CN114652736B - 一种非编码rna tdrkh-as1作为标志物和治疗靶点的用途 - Google Patents

一种非编码rna tdrkh-as1作为标志物和治疗靶点的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114652736B
CN114652736B CN202210537258.XA CN202210537258A CN114652736B CN 114652736 B CN114652736 B CN 114652736B CN 202210537258 A CN202210537258 A CN 202210537258A CN 114652736 B CN114652736 B CN 114652736B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
cells
tdrkh
breast cancer
shrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210537258.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114652736A (zh
Inventor
王晓稼
雷蕾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Cancer Hospital
Original Assignee
Zhejiang Cancer Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Cancer Hospital filed Critical Zhejiang Cancer Hospital
Priority to CN202210537258.XA priority Critical patent/CN114652736B/zh
Publication of CN114652736A publication Critical patent/CN114652736A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114652736B publication Critical patent/CN114652736B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种非编码RNA TDRKH‑AS1作为标志物和治疗靶点的用途，属于肿瘤生物治疗领域，公开了一种非编码RNA TDRKH‑AS1在制备预测乳腺癌氟维司群耐药的检测剂中的用途，公开了抑制非编码RNA TDRKH‑AS1表达的shRNA的用途，该shRNA的编码序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，或SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，能够有效敲低非编码RNA TDRKH‑AS1的表达，从而提高耐药乳腺癌细胞对氟维司群的敏感性，具备良好的药物开发前景。

Description

一种非编码RNA TDRKH-AS1作为标志物和治疗靶点的用途
技术领域
本发明属于肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种非编码RNA TDRKH-AS1作为标志物和治疗靶点的用途。
背景技术
乳腺癌是当今全球范围内发病率最高的女性恶性肿瘤，每年发病约为30.4万，发病率呈现持续上升的趋势，严重影响女性健康。而乳腺癌中又有将近70%为激素受体阳性乳腺癌，所以基于激素受体阳性乳腺癌的治疗方法和药物显得至关重要。内分泌治疗就是现有技术中常见的治疗该类乳腺癌的方法，其虽然是现有技术中较有效的治疗方法，但其仍存在较大缺陷，即内分泌治疗中的原发或继发内分泌耐药，该类耐药特性会严重影响患者的治疗效果，使得治疗效果无法达到预期。而目前尚无有效的生物标志物可用于预测氟维司群敏感性或用于靶向治疗逆转耐药。
近年来以非编码RNA为核心的表观遗传调控机制在生命活动中的作用越来越受到重视。长非编码RNA是一类转录本长度在200nt以上的非编码RNA分子，通常被认为不具备编码蛋白功能。但越来越多研究显示长非编码RNA的表达在不同的组织具有高度特异性，不仅其表达水平与肿瘤发展的不同阶段、不同组织学类型密切相关，可以作为肿瘤检测的特异标志物；而且长非编码RNA在肿瘤发生发展中的重要的调控作用也显示其作为肿瘤治疗靶点的可能性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非编码RNA TDRKH-AS1作为标志物和治疗靶点的用途，通过检测非编码RNA TDRKH-AS1在乳腺癌中的表达，能够预测乳腺癌氟维司群耐药，通过敲低非编码RNA TDRKH-AS1的表达能够提高耐药乳腺癌细胞对氟维司群的敏感性。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种抑制非编码RNA TDRKH-AS1表达的shRNA在制备逆转氟维司群耐药的药物中的用途，上述shRNA的编码序列选自1)、2)、3)中的一种：
1) SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的编码序列；
2) SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的编码序列；
3) SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的编码序列。
一种构建物在制备增加乳腺癌细胞对氟维司群敏感性的药物中的用途，该构建物由上述shRNA插入慢病毒载体质粒pLKO.1-GFP-Puro所得。
在一些实施方式中，上述构建物以冻干制剂形式保存。
一种非编码RNA TDRKH-AS1在制备预测乳腺癌氟维司群耐药的检测剂中的用途。
在一些实施方式中，上述检测剂包括用于检测非编码RNA TDRKH-AS1的表达情况的引物对。
在一些实施方式中，上述引物对如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
一种抑制非编码RNA TDRKH-AS1表达的shRNA和氟维司群在制备治疗乳腺癌药物中的用途，上述shRNA的编码序列选自1)、2)、3)中的一种：
1) SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的编码序列；
2) SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的编码序列；
3) SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的编码序列。
一种抑制非编码RNA TDRKH-AS1表达的慢病毒的构建方法，包括将上述shRNA通过Age I和EcoR I酶切位点插入慢病毒载体质粒pLKO.1-GFP-Puro，然后与psPAX2和pMD2.G共转染到宿主细胞293FT培养。
一种药物组合物，包括氟维司群，还包括上述的一种shRNA或上述的一种构建物，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
在某些实施方案中，上述构建物的剂型为冻干剂型。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：基于非编码RNA TDRKH-AS1在不同乳腺癌组织中的异常表达，通过检测样本中非编码RNA TDRKH-AS1能够帮助判断样本中乳腺癌细胞是否对氟维司群耐药，从而制定更为有效的治疗方案，提高治疗效果；此外，本发明还提供一种敲低非编码RNA TDRKH-AS1的shRNA，通过敲低非编码RNA TDRKH-AS1表达实现乳腺癌氟维司群耐药的逆转，提高乳腺癌对氟维司群的敏感性，提高治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中MCF-7及MCF-7R细胞中TDRKH-AS1的相对表达量；
图2为本发明实施例1中细胞中TDRKH-AS1的荧光原位杂交图；
图3为本发明实施例2中TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞中TDRKH-AS1的相对表达量；
图4为本发明实施例2中细胞的集落形成；
图5为本发明实施例2中氟维司群对乳腺癌细胞的生长抑制率；
图6为本发明实施例3中细胞中TDRKH-AS1的相对表达量；
图7为本发明实施例3中细胞的集落形成；
图8为本发明试验例1中冻存3个月后的细胞存活率；
图9为本发明试验例1中24h细胞增殖率；
图10为本发明试验例1中48h细胞增殖率；
图11为本发明试验例1中72h细胞增殖率。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
1、检测在氟维司群敏感乳腺癌细胞系、氟维司群耐药乳腺癌细胞系中长非编码RNA TDRKH-AS1的表达水平。MCF-7为氟维司群敏感乳腺癌细胞系；MCF-7R为氟维司群耐药乳腺癌细胞系。
1.1 MCF-7细胞从ATCC细胞库获得，将MCF-7细胞培养于含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，培养基加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素。
1.2 MCF-7R细胞系的构建：取对数生长期的MCF-7细胞1×107个，接种于直径为10cm的培养皿（以含10wt%胎牛血清、青霉素200U/mL、链霉素200U/mL的DMEM完全培养基为培养液），待细胞生长稳定后于培养液中加入1μmol/L氟维司群，每48h换液后加入等浓度的氟维司群，12个月后通过有线稀释法获得乳腺癌MCF-7氟维司群耐药的单克隆细胞株（称为MCF-7R），进而在无药物干预下进行扩增，为了维持MCF-7R的耐药性，后期培养于含有0.5μmol/L的氟维司群培养液中。
1.3 RT-PCR检测MCF-7、MCF-7R细胞中的TDRKH-AS1表达水平：
1.3.1用Trizol法分别提取总RNA：
分别取MCF-7、MCF-7R细胞放入1.5mL离心管中，2mL PBS洗涤2次，加入1mLTrizol，移液枪反复吹打20下，确保细胞全部裂解，然后吸至1.5mL离心管中；室温放置5分钟，使样品充分裂解，加入0.2mL氯仿，猛烈晃动10s，室温放置2min；12000g 4℃离心15min，吸取上层无色水相移至新的离心管，加入0 .5ml异丙醇，颠倒混匀，冰上放置10分钟；12000g 4℃离心10min，可见管底的RNA沉淀，小心吸去上清；加入1mL 75v/v%乙醇（DEPC水配制），颠倒混匀，7500g 4℃离心5min，小心吸去上清；加入20μL DEPC水溶解，Nanodrop分光光度计定量并质检，-80℃保存待用。
1.3.2反转录：加入2μg总RNA，1μL随机引物，加入DEPC水至12μL，在68℃ 孵育5min。取出产物后立即放置冰上4min，分别加入4μL Reaction Buffer，2μL 10mM dNTP Mix，1μL Reverse Transcriptase，M-MLV-Reverse和1μL RNase Inhibitor。在42℃水浴60min，再置于70℃水浴15min，立即放在冰上，静置5min，得cDNA模板，于-20℃下保存。
1.3.3实时荧光定量PCR检测TDRKH-AS1表达量：TDRKH-AS1和GAPDH的引物如表1所示。
表1 荧光定量PCR引物序列
Figure DEST_PATH_IMAGE001
取各组细胞的cDNA 1μL为模板，进行PCR反应，PCR反应体系（20μL）见表2：
表2 PCR反应体系（10μL）
Figure DEST_PATH_IMAGE002
反应条件为：95℃预变性5min；以95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，扩增40个循环，再以72℃充分延伸10min。以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCT法计算TDRKH-AS1的相对表达量。MCF-7及MCF-7R细胞中TDRKH-AS1的相对表达量见图1，其中A为MCF-7亲本细胞，B为MCF-7R耐药细胞，**P < 0.01表示有统计学意义。
由图1可以看出，MCF-7亲本细胞中长非编码RNA TDRKH-AS1的表达水平明显小于MCF-7R耐药细胞，说明耐药性氟维司群敏感乳腺癌细胞系中长非编码RNA TDRKH-AS1的表达水平比氟维司群耐药乳腺癌细胞系更高。
1.4荧光原位杂交（FISH）实验：
1.4.1分别取MCF-7、MCF-7R细胞1×103接种于6孔板的玻璃盖板上，37℃培养过夜，用1ｘPBS清洗细胞两次，加入1mL 4g/mL%多聚甲醛固定15min，将悬液涂在粘附性玻片上，每片约50μL的悬液；60℃恒温干燥箱烘片10min，得到细胞涂片。
1.4.2探针序列为5’-CCGCTTGTCCCTTGACTTCCTGTCCATCT-3’，并在其5’端添加Cy3（异硫氰酸荧光素）荧光基团作为FISH探针的通用荧光标记序列，由上海生工有限公司合成。
