CN114657237A - 一种pcr终点可视化检测核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于硫磺素T和G‑四链体的不开盖就能实现现场可视化快速检测的PCR终点核酸检测方法。该方法可以准确检测核酸，特异性和灵敏度高、适用性广、检出限低，且不易污染。PCR完成后用实时蓝光观测仪进行肉眼观察，就能直接进行结果检测。整个过程快速、简便，可以大量推广使用，应用前景良好。

Description

一种PCR终点可视化检测核酸的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及核酸分析检测，具体涉及一种PCR终点可视化检测核酸的方法。

背景技术

随着人类在分子生物学领域越来越深入的探索，核酸检测除了在医疗卫生领域受到广泛重视，在食品安全、农业、环境等领域也颇受青睐。由于生物样本中可获取的DNA含量通常比较低，用普通方法很难检出，因此需要先对含有待检测基因的DNA片段进行富集扩增。目前应用最广泛的DNA扩增手段是聚合酶链式反应(PCR)，PCR利用加热的方法打开扩增过程中产生的双链DNA，并通过升降温的循环过程实现产物的指数累积。由于PCR方法灵敏度非常高，适用于微量DNA的检测。但是传统的PCR方法用于DNA检测，需要对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，操作很繁琐，检测通量非常低，并且容易出现PCR产物的气溶胶污染。以PCR方法为基础开发的荧光定量TaqMan探针技术、数字PCR、基因芯片等方法很大程度上解决了传统PCR方法的一些缺陷。然而，TaqMan、数字PCR、基因芯片等方法需要精密的仪器作为辅助检测手段，导致开展相关实验的要求较高，检测试剂盒大多价格高昂，从而使得检测成本居高不下。另外，对特殊设备和专业人员的要求也限制了这些方法的应用。此外，这些方法还且不适应于现场快速检测。可视化核酸检测是一种很有前景的现场快速检测方法。但是目前已有的可视化核酸检测方法大多需要在反应后，开盖加入荧光染料或显色试剂，才能发生该荧光或颜色的变化，从而进行可视化检测，由于需要开盖，这种方法极易发生PCR产物污染。因此，开发一种PCR反应后不开盖、就能实现现场可视化快速检测的技术具有很重要的现实意义。

G-四链体是一种富含鸟嘌呤的序列，由四对胡斯坦配对(Hoogsteen-paired)形成的共面鸟嘌呤，通过堆叠作用形成。目前已经报道了很多能结合G-四链体并产生颜色或荧光变化的小分子，如结晶紫，原卟啉，锌卟啉和硫黄素T等。其中硫磺素T是一种能够与特定序列的G-四链体结构结合，并且产生荧光的有机小分子，目前有大量研究报道了硫磺素T及其衍生物与不同序列的G-四链体结合能够产生荧光，并且将其应用于核酸检测中。但是目前还没有报道基于硫磺素T和G-四链体在PCR反应后不开盖、就能实现现场可视化快速检测的方法。

发明内容

本发明提供了一种PCR终点可视化检测核酸的方法：在PCR体系中加入引物1和引物2、G-四链体序列、硫磺素T或硫磺素T衍生物、核酸聚合酶及其他常规PCR反应组分。其中引物1和/或引物2包含两部分：3’端能与目标核酸模板杂交的部分以及5’端能与G-四链体互补的部分；在观察检测结果所处温度下，引物1和/或引物2的5’端序列能通过碱基互补作用与G-四链体序列形成双链，使G-四链体处于封闭状态，不能与硫磺素T或硫磺素T衍生物结合产生荧光(图1A)。PCR时，高温变性使待测核酸双链解开，退火和延伸时引物1和2结合到待测核酸链上，在核酸聚合酶的作用下开始延伸，形成一端含有G-四链体互补序列或两端均含有G-四链体互补序列的延长模板(图1B和C)。当以延长模板为PCR扩增模板后，越来越多的引物1和2参与扩增并被封闭在双链PCR产物中，无法再对原有的外加G-四链体序列进行封闭，致使越来越多的外加G-四链体序列处于游离状态(图1D)。PCR结束后，在观察检测结果所处温度下，游离的G-四链体与PCR体系中已加入的硫磺素T或硫磺素T衍生物结合能产生肉眼能观测到的荧光(图1E)；没有目标DNA模板存在的情况下，由于PCR反应不会发生，在观察检测结果所处温度下，外加G-四链体序列被引物1和/或引物2封闭，从而不能与硫磺素T或硫磺素T衍生物结合产生荧光。反应结束后，通过肉眼观察有无荧光的产生就能判断是否有目标核酸的存在。

