌起始细胞是一群具有干性特征的细胞。本发明人的实验比较结果显示，利用肝前体细胞经过凋亡处理而获得的囊泡能被所述肝癌起始细胞特异地摄取，清除所述肝癌起始细胞，进而抑制肝癌的发生和发展，其抑制活性大大地高于普通肝细胞以及肝癌细胞来源的囊泡。
本发明的细胞囊泡来自于肝前体细胞，首先培养肝前体细胞，获得足够量的细胞培养物后，对其进行凋亡处理，从其凋亡的细胞中获得或分离所述的细胞囊泡。本发明的方法，可实现将死亡信号包裹到源自凋亡前体细胞的细胞囊泡中。
用于实现本发明所主张的技术效果的细胞囊泡，区别于常规状态下细胞产生的囊泡。也可以说，本发明所获得的细胞囊泡，包括了源自凋亡的肝前体细胞的囊泡以及包裹于/附着于/来源于所述细胞囊泡内/囊泡表面的具有生物活性的成分。其可带有化疗药物，但是其本身的效果又大大优于该化疗药物单独应用时的功效，且其本身具有良好的靶向作用。
作为本发明的优选方式，所述的凋亡处理包括以化疗药物处理所述细胞培养物。所述的化疗药物是能够使得本发明所述的肝前体细胞发生凋亡的药物。例如可包括选自以下的药物：蒽环类药物，长春碱类药物，紫杉碱类药物，表鬼臼毒素类药物，喜树碱类药物，蒽醌类药物，氮芥类药物，乙撑亚胺类药物，甲密胺类药物，烃化磺酸酯类药物，亚硝胺类药物，三氮烯类药物，叶酸同类物，嘧啶同类物，取代脲类药物，肾上腺皮质固醇类药物，黄体酮类药物等。
作为本发明的更优选的方式，所述的化疗药物包括蒽环类药物。进一步地，根据本发明人的较优实施例，优选的化疗药物为阿霉素，本发明的实施例结果显示，其能够促使肝前体细胞凋亡，并能促其产生较多的功能性细胞囊泡。
作为本发明的优选方式，所述的凋亡处理包括以肿瘤放疗射线照射所述细胞培养物。所述的肿瘤放疗射线可包括选自下组的射线：放射性同位素产生的γ射线、α射线、β射线，X射线、电子线、质子束及其他粒子束等，或其组合。
进一步地，根据本发明人的较优实施例，所述肿瘤放疗射线为γ射线，本发明的实施例结果显示，其能够促使肝前体细胞凋亡，并能促其产生较多的功能性细胞囊泡。
本发明人对获得/分离细胞囊泡的方法进行了优化。作为本发明的优选方式，所述的分离细胞囊泡包括：获取培养物上清，离心去除细胞及碎片，之后再离心分离所述细胞囊泡。根据本发明人的较优实施例，所述的分离细胞囊泡的方法包括：在1000±100g离心10±2min，之后以14000g±1000g离心2±0.5min，去除沉淀后，再以14000±1000g离心60±10min，收获沉淀，其中包括细胞囊泡。利用所述的方法，可以高效地分离所需的细胞囊泡，杂质量少，细胞囊泡活性高。
作为本发明的优选方式，离心分离所述细胞囊泡时，在低温条件下进行，所述的低温优选地为0～8℃，如2～6℃，更具体如3℃、4℃、5℃。
根据本发明的优选实施例，本发明所述细胞囊泡的平均粒径约为1000nm 左右，例如粒径约在600～1100nm，更具体地如700nm，800nm，900nm， 1000nm等。
应用
基于本发明的囊泡的优异性能，本发明提供了所述的囊泡的用途，用于抑制肝癌，或用于制备抑制肝癌的药物组合物(制剂)。所述肝癌包括：原发性肝癌，肝癌术后复发的肝癌；尤其优选地，所述肝癌包括复发的肝癌。
本发明获得的细胞囊泡，源自凋亡的肝前体细胞的细胞囊泡作为载体，其能靶向具有干性特征的肝癌起始细胞，且能有效清除具有干性特征的肝癌起始细胞，同时没有毒副作用。
本发明获得的细胞囊泡显示出作为理想的理疗试剂载体的特征，囊泡膜来源于细胞膜成分，具有优良的体内循环稳定性，低免疫原性，低毒副作用和特异细胞靶向性。
本发明使用源自凋亡的正常肝前体细胞得到的囊泡，相比于使用肝癌细胞来源的细胞囊泡，正常肝前体细胞的细胞囊泡在体内的应用更安全可靠。相比于使用外源性药物载体，正常肝前体细胞的细胞囊泡在体内循环更稳定，不易被清除。
相比于使用肝癌细胞来源的细胞囊泡，尤其令人感兴趣的是，本发明所述的细胞囊泡更易被同源细胞摄取，本发明所述囊泡是来源于具有干性特征的肝前体细胞，其能特异靶向体内具有干性特征的肝癌起始细胞，从而增强了囊泡制剂的疗效。
本发明利用肝前体细胞生产所述的细胞囊泡，肝前体细胞是肝脏内具有自我更新、高度增殖的成体干细胞。在本发明的技术方案中，所述肝前体细胞也呈现了非常优异的增殖和产生细胞囊泡的性能，从而使得本发明的技术方案可以规模化应用。
本发明所述的细胞囊泡，毒副作用非常低，本发明人还意外地发现，本发明的细胞囊泡不仅对机体没有毒副作用，而且能明显改善肝癌导致的体重减轻症状，从而使得本发明的技术方案具有良好的临床应用价值。
药物组合物及药盒
本发明所收集的囊泡制剂，可以按照常规方法制成药物注射制剂。
本发明还提供一种用于抑制肝癌的药物组合物，所述的药物组合物包括：本发明所述的囊泡；以及药学上或生理学上可接受的载体。
合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、 ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，白蛋白等。
作为一种优选的实施方式，可将利用本发明的方法收集到的细胞囊泡用生理盐水悬浮后制成注射液。
作为一种优选的实施方式，本发明的含有细胞囊泡的组合物可设置为控释的剂型，从而有利于在需要的时间内发挥较优的生物活性。
作为一种优选的实施方式，本发明的含有细胞囊泡的组合物还可与其它药物(如其它化疗药物，生物治疗药物)或其它治疗方法(如放疗方法)联合应用，以期进一步提供治疗效果或平衡其它化疗药物的毒性/副作用。
在使用时，是将安全有效量的本发明所述的囊泡施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式： A＝k×(W2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算； K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解的是，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。
本发明还提供了一种药盒或试剂盒，其中包括本发明所述的细胞囊泡；或其中包括本发明所述的药物组合物。
为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。
本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、使用化疗药阿霉素诱导大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞及大鼠肝细胞凋亡，分泌包裹阿霉素的细胞囊泡
1、实验材料和试剂
WB-F344大鼠肝前体细胞；RH35大鼠肝癌细胞；BRL大鼠肝细胞；阿霉素(商购，带有红色荧光)。
2、实验步骤
(1)在DMEM细胞培养液中培养大鼠肝前体细胞，直到获得2×107WB 细胞；在DMEM细胞培养液中培养大鼠肝癌细胞，直到获得2×107RH35细胞；在RPMI 1640细胞培养液中培养大鼠肝细胞，直到获得2×107BRL细胞。
(2)对上述大鼠肝前体细胞施用阿霉素，使阿霉素终浓度为100μg/ml；对上述大鼠肝癌细胞施用阿霉素，使阿霉素终浓度为100μg/ml；对上述大鼠肝细胞施用阿霉素，使阿霉素终浓度为100μg/ml。
(3)在施用阿霉素24h后，显微镜下观察细胞的形态，出现明显皱缩的凋亡形态后。分别收集凋亡的大鼠肝前体细胞上清，凋亡的大鼠肝癌细胞上清，及凋亡的大鼠肝细胞上清。4℃条件下，以1000g离心10min，以14000g 离心2min，去除上清中的细胞及碎片，再以14000g的离心力在4℃离心上清60min，分别得到大鼠肝前体细胞所产生的细胞囊泡，大鼠肝癌细胞所产生的细胞囊泡，和大鼠肝细胞所产生的细胞囊泡。
(4)分别将上述获得的大鼠肝前体细胞所产生的细胞囊泡，大鼠肝癌细胞囊泡，大鼠肝细胞囊泡分散于生理盐水中(微泡悬浮液)，于显微镜下观察形态，及动态光散射仪进行粒径分布和zeta电势的测定。
3、实验结果
分别将上述得到的微泡悬浮液分别置于24孔板中，然后分别在荧光显微镜下观察。
从图1A可以看出，施用阿霉素的大鼠肝癌细胞产生的包裹阿霉素的红色荧光的细胞囊泡(apoLTC-MPs)；从图1B可以看出，施用阿霉素的大鼠肝细胞产生的包裹阿霉素的红色荧光的细胞囊泡(apoHep-MPs)；从图1C可以看出，施用阿霉素的肝前体细胞产生的包裹阿霉素的红色荧光的细胞囊泡 (apoHPC-MPs)。由于单个阿霉素分子极小，无法使用荧光显微镜分辨，只有被包裹后才能聚集而被观察到，因此在荧光显微镜下观察到的红色囊泡即是细胞囊泡包裹的阿霉素，证实了细胞凋亡能分泌包裹阿霉素的细胞囊泡。
测定3种包裹阿霉素的细胞囊泡的粒径及电势，结果如图2。从图2A可以看出，3种包裹阿霉素的细胞囊泡的粒径分布无统计意义差异，其粒径大小约1μm；从图2B可以看出，3种包裹阿霉素的细胞囊泡的zeta电势也无显著性差异，zeta电势约为-20mV。
由此结果显示，阿霉素诱导的大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞，及大鼠肝细胞凋亡所产生的包裹阿霉素的细胞囊泡的表征均能被检测。
实施例2、阿霉素诱导大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞及大鼠肝细胞凋亡分泌的细胞囊泡对肝癌发生的影响
1、实验材料和试剂
大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞，大鼠肝细胞，阿霉素(商购，带有红色荧光)；SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；二乙基亚硝胺 (Diethylnitrosamine，DEN)购自Sigma-Aldrich公司。
2、实验步骤
(1)培养1×108个大鼠肝前体细胞，1×108个大鼠肝癌细胞，1×108个大鼠肝细胞。培养方法同实施例1。
(2)将上述培养的细胞更换无血清细胞培养液，并分别施用阿霉素，使阿霉素的终浓度为100μg/ml。
(3)在施用阿霉素24h后，按照实施例1的方法收集并分离来自1×108个大鼠肝前体细胞的细胞囊泡(2×107为1只大鼠的用量)，收集并分离来自 1×108个大鼠肝癌细胞的细胞囊泡(2×107为1只大鼠的用量)，收集并分离来自1×108个大鼠肝细胞的细胞囊泡(2×107为1只大鼠的用量)。
(4)大鼠原发性肝癌模型的建立：SD大鼠(体重140g)，饮用含有DEN 的水，DEN浓度为0.95mg/ml。DEN喂养5周，直至大鼠肝前体细胞大量异常增殖。随机将DEN诱癌大鼠分为4组，每组5只。将所制备的大鼠肝前体细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠作为实验组1；将所制备的大鼠肝癌细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠作为实验组2；将所制备的大鼠肝细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠作为实验组3；同时对另外5只SD大鼠经脾注射生理盐水，作为对照组。重复以上各实验组和对照组，每周一次，共 8周，DEN诱癌13周后处死各组大鼠，取出肝脏组织，观察各组肝癌发生情况。
3、实验结果
从图3可知，经脾注射来自凋亡的大鼠肝前体细胞分泌的囊泡组 (apoHPC-MPs)肝癌发生明显低于对照组(Saline)，从分离的肝组织上没有视线可观测到的肝癌病灶，肝脏组织光滑；注射来自凋亡的大鼠肝癌细胞分泌的囊泡组(apoLTC-MPs)肝癌发生与对照组没有区别，肝脏组织有显著的肝癌病灶；注射来自凋亡的大鼠肝细胞分泌的囊泡组(apoHep-MPs)肝癌发生与对照组(Saline)没有区别。
该结果表明，凋亡的大鼠肝前体细胞分泌的囊泡能明显抑制肝癌的发生，抑制效果极为优异。
实施例3、具有干性特征的肝癌起始细胞对大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞及大鼠肝细胞来源的囊泡的摄取
1、实验材料和试剂
大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞，大鼠肝细胞，阿霉素(商购，带有红色荧光)，SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，二乙基亚硝胺 (Diethylnitrosamine，DEN)购自Sigma-Aldrich公司。
2、实验步骤
(1)大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞，大鼠肝细胞的培养方法同实施例1。
(2)阿霉素处理上述细胞的方法同实施例1。
(3)细胞凋亡后，收集细胞上清，分离囊泡，细胞囊泡制备方法同实施例1。
(4)大鼠原发性肝癌模型的建立方法同实施例2。随机将DEN诱癌大鼠分为4组，每组5只。将制备的大鼠肝前体细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD 大鼠；将制备的大鼠肝癌细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠；将制备的大鼠肝细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠；同时对另外5只SD大鼠经脾注射生理盐水。24h后处死各组大鼠，取出肝脏组织，制备肝组织的冰冻切片，通过免疫荧光观察大鼠具有干性特征的肝癌起始细胞对大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞及大鼠肝细胞来源的细胞囊泡的摄取情况。
3、实验结果
DEN诱癌13周后肝组织切片的免疫荧光分析结果如图4所示，出乎意料的是，具有干性特征的肝癌起始细胞对凋亡的大鼠肝前体细胞分泌的囊泡 (apoHPC-MPs)摄取量最多，且摄取量显著多于凋亡的大鼠肝癌细胞分泌的囊泡(apoLTC-MPs)和凋亡的大鼠肝细胞分泌的囊泡(apoHep-MPs)。
结果表明，大鼠具有干性特征的肝癌起始细胞能特异摄取肝前体细胞来源的囊泡。这一结果说明囊泡易于聚集于肝癌病灶部位，从而有利于肝癌的靶向性抑制。
实施例4、凋亡的大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞，及大鼠肝细胞来源的囊泡对大鼠具有干性特征的肝癌起始细胞的清除作用
1、实验材料和试剂
大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞，大鼠肝细胞，阿霉素(商购，带有红色荧光)，SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，二乙基亚硝胺 (Diethylnitrosamine，DEN)购自Sigma-Aldrich公司。
2、实验步骤
(1)大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞，大鼠肝细胞的培养方法同实施例1。
(2)阿霉素处理细胞的方法同实施例1。
(3)凋亡的细胞微泡制备方法同实施例1。
(4)大鼠原发性肝癌模型的建立方法同实施例2。随机将DEN诱癌大鼠分为4组，每组5只。将制备的大鼠肝前体细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD 大鼠；将所制备的大鼠肝癌细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠；将所制备的大鼠肝细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠；同时对另外5只SD大鼠经脾注射生理盐水，作为对照组。以上各组操作每周重复1次，共重复8 周，13周后处死各组大鼠，取出肝脏组织，制备组织切片，通过免疫组化观察大鼠具有干性特征的肝癌起始细胞的清除情况。
3、实验结果
DEN诱癌13周后肝组织切片的免疫组化分析结果显示(图5)，凋亡的大鼠肝前体细胞来源的囊泡(apoHPC-MPs)能几乎全部清除具有干性特征的肝癌起始细胞；凋亡的大鼠肝细胞来源的囊泡(apoHep-MPs)能部分清除具有干性特征的肝癌起始细胞；而凋亡的大鼠肝癌细胞来源的囊泡(apoLTC-MPs)不能清除具有干性特征的肝癌起始细胞，且和对照组(CTRL)的具有干性特征的肝癌起始细胞的数量没有区别。
这一结果表明，凋亡的肝前体细胞来源的囊泡能特异清除动物具有干性特征的肝癌起始细胞，其通过降低具有干性特征的肝癌起始细胞数量、进而抑制由具有干性特征的肝癌起始细胞导致的肝癌。
实施例5、细胞囊泡对机体的毒副作用实验
1、实验材料和试剂
大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞，大鼠肝细胞，阿霉素(商购，带有红色荧光)，SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，二乙基亚硝胺 (Diethylnitrosamine，DEN)购自Sigma-Aldrich公司。
2、实验步骤
(1)培养大鼠肝前体细胞，大鼠肝癌细胞，大鼠肝细胞，使细胞数量分别达到1×108个，培养方法同实施例1。
(2)施用终浓度为100μg/ml阿霉素处理上述细胞，使细胞凋亡。
(3)24h后，收集分离凋亡的大鼠肝前体细胞所产生的细胞囊泡，凋亡的大鼠肝癌细胞所产生的细胞囊泡，和凋亡的大鼠肝细胞所产生的细胞囊泡，分离方法同实施例1。
(4)大鼠原发性肝癌模型的建立方法同实施例2。随机将DEN诱癌大鼠分为4组，每组5只。将制备的大鼠肝前体细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD 大鼠(2×107个细胞来源的囊泡为每只大鼠的用量)；将所制备的大鼠肝癌细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠(2×107个细胞来源的囊泡为每只大鼠的用量)；将所制备的大鼠肝细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠(2×107个细胞来源的囊泡为每只大鼠的用量)；同时对另外5只SD大鼠经脾注射生理盐水，作为对照组。以上各组操作每周重复1次，共重复8周，同时每周记录大鼠体重，13周后处死大鼠，分别采取静脉血，检测血清中ALT，AST，及肌酸激酶含量，并称重大鼠体重。
3、实验结果
由图6可以看出，相比较于注射生理盐水的对照组大鼠，注射凋亡的大鼠前体细胞来源的细胞囊泡(apoHPC-MPs)的ALT，AST和肌酸激酶含量没有明显变化(见图6A-C)，而实验鼠体重增加(见图6D)。注射凋亡的大鼠肝癌细胞来源的细胞囊泡(apoLTC-MPs)的实验组大鼠ALT，AST，肌酸激酶和体重都没有明显变化(见图6A-D)。注射凋亡的大鼠肝细胞来源的细胞囊泡(apoHep-MPs)的实验大鼠ALT，AST，肌酸激酶和体重没有明显变化(见图 6A-D)。
上述结果可见，将凋亡的大鼠肝前体细胞来源的囊泡作为靶向大鼠具有干性特征的肝癌起始细胞制剂不仅对机体没有毒副作用，而且能明显改善肝癌导致的实验鼠的体重减轻症状。
实施例6、阿霉素诱导的凋亡的大鼠肝前体细胞分泌的囊泡制剂能抑制肝癌的发生，此效果不是阿霉素药物和微泡各自的作用
1、实验材料和试剂
大鼠肝前体细胞，阿霉素(商购，带有红色荧光)，SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)购自 Sigma-Aldrich公司。
2、实验步骤
(1)培养3×108个大鼠肝前体细胞，培养方法同实施例1，将得到的大鼠肝前体细胞分为三组，每组包括1×108个大鼠肝前体细胞。
(2)第一组大鼠肝前体细胞施用终浓度为100ug/ml的阿霉素；第二组和第三组大鼠肝前体细胞，不进行任何处理。
(3)24h后，收集三组细胞培养液上清，分离微泡，分离方法按实施例1。
(4)大鼠原发性肝癌模型的建立方法同实施例2。随机将DEN诱癌大鼠分为5组，每组5只。将制备的阿霉素诱导的凋亡的大鼠肝前体细胞的细胞囊泡经脾注射5只SD大鼠(2×107个细胞来源的囊泡为每只大鼠的用量)；将第二组细胞所制备的细胞微泡经脾注射5只SD大鼠(没有经过阿霉素处理的细胞产生的囊泡，2×107个细胞来源的囊泡为每只大鼠的用量)；将所制备的第三组细胞的细胞微泡(没有经过阿霉素处理的细胞产生的囊泡，2×107个细胞来源的囊泡为每只大鼠的用量)与20μg的阿霉素(阿霉素诱导2×107个大鼠肝前体细胞凋亡产生的囊泡中包含20μg的阿霉素)混合经脾注射5只SD大鼠；将100μg的阿霉素经脾注射5只SD大鼠(每只大鼠的阿霉素用量为20μg)；同时对另外5只SD大鼠经脾注射生理盐水，作为对照组。以上各组操作每周重复1次，共重复8周，同时每周记录大鼠体重，13周后处死大鼠，观察大鼠肝癌的发生情况。
3、实验结果
结果显示(见图7)，与对照组相比，没有经过阿霉素处理的细胞产生的细胞囊泡(HPC-MPs)不能抑制肝癌的发生；单纯的阿霉素化疗药(DOX)治疗组不能抑制肝癌的发生；没有经过阿霉素处理的细胞产生的细胞囊泡(HPC-MPs) 与阿霉素药物(DOX)的单纯混合治疗组也不能抑制肝癌的发生；而经过阿霉素诱导细胞凋亡所产生的大鼠肝前体细胞来源的细胞囊泡(apoHPC-MPs)能有效抑制肝癌的发生，肝癌病灶明显减少。
这一结果证实，本发明以化疗药阿霉素诱导的肝前体细胞凋亡所产生的细胞囊泡能有效预防肝癌的发生。
实施例7、使用γ射线诱导大鼠肝前体细胞凋亡分泌细胞囊泡能有效抑制肝癌的发生，并且没有毒副作用
1、实验材料和试剂
大鼠肝前体细胞，γ放射源。SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)购自Sigma-Aldrich公司。
2、实验步骤
1)在DMEM细胞培养液中培养大鼠肝前体细胞，直到获得1×108WB 细胞。
2)对上述大鼠肝前体细胞(带无血清细胞培养液)施用20Gyγ放射源。
3)在照射后的72h，收集细胞培养上清，分离凋亡细胞的细胞囊泡，分离方法同实施例1。
4)大鼠原发性肝癌模型的建立方法同实施例2。随机将DEN诱癌大鼠分为2组，每组5只。将制备的WB大鼠肝前体细胞的细胞囊泡经脾注射5 只SD大鼠(2×107个细胞来源的囊泡为每只大鼠的用量)；同时对另外5只SD 大鼠经脾注射生理盐水，作为对照组。以上各组操作每周重复1次，共重复8周，同时每周记录大鼠体重，13周后处死大鼠，收取肝脏标本，观察大鼠肝癌的发生情况。分别采取静脉血，检测血清中ALT，AST水平。
3、实验结果
从图8可见，与对照组相比较，20Gyγ放射源照射诱导的肝前体细胞凋亡产生的细胞囊泡(Radiation-apoHPC-MPs)能非常有效地抑制肝癌的发生(图 8A)。且实验大鼠的ALT和AST肝损伤指标有改善(图8B)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种制备用于抑制肝癌的细胞囊泡的方法，包括：
(1) 培养肝前体细胞，获得肝前体细胞培养物；
(2) 对所述肝前体细胞培养物进行凋亡处理，获得含有凋亡细胞的培养物；所述的凋亡处理包括：以肿瘤化疗药物处理所述细胞培养物，或以肿瘤放疗射线照射所述细胞培养物；所述的肿瘤化疗药物为阿霉素，其在细胞培养物中的终浓度为50～200 μg/ml；所述肿瘤放疗射线为γ射线；
(3) 从所述含有凋亡细胞的培养物中获得或分离细胞囊泡；所述获得或分离细胞囊泡包括：获取培养物上清，2～8℃下，在1000±100g离心10±2min、以14000g±1000g离心2±0.5 min去除细胞及碎片，之后以14000±1000g离心60±10min，收获沉淀，其中包括细胞囊泡；所述细胞囊泡粒径为600～1100nm。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤化疗药物阿霉素在细胞培养物中的终浓度为80～120 μg/ml。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤化疗药物阿霉素在细胞培养物中的终浓度为100±10μg/ml。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述获得或分离细胞囊泡包括：获取培养物上清，在1000±50g离心10±1min、以14000g±500g离心2±0.2 min去除细胞及碎片，之后以14000±50g离心60±5min，收获沉淀，其中包括细胞囊泡。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，离心的温度为2～6℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述细胞囊泡的平均粒径为1000nm。
7.一种用于抑制肝癌的细胞囊泡，其来自于肝前体细胞，为肝前体细胞在凋亡状态下产生的细胞囊泡，其由权利要求1～6任一所述的方法制备获得。
8.权利要求7所述的细胞囊泡在制备抑制肝癌的药物组合物中的应用；其中，所述的肝癌包括：复发性肝癌或原发性肝癌；所述的肝癌是具有干性特征的肝癌起始细胞形成的肝癌。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物还用于：减少肝癌患者的体重降低。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物还用于：靶向和清除具有干性特征的肝癌起始细胞。
11.一种用于抑制肝癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括权利要求7所述的细胞囊泡，以及药学上可接受的载体。
12. 一种药盒，其特征在于，所述药盒中包括：
权利要求11所述的药物组合物；或
权利要求7所述的细胞囊泡。
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