1.4.3取细胞涂片，样品用胃蛋白酶溶液（10v/v%胃蛋白酶水溶液100mL+40mL纯水+1mol/L盐酸400μL）37℃消化10分钟，然后依次在70v/v%、90v/v%、100v/v%的梯度乙醇溶液中脱水1min，风干涂片；暗室避光操作，样品上滴加荧光标记探针10μL，荧光浓度为10ng/μL，使用盖玻片覆盖样本，放入预热的FISH专用湿盒中，90℃变性处理10min，将装有切片的湿盒放入37℃的恒温箱中杂交4h；暗室避光操作，涂片浸泡在2×SSC中2min，小心除去盖玻片后，2×SSC冲洗3次，每次3min；DAPI复染：暗室避光操作，在样品上滴加DAPI 10μL，使用盖玻片覆盖样品，放置于暗盒中，25℃孵育5min，缓慢除去盖玻片后，2×SSC冲洗3次，每次3min，后依次在70v/v%、90v/v%、100v/v%的梯度乙醇溶液中脱水1min；在盖玻片上滴加抗荧光猝灭封片剂封片，使用激光共聚焦镜检，由于Cy3荧光染料在红色激发光下法绿色荧光，DAPI荧光染料在UV光下发蓝色荧光，因此，拍照过程中个选用Cy3、DAPI两种通道进行结果观察和照片记录。细胞中TDRKH-AS1的荧光原位杂交图见图2，其中，其中A为MCF-7亲本细胞，B为MCF-7R耐药细胞，a为用DAPI通道的照片，b为用FITC通道的照片，c为用合并通道的照片。
图2可以看出，MCF-7R耐药细胞中的TDRKH-AS1的表达高于MCF-7亲本细胞，即FISH实验证明了TDRKH-AS1在耐药细胞中表达更高。
实施例2：
1、TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞系的构建：
1.1扩增TDRKH-AS1的引物：
上游引物：5’-AGGAGCTAGCGGACAGGAAGTCAAGGGACA-3’，
下游引物：5’-ATGCGAATTC GGAGTTGGAGGTTCCAGTGA-3’；
其中，上、下游引物的下划线部分为Nhe Ι、EcoR Ι酶切位点。
1.2 PCR扩增人的TDRKH-AS1基因片段：
利用Trizol法提取乳腺癌细胞MCF-7的总RNA，逆转录为cDNA（方法同实施例1中1.3.1及1.3.2）。PCR反应体系见表3（20μL）：
表3 PCR反应体系（20μL）
Figure DEST_PATH_IMAGE003
反应步骤：94℃预变性5min；95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，扩增39个循环，72℃延伸10min。将PCR产物电泳、胶回收目的片段。
1.3分别对pcDNA3.1质粒和TDRKH-AS1 PCR产物进行双酶切，酶切反应体系见表4：
表4 酶切反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE004
反应条件：37℃水浴60min。
1.4分别对双酶切后的pcDNA3.1质粒和TDRKH-AS1 PCR产物电泳，胶回收目的片段，将酶切后的pcDNA3.1质粒和TDRKH-AS1 PCR产物进行连接，连接反应体系（10μL）见表5：
表5 连接反应体系（10μL）
Figure DEST_PATH_IMAGE005
反应条件：25℃水浴60min。
1.5将TDRKH-AS1的表达载体质粒转化到大肠杆菌E.coli DH 5α中，经LB（100μg/mL氨苄青霉素）平板筛选过夜后，挑取阳性克隆子进行扩大培养，利用质粒提取试剂盒提取大肠杆菌中的质粒测序验证。测序结果验证重组质粒pcDNA3.1-TDRKH-AS1构建成功。
1.6细胞转染：
1.6.1将生长状态良好的乳腺癌细胞MCF-7按2×105个细胞/孔接种于24孔板中，每孔加入500μL DMEM完全培养基培养至细胞融合度达到60%时，开始转染。
1.6.2将1μg pcDNA3.1-TDRKH-AS1重组质粒加入50μL DMEM完全培养基，混合均匀，得到体系N1；将2.5μL Lipofectamine 2000加入50μL DMEM完全培养基，混合均匀，静置5min，得到体系N2；将体系N1和体系N2混合均匀，静置25min，得到体系N。
1.6.3弃取细胞培养板内原有的培养基，每孔加入400μL DMEM完全培养基及100μL体系N，6h后，每孔用2mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基换液，48h后用含600μg/mLG418的DMEM完全培养基，筛选14d，每隔3d换一次培养基。挑选单克隆细胞群维持G418（遗传霉素）抗性培养，G418的维持浓度为300μg/mL，得到稳定转染的TDRKH-AS1细胞株，将筛选后的细胞采用有限稀释法传代于96孔板中，采用含有300μg/mL G418的DMEM完全培养基单克隆化筛选后的细胞，将单克隆化的细胞扩大培养，实验分为对照组（空载系统慢病毒）、pcDNA3.1-TDRKH-AS1组，得到TDRKH-AS1过表达对照乳腺癌稳定细胞系、TDRKH-AS1过表达乳腺癌稳定细胞系。TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞中TDRKH-AS1的相对表达量见图3，其中C为TDRKH-AS1过表达对照乳腺癌细胞，D为TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞，**P < 0.01表示有统计学意义。
由图3可以看出，乳腺癌细胞MCF-7转染后，TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞的TDRKH-AS1相对表达量明显大于TDRKH-AS1过表达对照乳腺癌细胞。
2、平板克隆形成实验：分别取上述的TDRKH-AS1过表达对照乳腺癌细胞、TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞，进行实验，检测对氟维司群的耐药性。向含有DMEM完全培养基的培养皿（直径60mm）中，接种1000个生长状态良好的细胞，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀；置37℃、5v/v%CO2下培养15d，每隔3d更换一次完全培养基；当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15min，弃甲醇后空气干燥，用Giemsa染液（购自默克）染色10min，流水缓慢洗去染液，空气干燥。实验分为空白组（TDRKH-AS1过表达对照乳腺癌稳定细胞+培养基中含有6μmol/L DMSO）、对照组（TDRKH-AS1过表达对照乳腺癌细胞+培养基中含有6μmol/L氟维司群）、过表达组（TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞+培养基中含有6μmol/L氟维司群）3组。细胞的集落形成见图4，其中O为空白组，P为对照组，Q为过表达组。