其中引物1和/或引物2的5’端的G-四链体互补序列碱基数为5-40个，可以与G-四链体序列部分互补或完全互补，其作用为封闭G-四链体。

其中G-四链体序列是指一种富含G、能够与硫磺素T或硫磺素T衍生物结合产生荧光或颜色信号的序列。

其中PCR终点可视化检测核酸的方法中，当G-四链体封闭序列的Tm值所处温度条件可使G-四链体序列在PCR反应退火-延伸阶段与引物的封闭序列互补，核酸聚合酶需是一种缺乏5’-3’外切酶活性且具有5’-3’链置换活性的耐热性核酸聚合酶；反之，能满足普通PCR反应的耐热性核酸聚合酶即可。PCR的反应程序为92-98℃预变性0-5min；92-98℃，0-30s；45-65℃，0-30s；72℃，0-30s；共20-45个循环。当进行结果观察时，需采用能够激发硫磺素T或硫磺素T衍生物产生荧光的光源对反应产物进行照射，优选为对眼睛友好的蓝光光源。PCR体系中所含G-四链体互补序列的引物与PCR体系中的G-四链体序列的原始浓度比值范围为0.3-3。

本发明方法对待测核酸样本的来源没有限制，所有生物体来源的DNA或RNA等都可用本发明的方法进行检测。

本发明方法可以准确检测核酸，特异性和灵敏度高、适用性广、检出限低，且不易污染。用DNA提取试剂直接对待测样本进行DNA的提取，PCR完成后用实时蓝光观测仪进行肉眼观察，就能直接进行结果检测。整个过程快速、简便，可以大量推广使用，应用前景良好。

本发明所公开的方法关键在于：利用缺乏5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶的性质；利用G-四链体能与硫磺素T及其衍生物结合产生荧光的性质；

本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

1.创新性。本发明首次实现基于硫磺素T和G-四链体在PCR反应后不开盖、就能现场可视化快速检测的方法。

2.经济性。现有的实时荧光PCR技术，试剂和探针的合成费用都较高，设备昂贵，而本发明中所涉及的作为探针的引物由普通的核苷酸组成，不用荧光基团修饰，合成方便，荧光显色试剂廉价，因此，大大降低了检测成本。

3.不开盖。本发明所涉及的PCR终点可视化检测方法为封闭操作，与传统的终点检测方法相比，无需在反应过程中或反应后开盖加入染料或进行电泳，不易造成PCR产物污染，增强了方法的准确性。

4.实用性。现有的实时荧光PCR技术通常对检测设备具有较高的要求，从而使检测具有一定的局限性，而本发明检测方法仅需要普通PCR仪，因此，核酸检测变得更加广泛、实用、方便。

5.普适性。本发明所涉及的PCR终点可视化检测方法，针对不同样品中的待测核酸，只需改变引物中的与目标核酸序列互补的特异性序列。针对RNA的检测，只需要在PCR前加逆转录反应。因此本发明的应用包括并不限于动物、植物、微生物的DNA或RNA的检测。并且由于能够与硫磺素T及其衍生物结合的G-四链体种类繁多，它们在不同的缓冲液条件下能够有不同的荧光强度，能够给本发明涉及的PCR终点可视化检测方法提供丰富的可供选择的G-四链体，使得本发明拥有很高的普适性。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

本发明还提供了所述方法的应用，将其应用于食品中猪肉源成分、人类乙型肝炎病毒的检测中。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是PCR终点可视化检测法的原理示意图。

