CN114668694A - 黑茶提取物及其制备方法、化妆品 - Google Patents

黑茶提取物及其制备方法、化妆品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黑茶提取物及其制备方法、化妆品。该黑茶提取物的制备方法包括如下步骤；将黑茶置于低共熔溶剂中进行浸渍提取，得到黑茶提取物；所述低共熔溶剂的组分包含氢键受体和氢键供体，所述氢键受体和所述氢键供体的摩尔数之比为1:(1～2)；所述氢键受体为甜菜碱，所述氢键供体为碳原子数为2～5的烷烃二醇；或所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为尿素或柠檬酸。该黑茶提取物的制备方法能提高从黑茶中提取茶多酚时的提取率，且工艺简单。

Description

黑茶提取物及其制备方法、化妆品
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种黑茶提取物及其制备方法、化妆品。
背景技术
茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，其主要成分包括儿茶素类、黄酮及黄酮苷类、花色素类、酚酸和缩酚酸类等6类酚基化合物，具有抗氧化、防辐射、抗衰老等作用，是重要的天然活性物质。研究表明，茶多酚具有抗炎、抗癌细胞增殖、抗心血管疾病和降血糖等药理作用，此外，研究表明：茶多酚中的儿茶素类物质也是重要的呈味物质和活性成分，是茶叶苦涩味的来源之一，同时具有抗肿瘤、抗氧化、抗病菌以及保护心脑器官等多种药理作用。
在众多种类的茶叶中，黑茶的茶多酚含量尤其丰富，故人们习惯将黑茶作为保健茶叶。黑茶主产于湖南、四川、湖北、云南、广西等地，黑茶制品是由黑茶树的鲜叶或成熟的新梢经杀青、渥堆、干燥等工艺制成。传统的从黑茶中提取茶多酚的方法主要有：有机溶剂浸提法和离子沉淀法。其中，有机溶剂浸提法常用醇类的水溶液作溶剂进行浸提，但溶剂耗量大且难以回收。离子沉淀法通过特定的金属离子与茶多酚发生反应生成沉淀，然后将沉淀物溶于酸性溶液，即可回收茶多酚，该方法的提取效率较高，但步骤工艺复杂，产生的废液及废渣多。
因此，现有技术仍有待改进。
发明内容
基于此，本发明提供了一种黑茶提取物及其制备方法、化妆品。该黑茶提取物的制备方法能提高从黑茶中提取茶多酚时的提取率，且工艺简单。
本发明的技术方案如下。
本发明的一个方面，提供了一种黑茶提取物的制备方法，包括如下步骤；
将黑茶置于低共熔溶剂中进行浸渍提取，得到黑茶提取物；
所述低共熔溶剂的组分包含氢键受体和氢键供体，所述氢键受体和所述氢键供体的摩尔数之比为1:(1～2)；
所述氢键受体为甜菜碱，所述氢键供体为碳原子数为2～5的烷烃二醇；或
所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为尿素或柠檬酸。
在其中一些实施例中，所述氢键受体为甜菜碱，所述氢键供体为乙二醇；或
所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为柠檬酸。
在其中一些实施例中，在所述浸渍提取中，所述浸渍提取的温度为30℃～70℃。
在其中一些实施例中，所述黑茶与所述低共熔溶剂的固液比为1g:(10～50)mL。
在其中一些实施例中，以所述低共熔溶剂的总质量为基准，所述含氢键受体和所述氢键供体的总浓度为10wt％～90wt％。
在其中一些实施例中，所述浸渍提取的步骤在超声作用下进行，所述超声的频率为33KHz～40KHz。
在其中一些实施例中，所述浸渍提取的时间为10min～60min。
在其中一些实施例中，在所述浸渍提取包括如下步骤：
将所述黑茶于所述低共熔溶剂中浸渍提取，得到提取液；
从所述提取液中富集得到所述黑茶提取物。
在其中一些实施例中，所述富集包括如下步骤：
采用吸附树脂对提取液进行吸附处理，然后过滤，得到吸附处理后的吸附树脂和滤液；
对所述吸附处理后的吸附树脂进行解吸附，得到解吸液；
对所述解吸液进行干燥处理得到所述黑茶提取物；
将所述滤液替换所述低共熔溶剂重复进行所述浸渍提取的步骤。
在其中一些实施例中，所述吸附树脂和所述提取液的固液比为1g:(4～5)mL；和/或
所述吸附树脂为苯乙烯型吸附树脂。
本发明的又一方面，提供一种化妆品，所述化妆品的成分包括采用如上所述的黑茶提取物的制备方法制得的黑茶提取物；
所述黑茶提取物的浓度不小于100ppm。
上述黑茶提取物的制备方法中，将黑茶置于低共熔溶剂中进行浸渍提取，其中，控制低共熔溶剂中的氢键受体和氢键供体的摩尔数之比及氢键受体、氢键供体的种类，使低共熔溶剂形成特定的溶剂环境，有利于低共熔溶剂与茶多酚形成强作用力的氢键，从而从黑茶中提取出茶多酚，提高了提取效率和茶多酚的纯度，进而得到茶多酚含量高的黑茶提取物，且工艺简单。
上述黑茶提取物采用如上所述的制备方法制得，茶多酚含量高，杂质少。
上述化妆品的成分包括采用如上所述的黑茶，黑茶提取物含有高含量的茶多酚，且杂质少，通过进一步控制化妆品中黑茶提取物的浓度，使其对巨噬细胞IL-6的分泌具有较好的抑制作用，从而使化妆品具有明显的抗炎舒缓的功效。
附图说明
图1为实施例1中没食子酸吸光度标准曲线图；
图2为实施例1中不同溶剂提取时得到的黑茶中茶多酚含量柱状图；
图3为实施例2中不同浓度的DESs水溶液提取时得到的黑茶中茶多酚含量柱状图；
图4为实施例3中不同固液比提取时得到的黑茶中茶多酚含量柱状图；
图5为实施例4中不同温度下提取时得到的黑茶中茶多酚含量柱状图；
图6为实施例5中不同时间下提取时得到的黑茶中茶多酚含量柱状图；
图7为实施例8中ELISA检测时IL-6含量柱状图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
术语“碳原子数为2～5的烷烃二醇”是指碳原子数为2～5的烷烃中的任意两个氢被羟基取代后形成的化合物，碳原子数为2～5的烷烃包括直链烷烃和支链烷烃，实例包括但不限于：乙烷、丙烷、正丁烷、异丁烷、正戊烷、异戊烷和新戊烷等，由此，形成的碳原子数为2～5的烷烃二醇的实例包括但不限于：乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基丙烷-1,2-二醇、戊烷-2,3-二醇、戊烷-1,2-二醇和戊烷-2,3-二醇等。
本发明的一实施方式提供了一种黑茶提取物的制备方法，包括如下步骤S10。
步骤S10、将黑茶置于低共熔溶剂中进行浸渍提取，得到黑茶提取物。
低共熔溶剂的组分包含氢键受体和氢键供体，所述氢键受体和所述氢键供体的摩尔数之比为1:(1～2)；
上述低共熔溶剂中的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为碳原子数为2～5的烷烃二醇；或上述低共熔溶剂中的氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为尿素或柠檬酸。
上述黑茶提取物的制备方法中，将黑茶置于低共熔溶剂中进行浸渍提取，其中，控制低共熔溶剂中的氢键受体和氢键供体的摩尔数之比及氢键受体和氢键供体的种类，使低共熔溶剂形成特定的溶剂环境，有利于低共熔溶剂与茶多酚形成强作用力的氢键，从而从黑茶中提取出茶多酚，提高了提取效率和茶多酚的纯度，进而得到茶多酚含量高的黑茶提取物，且工艺简单。
需要说明的是，上述黑茶可以是新鲜的黑茶茶叶、或成熟的新梢或经杀青、渥堆、干燥等工序制成的黑茶制品。
在其中一些实施例中，上述浸渍提取的步骤中，黑茶以粉末的形式加入。
黑茶以粉末的形式加入，有利于增加黑茶与低共熔溶剂的接触面积，从而加快提取速度。
需要说明的是，当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。例如“碳原子数为2～5”即包括：碳原子数为2、3、4和5。
在其中一些实施例中，上述碳原子数为2～5的烷烃二醇包括乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基丙烷-1,2-二醇、戊烷-2,3-二醇、戊烷-1,2-二醇和戊烷-2,3-二醇中的至少一种。
在其中一些实施例中，上述碳原子数为2～5烷烃二醇为碳原子数为2～5直链烷烃二醇；进一步选自乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、戊烷-2,3-二醇、戊烷-1,2-二醇和戊烷-2,3-二醇中的至少一种。
在一具体的示例中，上述碳原子数为2～5烷烃二醇为碳原子数为乙二醇。
在其中一些实施例中，上述低共熔溶剂中的氢键受体为甜菜碱，氢键供体为乙二醇。
在其中一些实施例中，上述低共熔溶剂中氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为柠檬酸。
通过优选氢键受体及氢键供体的种类，其中，由氯化胆碱和柠檬酸组成的低共熔溶剂呈现较强的酸性，而多酚类分子中酚羟基的存在，使其呈酸性，因此酸性的环境有利于茶多酚的提取，同时由于柠檬酸结构中含有多个羧基，可以多酚化合物之间形成强作用力的氢键，提高了多酚的萃取率；而甜菜碱和乙二醇组成的低共熔溶剂也提供有利于与茶多酚形成强作用力的氢键的溶剂环境，进一步提高茶多酚的提取效率。
优选地，上述低共熔溶剂中氢键受体为氯化胆碱，氢键供体为柠檬酸。
在其中一些实施例中，上述浸渍提取的温度为30℃～70℃。
控制浸渍提取的温度为30℃～70℃，进一步保证低共熔溶剂的稳定的溶剂环境、加速低共熔溶剂和黑茶之间的相互作用的同时，保证茶多酚的生物活性，以进一步提高提取效率。
优选地，上述浸渍提取的温度为30℃～60℃。
在其中一些实施例中，在浸渍提取中，黑茶与低共熔溶剂的固液比为1g:(10～50)mL。
控制黑茶与低共熔溶剂的固液比，以调节固液接触面积，从而加快了茶多酚的溶出速度，进而提高工艺效率。
优选地，黑茶与低共熔溶剂的固液比为1g:40mL
在其中一些实施例中，以低共熔溶剂的总质量为基准，含氢键受体和氢键供体的总浓度为10wt％～90wt％。包括但不限于：10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％。
控制低共熔溶剂的浓度，以进一步保持低共熔溶剂的氢键平衡，并控制其粘度，从而加快了茶多酚的溶出速度，进而提高工艺效率。
进一步地，当低共熔溶剂的浓度从10％逐渐增加到50％时，茶多酚的含量也随之增加；当低共熔溶剂的浓度从50％增加到90％时，茶多酚的含量反而减少。原因可能是：低浓度虽然降低了低共熔溶剂的粘度，但破坏了氢键受体和氢键供体与目标化合物茶多酚之间的氢键平衡，反而降低了萃取效率。同时，高浓度的低共熔溶剂的粘度较高，不利于目标化合物的提取。
优选地，低共熔溶剂的浓度为30wt％～70wt％。
需要说明的是，低共熔溶剂的浓度指的是低共熔溶剂中氢键受体和氢键供体的总浓度。进一步地，低共熔溶剂中的溶剂为水。
在其中一些实施例中，浸渍提取的步骤在超声作用下进行，超声的频率为33KHz～40KHz。
浸渍提取的步骤在超声作用下进行，以加速低共熔溶剂和黑茶之间的相互作用。
在其中一些实施例中，上述浸渍提取的时间为10min～60min。
通过控制浸提时间，以提高工艺效率。一定时间范围内的浸渍提取，可以在加快茶多酚的溶出速度，但提取时间过长可能会破坏茶多酚的结构，进而降低提取效率。
优选地，上述浸渍提取的时间为10min～50min。
进一步优先得，上述浸渍提取的时间为50min。
在其中一些实施例中，浸渍提取包括如下步骤S11～S12。
步骤S11、将所述黑茶于低共熔溶剂中浸渍提取，得到提取液；
步骤S12、从提取液中富集得到所述黑茶提取物。
进一步地，富集包括如下步骤S121～S123。
步骤S121、采用吸附树脂对提取液进行吸附处理，然后过滤，得到吸附处理后的吸附树脂和滤液；
步骤S122、对吸附处理后的吸附树脂进行解吸附，得到解吸液；
对解吸液进行干燥处理得到黑茶提取物。
具体地，干燥处理的具体步骤如下：将解析液蒸发处理以去除溶剂，再经冷冻干燥处理，得到固态的黑茶提取物。
具体地，蒸发处理采用旋蒸。
步骤S123、将滤液替换低共熔溶剂重复进行步骤S10中的浸渍提取的步骤。
在浸渍提取的步骤中，采用吸附树脂对浸渍提取得到的提取液进行吸附处理，然后过滤，得到吸附处理后的吸附树脂和滤液；一方面，浸渍提取得到的提取液中的茶多酚的绝大部分被吸附在吸附树脂上，茶多酚得以富集，然后对解吸液进行干燥处理得到茶多酚含量较高的黑茶提取物；绝大部分茶多酚被富集后，滤液可回收，可将滤液替换低共熔溶剂重复进行浸渍提取的步骤，如此，回收了绝大部分低共熔溶剂，实现循环利用，降低了成本。
在其中一些实施例中，上述吸附树脂和所述浸渍提取得到的提取液的固液比为1g:(4～5)mL。
在其中一些实施例中，上述吸附树脂为苯乙烯型吸附树脂。
苯乙烯型吸附树脂是指以苯乙烯为主要单体制得的吸附树脂。包括纯聚苯乙烯吸附树脂及苯乙烯和二乙烯苯。具体型号包括但不限于：HP20、D101、HPD100、X-5、ADS-8、AB-8、HPD50等。
在其中一些实施例中，上述解吸附步骤采用的解析液为碳原子数为1～5的有机醇，包括但不限于甲醇、乙醇等。
在其中一些实施例中，在浸渍提取步骤之后，且在吸附处理步骤之前，还包括如下步骤：
将浸渍提取完成后的体系进行离心处理，然后取上清液得到浸渍提取后的提取液。
在其中一些实施例中，离心处理的时间为1min～5min。
进一步地，本发明还以低共熔溶剂的浓度(A)、黑茶与低共熔溶剂的固液比(B)、浸渍提取时间(C)和浸渍提取时间(D)为参考因素进行了L9(34)正交试验设计，以探究这四种因素对提取效率的影响。结果表明：影响提取黑茶中茶多酚时的提取效率的因素依次为C>B>D>A，即提取温度对茶多酚含量的影响最大。
进一步地，综合极差分析以及方差分析，浸渍提取的最佳工艺为：低共熔溶剂的浓度为50wt％，黑茶与低共熔溶剂的固液比为1:50g/mL，浸渍提取的温度70℃，浸渍提取的时间为50min。
在该工艺条件下，茶多酚含量最高，且该提取工艺稳定性良好。
本发明一实施方式还提供一种黑茶提取物，采用如上所述的制备方法制得，茶多酚含量高，杂质少。
本发明一实施方式还提供一种化妆品，该化妆品的成分包括采用如上所述的黑茶提取物的制备方法制得的黑茶提取物；黑茶提取物的浓度不小于100ppm。
上述化妆品的成分包括采用如上所述的黑茶提取物的制备方法制得的黑茶提取物，黑茶提取物含有特定含量的茶多酚，通过进一步控制化妆品中黑茶提取物的浓度，使其对巨噬细胞IL-6的分泌具有较好的抑制作用，从而使化妆品具有明显的抗炎舒缓的功效。
在一具体示例中，上述黑茶提取物的浓度为100ppm～400ppm。
上述化妆品可以是固态也可以是液态的化妆品，包括但不限于：柔肤水、爽肤水、精华水、乳液、面霜、精华液(乳)、面膜液、防晒霜、肌底液、喷雾、精华油、按摩膏、渗透乳、导入液、纯露、粉底液、隔离液、隔离霜及蜜粉等。
下面将结合具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不局限于下述实施例，应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。
具体实施例
实施例1
(1)DESs(低共熔溶剂)的制备：分别按照表1中氢键受体与氢键供体的摩尔比，称量氢键受体与氢键供体，按照所需浓度称量超纯水，然后混合均匀，然后置于事先已加入搅拌子的250mL的圆底烧瓶中，密封严实，于80℃的磁力搅拌装置中持续搅拌4h，直至获得均一、透明的液体。合成的DESs冷却至室温后，在60℃真空干燥条件中干燥24h，干燥后若无沉淀、浑浊等现象出现，即可判定DESs制备成功。氢键受体与氢键供体的摩尔比如下表1所示，具体的DESs的浓度均为70wt％。
(2)称取干燥至恒重的黑茶粉末0.1g置于10mL具塞试管中，按照1:20g/mL的固液比例加入预先已合成的不同种类的70％wt浓度的DESs；然后放置于温度为30℃、超声频率为40KHz的超声环境中超声提取10min，结束后将具塞试管放置于超速离心机(转速为6000r/min)中离心5min，取上清液为浸渍提取。
同时，茶多酚的传统提取方式为有机溶剂提取法，故用70wt％乙醇水溶液替代DESs建立对照组(control)，其他工艺条件同步骤上。
(3)将浸渍提取稀释20倍，精密吸取稀释后的提取液1mL置于10mL具塞试管中，采用福林酚法测定茶多酚含量，具体步骤如下：
1、没食子酸标准品准备
称取10mg没食子酸(GA)，于100mL容量瓶中溶解定容并摇匀，得到浓度为0.1mg/mL的没食子酸标准溶液，现配现用。
2、试剂配制
配制福林酚试剂：吸取5mL福林酚试剂转移至50mL容量瓶中，并用超纯水定容至刻度并摇匀，现配现用。
配制碳酸钠溶液：称取7.5g碳酸钠，加适量水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀常温保存待用。
3、标准曲线测定
用移液管分别吸取100μL、200μL、300μL、400μL、500μL的没食子酸标准储备液于10mL容量瓶中，用水定容至刻度并摇匀，得到浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的没食子酸工作液。用移液管分别吸取没食子酸工作液、水(空白对照用)各1.0mL于具塞试管中，在每个试管中分别加入5mL福林酚试剂，摇匀，反应5min，然后加入4mL7.5％Na2CO3溶液，摇匀后于室温下反应60min，然后于765nm处测定吸光度。
4、将测得的数据经过回归分析，以吸光度为纵坐标(Y)，没食子酸标准溶液浓度为横坐标(X)，绘制没食子酸吸光度标准曲线，如图1所示，得到回归方程为：Y＝0.0055X+0.014，相关系数R2＝0.9994。在浓度0～50μg/mL的范围内，没食子酸标准溶液浓度与吸光度线性关系良好。
将测得的稀释后的提取液的吸光度值代入标准曲线可进一步计算得到提取得到茶多酚的含量，并进一步按照如下公式计算黑茶中茶多酚含量：
黑茶中茶多酚含量＝提取得到茶多酚的质量(mg)/黑茶的质量(g)，单位：mg/g
具体结果如表1所示，柱状图如图2所示。
Figure BDA0003566059510000101
Figure BDA0003566059510000111
实施例2
探究DESs浓度的影响
(1)配置不同浓度的DESs:氢键受体为氯化胆碱、氢键供体为柠檬酸，氢键受体：氢键供体＝1:1，然后按照质量分数比用超纯水分别配制浓度为10％，30％，50％，70％，90％的DESs水溶液。
(2)准确称量0.1g干燥的黑茶粉末，按照1:30g/mL的比例加入3.0mL不同浓度的DESs水溶液中，然后分别放置在30℃、频率为40KHz的超声环境中超声提取20min。超声结束后，离心5min，取上清液为提取液，稀释100倍后，吸取提取液1mL置于10mL具塞试管中，按照实施例1步骤(3)中的福林酚法测定吸光值并计算黑茶中茶多酚含量(mg/g)。具体结果如表2所示，柱状图如图3所示。
表2
浓度 10％ 30％ 50％ 70％ 90％
茶多酚含量(mg/g) 44.93 67.58 76.00 61.92 39.27
从表中可以看出，当DESs浓度从10％逐渐增加到50％时，茶多酚的含量也随之增加；当DESs浓度从50％增加到90％时，茶多酚的含量反而减少。导致这一现象的原因可能是：低浓度的DESs的粘度虽低，但破坏了氢键受体、氢键供体与目标化合物茶多酚之间的氢键平衡，降低了提取效率，同时，高浓度DESs的粘度较高，又不利于目标化合物的提取。
实施例3
固液比的影响
(1)配置DESs:氢键受体为氯化胆碱、氢键供体为柠檬酸，氢键受体：氢键供体＝1:1，按照70％的质量百分数加入超纯水配置，得到70wt％DES水溶液。
(2)准确称量0.1g干燥的黑茶粉末，分别按照黑茶与DESs水溶液的固液比为：1g:10mL，1g:20mL，1g:30mL，1g:40mL，1g:50mL的比例加入70wt％的DESs水溶液，然后分别放置在30℃、频率为40KHz的超声环境中超声提取20min。超声结束后，离心5min，取上清液稀释100倍后得取提取液，吸取提取液1mL置于10mL具塞试管中，按照实施例1步骤(3)中的福林酚法测定吸光值并计算黑茶中茶多酚含量(mg/g)。具体结果如表3所示，柱状图如图4所示。
表3
固液比 1g:10mL 1g:20mL 1g:30mL 1g:40mL 1g:50mL
茶多酚含量(mg/g) 45.56 47.67 61.18 63.59 53.36
从表3及图4中可看出:茶多酚含量随着固液比从1:10增加到1:40，在1:40达到最大，可能是由于固液接触面积随着溶剂含量的增加而增大，从而加快了茶多酚的溶出速度。
实施例4
温度的影响
(1)配置DESs:氢键受体为氯化胆碱、氢键供体为柠檬酸，氢键受体：氢键供体＝1:1，按照70％的质量百分数加入超纯水配置，得到70wt％DES水溶液。
(2)准确称量0.1g干燥的黑茶粉末，按照1g:30mL的比例加入3.0mL的70wt％的DESs水溶液，然后分别放置30℃，40℃，50℃，60℃，70℃、频率为40KHz的超声环境中超声提取20min。超声结束后，离心5min，取上清液得提取液，稀释100倍后吸取提取液1mL置于10mL具塞试管中，按照实施例1步骤(3)中的福林酚法测定吸光值并计算黑茶中茶多酚含量(mg/g)。具体结果如表4所示，柱状图如图5所示。
表4
温度 30℃ 40℃ 50℃ 60℃ 70℃
茶多酚含量(mg/g) 51.76 55.54 56.16 73.43 71.45
从表4及图5结果可以看出：茶多酚含量随着温度的增加而增加，当温度高于60℃时，茶多酚的含量有下降趋势。可能的原因是：提高温度可以帮助加强分子扩散，加速溶剂和黑茶之间的相互作用，使细胞结构更好更有效地摧毁，促进茶多酚的溶出，但是过高的温度可能会引起超声空化效应，影响茶多酚的生物活性。由此，控制浸渍提取的温度为30℃～70℃，可在保证低共熔溶剂的稳定的溶剂环境、加速低共熔溶剂和黑茶之间的相互作用的同时，保证茶多酚的生物活性，以进一步提高提取效率。
实施例5
提取时间的影响
(1)配置DESs:氢键受体为氯化胆碱、氢键供体为柠檬酸，氢键受体：氢键供体＝1:1，按照70％的质量百分数加入超纯水配置，得到70wt％DES水溶液。
(2)准确称量0.1g干燥的黑茶粉末，按照1g:30/mL的固液比例加入70wt％的DESs水溶液，然后分别放置在30℃，频率为40KHz的超声环境中分别超声提取20min，30min，40min，50min，60min，超声结束后，离心5min，取上清液得提取液，稀释100倍后，吸取提取液1mL置于10mL具塞试管中，按照实施例1步骤(3)中的福林酚法测定吸光值并计算黑茶中茶多酚含量(mg/g)。具体结果如表5所示，柱状图如图6所示。
表5
提取时间(min) 20 30 40 50 60
茶多酚含量(mg/g) 56.34 61.99 65.15 72.38 72.52
从表5及图6结果可以看出：在20～50min时，茶多酚含量呈逐渐增加的趋势；50min时茶多酚含量最高，时间继续增加，茶多酚含量几乎不变。这说明超声时间可以在一定范围内加快茶多酚的溶出速度。
实施例6
正交优化工艺实验
(1)根据单因素试验的结果，选择DESs浓度(A)、黑茶与DESs的固液比(B)、超声提取温度(C)和超声提取时间(D)为参考因素，选择合适的水平因子，以茶多酚含量为指标，进行L9(34)正交试验设计，对DESs提取黑茶中的茶多酚提取工艺进行优化。其中，DESs:氢键受体为氯化胆碱、氢键供体为柠檬酸，氢键受体：氢键供体＝1:1。
L9(34)正交试验因素测试水平设置表如表6所示。
表6
Figure BDA0003566059510000141
DESs提取黑茶茶多酚正交试验结果如表7所示
表7
Figure BDA0003566059510000142
其中，K1、K2、K3分别代表每个因素各个水平下的指标总和、R为各因素结果的极差。
进一步地，正交实验方差分析结果如表8所示。
表8
Figure BDA0003566059510000143
分析上述L9(34)正交试验结果：从表7的极差结果可以看出，影响DESs提取黑茶中茶多酚的提取效率的因素依次为C>B>D>A，即温度对茶多酚提取效率的影响最大。综合极差分析表7以及方差分析表8分析可得出：理论上，DESs提取黑茶中的茶多酚时的最佳提取工艺条件为A2B3C3D2，即DES浓度为50wt％、黑茶与DES的固液比1g:50/mL，超声温度70℃，提取时间50min。
由于最佳的工艺条件即A2B3C3D2，并不属于L9(34)正交表中的实验，所以需要对其进行验证性实验。采用A2B3C3D2的工艺条件提取茶多酚，平行进行3次，结果如表9所示。
表9
Figure BDA0003566059510000151
三次平行实验茶多酚的含量分别为87.64mg/g、88.45mg/g、89.72mg/g，茶多酚的平均提取量为88.60mg/g，RSD值为1.18％(n＝3)。结果表明，在最佳工艺条件下，茶多酚含量最高，且该提取工艺稳定性良好。
实施例7
茶多酚的富集回收与DESs重复利用
(1)选用AB-8型号的大孔吸附树脂进行实验，以上述正交实验确定的最佳提取工艺条件进行提取得到茶多酚DESs提取液，按照树脂：提取液＝1g:5mL的比例添加大孔吸附树脂，并将其混匀放置于25℃恒温生化振荡培养箱上摇动24h(转速为120r·min-1)。大孔树脂完全吸附并饱和后，过滤得到滤液，用测定滤液中的茶多酚含量，并进一步计算大孔树脂的茶多酚吸附率，具体按照如下公式计算出大孔树脂的茶多酚吸附率(A)：
A(％)＝(C0-C1)/C0×100
其中C0代表吸附前DESs提取液中茶多酚的浓度，C1代表大孔树脂吸附后的滤液中的茶多酚浓度。
然后将过滤得到的吸附饱和的大孔树脂与乙醇按照1g:5mL的比例混合，振摇12h(150r·min-1)解吸，再过滤大孔树脂，得乙醇解吸附溶液，取乙醇解吸附溶液测定茶多酚含量，并进一步计算解吸率，具体以下公式计算出大孔树脂的解吸率(B):
B(％)＝C2/(C0-C1)×100
其中，C2代表解吸液中茶多酚的浓度，C0代表吸附前DESs提取液中茶多酚的浓度，C1代表大孔树脂吸附后上清液茶多酚的浓度。
最后，利用以下公式计算大孔树脂吸附茶多酚总收率(N)：
N(％)＝A×B
具体计算结果如表10所示。
表10
编号 A吸附率(％) B解吸率(％) N总收率(％)
1 81.77 86.52 70.75
(2)将大孔树脂吸附后过滤得到的滤液替换步骤(1)中的DESs进行新的黑茶样品的提取，具体步骤同步骤(1)，测定其提取液茶多酚含量，并以步骤(1)中DESs提取时测试得到的茶多酚含量88.27mg/g作为DESs标准水平，计算DESs重复利用率(％)。
重复利用率(％)＝滤液重复提取时的茶多酚含量/DESs标准水平×100％。结果如表11所示。
表11
Figure BDA0003566059510000161
由上表结果可知：DESs提取液中的茶多酚经过大孔树脂的吸附后，回收的DESs仍可被用于进行下一次的提取，且重复提取时仍保持高提取效率，重复利用率高。例如，选择AB-8型号的大孔树脂进行3次重复利用实验(n＝3)，如表11所示，从表中可以看出，DESs提取液中的茶多酚经过大孔树脂的吸附后，回收的DESs再次提取黑茶中的茶多酚实验时，DESs的平均重复利用率为93.60％。可见，DESs能被重复使用，并保持较高的提取效率。
实施例8
化妆品抗炎舒缓功效测试
一、实验设计：以巨噬细胞Ana-1为研究对象，采用脂多糖(LPS)为刺激因子，构建体外炎症细胞模型，通过炎性因子IL-6分泌量的检测，探讨通过DESs制备的黑茶提取物抗炎功效。
二.实验材料
1.主要仪器:酶标仪(Varioskan Lux，Thermo Fisher)、生物安全柜(江苏力康，HFsafe1500LC)、二氧化碳恒温培养箱(IRM)、倒置显微镜(OLYMPUS，CKX53)、漩涡混合仪(IKA，VORTEX 2)
2.主要试剂：1×PBS缓冲液(Solarbio)，RPMI 1640基础培养基(Solarbio)，NaHCO3(国药集团)，FBS(Gibco)，LPS粉末(Solarbio)，小鼠IL-6ELISA试剂盒(生工生物，D721022)
3.培养基及溶液配制
(1)RPMI 1640完全培养基：向RPMI 1640培养基中加入FBS，使其含量为10wt％
(2)LPS：以1×PBS缓冲液为稀释液，配制1mg/mL的LPS溶液
4.黑茶提取物样品信息：黑茶提取物由上述实施例制备得到，信息如表12所示。
表12
样品名称 形态 颜色 储存条件 茶多酚含量(％)
黑茶提取物 粉末状 黑色 阴凉干燥 6.16wt％
(3)将黑茶提取物样品粉末溶于1×PBS中，配制10mg/mL的母液。
三.供试样品对Ana-1细胞分泌IL-6的影响
1.细胞接种：将Ana-1细胞按4000个/孔接种于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
2.LPS诱导炎症反应：将1mg/ml的LPS溶液稀释至3μg/ml，按50μl/孔加至孔板中，阴性对照组加等量培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养4h。
3.待测样品稀释与加样：以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制0.4％的样品工作液加至细胞，100μL/孔，阴性对照组加等量完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱内培养24h。
4.通过ELISA法检测IL-6含量，操作步骤如下：
A.预先计算好所需的酶标条，实验前30min拿出试剂盒，恢复至室温。
B.标准品梯度稀释：用标准品&样品稀释液分别按照500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、0pg/mL配置标准品稀释液。
C.收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心(4℃，1000×g，20min)，取上清后，30倍稀释作为检测样本。
D.各反应孔中加入100μL标准品工作液及检测样本，各组均设2个复孔，于37℃孵箱孵育90min。
E.弃去液体，甩干，各反应孔中加入100μL生物素标记白介6抗体工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育60min。
F.弃去液体，甩干，各反应孔中加入300μL洗涤液，浸泡1-2min后甩干。重复4次。
G.各反应孔中加入100μL HRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育30min。
H.各反应孔中加入300μL洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液。重复4次。
I.各反应孔中加入90μL显色剂至反应孔中，于37℃避光显色15min左右。
J.各反应孔中加入50μL终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值K.根据标准品的己知浓度和所测OD值计算标准曲线回归方程(R2>0.99)，将样品孔的OD值代入计算所测样品的浓度，再乘稀释倍数即得到原样品的实际IL-6浓度。
5.统计分析：采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，计量资料以x±s表示，组间差异采用one-way ANOVA分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
四、实验结果：通过ELISA检测各组炎症因子IL-6含量，采用GraphPad Prism 8.0绘图，各组IL-6含量变化趋势如图7所示。经LPS诱导后，阳性对照组IL-6含量较阴性对照组显著提高；与阳性对照组相比，100、400ppm浓度黑茶提取物加样组的IL-6含量下降，25ppm浓度加样组未有明显下降。由ELISA检测IL-6含量结果来看，黑茶提取物在100ppm～400ppm的作用浓度时，对巨噬细胞IL-6的分泌具有一定的抑制作用，可使化妆品具有明显的抗炎舒缓功效。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一种黑茶提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤；
将黑茶置于低共熔溶剂中进行浸渍提取，得到黑茶提取物；
所述低共熔溶剂的组分包含氢键受体和氢键供体，所述氢键受体和所述氢键供体的摩尔数之比为1:(1～2)；
所述氢键受体为甜菜碱，所述氢键供体为碳原子数为2～5的烷烃二醇；或
所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为尿素或柠檬酸。
2.根据权利要求1所述的黑茶提取物的制备方法，其特征在于，所述氢键受体为甜菜碱，所述氢键供体为乙二醇；或
所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为柠檬酸。
3.根据权利要求1所述的黑茶提取物的制备方法，其特征在于，所述浸渍提取的温度为30℃～70℃。
4.根据权利要求1～3任一项所述的黑茶提取物的制备方法，其特征在于，在所述浸渍提取中，所述黑茶与所述低共熔溶剂的固液比为1g:(10～50)mL。
5.根据权利要求1～3任一项所述的黑茶提取物的制备方法，其特征在于，以所述低共熔溶剂的总质量为基准，所述含氢键受体和所述氢键供体的总浓度为10wt％～90wt％。
6.根据权利要求1～3任一项所述的黑茶提取物的制备方法，其特征在于，所述浸渍提取的步骤在超声作用下进行，所述超声的频率为33KHz～40KHz。
7.根据权利要求1～3任一项所述的黑茶提取物的制备方法，其特征在于，所述浸渍提取的时间为10min～60min。
8.根据权利要求1～3任一项所述的黑茶提取物的制备方法，其特征在于，所述浸渍提取包括如下步骤：
将所述黑茶于所述低共熔溶剂中浸渍提取，得到提取液；
从所述提取液中富集得到所述黑茶提取物。
9.根据权利要求8所述的黑茶提取物的制备方法，其特征在于，所述富集包括如下步骤：
采用吸附树脂对所述提取液进行吸附处理，然后过滤，得到吸附处理后的吸附树脂和滤液；
对所述吸附处理后的吸附树脂进行解吸附，得到解吸液；
对所述解吸液进行干燥处理得到所述黑茶提取物；
将所述滤液替换所述低共熔溶剂重复进行所述浸渍提取的步骤。
10.根据权利要求9所述的黑茶提取物的制备方法，其特征在于，所述吸附树脂和所述提取液的固液比为1g:(4～5)mL；和/或
所述吸附树脂为苯乙烯型吸附树脂。
11.一种黑茶提取物，其特征在于，所述黑茶提取物采用如权利要求1～10任一项所述的黑茶提取物的制备方法制得。
12.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品的成分包括采用如权利要求11所述的黑茶提取物；
所述黑茶提取物的浓度不小于100ppm。
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