由图4可以看出，TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞形成的集落数大于TDRKH-AS1过表达对照乳腺癌细胞，说明敏感株中过表达TDRKH-AS1会增强乳腺癌细胞对氟维司群的耐药性。
3、乳腺癌细胞对氟维司群的敏感性检测：分别取对数生长期MCF-7和TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞以每孔3000个细胞的密度接种到96孔板（用DMEM完全培养基）中，在37℃5v/v%CO2培养箱中培养至细胞贴壁后分别加氟维司群，最终浓度分别为0（细胞对照组），2，4，8和16μmol/L，每个浓度设置4个复孔，同时设空白对照组，置37℃、5v/v% CO2培养箱48h后，每孔加20μL ΜTT（5g/L）溶液，继续培养4h后，吸出培养基，每孔加200μL三联液（10gSDS，异丁醇5mL，0.1mL 10M盐酸与ddH2O配置成100mL溶液），继续培养过夜，酶标仪570nm条件下测定吸光度（A570nm）值，以三联液作为空白对照组，检测细胞存活率。细胞生长抑制率（%）=（对照组A570nm - 实验组A570nm）/细胞对照组A570nm×100%。氟维司群对乳腺癌细胞的生长抑制率见图5，其中C为TDRKH-AS1过表达对照乳腺癌细胞，D为TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞，**P < 0.01表示有统计学意义。
由图5可以看出，氟维司群对TDRKH-AS1过表达乳腺癌细胞的生长抑制率明显大于TDRKH-AS1过表达对照乳腺癌细胞，这说明，敏感株中TDRKH-AS1的过表达会降低乳腺癌细胞对氟维司群的敏感性。
实施例3：
1、根据人类非编码RNA TDRKH-AS1基因的mRNA序列（NR_146292.1）设计2个靶序列，分别为靶点1 GACCACCTCTAGGCCAATTAC，靶点2 GCAGCAGATCAAGAAACAGAA，靶点3GATCAAGAAACAGAACATTGC。
2、慢病毒干扰载体的构建
2.1选择PLKO.1-GFP-Puro作为慢病毒shRNA敲除质粒载体，购自上海圻明生物科技有限公司；
2.2对于每个位点合成相应的shRNA，设计的shRNA寡核苷酸链由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表6。
表6 TDRKH-AS1基因shRNA寡核苷酸链序列
Figure DEST_PATH_IMAGE006
2.3由质粒提取试剂盒提取PLKO.1-GFP-Puro载体，通过双酶切体系：1μL EcoR Ι+1μL Age Ι+5μL 10×NEB Cutsmart Buffer+1μg PLKO.1-GFP-Puro+ddH2O（补充至50μL），37℃，1h，双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收双酶切后载体。
2.4用pH调至8.0的TE溶液对DNA oligo（寡核苷酸）将shRNA引物溶解至浓度为100μM，再分别取相应的两条链进行退火，退火体系（50μL）见表7：
表7 退火体系（50μL）
Figure DEST_PATH_IMAGE008
反应条件设置为95℃ 5min，随后进行的体系分别为85℃ 5min，75℃ 5min，70℃5min，最后将反应完的体系在4℃下保存，最终产物分别为10μM的shRNA1模板、10μM的shRNA2模板、10μM的shRNA3模板。
2.5将shRNA与质粒连接，连接反应体系（10μL）见表8：
表8连接反应体系（10μL）
Figure DEST_PATH_IMAGE010
混匀后瞬时离心，22℃连接2h。
取连接反应产物转化到大肠杆菌E.coli DH 5α中，经LB（100μg/mL氨苄青霉素）平板筛选过夜后，挑取阳性克隆子进行扩大培养，利用质粒提取试剂盒提取大肠杆菌中的质粒测序验证。测序结果验证重组质粒构建成功。即构建了靶向性沉默TDRKH-AS1基因的重组质粒PLKO.1-shRNA1、PLKO.1-shRNA2、PLKO.1-shRNA3。
2.5包装细胞的获得：
细胞复苏：从液氮中取出冻存的293FT细胞，立刻放入37℃水浴锅，不停晃动冻存管使其尽快融化。将融化后的细胞放入15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，然后将其加入T25细胞培养瓶中，补足6mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，再加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素。放入37℃，5v/v% CO2二氧化碳培养箱中培养，隔日换液一次。
细胞传代：待细胞长至90%时，按照一传三的方式传代。轻轻吸出培养基，加入1mlPBS，放平轻轻晃动后吸出PBS。加入1mL 0.125wt%胰酶，放平培养瓶消化40s后，加入1m含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，并吹打混匀。转移到15mL离心管后，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，将其加入T75细胞培养瓶中，补足24ml含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，再加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素，放入37℃，5v/v% CO2二氧化碳培养箱中培养。
细胞冻存：待细胞长满单层，轻轻吸出培养基，加入3ml PBS，放平轻轻晃动后吸出PBS，加入3mL 0.125wt%的胰酶，放平培养瓶消化40s后，加入3mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，并吹打混匀，转移至15mL离心管，1500rpm离心5min，弃去上清，加入3mL细胞冻存液，（每100mL细胞冻存液包括：88mL DMEM完全培养基、6mL胎牛血清、6mL甘油），甘油轻轻吹打重悬细胞，将其分装至细胞冻存管内，放置在-80℃冰箱，隔天保存至液氮罐中，得到包装细胞。