图2是具体实施例1用正反引物1检测食品中猪肉源成分的结果图。

图3是具体实施例2用正反引物2检测人类乙型肝炎病毒基因的结果图。

图4是具体实施例3用正反引物3检测食品中猪肉源成分的结果图。

图5是具体实施例4对正向引物4和反向引物3的引物特异性检测结果图。

图6是具体实施例5特异性检测结果图。

图7是具体实施例6灵敏度检测结果图。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1用正反引物1检测食品中猪肉源成分

(1)正反引物1、G-四链体序列1、猪细胞色素B基因部分序列，其中两条正反引物均在5’端包含有能与G-四链体完全互补的片段。

正向引物1：5’-CCCCTCTTCCCTCTTCCCACACCGCCCGCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3’

反向引物1：5’-CCCCTCTTCCCTCTTCCCACACCGCCCCCTCAAACATCTCATCATGATGAAA-3’

G-四链体序列1：5’-GGGCGGTGTGGGAAGAGGGAAGAGGGG-3’

猪细胞色素B基因部分序列：

5’-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTAGCTCCTCAGAATGATATTTGTCCTCAGGGCAGGACGTAGCCTATGAAGGCTGTTGCTATAACGGTAAATAGTAGGACTACTCCAATGTTTCATGTTTCTAGGAATATATAGGATCCGTAGTATAGGCCTCGGCCTACGTGGATGAATAGGCAAATAAAGAACATGGATGCTCCGTTTGCATGTAGGTAGCGAATAACTCATCCGTAATTTACGTCTCGACAGATGTGTGTAACTGATGAGAAAGCTGTTGTTGTGTCTGATGTGTAATGTATTGCTAAGAACAGGCCTGTTAGGATTTGCAAGATTAGGCAGATGCCTAAGAGGGAACCGAAGTTTCATCATGATGAGATGTTTGATGGGGCTGGGAGGTC-3’

(2)反应体系及PCR条件

PCR方案是：94℃1min预变性；94℃10s，65℃30s，72℃30s，35个循环；72℃1min。

(3)检测方法

将PCR反应后的PCR管降温至室温，直接置于波长为440-485nm的蓝光实时观测仪下肉眼观测荧光。

(4)检测结果

结果如图2所示，用肉眼可观察到，猪肉全基因组DNA(阳性)组显示荧光，阴性对照组无荧光。

实施例2用正反引物2检测人类乙型肝炎病毒基因

(1)正反引物2、G-四链体序列2、人类乙型肝炎病毒基因部分序列，其中两条正反引物均在5’端包含有能与G-四链体完全互补的片段。

正向引物2：5’-CCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTGTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’

反向引物2：5’-CCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTGGACAAACGGGCAACATACCT-3’

G-四链体序列2：5’-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’

人类乙型肝炎病毒基因部分序列：5′-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTYTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCRAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3′

(2)反应体系及PCR条件

PCR方案是：94℃1min预变性；94℃10s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃1min。

(3)检测方法

将PCR反应后的PCR管降温至室温，直接置于波长为440-485nm的蓝光实时观测仪下肉眼观测荧光。

(4)检测结果

结果如图3所示，用肉眼可观察到，人类乙型肝炎患者血清全基因组DNA提取液(阳性)组显示荧光，阴性对照无荧光。

实施例3用正反引物3检测食品中猪肉源成分

(1)正反引物3、G-四链体序列2、猪细胞色素B基因部分序列，其中两条正反引物中只有正向引物在5’端包含有能与G-四链体完全互补的片段。

正向引物3：5’-CCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTGCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3’

反向引物3：5’-GACCTCCCAGCCCCATCAAACATCTCATCATGATGAAA-3’

G-四链体序列2：5’-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’

