CN114671957A - 一种靶向实体瘤的car-t细胞的构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫治疗技术领域，公开了一种在实体瘤中激活的靶向实体瘤特异性高表达膜蛋白的CAR‑T细胞及其构建方法与应用。所述CAR结构对应的DNA序列含有实体瘤缺氧微环境可激活的启动子，所述启动子由HIF‑1可结合的缺氧反应元件连接构成，所述缺氧反应元件的重复数为3‑5个。所述CAR结构对应的DNA序列在启动子下游含有CA9、GLUT‑1或MCT4等蛋白的抗体对应的基因，可以在T淋巴细胞到达实体瘤时将相应的CAR高效表达于细胞膜上，因此能够在实体瘤缺氧微环境中激活CAR‑T细胞，增强CAR‑T细胞靶向实体瘤的治疗作用，使其具有更广阔的临床应用前景。本发明为CAR‑T细胞用于实体瘤治疗提供了一种新的思路和策略。

Description

一种靶向实体瘤的CAR-T细胞的构建方法和应用
技术领域
本发明属于免疫治疗技术领域，特别涉及一种缺氧可激活的启动子在CAR-T细胞中的应用，一种缺氧可激活的启动子的CAR结构、表达载体、CAR-T细胞及其应用以及提高实体瘤缺氧微环境下CAR-T细胞杀伤肿瘤的方法。
背景技术
CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell)全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种新型的细胞疗法，近年来发展迅速，为肿瘤治疗带来新的突破口。CAR-T细胞免疫疗法流程为分离肿瘤患者T细胞，通过基因工程技术改造T细胞使其表达特异性靶向肿瘤的CAR结构，在体外大量培养后再将其输回患者体内用以攻击肿瘤细胞。一般而言，CAR结构包含胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号转导域。胞外抗原结合域包含靶向肿瘤抗原的ScFv(单链可变片段)。CAR-T细胞免疫疗法具有更加精确的靶向性、更强的杀伤力和更持久的作用效果。
根据临床结果，CAR-T细胞免疫疗法在血液系统肿瘤中取得了巨大突破，以CD19-CAR-T治疗晚期恶性B细胞和淋巴瘤效果最为显著。但与血液系统肿瘤相比，CAR-T细胞免疫疗法未能成功应用于实体瘤的治疗。究其原因，一方面是CAR-T细胞较难进入实体瘤内部，另一方面是实体瘤缺氧和酸化的微环境会抑制T细胞的活化，降低其活性，抑制细胞因子的释放，最终导致免疫逃逸。因此，如何突破上述治疗障碍就成为CAR-T疗法应用于实体瘤的关键。
鉴于此，构建一种在实体瘤中特异激活的CAR结构，并且特异性靶向实体瘤中的特有表达蛋白很有必要。
发明内容
本发明专门利用实体瘤的缺氧微环境，设计一种缺氧可激活的CAR结构，并且该CAR结构恰恰靶向在缺氧实体瘤中特异性高表达的膜蛋白，从而实现CAR-T细胞靶向归巢、精准杀伤实体瘤的治疗目的。
本发明的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达缺氧可激活的靶向AXL、CA9、CD39、CD47、CD73、CD274(PDL1)、L1CAM(CD171)、MCT4、MET、NHE1、PLAUR(uPAR)、GLUT-1(SLC2A1)、SLC7A11、GLUT-3、MET的嵌合抗原受体CAR。
在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞，较佳地为T细胞。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR所识别的抗原为AXL、CA9、CD39、CD47、CD73、CD274(PDL1)、L1CAM(CD171)、MCT4、MET、NHE1、PLAUR(uPAR)、GLUT-1(SLC2A1)、SLC7A11、GLUT-3、MET中的任意一项或多项。
在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗原结合片段是Fab或scFv或单结构域抗体sdFv。
在另一优选例中，所述缺氧激活通过缺氧微环境可激活的启动子实现。
在另一优选例中，所述缺氧激活通过实体瘤缺氧微环境可激活的启动子实现。
在另一优选例中，所述启动子由HIF-1结合的缺氧反应元件连接构成，所述缺氧反应元件的重复数为3-5个，其后连接迷你启动子，所述迷你启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子(miniCMV)、HSV胸苷激酶(TK)的启动子(Mini-TK)、猿猴病毒40(SV40)的启动子(minSV40)、腺病毒晚期启动子(MLP)或者合成启动子
在另一优选例中，所述缺氧激活的启动子的核心核酸序列为5′-RCGTG-3′(R代表A或者G)。
在另一优选例中，所述CAR的结构如式I所示：
X1-ScFv-H-TM-CS-X2(I)
式中，
所述“-”为连接肽或肽键；
X1为无或信号肽序列；
ScFv为CAR的胞外段或靶向肿瘤抗原配体的抗体单链可变区序列；
H为铰链区；
TM为跨膜结构域；
CS为共刺激信号分子；
X2为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述X1为选自下组的蛋白的信号肽：CD4、CD8、CD28、GM-CSF、4-1BB(CD137)或其组合。
在另一优选例中，所述X1为CD8来源的信号肽。
在另一优选例中，所述ScFv含有靶向AXL、CA9、CD39、CD47、CD73、CD274(PDL1)、L1CAM(CD171)、MCT4、MET、NHE1、PLAUR(uPAR)、GLUT-1(SLC2A1)、SLC7A11、GLUT-3、MET中任意一项或多项的抗原结合结构域。
在另一优选例中，所述H为选自下组的蛋白的铰链区：CD4、CD7、CD8、CD28、4-1BB或其组合。
在另一优选例中，所述H为CD8来源的铰链区。
在另一优选例中，所述TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD3ε、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD80、CD86、4-1BB、CTLA-4、PD-1、LAG-3或其组合。
在另一优选例中，所述TM为CD8来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述CS为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD83、CD86、CD127、CD134、4-1BB、OX40、ICOS、GITR、PD-1、PD1L、B7-H3、DAP10、CDS、ICAM-1、LFA-1、NKG2C或其组合。
在另一优选例中，所述CS为4-1BB、CD28来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述CS为4-1BB、CD28来源的共刺激信号分子。
本发明第二方面提供了一种制备本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(A)提供一待改造的免疫细胞；和
(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达所述缺氧可激活的靶向AXL、CA9、CD39、CD47、CD73、CD274(PDL1)、L1CAM(CD171)、MCT4、MET、NHE1、PLAUR(uPAR)、GLUT-1(SLC2A1)、SLC7A11、GLUT-3、MET的嵌合抗原受体，从而获得所述的工程化的免疫细胞。
在另一优选例中，在步骤(A)中，还包括分离和/或激活待改造的免疫细胞。
在另一优选例中，在步骤(B)中，包括将表达所述的CAR的表达盒导入所述免疫细胞。
在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
在另一优选例中，所述的表达盒含有编码所述的嵌合抗原受体CAR的核酸序列。
在另一优选例中，所述的表达盒位于病毒载体上。
在另一优选例中，所述的载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统或其组合。
在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。
在某些实施例中，所述慢病毒载体选自以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
本发明第三方面提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明第四方面提供了如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的用途，用于制备选择性杀伤肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体瘤或其组合，优选地，所述肿瘤为实体瘤。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。
在另一优选例中，所述实体瘤包括但不限于前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、脑癌和皮肤癌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对本申请实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明提供的ScFv-CAR载体示意图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
1.高亲和力ScFv的制备
使用前述实体瘤细胞膜特异性高表达蛋白或其胞外结构域多次免疫大鼠，收集大鼠血清。通过磁珠对该蛋白进行标记，然后将其与大鼠血清进行孵育，通过磁性吸附将高亲和力的抗体分离出来，然后分析其重链和轻链可变区中互补决定区(CDR)氨基酸序列，用以替换人源IgG中ScFV的对应序列。此外，还可通过噬菌体展示技术等获得高亲和力的ScFv氨基酸序列。
2.ScFv-CAR慢病毒表达载体的构建
根据步骤1中ScFv蛋白序列,合成对应的DNA序列，以其为模板，PCR扩增得到足够量的ScFv基因。利用快切酶BamH1和T4 DNA Ligase构建重组质粒。
3.病毒包装与滴度测定
通过三质粒转染系统将目的质粒送入293T细胞内，按照质量比辅助质粒PS:辅助质粒PM:目的质粒＝5:3:3比例添加进入Opti-MEM培养基，加入50μLPEI溶液，吹打混匀后，室温静置20min。将1mLDNA/PEI混合物慢慢滴入293T培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育，6-8h后更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育。质粒转染48h后，收集上清后，添加10mL新鲜Opti-MEM培养基继续培养至72h，再次收集上清，与48h收集的上清混合后，置于4℃冰箱内待用；4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤得到的上清；将过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000rpm离心2h，用1/100上清体积的PBS进行稀释，反复吹打后转入密闭的离心管中4℃过夜；将病毒液分装至合适的体积，置于-80℃中保存，并取200μL病毒进行滴度测定。
消化293T细胞，离心后计数，用含血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为2×105/mL，向24孔培养板的每孔中加入0.5mL细胞悬液。用全培养基按以下比例稀释病毒上清：1:3；1:9；1:27分别将100μL病毒原液及按不同比例稀释后的病毒液，加入到已接种细胞的24孔板中，16h后弃去感染上清，添加0.5mL新鲜全培养基，缺氧培养48h后流式检测被感染细胞的目的基因表达，滴度＝2×105×感染效率×稀释倍数。
4.CAR-T细胞制备
将制备的慢病毒加入到含有人源T细胞的培养基中，16h后离心换液，加入新鲜的完全培养基继续培养，得到CAR-T细胞。分别于常氧和缺氧条件下培养CAR-T一天，收集CAR-T细胞，通过流式检测CAR-T细胞阳性率。
实施例2：
1.CAR-T抗肿瘤活性研究
制备癌细胞单细胞悬液，用羧基荧光素双乙酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)试剂进行染色。按照1:1、1:3、1:9的靶效比，添加相应个数的阳性CAR-T细胞，使其与癌细胞共培养12h，同时设置常氧和缺氧条件。使用ELISA试剂盒测定培养基中IFN-γ和IL-2因子浓度，以此来评价共培养后CAR-T细胞激活能力。与此同时，使用流式细胞仪测定癌细胞的凋亡情况。将孔内细胞转移至EP管内，加入APC Annexin V抗体避光孵育后进行流式检测。流式细胞仪上选择FL1-FITC通道进行CFSE的检测，圈出所有CFSE阳性的细胞群。CFSE阳性圈出后，选择FL1-APC通道进行Annexin-Ⅴ染色检测，Anexin-Ⅴ染色阳性的细胞即为凋亡靶细胞。根据流式结果，计算CAR-T细胞对癌细胞的杀伤效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向实体瘤特异性高表达膜蛋白的嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其CAR结构如下式I所示：
X1-ScFv-H-TM-CS-X2 (I)
式中，
所述“-”为连接肽或肽键；
X1为无或信号肽序列；
ScFv为CAR的胞外段或靶向肿瘤抗原配体的抗体单链可变区序列；
H为铰链区；
TM为跨膜结构域；
CS为共刺激信号分子；
X2为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
所述CAR结构对应的DNA序列含有实体瘤缺氧微环境可激活的启动子；所述启动子由HIF-1结合的缺氧反应元件连接构成，所述缺氧反应元件的重复数为3-5个，其后连接迷你启动子。
2.根据权利要求1所述的靶向实体瘤特异性高表达膜蛋白的CAR，其特征在于，所述缺氧激活的启动子的核心核酸序列为5′-RCGTG-3′，R代表A或者G。
3.根据权利要求1-2任一项所述的靶向实体瘤特异性高表达膜蛋白的CAR，其特征在于，所述ScFv为CAR结构的抗原识别区；所述抗原识别区所识别的抗原为AXL、CA9、CD39、CD47、CD73、CD274(PDL1)、L1CAM(CD171)、MCT4、MET、NHE1、PLAUR(uPAR)、GLUT-1(SLC2A1)、SLC7A11、GLUT-3、MET中的任意一项或多项。
4.一种包含表达权利要求1-3任意一项所述CAR的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、单纯疱疹病毒载体、DNA载体、RNA载体、质粒中的任一种。
5.根据权利要求4所述的CAR的表达载体，其特征在于，其表达载体具有以下结构：
5HRE—CMV—CD8—ScFv—CD8H—CD8TM—4-1BB—CD28-CD3ζ。
6.一种靶向缺氧实体瘤的CAR-免疫细胞，其特征在于，其CAR为权利要求1-5任一项所述的CAR；所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
7.一种制备权利要求6任一项所述的靶向缺氧实体瘤的CAR-免疫细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提供一待改造的免疫细胞；
2)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达权利要求1-3任意一项所述CAR。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
9.权利要求1-3任一项所述的CAR和/或权利要求4-5任一项所述的表达载体和/或权利要求6所述的CAR-免疫细胞和/或权利要求7所述的方法制备的CAR-免疫细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括血液系统肿瘤和实体瘤，所述血液系统肿瘤包括但不限于急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤；所述实体瘤包括但不限于前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、脑癌和皮肤癌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115925985A (zh) * 2022-08-26 2023-04-07 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 Car-t细胞及其在非小细胞肺癌治疗中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111686128A (zh) * 2019-03-12 2020-09-22 重庆精准生物技术有限公司 一种缺氧可调控的启动子在car-t中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111686128A (zh) * 2019-03-12 2020-09-22 重庆精准生物技术有限公司 一种缺氧可调控的启动子在car-t中的应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115925985A (zh) * 2022-08-26 2023-04-07 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 Car-t细胞及其在非小细胞肺癌治疗中的应用
CN115925985B (zh) * 2022-08-26 2023-10-31 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 Car-t细胞及其在非小细胞肺癌治疗中的应用
WO2024040681A1 (zh) * 2022-08-26 2024-02-29 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 Car-t细胞及其在非小细胞肺癌治疗中的应用

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