2.6慢病毒包装与浓缩：将包装细胞按照2.5进行复苏和传代后，接种6×105个细胞至6cm培养皿（用DMEM完全培养基）中培养至70%融合时，用DMEM完全培养基换液；将2μg重组质粒PLKO.1-shRNA、2μg包膜载体psPAX2（购自上海圻明生物科技有限公司）以及2μg包装载体pMD2.G（购自上海圻明生物科技有限公司）溶于300μL DMEM完全培养基中混匀，得到体系X1，将18μL Lipofectamine 2000转染试剂（购自赛默飞）溶于300μL DMEM完全培养基中混匀，得到体系X2；将体系X2加入体系X1中混匀，静置10min后，加入293FT细胞的培养皿中，轻轻摇匀，在37℃ 5v/v%CO2培养箱中培养过夜；转染18h后，用5mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基换液，在转染后48h收集上清液（病毒原液），将病毒原液在2500rpm离心15min，取上清用0.45μm滤膜过滤后，滤液保存于-80℃，得到pLKO.1-shRNA慢病毒，由上述不同的重组质粒分别得到pLKO.1-shRNA1慢病毒、pLKO.1-shRNA2慢病毒、pLKO.1-shRNA3慢病毒。空载系统慢病毒采用同样的方法制备。
2.7取生长状态良好的MCF-7细胞接种到24孔板中，每孔4×105个细胞，每孔加入400μL含有10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，在37℃ 5v/v%CO2培养箱中培养24h后，去24孔板中的培养基，加入500μL含有10v/v%病毒液、5μg/mL聚凝胺、10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，继续培养24h后用含有10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基换液，继续培养48h，检测敲低效果。实验分为对照组（空载系统慢病毒）、pLKO.1-shRNA1组、pLKO.1-shRNA2组、pLKO.1-shRNA3组。敲低效果的检测：慢病毒载体上带有GFP绿色荧光蛋白，在病毒感染96小时后用倒置荧光显微镜观察GFP绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况；用BDinflux cell sorter细胞分选仪对敲低的细胞分选，得到100% GFP的筛选细胞。
2.8分别将空载系统慢病毒沉默对照细胞、pLKO.1-shRNA1沉默细胞、pLKO.1-shRNA2沉默细胞、pLKO.1-shRNA3沉默细胞、按照每孔4×105个细胞铺板在24孔板，培养至细胞融合至85%时，采用RT-PCR法检测各组细胞中的TDRKH-AS1基因的表达量。细胞中TDRKH-AS1的相对表达量见图6，其中E为对照组（空载系统慢病毒沉默对照细胞），F为pLKO.1-shRNA1沉默细胞，G为pLKO.1-shRNA2沉默细胞，H为pLKO.1-shRNA3沉默细胞，*表示与对照组相比，**P < 0.01表示有统计学意义。
由图6可以看出，pLKO.1-shRNA1沉默细胞、pLKO.1-shRNA2沉默细胞、pLKO.1-shRNA3沉默细胞中TDRKH-AS1的相对表达量显著低于空载系统慢病毒沉默对照细胞，这说明本实施例提供的pLKO.1-shRNA1慢病毒、pLKO.1-shRNA2慢病毒、pLKO.1-shRNA3慢病毒能够显著敲低TDRKH-AS1基因。
3、平板克隆形成实验：空载系统慢病毒沉默对照细胞、pLKO.1-shRNA2沉默细胞，进行实验，检测对氟维司群的耐药性。向含有DMEM完全培养基的培养皿（直径60mm）中，接种1000个生长状态良好的细胞，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀；置37℃、5v/v%CO2下培养15d，每隔3d更换一次完全培养基；当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15min，弃甲醇后空气干燥，用Giemsa染液（购自默克）染色10min，流水缓慢洗去染液，空气干燥。实验分为空白组（空载系统慢病毒沉默对照细胞+培养基中含有6μmol/L DMSO）、对照组（空载系统慢病毒沉默对照细胞+培养基中含有6μmol/L氟维司群）、敲除组（pLKO.1-shRNA2沉默细胞+培养基中含有6μmol/L氟维司群）3组。细胞的集落形成见图7，其中R为空白组、S为对照组、T为敲除组。
由图7可以看出，敲除组细胞的集落数明显小于对照组，这说明，TDRKH-AS1的敲低能够提高乳腺癌细胞对氟维司群的敏感性。
实施例4：
2.5包装细胞的获得：
细胞复苏：从液氮中取出冻存的293FT细胞，立刻放入37℃水浴锅，不停晃动冻存管使其尽快融化。将融化后的细胞放入15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，然后将其加入T25细胞培养瓶中，补足6mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，再加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素。放入37℃，5v/v% CO2二氧化碳培养箱中培养，隔日换液一次。
细胞传代：待细胞长至90%时，按照一传三的方式传代。轻轻吸出培养基，加入1mlPBS，放平轻轻晃动后吸出PBS。加入1mL 0.125wt%胰酶，放平培养瓶消化40s后，加入1m含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，并吹打混匀。转移到15mL离心管后，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，将其加入T75细胞培养瓶中，补足24ml含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，再加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素，放入37℃，5v/v% CO2二氧化碳培养箱中培养。
细胞冻存：待细胞长满单层，轻轻吸出培养基，加入3ml PBS，放平轻轻晃动后吸出PBS，加入3mL 0.125wt%的胰酶，放平培养瓶消化40s后，加入3mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，并吹打混匀，转移至15mL离心管，1500rpm离心5min，弃去上清，加入3mL细胞冻存液，（每100mL细胞冻存液包括：88mL DMEM完全培养基、6mL胎牛血清、6mL甘油、0.3mg酒石酸钾钠），甘油轻轻吹打重悬细胞，将其分装至细胞冻存管内，放置在-80℃冰箱，隔天保存至液氮罐中，得到包装细胞。其余部分和实施例1完全一致。
实施例5：
2.5包装细胞的获得：
细胞复苏：从液氮中取出冻存的293FT细胞，立刻放入37℃水浴锅，不停晃动冻存管使其尽快融化。将融化后的细胞放入15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，然后将其加入T25细胞培养瓶中，补足6mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，再加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素。放入37℃，5v/v% CO2二氧化碳培养箱中培养，隔日换液一次。