猪细胞色素B基因部分序列：

5′-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTAGCTCCTCAGAATGATATTTGTCCTCAGGGCAGGACGTAGCCTATGAAGGCTGTTGCTATAACGGTAAATAGTAGGACTACTCCAATGTTTCATGTTTCTAGGAATATATAGGATCCGTAGTATAGGCCTCGGCCTACGTGGATGAATAGGCAAATAAAGAACATGGATGCTCCGTTTGCATGTAGGTAGCGAATAACTCATCCGTAATTTACGTCTCGACAGATGTGTGTAACTGATGAGAAAGCTGTTGTTGTGTCTGATGTGTAATGTATTGCTAAGAACAGGCCTGTTAGGATTTGCAAGATTAGGCAGATGCCTAAGAGGGAACCGAAGTTTCATCATGATGAGATGTTTGATGGGGCTGGGAGGTC-3′

(2)反应体系及PCR条件

PCR方案是：94℃1min预变性；94℃10s，65℃30s，72℃30s，35个循环；72℃1min。

(3)检测方法

将PCR反应后的PCR管降温至室温，直接置于波长为440-485nm的蓝光实时观测仪下肉眼观测荧光。

(4)检测结果

结果如图4所示，用肉眼可观察到，猪肉全基因组DNA(阳性)组显示荧光，阴性对照组无荧光。

实施例4正向引物4反向引物3检测猪肉的特异性考察

分别以猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸡肉和鸭肉共计6种肉类已验证的基因组DNA为模板进行普通PCR扩增。

(1)正向引物4、反向引物3、猪细胞色素B基因部分序列

正向引物4：5’-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3’

反向引物3：5’-GACCTCCCAGCCCCATCAAACATCTCATCATGATGAAA-3’

猪细胞色素B基因部分序列：

5’-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTAGCTCCTCAGAATGATATTTGTCCTCAGGGCAGGACGTAGCCTATGAAGGCTGTTGCTATAACGGTAAATAGTAGGACTACTCCAATGTTTCATGTTTCTAGGAATATATAGGATCCGTAGTATAGGCCTCGGCCTACGTGGATGAATAGGCAAATAAAGAACATGGATGCTCCGTTTGCATGTAGGTAGCGAATAACTCATCCGTAATTTACGTCTCGACAGATGTGTGTAACTGATGAGAAAGCTGTTGTTGTGTCTGATGTGTAATGTATTGCTAAGAACAGGCCTGTTAGGATTTGCAAGATTAGGCAGATGCCTAAGAGGGAACCGAAGTTTCATCATGATGAGATGTTTGATGGGGCTGGGAGGTC-3’

(2)反应体系及PCR条件

PCR方案是：94℃1min预变性；94℃10s，65℃30s，72℃30s，35个循环；72℃1min。

(3)检测方法

将DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，并置于激光扫描成像仪下观察荧光条带。

(4)检测结果

结果如图5所示。泳道1为DNA Marker，泳道2-7分别为以猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸡肉、鸭肉DNA模板的PCR产物，泳道8为空白对照。琼脂糖凝胶电泳结果显示仅以猪肉DNA为模板时出现扩增条带。可见该引物仅仅对猪肉DNA产生特异性扩增，特异性良好。

实施例5正反引物1可视化检测猪肉的特异性考察

分别以猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸡肉和鸭肉共计6种肉类已验证的基因组DNA为模板，用实施例1的方法，进行PCR终点可视化检测。

扩增结束后，通过观察对不同模板DNA的PCR管在实时蓝光观测仪下是否有荧光来判定其特异性。若仅猪肉DNA能产生荧光，其他肉类DNA扩增后产生的荧光与空白组一致，判定检测体系无非特异性扩增。反之则认为检测体系与其他物种具有交叉反应。

实验结果见图6。结果显示，6种肉类DNA中，仅有猪肉DNA样本有荧光，判定为含有猪肉DNA，其它肉类均与空白组一样未见荧光，特异性验证结果理想。

实施例6正反引物1可视化检测猪肉的灵敏度考察

取已验证的猪肉DNA模板与牛肉DNA模板以不同比例混合制成猪肉DNA占比不同的混合样品，用实施例1的方法，进行灵敏度测试。猪肉DNA模板占比分别为100％、50％、10％、5％、1％、0％六种不同的梯度，扩增结束后，通过观察对不同占比模板DNA的PCR管在实时蓝光观测仪下是否有荧光来判定其灵敏度。如果PCR管中观测到荧光，当猪肉DNA模板占比越小则说明该方法能够在大量的牛肉DNA干扰下检测出猪肉DNA，灵敏度越高；当猪肉DNA模板占比越高，说明该方法容易越容易受到牛肉DNA干扰，灵敏度越低。

实验结果见图7。结果显示，猪肉DNA模板占比为1％-100％的六个不同的梯度均有荧光，且占比越高，荧光强度越大，而含猪肉DNA模板0％，即纯牛肉DNA模板的实验组无荧光，与空白对照一致。该试验说明该方法能在混合猪牛肉DNA检出仅1％猪肉DNA模板含量的样本，灵敏度高。

综上，本发明方法可以准确检测目标DNA，并且成功应用于实际样本的检测，检测快速、简便、成本低廉，可以大量推广使用，应用前景良好。

Claims (8)

1.一种PCR终点可视化检测核酸的方法，其特征是：在PCR体系中加入引物1和引物2、G-四链体序列、硫磺素T或硫磺素T衍生物、核酸聚合酶及其他常规PCR反应组分；PCR时，高温变性使待测核酸双链解开，退火和延伸时引物1和2结合到待测核酸链上，在核酸聚合酶的作用下开始延伸，形成一端含有G-四链体互补序列或两端均含有G-四链体互补序列的延长模板；当以延长模板为PCR扩增模板后，越来越多的引物1和2参与扩增并被封闭在双链PCR产物中，无法再对原有的外加G-四链体序列进行封闭，致使越来越多的外加G-四链体序列处于游离状态；PCR结束后，在观察检测结果所处温度下，游离的G-四链体与PCR体系中已加入的硫磺素T或硫磺素T衍生物结合能产生肉眼能观测到的荧光；没有目标DNA模板存在的情况下，由于PCR反应不会发生，在观察检测结果所处温度下，外加G-四链体序列被引物1和/或引物2封闭，从而不能与硫磺素T或硫磺素T衍生物结合产生荧光；反应结束后，通过肉眼观察有无荧光的产生就能判断是否有目标核酸的存在。

2.根据权利要求1中所述的引物1、引物2，其特征是：引物1和/或引物2包含两部分，3’端能与目标核酸模板杂交的部分以及5’端能与G-四链体互补的部分；在观察检测结果所处温度下，引物1和/或引物2的5’端序列能通过碱基互补作用与G-四链体序列形成双链，使G-四链体处于封闭状态，不能与硫磺素T或硫磺素T衍生物结合产生荧光。

3.根据权利要求1、2中所述的引物1、引物2，其特征是：5’端的G-四链体互补序列碱基数为5-40个，可以与G-四链体序列部分互补或完全互补，其作用为封闭G-四链体。

4.根据权利要求1～3中所述的G-四链体序列，其特征是：一种富含G、能够与硫磺素T或硫磺素T衍生物结合产生荧光或颜色信号的序列。

5.根据权利要求1中所述的PCR终点可视化检测核酸的方法，其特征是：当G-四链体封闭序列的Tm值所处温度条件可使G-四链体序列在PCR反应的退火-延伸阶段与引物的封闭序列互补，核酸聚合酶需是一种缺乏5’-3’外切酶活性且具有5’-3’链置换活性的耐热性核酸聚合酶；反之，能满足普通PCR反应的耐热性核酸聚合酶即可。

6.根据权利要求1所述的PCR终点可视化检测核酸的方法，其特征在于，PCR的反应程序为92-98℃预变性0-5min；92-98℃，0-30s；45-65℃，0-30s；72℃，0-30s；共20-45个循环。

7.根据权利要求1所述的PCR终点可视化检测核酸的方法，其特征在于，进行结果观察时，需采用能够激发硫磺素T或硫磺素T衍生物产生荧光的光源对反应产物进行照射，优选为对眼睛友好的蓝光光源。

8.根据权利要求1所述的PCR终点可视化检测核酸的方法，其特征在于，PCR体系中含G-四链体互补序列的引物与PCR体系中的G-四链体序列的原始浓度比值范围为0.5-3。

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