细胞传代：待细胞长至90%时，按照一传三的方式传代。轻轻吸出培养基，加入1mlPBS，放平轻轻晃动后吸出PBS。加入1mL 0.125wt%胰酶，放平培养瓶消化40s后，加入1m含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，并吹打混匀。转移到15mL离心管后，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，将其加入T75细胞培养瓶中，补足24ml含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，再加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素，放入37℃，5v/v% CO2二氧化碳培养箱中培养。
细胞冻存：待细胞长满单层，轻轻吸出培养基，加入3ml PBS，放平轻轻晃动后吸出PBS，加入3mL 0.125wt%的胰酶，放平培养瓶消化40s后，加入3mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，并吹打混匀，转移至15mL离心管，1500rpm离心5min，弃去上清，加入3mL细胞冻存液，（每100mL细胞冻存液包括：88mL DMEM完全培养基、6mL胎牛血清、5mL甘油、1mL3-氢基丙酸），甘油轻轻吹打重悬细胞，将其分装至细胞冻存管内，放置在-80℃冰箱，隔天保存至液氮罐中，得到包装细胞。其余部分和实施例1完全一致。
实施例6：
2.5包装细胞的获得：
细胞复苏：从液氮中取出冻存的293FT细胞，立刻放入37℃水浴锅，不停晃动冻存管使其尽快融化。将融化后的细胞放入15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，然后将其加入T25细胞培养瓶中，补足6mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，再加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素。放入37℃，5v/v% CO2二氧化碳培养箱中培养，隔日换液一次。
细胞传代：待细胞长至90%时，按照一传三的方式传代。轻轻吸出培养基，加入1mlPBS，放平轻轻晃动后吸出PBS。加入1mL 0.125wt%胰酶，放平培养瓶消化40s后，加入1m含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，并吹打混匀。转移到15mL离心管后，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，将其加入T75细胞培养瓶中，补足24ml含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，再加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素，放入37℃，5v/v% CO2二氧化碳培养箱中培养。
细胞冻存：待细胞长满单层，轻轻吸出培养基，加入3ml PBS，放平轻轻晃动后吸出PBS，加入3mL 0.125wt%的胰酶，放平培养瓶消化40s后，加入3mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，并吹打混匀，转移至15mL离心管，1500rpm离心5min，弃去上清，加入3mL细胞冻存液，（每100mL细胞冻存液包括：88mL DMEM完全培养基、6mL胎牛血清、5mL甘油、0.3mg酒石酸钾钠、1mL 3-氢基丙酸），甘油轻轻吹打重悬细胞，将其分装至细胞冻存管内，放置在-80℃冰箱，隔天保存至液氮罐中，得到包装细胞。其余部分和实施例1完全一致。
试验例1：
1.1冻存细胞存活率的检测：分别从液氮中取出上述实施例冻存的包装细胞，立刻放入37℃水浴锅，不停晃动冻存管使其尽快融化。将融化后的细胞放入15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，然后将其加入T25细胞培养瓶中，补足6mL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，再加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素。放入37℃，5v/v% CO2二氧化碳培养箱中培养3h，收集细胞到2ml离心管中，离心去除培养基后，利用凋亡检测缓冲液重悬细胞，按照细胞凋亡检测试剂盒说明加入FITC-Annexin V和PI染色，最后利用流式细胞仪检测细胞存活率。冻存3个月后的细胞存活率见图8，其中I为实施例3，J为实施例4，K为实施例5，L为实施例6，*表示与实施例3相比，*P < 0.05，**P < 0.01表示有统计学意义，#表示与实施例6相比，##P <0.01表示有统计学意义。
1.2增殖能力的检测：分别取上述实施例获得的冻存3个月的包装细胞，进行细胞复苏后，待细胞长至90%时，向96孔细胞板的每孔接种3000个细胞，并加入100μL含10wt%胎牛血清的DMEM完全培养基，每组4个复孔，检测细胞在不同时间点的增殖情况（0h，24h，48h，72h）。在每个时间点，每孔加5mg/mL MTT在37℃培养箱孵育4h，用枪头小心吸取孔中溶液，加入150uL DMSO，混匀。酶标仪570nm条件下测定吸光度值，计算24h，48h，72h的细胞增殖率，例如48h细胞增殖率（%）=（培养48h时A570nm-培养0h时A570nm）/培养0h时A570nm×100%。24h细胞增殖率见图9，其中I为实施例3，J为实施例4，K为实施例5，L为实施例6，*表示与实施例3相比，*P < 0.05，**P < 0.01表示有统计学意义，#表示与实施例6相比，##P < 0.01表示有统计学意义。48h细胞增殖率见图10，其中I为实施例3，J为实施例4，K为实施例5，L为实施例6，*表示与实施例3相比，*P < 0.05，**P < 0.01表示有统计学意义，#表示与实施例6相比，##P < 0.01表示有统计学意义。72h细胞增殖率见图11，其中I为实施例3，J为实施例4，K为实施例5，L为实施例6，*表示与实施例3相比，*P < 0.05，**P < 0.01表示有统计学意义，#表示与实施例6相比，##P < 0.01表示有统计学意义。
由图8可以看出，实施例5、实施例6冻存的包装细胞在冻存3个月时的细胞存活率大于实施例3、实施例4，且实施例6大于实施例5；有图9、图10、图11可以看出，实施例5、实施例6冻存3个月的包装细胞复苏后，培养24，48h，72h的细胞增殖率大于实施例3、实施例4，且实施例6大于实施例5，这说明，细胞冻存液中3-羟基丙酸的加入能够减少冻存过程对细胞的损失，从而提高细胞复苏后的存活率及增殖能力，酒石酸钾钠的加入能够与3-氢基丙酸能够发挥协同作用，细胞复苏后的存活率和增殖能力得到进一步提升。分析其中的原理可能是：3-氢基丙酸具有很强的水分子络合能力，进一步弱化了水的结晶过程，避免了冷冻过程对细胞的损伤，细胞复苏后细胞存活率高、增殖能力较好；而酒石酸钾钠能够中和掉细胞培养基中积累的氧自由基，减少对细胞的毒害，单独使用时效果不明显，与3-氢基丙酸搭配使用时能够发挥协同作用，进一步提高细胞复苏后的存活率和增殖能力。冻存细胞复苏后的存活率和增殖能力较好能够降低细胞活化次数，简化敲减TDRKH-AS1慢病毒的制备步骤，并降低生产成本，从而提高其市场应用前景。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江省肿瘤医院
<120> 一种非编码RNA TDRKH-AS1作为标志物和治疗靶点的用途
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggtgacca cctctaggcc aattacttca agagagtaat tggcctagag gtggtctttt 60
ttg 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcaaaaa agaccacctc taggccaatt actctcttga agtaattggc ctagaggtgg 60
tca 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggtgcagc agatcaagaa acagaattca agagattctg tttcttgatc tgctgctttt 60
ttg 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattcaaaaa agcagcagat caagaaacag aatctcttga attctgtttc ttgatctgct 60
gca 63
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggtgatca agaaacagaa cattgcttca agagagcaat gttctgtttc ttgatctttt 60
ttg 63
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aattcaaaaa agatcaagaa acagaacatt gctctcttga agcaatgttc tgtttcttga 60
tca 63
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggacaggaag tcaagggaca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggagttggag gttccagtga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgttgtggat ctgacctgcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagtcgcagg agacaacctg 20
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgcttgtcc cttgacttcc tgtccatct 29
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggagctagc ggacaggaag tcaagggaca 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgcgaattc ggagttggag gttccagtga 30
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaccacctct aggccaatta c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcagcagatc aagaaacaga a 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gatcaagaaa cagaacattg c 21

Claims (7)

1.一种抑制非编码RNA TDRKH-AS1表达的shRNA在制备逆转乳腺癌氟维司群耐药的药物中的用途，其特征在于：所述shRNA的编码序列选自1)、2)、3)中的一种：
1) SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的编码序列；
2) SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的编码序列；
3) SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的编码序列。
2.一种构建物在制备增加乳腺癌细胞对氟维司群敏感性的药物中的用途，其特征在于：所述构建物由权利要求1所述的shRNA插入慢病毒载体质粒pLKO.1-GFP-Puro所得。
3.一种检测非编码RNA TDRKH-AS1表达情况的引物对在制备预测乳腺癌氟维司群耐药的检测剂中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述引物对如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
5.一种抑制非编码RNA TDRKH-AS1表达的慢病毒的构建方法，其特征在于：包括将权利要求1所述的shRNA通过Age I和EcoR I酶切位点插入慢病毒载体质粒pLKO.1-GFP-Puro，然后与psPAX2和pMD2.G共转染到宿主细胞293FT培养。
6.一种抑制非编码RNA TDRKH-AS1表达的shRNA和氟维司群在制备治疗乳腺癌药物中的用途，其特征在于：所述shRNA的编码序列选自1)、2)、3)中的一种：
1) SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
2) SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
3) SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
7.一种药物组合物，包括氟维司群，其特征在于：还包括权利要求1所述的shRNA或权利要求2所述的构建物，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
CN202210537258.XA 2022-05-18 2022-05-18 一种非编码rna tdrkh-as1作为标志物和治疗靶点的用途 Active CN114652736B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210537258.XA CN114652736B (zh) 2022-05-18 2022-05-18 一种非编码rna tdrkh-as1作为标志物和治疗靶点的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210537258.XA CN114652736B (zh) 2022-05-18 2022-05-18 一种非编码rna tdrkh-as1作为标志物和治疗靶点的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114652736A CN114652736A (zh) 2022-06-24
CN114652736B true CN114652736B (zh) 2022-08-30

Family

ID=82037939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210537258.XA Active CN114652736B (zh) 2022-05-18 2022-05-18 一种非编码rna tdrkh-as1作为标志物和治疗靶点的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114652736B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11866707B2 (en) 2022-05-18 2024-01-09 Zhejiang Cancer Hospital Use of non-coding RNA SNHG17 as biomarker and therapeutic target

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201534A (zh) * 2020-05-29 2021-08-03 中山大学孙逸仙纪念医院 一种长非编码rna bdnf-as及其作为标志物和治疗靶点的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201132813A (en) * 2010-03-03 2011-10-01 Koo Foundation Sun Yat Sen Cancer Ct Methods for classifying and treating breast cancers
CN109562549B (zh) * 2016-08-01 2021-07-09 豪倍公司 用于形成模制部件的模具和方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201534A (zh) * 2020-05-29 2021-08-03 中山大学孙逸仙纪念医院 一种长非编码rna bdnf-as及其作为标志物和治疗靶点的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114652736A (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114652736B (zh) 一种非编码rna tdrkh-as1作为标志物和治疗靶点的用途
WO2019206341A1 (zh) 一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用
CN115029351A (zh) 一种shRNA或BACH1缺失巨噬细胞来源的EVs在制备治疗高血压的药物中的应用
CN110511903A (zh) 一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用
CN114432452A (zh) RNA Hsa_circ_0063865抑制剂在制备抗食管鳞状细胞癌药物中的应用
CN108034655B (zh) 一种长非编码rna及其组合物在诊断/治疗结直肠癌中的应用
CN107312855B (zh) 一种与喉鳞癌相关的基因及其应用
CN107164554B (zh) Asprv1作为生物标志物在喉鳞癌诊疗中的应用
CN109666674B (zh) circCDYL2及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂
CN116059237B (zh) 信号通路在chd药物开发中的应用
CN110129319B (zh) 一种PRALR的siRNA及其用途
CN114652737B (zh) 一种非编码rna snhg17作为标志物和治疗靶点的用途
CN110951880B (zh) 检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的应用
CN111172161B (zh) 一种长非编码rna及其在诊断/治疗子痫前期中的应用
US11866707B2 (en) Use of non-coding RNA SNHG17 as biomarker and therapeutic target
CN107893119B (zh) Zcchc12在骨肉瘤中的应用
CN114134145A (zh) Hoxc10在胃癌发病机制中的作用
CN105695617A (zh) 乳头状癌的肿瘤标志物及其应用
CN111206034B (zh) 猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用
CN111499694B (zh) 一种乳腺癌干细胞特异性透膜肽及其在制备干扰hTERT基因的组合物中的用途
CN111333701B (zh) 一种宫颈癌干细胞特异性透膜肽及其在制备干扰IKCa1基因的组合物中的用途
CN110522912B (zh) Mlec基因抑制剂及其应用
CN114081952B (zh) 初级纤毛生成相关标志物及其应用
CN111876484B (zh) 敲低lncBCAS1-4_1细胞株在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111455081B (zh) lncRNA147410.3在弓形虫脑病中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant