CN114636683A - 确定染色液成分配比的方法 - Google Patents

Abstract

本说明书实施例提供了一种确定染色液成分配比的方法。所述染色液包括第一染色试剂和第二染色试剂，所述方法包括：基于一组或多组目标荧光图像，确定所述第一染色试剂在所述染色液中的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂在所述染色液中的一个或多个目标浓度，其中所述一组或多组目标荧光图像是使用一种或多种混合染色液对一个或多个死细胞样品分别染色后采集的，所述一种或多种混合染色液是用所述第一染色试剂和所述第二染色试剂按照一个或多个候选浓度组合配制而成的。

Description

确定染色液成分配比的方法

分案说明

本申请是针对申请日为2021年7月28日、申请号为CN202110859856.4、发明名称为“一种确定荧光通道曝光时间的方法”的中国申请提出的分案申请。

技术领域

本说明书涉及生化检测领域，特别涉及一种染色液、细胞特征参数检测方法、确定染色液中染色试剂的配比的方法以及确定荧光成像过程中曝光时间的方法。

背景技术

在生化检测领域，常常需要对细胞的数量、细胞活率等参数进行检测。对于细胞活率检测，传统的方法是台盼蓝染色，但是台盼蓝方法在检测冻存的和解冻的细胞的活率方面效果欠佳。吖啶橙(Acridine Orange，AO)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)为近年来广泛用于细胞染色的荧光染料。用AO和PI同时对细胞样品进行染色后，可以利用AO通道和PI通道，分别采用适合AO的激发光和适合PI的激发光照射细胞样品，并采集相应的荧光图像，用于分析活细胞数目、死细胞数目等参数。因此，需要提供AO/PI染色液的成分配比优化方法、曝光时间优化方法以及检测效果更好的AO/PI染色液。

发明内容

本说明书实施例之一提供一种用于细胞染色的染色液。所述细胞染色的染色液包括：吖啶橙和碘化丙啶，其中所述吖啶橙和所述碘化丙啶的质量浓度的比值在0.375:1000-50:1000范围之内，并且所述染色液的pH值在7.0-8.0范围之内。

本说明书实施例之一提供一种染色液的配制方法，所述方法包括：获取吖啶橙溶液；获取碘化丙啶溶液；配制缓冲液；以及将所述吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液与缓冲液混合均匀，得到所述染色液。

本说明书实施例之一提供一种检测细胞样品的特征参数的方法，所述方法包括：使用前述染色液对细胞样品进行染色；通过荧光显微成像，获取染色后的细胞样品的吖啶橙通道荧光图像和碘化丙啶通道荧光图像；基于所述吖啶橙通道荧光图像和所述碘化丙啶通道荧光图像，确定所述细胞样品的特征参数，所述特征参数包括以下参数中的一项或多项：总细胞个数、活细胞个数、死细胞个数、总细胞浓度、活细胞浓度、死细胞浓度以及细胞活率。

本说明书实施例之一提供一种确定荧光通道曝光时间的方法。该方法可以用于多荧光通道的荧光成像设备。所述方法可以包括：基于一个或多个第一目标荧光图像和一个或多个第二目标荧光图像，确定第一通道的一个或多个第一目标曝光时间和第二通道的一个或多个第二目标曝光时间。在一些实施例中，所述一个或多个第一目标荧光图像是以混合染色样本为基础，使用第一通道在一个或多个第一候选曝光时间下采集的。在一些实施例中，所述一个或多个第二目标荧光图像是以所述混合染色样本为基础，使用第二通道在一个或多个第二候选曝光时间下采集的。在一些实施例中，所述混合染色样本是使用含有第一染色试剂和第二染色试剂的混合染色液进行染色的死细胞样品。在一些实施例中，所述第一候选曝光时间和第二候选曝光时间是由以下步骤确定的：基于使用含有所述第一染色试剂的第一染色液进行染色的活细胞样品，确定对应于所述第一染色试剂的所述第一通道的一个或多个第一有效显色曝光时间；基于使用含有所述第二染色试剂的第二染色液进行染色的死细胞样品，确定对应于所述第二染色试剂的所述第二通道的一个或多个第二有效显色曝光时间；确定所述第二通道对应的一个或多个有效去噪曝光时间；以及基于所述一个或多个第一有效显色曝光时间、所述一个或多个第二有效显色曝光时间和所述一个或多个去噪曝光时间，确定所述第一通道的所述一个或多个第一候选曝光时间和所述第二通道的所述一个或多个第二候选曝光时间。

本说明书实施例之一提供一种确定染色液成分配比及匹配的荧光通道曝光时间的方法，其特征在于，所述染色液包括第一染色试剂和第二染色试剂，所述方法包括：基于一组或多组目标荧光图像，确定所述第一染色试剂对应的一个或多个目标浓度、所述第二染色试剂对应的一个或多个目标浓度、所述第一通道对应的一个或多个第一目标曝光时间和所述第二通道对应的一个或多个第二目标曝光时间。在一些实施例中，所述一组或多组目标荧光图像是使用一种或多种混合染色液对一个或多个死细胞样品分别染色后采集的。在一些实施例中，所述一种或多种混合染色液是用所述第一染色试剂和所述第二染色试剂按照所述一个或多个候选浓度曝光时间组合配制而成的。在一些实施例中，所述候选浓度曝光时间组合是由以下步骤确定的：确定所述第一染色试剂的用于活细胞显色的一个或多个第一有效显色浓度及匹配的一个或多个第一有效显色曝光时间，所述一个或多个第一有效显色曝光时间对应于所述第一染色试剂关联的第一通道；确定所述第二染色试剂的用于死细胞显色的一个或多个第二有效显色浓度及匹配的一个或多个第二有效显色曝光时间，所述一个或多个第二有效显色曝光时间对应于所述第二染色试剂关联的第二通道；基于使用含有所述第一染色试剂的第一染色液进行染色的一个或多个死细胞样品，确定第一染色试剂的一个或多个有效去噪浓度及匹配的对应于所述第二通道的一个或多个有效去噪曝光时间；基于所述一个或多个第一有效显色浓度、所述一个或多个第一有效显色曝光时间、所述一个或多个第二有效显色浓度、所述一个或多个第二有效显色曝光时间、所述一个或多个有效去噪浓度和所述一个或多个有效去噪曝光时间，确定满足预设条件的一个或多个候选浓度曝光时间组合。

附图说明

本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构，其中：

图1为根据本说明书一些实施例所示的细胞样品检测系统100的应用场景示意图；

图2是根据本说明书一些实施例所示的处理设备的模块图；

图3是根据本说明书一些实施例所示的确定第一染色试剂和第二染色试剂目标浓度的实验流程图；

图4是根据本说明书一些实施例所示的确定第一通道的第一目标曝光时间和第二通道的第二目标曝光时间的实验流程图；

图5是根据本说明书一些实施例所示的确定第一染色试剂的目标浓度、第二染色试剂的目标浓度、第一通道的第一目标曝光时间和第二通道的第二目标曝光时间的实验流程图；

图6是根据本说明书一些实施例所示的对照染色液在不同条件下测试的细胞活率曲线图；

图7是根据本说明书一些实施例所示的对照染色液在不同重悬条件下的荧光图像；

图8是根据本说明书一些实施例所示的测试染色液在不同条件下测试的细胞活率曲线图；

图9是根据本说明书一些实施例所示的测试染色液在不同重悬条件下的荧光图像；

图10是根据本说明书一些实施例所示的使用含4.0μg/mL染色试剂AO和800μg/mL染色试剂PI的混合染色液进行染色的死细胞样品分别在AO通道和PI通道采集的荧光图像。

具体实施方式

为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。

应当理解，本文使用的“系统”、“装置”、“单元”和/或“模块”是用于区分不同级别的不同组件、元件、部件、部分或装配的一种方法。然而，如果其他词语可实现相同的目的，则可通过其他表达来替换所述词语。

如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。

本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。

AO/PI双荧光法为检测细胞活率的常见方法。吖啶橙(Acridine Orange，AO)为一种荧光染料，该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm(DNA)，640nm(RNA)。在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光。而在凋亡细胞中，吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种DNA结合性染料，其最大激发波长和最大发射波长分别为488nm和630nm，产生红色荧光，但无膜通透性。因此，在荧光显微镜下观察，活细胞不能着色，早期凋亡细胞呈微弱红光，晚期凋亡细胞红光加强，坏死细胞呈强红色荧光。在AO/PI双荧光法检测细胞活率时，AO/PI混合染色液的成分配比及这两种染料的浓度等因素都会影响检测结果的准确率。此外，其他检测参数如荧光通道曝光时间的选择也会影响成像效果。

本说明书实施例之一提供了一种细胞样品检测系统。该细胞样品检测系统可以对采用AO/PI双荧光法等方法染色后的细胞样品进行分析，获取活细胞数量、死细胞数量、细胞活率等参数。

图1为根据本说明书一些实施例所示的细胞样品检测系统100的应用场景示意图。如图1所示，细胞样品检测系统100可以包括目标细胞样品110、荧光成像设备120、处理设备130、网络140、存储设备150。在一些实施例中，存储设备150可以存储目标细胞样品(例如，目标细胞样品110)的基础信息、荧光图像、曝光时间等数据，还可以存储目标细胞样品110的特征参数，例如目标细胞的细胞活率、总细胞密度、死细胞密度、活细胞密度等。存储设备150还可以存储一项或多项参考阈值等数据。在一些实施例中，目标细胞样品110可以保存在专门的储藏设备中以备进一步处理，例如进行染色等。在一些实施例中，目标细胞样品110可以是来源于人或动物的细胞。具体的，目标细胞样品110可以是仓鼠细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞。荧光成像设备120可以用于对目标细胞样品110进行检测。处理设备130可以用于对相关信息进行处理、分析以生成检测结果。在一些实施例中，处理设备130、网络140、存储设备150中的一种或多种也可以集成在荧光成像设备120中。

在一些实施例中，目标细胞样品110可以是来源于动物的细胞。动物包括但不限于灵长类动物或非灵长类动物。在一些实施例中，目标细胞样品110可以包括一种或多种癌细胞、免疫细胞、干细胞、上皮细胞、神经细胞、生殖细胞等。在一些实施例中，目标细胞样品110可以是植物细胞、真菌细胞、细菌、病毒等。

在一些实施例中，荧光成像设备120可以是用于细胞样品检测的具有荧光通道成像功能的设备。例如，荧光成像设备120可以是透射式荧光显微镜、反射式荧光显微镜。荧光成像设备120可以包括光源、滤光片、图像采集装置等组件。在一些实施例中，荧光成像设备120可以包括一个或多个通道，其中每个通道可以包括对应于一种荧光染色试剂的滤光片。在一些实施例中，所述滤光片可以包括激发滤光片和吸收滤光片。激发滤光片可以将光源发出的光过滤得到特定波长范围的激发光(又称为入射光)，而激发光可以用于照射染色后的细胞样品，使其中的荧光染色试剂受到激发而发出特定波长范围的发射光。吸收滤光片可以用于过滤照射过细胞样品后的光，从而阻挡激发光的通过。在一些实施例中，荧光成像设备120图像采集装置可以用于采集发射光并成像。在一些实施例中，荧光成像设备120可以包括一个或多个图像采集装置。例如，在使用AO/PI染色法时，可以分别通过对应于AO的通道和对应于PI的通道，使用两个图像采集装置获取不同图像。或者，也可以采用同一个图像采集装置，先后通过对应于AO的通道和对应于PI的通道获取不同图像。在一些实施例中，图像采集装置可以包括彩色相机、黑白相机。在一些实施例中，荧光成像设备120可以将获取到的荧光图像发送至处理设备130分析。在一些实施例中，处理设备130可以集成在荧光成像设备120中。

在一些实施例中，处理设备130可以包括一个或多个处理器。处理器可以处理由荧光成像设备120、存储设备150等设备获得的数据和/或信息。例如，处理设备130可以对荧光图像进行分析，从而确定细胞样品的检测结果。再例如，处理设备130可以根据对细胞样品的检测结果，判断检测过程中的参数(例如染色液成分配比、荧光通道曝光时间等参数)是否合适。需要说明的是，染色液成分配比是指染色液中各染色试剂的浓度比例和/或染色试剂的具体浓度等参数。在一些实施例中，所述处理设备130可以包括单个的处理器或者一个处理器群组。该处理器群可以是集中式的或分布式的(例如，荧光成像设备120可以是一个分布式的系统)。在一些实施例中，处理设备130可以是本地的或远程的。在一些实施例中，处理设备130可以通过网络140从存储设备150处获取信息和/或数据。在一些实施例中，处理器可以在一个云平台上实现。仅仅举个例子，该云平台可以包括私有云、公共云、混合云、社区云、分布云、云之间、多重云等或上述举例的任意组合。处理设备130可包含中央处理器(CPU)、专用集成电路(ASIC)、专用指令处理器(ASIP)、图形处理器(GPU)、物理处理器(PPU)、数字信号处理器(DSP)、现场可编程门阵列(FPGA)、可编辑逻辑电路(PLD)、控制器、微控制器单元、精简指令集电脑(RISC)、微处理器等或以上任意组合。

网络140可以提供信息交换的渠道。在一些实施例中，荧光成像设备120和存储设备150之间可以通过网络140交换信息。例如，荧光成像设备120可以通过网络140接收存储设备150中的数据。在一些实施例中，目标细胞样品110的相关信息可以通过网络140传输给荧光成像设备120和/存储设备150。例如，荧光成像设备120可以将基于目标细胞样品110获取的荧光图像通过网络140发送至荧光成像设备120和/或存储设备150。在一些实施例中，网络140可以是任意类型的有线或无线网络。例如，网络140可包括一缆线网络、有线网络、光纤网络、电信网络、内部网络、网际网络、区域网络(LAN)、广域网络(WAN)、无线区域网络(WLAN)、都会区域网络(MAN)、公共电话交换网络(PSTN)、蓝牙网络、ZigBee网络、近场通讯(NFC)网络等或以上任意组合。

存储设备150可以用于存储数据和/或指令集。在一些实施例中，存储设备150可以存储从处理设备130获得的数据，例如对目标细胞样品110的分析结果，如细胞活率等。在一些实施例中，存储设备150可存储供处理设备130执行或使用的信息和/或指令，以执行本说明书中描述的示例性方法。在一些实施例中，存储设备150中可以存储曝光时间数据。在一些实施例中，存储设备150可以包括大容量存储器、可移动存储器、易失性读写存储器、只读存储器(ROM)等或其任意组合。在一些实施例中，存储设备150可以在云平台上实现。仅作为示例，云平台可以包括私有云、公共云、混合云、社区云、分布式云、中间云、多云等或其任意组合。在一些实施例中，存储设备150可以是处理设备130的一部分。

在一些实施例中，细胞样品检测系统100还可以包括一个终端设备(未示出)。终端设备可以包括输入设备(如键盘、鼠标)和/或输出设备(如显示屏、扬声器)。用户可以通过终端设备与处理设备130、荧光成像设备120等设备进行互动。例如，用户可以通过终端设备查看荧光成像设备120获取的关于目标细胞样品110的荧光图像。再例如，用户可以观察图像，判断该荧光图像是否符合检测要求并将判断结果输入到终端设备中，终端设备再将用户的判断结果传输给处理设备130。

所述细胞样品检测系统的至少部分功能可以由计算设备200实现。图2是根据本说明书一些实施例所示的计算设备200的模块图。如图2所示，该细胞样品检测系统可以包括获取模块210、荧光图像处理模块220、数据分析模块230。在一些实施例中，处理设备130可以在计算设备200上实现。例如，处理设备130可以获取目标细胞样品110的荧光图像。又例如，处理设备130可以基于目标细胞样品110的荧光图像，确定检测过程中的参数(如荧光通道曝光时间、染色液成分配比等)是否符合要求。再例如，处理设备130可以对获取到的荧光图像进行分析，从而确定细胞样品的一些特征参数，如活细胞个数、死细胞个数等。

获取模块210可以用于从其他组件获取数据。在一些实施例中，获取模块210可以获取用户输入的指令或数据。例如，获取模块210可从终端设备获取用户输入，并基于用户输入，确定一个或多个用于确定染色液成分配比过程中的参数，如第一有效显色浓度、第一候选有效曝光时间、第二有效显色浓度、第二候选有效曝光时间等。在一些实施例中，获取模块210可以用于从荧光成像设备120获取荧光图像，如流程300-500中描述的第一荧光图像、第二荧光图像、第三荧光图像、目标荧光图像等。

荧光图像处理模块220可以用于对获取模块210所获取的荧光图像的基本特征进行分析。在一些实施例中，荧光图像处理模块220可以用于确定一个或多个荧光图像中每个荧光图像的平均荧光强度。在一些实施例中，荧光图像处理模块220可以将获取到的每个荧光图像的平均荧光强度发送至数据分析模块230。例如，荧光图像处理模块220可以确定第一荧光图像、第二荧光图像、第三荧光图像、目标荧光图像等的平均荧光强度。

数据分析模块230可以用于对前述获取到的数据进行分析。在一些实施例中，数据分析模块230可以用于确定染色液成分配比和荧光通道曝光参数的方法。例如，数据分析模块230可以确定第一图像的平均荧光强度是否处于预设范围内；响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第一荧光图像的第一候选有效浓度为一个所述第一有效显色浓度。再例如，数据分析模块230可以确定第二荧光图像的平均荧光强度是否处于预设范围内；以及响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第二荧光图像的第二候选有效浓度为一个所述第二有效显色浓度。在一些实施例中，数据分析模块230可以对于所述一组或多组目标荧光图像中的每组目标荧光图像，获取所述第一目标荧光图像的第一平均荧光强度以及所述第二目标荧光图像的第二平均荧光强度；确定所述第一平均荧光强度是否在第一预设范围内；确定所述第二平均荧光强度是否在第二预设范围内。响应于确定所述第一平均荧光强度在所述第一预设范围内且所述第二平均荧光强度在所述第二预设范围内，数据分析模块230可以确定所述第一目标荧光图像和所述第二目标荧光图像对应的候选浓度组合作为目标浓度组合。数据分析模块230还可以基于一个或多个所述目标浓度组合，确定所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂的一个或多个目标浓度。

在一些实施例中，在检测细胞活率的方法中，数据分析模块230可以根据荧光图像处理模块220所确定的AO通道荧光图像和PI通道荧光图像平均荧光强度，分析目标细胞样品的一个或多个特征参数。AO通道荧光图像是指荧光成像设备120在AO通道下得到的荧光图像。在一些实施例中，基于AO荧光图像识别的细胞个数统计为活细胞个数。PI荧光图像是指在荧光成像设备120在PI通道下得到的荧光图像。在一些实施例中，基于PI荧光图像识别的细胞个数统计为死细胞个数。在一些实施例中，基于AO荧光图像识别的细胞个数与基于PI荧光图像识别的细胞个数之和为总细胞个数。在一些实施例中，可以基于总细胞个数和样本体积确定总细胞浓度。在一些实施例中，可以基于活细胞个数和样本体积确定活细胞浓度。在一些实施例中，可以基于死细胞个数和样本体积确定死细胞浓度。在一些实施例中，可以将活细胞个数和总细胞个数之比确定为细胞活率。

在一些实施例中，在检测目标细胞样本的特征参数(如细胞活率等)的过程中，若数据分析模块230确定基于第一通道或第二通道所获取的荧光图像的平均荧光强度不在对应于第一通道或第二通道的平均荧光强度预设范围内，则数据分析模块230可以确定该荧光图像不满足要求，需要调整检测过程中的参数，例如第一通道或第二通道的曝光时间、染色液中第一染色试剂或第二染色试剂的浓度或浓度比例等。

需要注意的是，以上对于细胞样品检测系统及其模块的描述，仅为描述方便，并不能把本说明书限制在所举实施例范围之内。可以理解，对于本领域的技术人员来说，在了解该系统的原理后，可能在不背离这一原理的情况下，对各个模块进行任意组合，或者构成子系统与其他模块连接。例如，在一些实施例中，获取模块210、荧光图像处理模块220和数据分析模块230可以是一个系统中的不同模块，也可以是一个模块实现上述的两个或两个以上模块的功能。例如，获取模块210和荧光图像处理模块220也可以是一个模块，该模块可以同时具有获取检测数据和确定该细胞样品中荧光图像的曝光时间的功能。又例如，各个模块可以共用一个存储模块，各个模块也可以分别具有各自的存储模块。诸如此类的变形，均在本说明书的保护范围之内。

本说明书实施例之一提供了一种确定染色液成分配比的方法。

在一些实施例中，所述染色液包括第一染色试剂和第二染色试剂，所述确定染色液成分配比的方法可以包括：基于一组或多组目标荧光图像，确定所述第一染色试剂在所述染色液中的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂在所述染色液中的一个或多个目标浓度，其中：所述一组或多组目标荧光图像是使用一种或多种混合染色液对一个或多个死细胞样品分别染色后采集的，所述一种或多种混合染色液是用所述第一染色试剂和所述第二染色试剂按照一个或多个候选浓度组合配制而成的，并且所述候选浓度组合是由以下步骤确定的：确定所述第一染色试剂的用于活细胞显色的一个或多个第一有效显色浓度；确定所述第二染色试剂的用于死细胞显色的一个或多个第二有效显色浓度；确定所述第一染色试剂的一个或多个有效去噪浓度；以及基于所述一个或多个第一有效显色浓度、所述一个或多个第二有效显色浓度和所述一个或多个有效去噪浓度，确定所述第一染色试剂和所述第二染色试剂的满足预设条件的一个或多个候选浓度组合。

在一些实施例中，所述确定所述第一染色试剂的用于活细胞显色的一个或多个第一有效显色浓度可以包括：基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效浓度中确定所述一个或多个第一有效显色浓度，其中，所述一个或多个第一荧光图像，是以使用一种或多种第一染色液对一个或多个活细胞样品染色后通过对应于所述第一染色试剂的第一通道采集的，所述一种或多种第一染色液是用所述第一染色试剂按照所述一个或多个第一候选有效浓度配制而成的。

在一些实施例中，所述基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效浓度中确定所述一个或多个第一有效显色浓度可以包括：对于所述一个或多个第一荧光图像中每个第一荧光图像，确定所述第一荧光图像的平均荧光强度；确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第一荧光图像的第一候选有效浓度为一个所述第一有效显色浓度。

在一些实施例中，所述确定第二染色试剂的用于死细胞显色的一个或多个第二有效显色浓度可以包括：基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效浓度中确定所述一个或多个第二有效显色浓度，其中，所述一个或多个第二荧光图像，是以使用一种或多种第二染色液对一个或多个活细胞样品染色后通过对应于所述第二染色试剂的第二通道采集的，所述一种或多种第二染色液是用所述第二染色试剂按照所述一个或多个第二候选有效浓度配制而成的。

在一些实施例中，所述基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效浓度中确定所述一个或多个第二有效显色浓度可以包括：对于所述一个或多个第二荧光图像中每个第二荧光图像，确定所述第二荧光图像的平均荧光强度；确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；以及响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第二荧光图像的第二候选有效浓度为一个所述第二有效显色浓度。

在一些实施例中，所述确定所述第一染色试剂和所述第二染色试剂的满足预设条件的一个或多个候选浓度组合可以包括：基于所述一个或多个第一有效显色浓度与所述一个或多个有效去噪浓度的交集，确定所述第一染色试剂的一个或多个候选有效浓度；以及基于所述第一染色试剂的一个或多个候选有效浓度和所述第二染色试剂的一个或多个第二有效显色浓度，确定所述一个或多个候选浓度组合。

在一些实施例中，所述一组或多组目标荧光图像中的每组目标荧光图像可以包括：第一目标荧光图像和第二目标荧光图像，其中所述第一目标荧光图像是通过对应于第一染色试剂的第一通道采集的，所述第二目标荧光图像是通过对应于第二染色试剂的第二通道采集的。

在一些实施例中，所述基于一组或多组目标荧光图像，确定所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂的一个或多个目标浓度可以包括：对于所述一组或多组目标荧光图像中的每组目标荧光图像，获取所述第一目标荧光图像的第一平均荧光强度以及所述第二目标荧光图像的第二平均荧光强度；确定所述第一平均荧光强度是否在第一预设范围内；确定所述第二平均荧光强度是否在第二预设范围内；响应于确定所述第一平均荧光强度在所述第一预设范围内且所述第二平均荧光强度在所述第二预设范围内，确定所述第一目标荧光图像和所述第二目标荧光图像对应的候选浓度组合作为目标浓度组合；基于一个或多个所述目标浓度组合，确定所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂的一个或多个目标浓度。

在一些实施例中，当所述第一染色试剂的荧光基团与所述第二染色试剂的荧光基团之间的距离小于距离阈值时，可以存在荧光共振能量转移效应。

在一些实施例中，可以基于所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂的一个或多个目标浓度，确定所述第一染色试剂和所述第二染色试剂的用于制作混合染色液的一个或多个目标混合浓度比例。

在一些实施例中，所述第一染色试剂可以为吖啶橙，所述第二染色试剂可以为碘化丙啶。

在一些实施例中，所述确定染色液成分配比的方法可以通过图1的细胞样品检测系统来实现。图3是根据本说明书一些实施例所示的确定染色液成分配比的示例性流程图。流程300的至少一部分步骤可以被实现为存储在存储设备150中的一个指令(例如应用程序)。图1中的处理设备130可以执行该指令，并且在执行指令时，处理设备130可以被配制为执行流程300。例如，流程300中的一个或多个步骤可以由荧光图像处理模块220和数据分析模块230执行。在一些实施例中，处理设备130也可以部分或全部集成在荧光成像设备120中。

在一些实施例中，确定染色液成分配比的方法可包括流程300的步骤310至步骤350。

在步骤310中，可确定第一染色试剂的用于活细胞显色的一个或多个第一有效显色浓度。

第一染色试剂是指用于至少使细胞样品中的活细胞染色的试剂。在一些实施例中，第一染色试剂可以是荧光试剂。

第一有效显色浓度是指能够使经含有第一染色试剂的第一染色液染色的活细胞样品在荧光成像设备(如荧光成像设备120)的第一通道下有效显色的第一染色试剂浓度。在一些实施例中，一个或多个第一有效显色浓度可以包括一个或多个具体值，也可以指第一有效显色浓度的取值范围。需要说明的是，第一通道为荧光成像设备的可匹配第一染色试剂的荧光通道(例如AO通道)，通过该荧光通道可采集第一染色试剂发出的荧光。第一染色液含有第一染色试剂，但不含第二染色试剂。仅作为示例，第一染色液可由第一染色试剂和磷酸盐(PBS)缓冲液配制而成。如本文中所使用的，活细胞样品是指细胞活率大于40％的细胞样品。活细胞样品中至少部分细胞为活细胞，活细胞样品还可包含死细胞和/或凋亡细胞。例如，活细胞样品可为细胞活率约90％、80％、70％、60％、50％或40％的细胞样品。

在一些实施例中，处理设备130可以对一个或多个第一荧光图像进行分析，从而从一个或多个第一候选有效浓度中确定一个或多个第一有效显色浓度。可以使用第一染色试剂按照一个或多个第一候选有效浓度配制第一染色液，并使用第一染色液对活细胞样品进行染色。荧光成像设备可以使用第一通道采集染色后的活细胞样品的一个或多个第一荧光图像并发送给处理设备130。

在一些实施例中，处理设备130可以分析每个第一荧光图像的平均荧光强度是否满足要求，从而从一个或多个第一候选有效浓度中确定一个或多个第一有效显色浓度。若第一荧光图像的平均荧光强度在预设范围内，则该第一荧光图像对应的第一候选有效浓度可以被指定为一个第一有效显色浓度。如本文所使用的，在没有特殊说明时，一个图像的平均荧光强度是指该图像上所有像素点的平均荧光强度。

在一些实施例中，预设范围可以是对应第一通道的机器线性范围(又称为第一线性范围)。在一些实施例中，预设范围可以窄于第一线性范围，例如在第一线性范围的中间值附近的一个更窄范围。当荧光图像的平均荧光强度在所述预设范围之内时，可以认为该荧光图像的明亮度适中，适合用于后续分析。需要说明的是，不同荧光成像设备的第一线性范围可能存在一定差异。在一些实施例中，预设范围的数据可以存储在存储设备150中，处理设备130可从存储设备150调取预设范围的数据，通过对比确定第一荧光图像的平均荧光强度是否处于预设范围内。例如，对应于第一通道的第一线性范围可以是1500-15000au。相应地，对应于第一通道的预设范围可以是1500-15000au，也可以是第一线性范围中间值附近的6000au-9000au。在一些实施例中，若平均荧光强度高于预设范围的最高值，则为过曝；若平均荧光强度低于预设范围的最小值，则图像不够明亮，荧光信号低。这两种情况下，荧光图像的成像质量都过低，不适合用于后续对细胞样品的各种参数(例如细胞活率)进行分析。在一些实施例中，还可以基于荧光图像的各像素荧光强度信息及荧光强度的分布情况来判断该荧光图像是否出现过曝。例如，处理设备130可以对荧光图像的各像素荧光强度信息及荧光强度的分布情况进行统计，生成该荧光图像的直方图。直方图中，若荧光强度在参考荧光强度范围内的像素的数目大于预先设定的阈值(例如可以是具体数字，也可以是百分比)，则处理器130可以判定图像出现过曝。此处的参考荧光强度范围和阈值可以是细胞样品检测系统100中的默认值，也可以由用户进行设定和/或调整。例如，若对应于第一通道的预设范围是1500-15000au，参考荧光强度范围可以是13000-15000au。又例如，阈值可以设为2％、3％等。在一些实施例中，处理设备130还可以确定荧光图像的局部(例如9x9像素)的平均荧光强度。若局部的平均荧光强度超出预设范围的最大值，说明该荧光图像发生了局部过曝，则该荧光图像的成像质量也不满足要求。

在一些实施例中，处理设备130可以基于用户输入来从一个或多个第一候选有效浓度中确定一个或多个第一有效显色浓度。终端设备可以显示至少两个第一标准荧光图像，并且用户可以通过终端设备观察及对比第一荧光图像与所述至少两个第一标准荧光图像，以判断第一荧光图像是否符合荧光信号清晰明亮的特征，以及判断第一荧光图像是否符合图像正确曝光的特征。需要说明的是，第一标准荧光图像是由第一通道采集的标准图像，具有荧光信号清晰明亮、图像正确曝光的特征。荧光信号清晰明亮是指荧光图像的荧光信号具有明确、清晰的边缘轮廓，信号强度处于机器或人眼可识别范围内。图像正确曝光是指荧光图像高光区荧光信号可明显区别于背景，且背景无噪点。

在一些实施例中，所述至少两个第一标准荧光图像可包括第一强荧光信号标准图像和第一弱荧光信号标准图像。第一强荧光信号标准图像的平均荧光强度可为人工或机器可识别范围的最高值(例如，对应第一通道的预设范围的最高值)。第一弱荧光信号标准图像的平均荧光强度可为人工或机器可识别范围的最低值(例如，对应第一通道的预设范围的最低值)。具体的，荧光信号清晰明亮的第一荧光图像的荧光强度应不高于第一强荧光信号标准图像，且不低于第一弱荧光信号标准图像。

具体的，若与所述至少两个第一标准荧光图像相比，第一荧光图像符合荧光信号清晰明亮的特征以及图像正确曝光的特征，则用户可判断该第一荧光图像对应的第一候选有效浓度可以作为第一有效显色浓度，并将判断结果输入至终端设备。处理设备130可从终端设备获取用户输入，并基于用户输入，从一个或多个第一候选有效浓度中确定一个或多个第一有效显色浓度。

在一些实施例中，处理设备130可基于用户输入，随机生成一个或多个第一候选有效浓度。例如，用户可通过终端设备输入第一候选有效浓度的数值范围、指定生成第一候选有效浓度的个数以及多个第一候选有效浓度的数量关系(如等比、等差、无规律等)，处理设备130根据用户输入的数值范围、个数及数量关系随机生成一组第一候选有效浓度。在一些实施例中，用户可输入一个或多个浓度数值，处理设备130可以将用户输入的一个或多个浓度数值确定为一个或多个第一候选有效浓度。

在步骤320中，可确定所述第二染色试剂的用于死细胞显色的一个或多个第二有效显色浓度。

第二染色试剂是指主要用于使细胞样品中的死细胞染色的试剂。在一些实施例中，第二染色试剂可以是荧光试剂。

第一染色试剂和第二染色试剂可配合使用，并对细胞样品进行混合染色。在一些实施例中，当第二染色试剂的荧光基团与第一染色试剂的荧光基团之间的距离小于距离阈值(例如

)时，两者之间存在荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energytransfer,FRET)效应。在一些实施例中，第一染色试剂为吖啶橙(AO)，第二染色试剂为碘化丙啶(PI)。二者均能穿透死细胞的破损细胞膜，因此在死细胞中，第一染色试剂和第二染色试剂有可能存在荧光共振能量转移效应。当采用AO的激发光照射死细胞时，由于荧光共振能量转移效应的存在，可能检测到对应于PI的发射光。

第二有效显色浓度是指能够使经含有第二染色试剂的第二染色液染色的第一死细胞样品在荧光成像设备(如荧光成像设备120)的第二通道下有效显色的第二染色试剂浓度。在一些实施例中，一个或多个第二有效显色浓度可以包括一个或多个具体值，也可以指第二有效显色浓度的取值范围。需要说明的是，第二通道为荧光成像设备的可匹配第二染色试剂的荧光通道(例如PI通道)，通过该荧光通道可采集第二染色试剂发出的荧光。第二染色液含有第二染色试剂，但不含第一染色试剂。仅作为示例，第二染色液可由第二染色试剂和磷酸盐(PBS)缓冲液配制而成。如本文中所使用的，第一死细胞样品是指细胞活率低于30％的细胞样品。第一死细胞样品中至少部分细胞为死细胞(如坏死细胞和凋亡细胞)，第一死细胞样品中还可能含有活细胞。例如，第一死细胞样品可以为细胞活率约0％、10％、20％或30％的细胞样品。

在一些实施例中，处理设备130可以对一个或多个第二荧光图像进行分析，从而从一个或多个第二候选有效浓度中确定一个或多个第二有效显色浓度。可以使用第二染色试剂按照一个或多个第二候选有效浓度配制第一染色液，并使用第二染色液对第一死细胞样品进行染色。荧光成像设备可以使用第二通道采集染色后的第一死细胞样品的一个或多个第二荧光图像并发送给处理设备130。

在一些实施例中，处理设备130可以分析每个第二荧光图像的平均荧光强度是否满足要求，从而从一个或多个第二候选有效浓度中确定一个或多个第二有效显色浓度。若第二荧光图像的平均荧光强度在预设范围内，则该第二荧光图像对应的第一候选有效浓度可以被指定为一个第二有效显色浓度。

在一些实施例中，处理设备130可以基于用户输入来从一个或多个第二候选有效浓度中确定一个或多个第二有效显色浓度。例如，用户可以通过终端设备观察及对比第二荧光图像与至少两个第二标准荧光图像，以判断第二荧光图像是否符合荧光信号清晰明亮的特征，以及判断第二荧光图像是否符合图像正确曝光的特征。需要说明的是，第二标准荧光图像是由第二通道采集的标准图像，具有荧光信号清晰明亮、图像正确曝光的特征。

在一些实施例中，所述至少两个第二标准荧光图像可包括第二强荧光信号标准图像和第二弱荧光信号标准图像。第二强荧光信号标准图像的平均荧光强度可为人工或机器可识别范围的最高值(例如，对应第二通道的预设范围的最高值)。第二弱荧光信号标准图像的平均荧光强度可为人工或机器可识别范围的最低值(例如，对应第二通道的预设范围的最低值)。具体的，荧光信号清晰明亮的第二荧光图像的荧光强度应低于第二强荧光信号标准图像，且高于第二弱荧光信号标准图像。

在一些实施例中，步骤320可以采取与步骤310确定第一有效显色浓度类似的方式来确定第二有效显色浓度，在此不再赘述。

在步骤330中，可确定第一染色试剂的一个或多个有效去噪浓度。

有效去噪浓度是指能够使经第一染色液染色的第一死细胞样品在荧光成像设备的第二通道下采集的荧光图像(又称为第三荧光图像)的平均荧光强度低于阈值的第一染色试剂浓度。该阈值可以小于对应于第二通道的机器线性范围的最低值。例如，该阈值可以是1000au、500au等。在一些实施例中，一个或多个有效去噪浓度可以包括一个或多个具体值，也可以指有效去噪浓度的取值范围。在一些实施例中，第一染色试剂的激发光的波长范围和第二染色试剂的激发光光谱可能存在一定重叠。在一些实施例中，第一染色试剂和第二染色试剂的发射光光谱也可能存在一定重叠。通过步骤330，可以避免通过第二通道采集到过多的第一试剂的发射光的情况，从而使采用第一染色试剂和第二染色试剂同时染色时，对活细胞和死细胞的区分效果更明显，检测结果更加准确。

在一些实施例中，可基于一个或多个第三荧光图像，从一个或多个候选去噪浓度中确定一个或多个有效去噪浓度。在一些实施例中，可以使用第一染色试剂按照一个或多个候选去噪浓度配制成第一染色液，并使用该第一染色液对第一死细胞样品进行染色。在一些实施例中，候选去噪浓度可以在步骤310中确定的一个或多个第一有效显色浓度中选取。在一些实施例中，候选去噪浓度也可以包括用其他方式确定的浓度，例如基于用户输入、按梯度生成等方式。荧光成像设备可以通过第二通道(例如PI通道)采集染色后的一个或多个第一死细胞样品的一个或多个第三荧光图像。处理设备130可以判断第三荧光图像的平均荧光强度是否低于前述阈值。若第三荧光图像的平均荧光强度低于该阈值，则该第三荧光图像对应的候选去噪浓度可以作为一个有效去噪浓度。

在一些实施例中，处理设备130可以基于用户输入来从一个或多个候选去噪浓度中确定一个或多个有效去噪浓度。用户可通过终端设备输入至少一个第三标准荧光图像，并且用户可以通过终端观察并对比第三荧光图像与所述至少一个第三标准荧光图像，以判断第三荧光图像是否符合无荧光信号或低荧光信号的特征。需要说明的是，第三标准荧光图像是由第二通道采集的标准图像，具有无荧光信号的特征。具体的，若第三荧光图像的荧光强度不高于所述至少一个第三标准荧光图像，则可以认为第三荧光图像符合无荧光信号或低荧光信号的特征，通过第二通道采集到的第一试剂的荧光信号较低或没有，并且该第三荧光图像对应的候选去噪浓度可以作为一个有效去噪浓度。

在一些实施例中，确定一个或多个有效去噪浓度的具体方式也可以参考步骤310，在此不再赘述。

在步骤340中，可确定所述第一染色试剂和所述第二染色试剂的满足预设条件的一个或多个候选浓度组合。

在一些实施例中，可基于步骤310确定的一个或多个第一有效显色浓度、步骤320确定的一个或多个第二有效显色浓度和步骤330确定的一个或多个有效去噪浓度，确定第一通道和第二通道的满足预设条件的一个或多个候选浓度组合。

在一些实施例中，可基于第一有效显色浓度和有效去噪浓度的交集，确定第一染色试剂的候选有效浓度。该候选有效浓度可以指一个或多个具体值，也可以指一个取值范围。

在一些实施例中，可基于第一有效显色浓度的取值范围与有效去噪浓度的取值范围的交集确定第一染色试剂的候选有效浓度的取值范围，并在第一染色试剂的候选有效浓度的取值范围内选取第一染色试剂的一个或多个第一候选有效浓度。其中，第一有效显色浓度的取值范围可根据多个第一有效显色浓度确定，其取值范围的端值可分别为多个第一有效显色浓度中的最大值和最小值；有效去噪浓度的取值范围可根据多个有效去噪浓度确定，其取值范围的端值可分别为多个有效去噪浓度中的最大值和最小值。具体的，第一候选有效浓度既处于第一有效显色浓度的取值范围内，也处于有效去噪浓度的取值范围。在一些实施例中，在确定第一试剂的候选有效浓度的取值范围后，可采用不同方式(例如基于用户输入、随机选取、按照梯度选取等方式)在第一染色试剂的第一候选有效浓度的取值范围内选取第一染色试剂的一个或多个候选有效浓度。

在一些实施例中，一个或多个第一有效显色浓度和一个或多个有效去噪浓度均指具体值，则可以直接根据一个或多个第一有效显色浓度和一个或多个有效去噪浓度的交集，确定第一染色试剂的候选有效浓度的一个或多个值。在一些实施例中，可将第一染色试剂的一个或多个候选有效浓度和所述第二染色试剂的一个或多个第二有效显色浓度进行两两组合，确定一个或多个候选浓度组合。例如，一个候选浓度组合中可以包括第一染色试剂的一个候选有效浓度和第二染色试剂的一个第二有效显色浓度。

在步骤350中，可确定第一染色试剂的一个或多个目标浓度和第二染色试剂的一个或多个目标浓度。

在一些实施例中，基于一组或多组目标荧光图像，步骤350可确定步骤340中确定的一个或多个候选浓度组合中的每个候选浓度组合是否为目标浓度组合，其中，一组或多组目标荧光图像中的每组目标荧光图像对应一个候选浓度组合。每组荧光图像可以包括基于同一候选浓度组合染色后的第二死细胞样品的从第一通道采集的一个第一目标荧光图像和从第二通道采集的一个第二目标荧光图像。处理设备130可进一步基于目标浓度组合，确定所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂的一个或多个目标浓度。所述一个或多个目标浓度可以是具体值，也可以是一个取值范围。例如目标浓度组合为(A₁,B₁)、(A₂,B₂)、(A₃,B₃)，则第一染色试剂的目标浓度可以是A₁、A₂、A₃，也可以是A₁–A₃。

具体地，可以使用第一染色试剂和第二染色试剂按照一个或多个候选浓度组合配制成混合染色液，并使用该混合染色液对第二死细胞样品进行染色。对于每一个染色后的死细胞样品，荧光成像设备可以通过对应于第一染色试剂的第一通道采集所述第一目标荧光图像，并通过对应于第二染色试剂的第二通道采集所述第二目标荧光图像。如本文中所使用的，第二死细胞样品是指细胞活率约为零的细胞样品。在一些实施例中，第一染色试剂和第二染色试剂可以同时进入死细胞中，因此可能存在荧光共振能量转移效应。例如，第一染色试剂和第二染色试剂可以分别是AO和PI。AO主要可以使活细胞被染色，但也可以对死细胞染色并被激发出一定强度的荧光。而PI可以使死细胞被染色，不可以使活细胞被染色。在死细胞中，当采用对应于第一染色试剂的激发光照射细胞时，可能会发出第二染色试剂对应的发射光。第一通道的滤光片可以设置为过滤第一染色试剂的激发光以及第二染色试剂对应的发射光。通过这样的方式，在实际应用本方法所得到的染色液成分配比来检测目标细胞样品110时，可以减少或避免采集到死细胞中AO染色试剂被激发出的荧光，从而能够更好地区分活细胞和死细胞，提高检测分析的准确率。因此，在本方法中，AO主要用于使活细胞显色，而PI主要用于使死细胞显色。

在一些实施例中，处理设备130可以对于所述一组或多组目标荧光图像中的每组目标荧光图像，获取所述第一目标荧光图像的第一平均荧光强度以及所述第二目标荧光图像的第二平均荧光强度。处理设备130可以确定所述第一平均荧光强度是否在第一预设范围内，并确定所述第二平均荧光强度是否在第二预设范围内。响应于确定所述第一平均荧光强度在所述第一预设范围内且所述第二平均荧光强度在所述第二预设范围内，处理设备130可以确定所述第一目标荧光图像和所述第二目标荧光图像对应的候选浓度组合作为目标浓度组合。其中，第一预设范围的最大值小于第一通道的机器线性范围的最小值。第二预设范围可以是对应于第二通道的机器线性范围。在一些实施例中，第二预设范围可以窄于第二通道机器线性范围，例如第二通道机器线性范围的中间值附近的一个更窄范围。

在一些实施例中，处理设备130可以基于用户输入来从步骤340中确定的一个或多个候选浓度组合中确定一个或多个目标浓度组合。荧光成像设备可以将一组或多组目标荧光图像发送至终端设备，用户可通过终端设备输入所述至少两个第二标准荧光图像，以及至少一个第四标准荧光图像。用户可以通过终端观察并对比第一目标荧光图像与所述至少一个第四标准荧光图像，以判断第一目标荧光图像是否符合无荧光信号或低荧光信号的特征。并且用户可以通过终端观察并对比第二目标荧光图像与所述至少两个第二标准荧光图像，以判断第一目标荧光图像是否符合荧光信号清晰明亮以及图像正确曝光的特征。具体的，若第一目标荧光图像符合无荧光信号或低荧光信号的特征，且第二目标荧光图像符合荧光信号清晰明亮的特征，则用户可以判断该组目标荧光图像对应的候选浓度组合可作为目标浓度组合，并将判断结果输入到终端设备。处理设备130可以从终端设备获取用户的输入，从而确定目标浓度组合。

需要说明的是，第四标准荧光图像是由第一通道采集的标准图像，具有无荧光信号或低荧光信号的特征。确定一个或多个目标浓度组合的具体方式也可以参考320步骤和步骤330，在此不再赘述。

在一些实施例中，流程300还可包括确定第一染色试剂和第二染色试剂的用于制作混合染色液的一个或多个目标混合浓度比例。此处的一个或多个目标混合浓度比例可以包括一个或多个具体值，也可以包括混合浓度比例范围。例如，处理设备130可以根据每一组目标浓度组合中第一染色试剂和第二染色试剂的目标浓度的比值直接确定合适的目标混合浓度比例。或者，处理设备130可根据第一染色试剂的一个或多个目标浓度的具体值与第二染色试剂的一个或多个目标浓度的具体值进行排列组合，确定第一染色试剂和第二染色试剂的一个或多个目标混合浓度比例。在一些实施例中，处理设备130还可以基于上述一个或多个目标混合浓度比例的具体值，确定目标混合浓度比例的合适取值范围。

使用按照上述目标混合浓度比例配制的混合染色液染色的细胞样品进行荧光图像采集，可提高荧光图像的成像质量，使荧光图像对细胞样品中的活细胞和死细胞具有良好的区分效果，从而能够提高后续分析结果(例如活细胞个数、死细胞个数等参数)的准确度。以AO/PI双染色法为例，在第一通道采集的荧光图像上，可使上述细胞样品中的活细胞有明显的荧光信号显示，细胞样品中的坏死细胞及凋亡细胞无荧光信号显示或无明显荧光信号显示，而在第二通道采集的荧光图像上，细胞样品中的坏死细胞及凋亡细胞有明显的荧光信号显示。

应当注意的是，上述有关流程300的描述仅仅是为了示例和说明，而不限定本说明书的适用范围。对于本领域技术人员来说，在本说明书的指导下可以对流程300进行各种修正和改变。然而，这些修正和改变仍在本说明书的范围之内。例如，在流程300中，曝光时间这一参数可以是定值。又例如，在流程300中还可以包括确定其他参数的步骤，如第一通道和/或第二通道的曝光时间(可参见流程400或流程500)。在一些实施例中，流程300中的步骤310-330可以按任意顺序进行，也可以同时进行。

本说明书实施例之一提供了一种确定荧光通道曝光时间的方法。

在一些实施例中，所述确定荧光通道曝光时间的方法，可以用于具有多荧光通道的荧光成像设备，包括：基于一个或多个第一目标荧光图像和一个或多个第二目标荧光图像，确定所述荧光成像设备的第一通道的一个或多个第一目标曝光时间和所述荧光成像设备的第二通道的一个或多个第二目标曝光时间，其中：所述一个或多个第一目标荧光图像是以混合染色样品为基础，由所述荧光成像设备使用第一通道在一个或多个第一候选曝光时间下采集的，所述一个或多个第二目标荧光图像是以所述混合染色样品为基础，由所述荧光成像设备使用第二通道在一个或多个第二候选曝光时间下采集的，所述混合染色样品是使用含有第一染色试剂和第二染色试剂的混合染色液进行染色的死细胞样品，所述第一通道对应于所述第一染色试剂，所述第二通道对应于所述第二染色试剂，并且所述第一候选曝光时间和第二候选曝光时间是由以下步骤确定的：基于使用含有所述第一染色试剂的第一染色液进行染色的活细胞样品，确定对应于所述第一通道的一个或多个第一有效显色曝光时间；基于使用含有所述第二染色试剂的第二染色液进行染色的死细胞样品，确定对应于所述第二通道的一个或多个第二有效显色曝光时间；确定所述第二通道对应的一个或多个有效去噪曝光时间；以及基于所述一个或多个第一有效显色曝光时间、所述一个或多个第二有效显色曝光时间和所述一个或多个去噪曝光时间，确定所述第一通道的所述一个或多个第一候选曝光时间和所述第二通道的所述一个或多个第二候选曝光时间。

在一些实施例中，所述确定对应于所述第一染色试剂的所述第一通道的一个或多个第一有效显色曝光时间可以包括：基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效曝光时间中确定所述一个或多个第一有效显色曝光时间，其中，所述一个或多个第一荧光图像，是以使用含有所述第一染色试剂的第一染色液进行染色的活细胞样品为基础，在一个或多个第一候选有效曝光时间下使用所述第一通道采集的。

在一些实施例中，所述基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效曝光时间中确定所述一个或多个第一有效显色曝光时间可以包括：对于所述一个或多个第一荧光图像中每个第一荧光图像，确定所述第一荧光图像的平均荧光强度；确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第一荧光图像的第一候选有效曝光时间为一个所述第一有效显色曝光时间。

在一些实施例中，所述确定对应于所述第二染色试剂的所述第二通道的一个或多个第二有效显色曝光时间可以包括：基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效曝光时间确定所述一个或多个第二有效显色曝光时间，其中，所述第二荧光图像，是以使用第二染色试剂染色的第一死细胞样品为基础，在一个或多个第二候选有效曝光时间下使用所述第二通道采集的。

在一些实施例中，所述基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效曝光时间确定所述一个或多个第二有效显色曝光时间可以包括：对于所述一个或多个第二荧光图像中每个第二荧光图像，确定所述第二荧光图像的平均荧光强度；确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第二荧光图像的第二候选有效曝光时间为一个所述第二有效显色曝光时间。

在一些实施例中，所述确定所述第二通道对应的一个或多个有效去噪曝光时间可以包括：基于一个或多个第三荧光图像，从一个或多个第二候选有效曝光时间中确定所述一个或多个有效去噪曝光时间，其中，所述一个或多个第三荧光图像，是以使用含所述第一染色试剂的第一染色液进行染色的死细胞样品为基础，在一个或多个第二候选有效曝光时间下使用所述第二通道采集的。

在一些实施例中，所述基于一个或多个第三荧光图像，从一个或多个候选去噪曝光时间中确定所述一个或多个有效去噪曝光时间可以包括：对于所述一个或多个第三荧光图像中每个第三荧光图像，确定所述第三荧光图像的平均荧光强度；确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第三荧光图像的候选去噪曝光时间为一个所述有效去噪曝光时间。

在一些实施例中，所述确定所述第一通道的所述一个或多个第一候选曝光时间和所述第二通道的所述一个或多个第二候选曝光时间可以包括：确定所述第一通道对应的所述一个或多个第一有效显色曝光时间为所述一个或多个第一候选曝光时间；基于所述第二通道对应的所述一个或多个第二有效显色曝光时间与所述第二通道对应的所述一个或多个有效去噪曝光时间的交集，确定所述第二通道的所述一个或多个第二候选曝光时间。

在一些实施例中，所述基于一个或多个第一目标荧光图像和一个或多个第二目标荧光图像，确定第一通道的一个或多个第一目标曝光时间和第二通道的一个或多个第二目标曝光时间可以包括：对于所述一个或多个第一目标荧光图像和所述一个或多个第二目标荧光图像中的每个第一目标荧光图像和每个第二目标荧光图像，获取所述第一目标荧光图像的第一平均荧光强度以及所述第二目标荧光图像的第二平均荧光强度；确定所述第一平均荧光强度是否在第一预设范围内；确定所述第二平均荧光强度是否在第二预设范围内；响应于确定所述第一平均荧光强度在所述第一预设范围内，指定对应于所述第一目标荧光图像的第一候选曝光时间为一个所述第一目标曝光时间；响应于确定所述第二平均荧光强度在所述第二预设范围内，指定对应于所述第二目标荧光图像的所述第二候选曝光时间为一个所述第二目标曝光时间。

在一些实施例中，当所述第一染色试剂的荧光基团与所述第二染色试剂的荧光基团之间的距离小于距离阈值时，可以存在荧光共振能量转移效应。

在一些实施例中，所述第一染色试剂可以为吖啶橙，所述第二染色试剂可以为碘化丙啶。

图4是根据本说明书一些实施例所示的确定荧光通道曝光时间的示例性流程图。流程400的至少一部分步骤可以被实现为存储在存储设备150中的一个指令(例如应用程序)。图1中的处理设备130可以执行该指令，并且在执行指令时，处理设备130可以被配置为执行流程400。例如，流程400可以由数据分析模块230执行。在一些实施例中，处理设备130也可以部分或全部集成在荧光成像设备120中。

在一些实施例中，确定荧光通道曝光时间的方法可包括流程400的步骤410至步骤450。

在步骤410中，可确定对应于第一染色试剂的第一通道的一个或多个第一有效显色曝光时间。

第一有效显色曝光时间是指使经第一染色液染色的活细胞样品在荧光成像设备(如荧光成像设备120)的第一通道下有效显色的曝光时间。其中，第一染色液是使用第一染色试剂配制而成的。在一些实施例中，一个或多个第一有效显色曝光时间可以包括一个或多个具体值，也可以指一个取值范围。

在一些实施例中，可基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效曝光时间中确定所述一个或多个第一有效显色曝光时间。荧光成像设备可以使用第一通道按照一个或多个第一候选有效曝光时间来采集用第一染色液染色后的活细胞样品的一个或多个第一荧光图像，并发送给处理设备130。

在一些实施例中，处理设备130可以分析每个第一荧光图像的平均荧光强度是否满足要求，从而从一个或多个第一候选有效曝光时间中确定一个或多个第一有效显色曝光时间。若第一荧光图像的平均荧光强度在预设范围内，则该第一荧光图像对应的第一候选有效曝光时间可以被指定为一个第一有效显色曝光时间。

在一些实施例中，预设范围可以是对应第一通道的机器线性范围(又称为第一线性范围)。在一些实施例中，预设范围可以小于第一线性范围，例如在第一线性范围中间的一个更小范围。需要说明的是，不同荧光成像设备的第一线性范围可能存在一定差异。在一些实施例中，第一线性范围的数据可以存储在存储设备150中，处理设备130可从存储设备150调取第一线性范围的数据，通过对比确定第一荧光图像的平均荧光强度是否处于第一线性范围内。例如，对应于AO通道的预设范围可以是1500-15000au。

在一些实施例中，处理设备130可以基于用户输入来从一个或多个第一候选有效曝光时间中确定一个或多个第一有效显色曝光时间。用户可以通过终端设备输入至少两个第一标准荧光图像，并且用户可以通过终端设备观察及对比第一荧光图像与所述至少两个第一标准荧光图像，以判断第一荧光图像是否符合荧光信号清晰明亮以及图像正确曝光的特征。若第一荧光图像符合荧光信号清晰明亮以及图像正确曝光的特征，则用户判定该第一荧光图像对应的第一候选有效曝光时间可作为一个第一有效显色曝光时间。

在一些实施例中，处理设备130可基于用户输入，随机生成一个或多个第一候选有效曝光时间。例如，用户可通过终端设备输入第一候选有效曝光时间的数值范围，指定生成第一候选有效曝光时间的个数以及多个第一候选有效曝光时间的数量关系(如等比、等差、无规律等)，处理设备130根据用户输入的数值范围、个数及数量关系随机生成一组第一候选有效曝光时间。在一些实施例中，用户可输入一个或多个曝光时间数值，处理设备130可以将用户输入的一个或多个数值确定为一个或多个第一候选有效曝光时间。

在步骤420中，确定对应于第二染色试剂的第二通道的一个或多个第二有效显色曝光时间。

第二有效显色曝光时间是指能够使经第二染色液染色的第一死细胞样品在荧光成像设备的第二通道下有效显色的曝光时间。其中，第二染色液是使用第二染色试剂配制而成的。在一些实施例中，一个或多个第二有效显色曝光时间可以包括一个或多个具体值，也可以指第二有效显色曝光时间的取值范围。

在一些实施例中，可基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效曝光时间中确定所述一个或多个第二有效显色曝光时间。荧光成像设备可以使用第二通道按照一个或多个第二候选有效曝光时间来采集用第二染色液染色后的活细胞样品的一个或多个第二荧光图像，并发送给处理设备130。处理设备130可以分析每个第二荧光图像的平均荧光强度是否满足要求，从而从一个或多个第二候选有效曝光时间中确定一个或多个第二有效显色曝光时间。若第二荧光图像的平均荧光强度在预设范围内，则该第二荧光图像对应的第二候选有效曝光时间可以被指定为一个第二有效显色曝光时间。

在一些实施例中，处理设备130可以基于用户输入来从一个或多个第二候选有效曝光时间中确定一个或多个第二有效显色曝光时间。用户可以通过终端设备输入所述至少两个第二标准荧光图像，并且观察及对比第二荧光图像与所述至少两个第二标准荧光图像，以判断第二荧光图像是否符合荧光信号清晰明亮以及图像正确曝光的特征。若第二荧光图像符合荧光信号清晰明亮以及图像正确曝光的特征，则用户判断该第二荧光图像对应的第二候选有效曝光时间可作为一个第二有效显色曝光时间。

在一些实施例中，确定一个或多个第二有效显色曝光时间的具体方式，可参考本披露的其他部分，例如流程400的步骤410，在此不再赘述。

在步骤430中，可确定第二通道对应的一个或多个有效去噪曝光时间。

有效去噪曝光时间是指能够使经第一染色液染色的第一死细胞样品在荧光成像设备的第二通道下采集的荧光图像(又称为第三荧光图像)的平均荧光强度低于阈值的曝光时间。该阈值可以小于对应于第二通道的机器线性范围的最低值。例如，该阈值可以是1000au、500au等。在一些实施例中，一个或多个有效去噪曝光时间可以包括一个或多个具体值，也可以指有效去噪曝光时间的取值范围。在一些实施例中，第一染色试剂和第二染色试剂的发射光谱存在一定重叠。通过步骤430，可以避免通过第二通道采集到过多的第一试剂的发射光的情况，从而使采用第一染色试剂和第二染色试剂同时染色时对活细胞和死细胞的区分效果更明显，检测结果更加准确。

在一些实施例中，可基于一个或多个第三荧光图像，从一个或多个候选去噪曝光时间中确定一个或多个有效去噪曝光时间。在一些实施例中，荧光成像设备可以通过第二通道(例如PI通道)按照一个或多个候选去噪曝光时间来采集染色后的一个或多个第一死细胞样品的一个或多个第三荧光图像。处理设备130可以判断第三荧光图像的平均荧光强度是否低于前述阈值。若第三荧光图像的平均荧光强度低于该阈值，则该第三荧光图像对应的候选去噪曝光时间可以作为一个有效去噪曝光时间。

在一些实施例中，处理设备130可以基于用户输入来从一个或多个候选去噪曝光时间中确定一个或多个有效去噪曝光时间。用户可以通过终端设备输入至少一个第三标准荧光图像，观察及对比第三荧光图像与所述至少一个第三标准荧光图像，以判断第三荧光图像是否符合无荧光信号的特征。若第三荧光图像符合无荧光信号的特征，则用户判断该第三荧光图像对应的候选去噪曝光时间可以作为一个有效去噪曝光时间。

确定一个或多个第二有效显色曝光时间的具体方式，可参考本披露的其他部分，例如流程300的步骤330，在此不再赘述。

在步骤440中，可确定第一通道的一个或多个第一候选曝光时间和第二通道的一个或多个第二候选曝光时间。

在一些实施例中，可基于步骤420确定的一个或多个第二有效显色曝光时间和步骤430确定的一个或多个有效去噪曝光时间的交集，确定第二通道的一个或多个第二候选曝光时间。该一个或多个第二候选曝光时间可以指一个或多个具体值，也可以指一个取值范围。

在一些实施例中，可基于第二有效显色曝光时间的取值范围与有效去噪曝光时间的取值范围的交集确定第二通道的第二候选曝光时间的取值范围，并在第二通道的第二候选曝光时间的取值范围内选取一个或多个第二候选曝光时间。其中，第二有效显色曝光时间的取值范围可根据多个第二有效显色曝光时间确定，其取值范围的端值可分别为多个第二有效显色曝光时间中的最大值和最小值；有效去噪曝光时间的取值范围可根据多个有效去噪曝光时间确定，其取值范围的端值可分别为多个有效去噪曝光时间中的最大值和最小值。具体的，第二候选曝光时间既处于第二有效显色曝光时间的取值范围内，也处于有效去噪曝光时间的取值范围。在一些实施例中，在确定第二通道的第二候选曝光时间的取值范围后，可采用不同方式(例如基于用户输入、随机选取、按照梯度选取等方式)在第二候选曝光时间的取值范围内选取一个或多个第二候选曝光时间。

在一些实施例中，一个或多个第二有效显色曝光时间和一个或多个有效去噪曝光时间均指具体值，则可以直接根据一个或多个第二有效显色曝光时间和一个或多个有效去噪曝光时间的交集，确定第二通道的第二候选有效曝光时间的一个或多个值。

在一些实施例中，处理设备130可将步骤410确定的一个或多个第一有效显色曝光时间指定为第一通道的一个或多个第一候选曝光时间。在一些实施例中，处理设备130可基于第一有效显色曝光时间的取值范围确定第一通道的第一候选曝光时间的取值范围。在确定第一通道的第一候选曝光时间的取值范围后，可采用不同方式(例如基于用户输入、随机选取、按照梯度选取等方式)在第一候选曝光时间的取值范围内选取一个或多个第一候选曝光时间。

在步骤450中，可以确定第一通道的一个或多个第一目标曝光时间和第二通道的一个或多个第二目标曝光时间。

在一些实施例中，可基于一个或多个第一目标荧光图像和一个或多个第二目标荧光图像，确定第一通道的一个或多个第一目标曝光时间和第二通道的一个或多个第二目标曝光时间。所述一个或多个第一目标曝光时间和第二目标曝光时间可以是具体值，也可以是一个取值范围。

具体地，可以使用第一染色试剂和第二染色试剂配制成混合染色液，并使用该混合染色液对第二死细胞样品进行染色。对于每一个染色后的第二死细胞样品，荧光成像设备可以通过对应于第一染色试剂的第一通道使用在第一候选曝光时间下采集所述第一目标荧光图像，并通过对应于第二染色试剂的第二通道在第二候选曝光时间下采集所述第二目标荧光图像。

对于一个或多个第一目标荧光图像，处理设备130可以判断其中每个第一目标荧光图像是否满足预设条件。在一些实施例中，处理设备130可以确定每个第一目标荧光图像的平均荧光强度，并和第一预设范围进行比较。若平均荧光强度在第一预设范围内，处理设备130可以确定该第一目标荧光图像对应的第一候选曝光时间为一个第一目标曝光时间。其中，第一预设范围的最大值小于第一通道的机器线性范围的最小值。例如，第一预设范围可为0-500au。

类似地，对于一个或多个第二目标荧光图像，处理设备130可以判断每个第二目标荧光图像是否满足预设条件。在一些实施例中，处理设备130可以确定每个第二目标荧光图像的平均荧光强度，并和第二预设范围进行比较。若一个第二目标荧光图像的平均荧光强度在第二预设范围内，处理设备130可以确定该第二目标荧光图像对应的第二候选曝光时间为一个第二目标曝光时间。其中，第二预设范围可以是对应于第二通道的机器线性范围。例如，第二预设范围可为2000-10000au。

在一些实施例中，处理设备130可以基于用户输入来从一个或多个第一候选曝光时间中确定一个或多个第一目标曝光时间，并且从一个或多个第二候选曝光时间中确定一个或多个第二目标曝光时间。

在一些实施例中，荧光成像设备可以将一个或多个第一目标荧光图像发送至终端设备，用户可以通过终端设备输入所述至少一个第四标准荧光图像，并且观察及对比第一目标荧光图像与所述至少一个第四标准荧光图像，以判断第一目标荧光图像是否符合无荧光信号或低荧光信号的特征。若第一目标荧光图像符合无荧光信号或低荧光信号的特征，则用户可判断该第一目标荧光图像对应的第一候选曝光时间可作为第一目标曝光时间。

在一些实施例中，荧光成像设备可以将一个或多个第二目标荧光图像发送至终端设备，用户可以通过终端设备输入所述至少两个第二标准荧光图像，并且观察及对比第二目标荧光图像与所述至少两个第二标准荧光图像，以判断第二荧光图像是否符合荧光信号清晰明亮以及图像正确曝光的特征。若第二荧光图像符合荧光信号清晰明亮以及图像正确曝光的特征，则用户可判断该第二荧光图像对应的第二候选曝光时间可作为第二目标曝光时间。

用户可以将判断结果输入到终端设备。处理设备130可以从终端设备获取用户的输入，从而确定一个或多个第一目标曝光时间和一个或多个第二目标曝光时间。确定一个或多个第一目标曝光时间和一个或多个第二目标曝光时间的具体方式，可参考本披露的其他部分，例如流程300的步骤350，在此不再赘述。

在一些实施例中，处理设备130还可以根据一个或多个第一目标曝光时间和一个或多个第二目标曝光时间，确定一个或多个目标曝光时间组合。荧光成像设备在获取荧光图像时，可以根据用户指定或默认设置采取其中一个目标曝光时间组合，按照该目标曝光时间组合中的第一目标曝光时间和第二目标曝光时间来获取荧光图像。

在一些实施例中，可基于第一通道的一个或多个第一目标曝光时间和第二通道的一个或多个第二目标曝光时间，确定第一通道和第二通道的目标曝光时间范围。

使用上述第一目标曝光时间和第二目标曝光时间对用含有第一染色试剂和第二染色试剂的混合染色液染色后的细胞样品进行荧光图像采集，可提高荧光图像的成像质量，有效利用染色试剂之间的荧光共振能量转移效应，使荧光图像对细胞样品中的活细胞和死细胞具有良好的区分效果，从而能够提高后续分析结果(例如活细胞个数、死细胞个数等参数)的准确度。以AO/PI双染色法为例，在第一通道采集的荧光图像上，可使上述细胞样品中的活细胞有明显的荧光信号显示，细胞样品中的坏死细胞及凋亡细胞无荧光信号显示或无明显荧光信号显示，而在第二通道采集的荧光图像上，细胞样品中的坏死细胞及凋亡细胞有明显的荧光信号显示。

应当注意的是，上述有关流程400的描述仅仅是为了示例和说明，而不限定本说明书的适用范围。对于本领域技术人员来说，在本说明书的指导下可以对流程400进行各种修正和改变。然而，这些修正和改变仍在本说明书的范围之内。例如，在流程400中，混合染色液中的第一染色试剂和第二染色试剂的浓度可以是固定值。又例如，在流程400中还可以包括确定其他参数的步骤，如第一染色试剂和第二染色试剂的浓度(可参见流程300或流程500)。在一些实施例中，流程400中的步骤410-430可以按任意顺序进行，也可以同时进行。

本说明书实施例之一提供了一种确定染色液成分配比及匹配的荧光通道曝光时间的方法。

在一些实施例中，所述染色液包括第一染色试剂和第二染色试剂，所述方法可以包括：基于一组或多组目标荧光图像，确定所述第一染色试剂在所述染色液中的一个或多个目标浓度、所述第二染色试剂在所述染色液中的一个或多个目标浓度、所述第一染色试剂关联的第一通道对应的一个或多个第一目标曝光时间和所述第二染色试剂关联的第二通道对应的一个或多个第二目标曝光时间，其中：所述一组或多组目标荧光图像是使用一种或多种混合染色液对一个或多个死细胞样品分别染色后采集的，所述一种或多种混合染色液是用所述第一染色试剂和所述第二染色试剂按照所述一个或多个候选浓度曝光时间组合配制而成的，并且所述候选浓度曝光时间组合是由以下步骤确定的：确定所述第一染色试剂的用于活细胞显色的一个或多个第一有效显色浓度及匹配的一个或多个第一有效显色曝光时间，所述一个或多个第一有效显色曝光时间对应于所述第一通道；确定所述第二染色试剂的用于死细胞显色的一个或多个第二有效显色浓度及匹配的一个或多个第二有效显色曝光时间，所述一个或多个第二有效显色曝光时间对应于所述第二通道；基于使用含有所述第一染色试剂的第一染色液进行染色的一个或多个死细胞样品，确定第一染色试剂的一个或多个有效去噪浓度及匹配的对应于所述第二通道的一个或多个有效去噪曝光时间；基于所述一个或多个第一有效显色浓度、所述一个或多个第一有效显色曝光时间、所述一个或多个第二有效显色浓度、所述一个或多个第二有效显色曝光时间、所述一个或多个有效去噪浓度和所述一个或多个有效去噪曝光时间，确定满足预设条件的一个或多个候选浓度曝光时间组合。

在一些实施例中，所述确定所述第一染色试剂的用于活细胞显色的一个或多个第一有效显色浓度及匹配的一个或多个第一有效显色曝光时间可以包括：基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效浓度和一个或多个第一候选有效曝光时间中确定所述一个或多个第一有效显色浓度及匹配的所述一个或多个第一有效显色曝光时间，其中，所述第一荧光图像，是以使用一种或多种第一染色液进行染色的一个或多个活细胞样品为基础，在所述一个或多个第一候选有效曝光时间下使用所述第一通道采集的，所述一种或多种第一染色液是用所述第一染色试剂按照所述一个或多个第一候选有效浓度配制而成的。

在一些实施例中，所述基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效浓度和一个或多个第一候选有效曝光时间中确定所述一个或多个第一有效显色浓度及匹配的所述一个或多个第一有效显色曝光时间可以包括：对于所述一个或多个第一荧光图像中每个第一荧光图像，确定所述第一荧光图像的平均荧光强度；确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第一荧光图像的第一候选有效浓度为一个所述第一有效显色浓度，指定对应于所述第一荧光图像的第一候选有效曝光时间为一个所述第一有效显色曝光时间。

在一些实施例中，所述确定所述第二染色试剂的用于死细胞显色的一个或多个第二有效显色浓度及匹配的一个或多个第二有效显色曝光时间可以包括：基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效浓度和一个或多个第二候选有效曝光时间中确定所述一个或多个第二有效显色浓度及匹配的所述一个或多个第二有效显色曝光时间，其中，所述第二荧光图像，是以使用一种或多种第二染色液进行染色的一个或多个死细胞样品为基础，在所述一个或多个第二候选有效曝光时间下使用所述第二通道采集的，所述一种或多种第二染色液是用所述第二染色试剂按照所述一个或多个第二候选有效浓度配制而成的。

在一些实施例中，所述基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效浓度和一个或多个第二候选有效曝光时间中确定所述一个或多个第二有效显色浓度及匹配的所述一个或多个第二有效显色曝光时间可以包括：对于所述一个或多个第二荧光图像中每个第二荧光图像，确定所述第二荧光图像的平均荧光强度；确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第二荧光图像的第二候选有效浓度为一个所述第二有效显色浓度，指定对应于所述第二荧光图像的第二候选有效曝光时间为一个所述第二有效显色曝光时间。

在一些实施例中，所述确定第一染色试剂的一个或多个有效去噪浓度及匹配的对应于所述第二通道的一个或多个有效去噪曝光时间可以包括：基于一个或多个第三荧光图像，从一个或多个候选去噪浓度和一个或多个候选去噪曝光时间中确定所述一个或多个有效去噪浓度及匹配的所述一个或多个有效去噪曝光时间，其中，所述一个或多个第三荧光图像，是以使用一个或多个第一染色液进行染色的一个或多个死细胞样品为基础，在所述一个或多个候选去噪曝光时间下使用所述第二通道采集的，所述一种或多种第一染色液是用所述第二染色试剂按照所述一个或多个候选去噪浓度配制而成的。

在一些实施例中，所述基于一个或多个第三荧光图像，从一个或多个候选去噪浓度和一个或多个候选去噪曝光时间中确定所述一个或多个有效去噪浓度及匹配的所述一个或多个有效去噪曝光时间可以包括：对于所述一个或多个第三荧光图像中每个第三荧光图像，确定所述第三荧光图像的平均荧光强度；确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第三荧光图像的候选去噪浓度为一个所述有效去噪浓度，指定对应于所述第三荧光图像的候选去噪曝光时间为一个所述有效去噪曝光时间。

在一些实施例中，所述确定满足预设条件的一个或多个候选浓度曝光时间组合可以包括：基于所述一个或多个第一有效显色浓度与所述一个或多个有效去噪浓度的交集，确定所述第一染色剂的一个或多个第一候选浓度；基于所述一个或多个第二有效显色曝光时间与所述一个或多个有效去噪曝光时间的交集，确定所述第二通道的一个或多个第二候选曝光时间；基于所述一个或多个第一候选浓度、所述一个或多个第二有效显色浓度、所述一个或多个第一有效显色曝光时间和所述一个或多个第二候选曝光时间，确定所述一个或多个浓度曝光时间组合。

在一些实施例中，所述一组或多组目标荧光图像中的每组目标荧光图像可以包括：第一目标荧光图像和第二目标荧光图像，其中所述第一目标荧光图像是通过对应于所述第一染色试剂的所述第一通道采集的，所述第二目标荧光图像是通过对应于所述第二染色试剂的所述第二通道采集的。

在一些实施例中，所述基于一组或多组目标荧光图像，确定所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度、所述第二染色试剂对应的一个或多个目标浓度、所述第一通道对应的一个或多个第一目标曝光时间和所述第二通道对应的一个或多个第二目标曝光时间可以包括：对于所述一组或多组目标荧光图像中的每组目标荧光图像，获取所述第一目标荧光图像的第一平均荧光强度以及所述第二目标荧光图像的第二平均荧光强度；确定所述第一平均荧光强度是否在第一预设范围内；确定所述第二平均荧光强度是否在第二预设范围内；响应于确定所述第一平均荧光强度在所述第一预设范围内且所述第二平均荧光强度在所述第二预设范围内，确定所述第一目标荧光图像和所述第二目标荧光图像对应的候选浓度曝光时间组合作为一个目标浓度曝光时间组合，所述目标浓度曝光时间组合包括所述第一染色试剂的一个目标浓度、所述第二染色试剂的一个目标浓度、所述第一通道对应的一个第一目标曝光时间和所述第二通道对应的一个第二目标曝光时间；基于一个或多个所述目标浓度曝光时间组合，确定所述第一染色试剂和所述第二染色试剂的目标浓度比例范围，以及可匹配的所述第一通道和所述第二通道的目标曝光时间范围。

在一些实施例中，当所述第一染色试剂的荧光基团与所述第二染色试剂的荧光基团之间的距离小于距离阈值时，可以存在荧光共振能量转移效应。

在一些实施例中，可以基于所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂的一个或多个目标浓度，确定所述第一染色试剂和所述第二染色试剂的用于制作混合染色液的一个或多个目标混合浓度比例。

在一些实施例中，所述第一染色试剂可以为吖啶橙，所述第二染色试剂可以为碘化丙啶。

图5是根据本说明书一些实施例所示的确定染色液成分配比及匹配的荧光通道曝光时间的示例性流程图。流程500的至少一部分步骤可以被实现为存储在存储设备150中的一个指令(例如应用程序)。图1中的处理设备130可以执行该指令，并且在执行指令时，处理设备130可以被配置为执行流程500。例如，流程500可以由数据分析模块230执行。在一些实施例中，处理设备130也可以部分或全部集成在荧光成像设备120中。

在一些实施例中，确定染色液成分配比及匹配的荧光通道曝光时间的方法可包括流程500的步骤510至步骤550。

在步骤510中，可确定第一染色试剂的用于活细胞显色的一个或多个第一有效显色浓度及匹配的一个或多个第一有效显色曝光时间。

在一些实施例中，获取荧光图像的合适曝光时间和染色液中荧光染色试剂的浓度有一定关联。若荧光试剂浓度较高，则用激发光照射后，染色样品发射的荧光信号可能较强，因此可能需要适当缩短采集荧光图像所使用的曝光时间；反之，若荧光试剂浓度较低，则用激发光照射后，染色样品发射的荧光信号可能较弱，因此可能需要适当延长采集荧光图像所使用的曝光时间。因此，在一些实施例中，不同的曝光时间范围与不同的荧光染色试剂的浓度相匹配。

在一些实施例中，步骤510可以结合流程300中的步骤310和流程400中的步骤410中所描述的方式来进行。在一些实施例中，处理设备130可以根据一个或多个第一荧光图像来确定所述一个或多个第一有效显色浓度及匹配的第一有效显色曝光时间。

一个或多个第一荧光图像是基于染色后的活细胞样品获取的。在一些实施例中，可以用第一染色试剂按照一个或多个第一候选有效浓度来配制第一染色液，并对活细胞样品进行染色。对每个染色后的活细胞样品，荧光成像设备可以按照一个或多个第一候选有效曝光时间，通过第一通道获取一个或多个第一荧光图像。处理设备130可以基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效浓度和一个或多个第一候选有效曝光时间中确定一个或多个第一有效显色浓度及匹配的一个或多个第一有效显色曝光时间。具体如何基于第一荧光图像来判断可以参照步骤310和410中所述，这里不再赘述。

在步骤520中，可以确定第二染色试剂的用于死细胞显色的一个或多个第二有效显色浓度及匹配的一个或多个第二有效显色曝光时间。

在一些实施例中，步骤520可以结合流程300中的步骤320和流程400中的步骤420中所描述的方式来进行。在一些实施例中，处理设备130可以根据一个或多个第二荧光图像来确定所述一个或多个第二有效显色浓度及匹配的第二有效显色曝光时间。

一个或多个第二荧光图像是基于染色后的第一死细胞样品获取的。在一些实施例中，可以用第二染色试剂按照一个或多个第二候选有效浓度来配制第二染色液，并对第一死细胞样品进行染色。对每个染色后的第一死细胞样品，荧光成像设备可以按照一个或多个第二候选有效曝光时间，通过第二通道获取一个或多个第二荧光图像。处理设备130可以基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效浓度和一个或多个第二候选有效曝光时间中确定一个或多个第二有效显色浓度及匹配的一个或多个第二有效显色曝光时间。具体如何基于第二荧光图像来判断可以参照步骤320和420中所述，这里不再赘述。

在步骤530中，可确定第一染色试剂的一个或多个有效去噪浓度及匹配的对应于第二通道的一个或多个有效去噪曝光时间。

在一些实施例中，步骤530可以结合流程300中的步骤330和流程400中的步骤430中所描述的方式来进行。在一些实施例中，处理设备130可以根据一个或多个第三荧光图像来确定所述一个或多个有效去噪浓度及匹配的有效去噪曝光时间。

一个或多个第三荧光图像是基于染色后的第一死细胞样品获取的。在一些实施例中，可以用第一染色试剂按照一个或多个候选去噪浓度来配制第一染色液，并对第一死细胞样品进行染色。对每个染色后的第一死细胞样品，荧光成像设备可以按照一个或多个候选去噪曝光时间，通过第二通道获取一个或多个第三荧光图像。处理设备130可以基于一个或多个第三荧光图像，从一个或多个候选去噪浓度和一个或多个候选去噪曝光时间中确定一个或多个有效去噪浓度及匹配的对应于第二通道的一个或多个有效去噪曝光时间。具体如何基于第三荧光图像来判断可以参照步骤330和430中所述，这里不再赘述。

在步骤540中，可确定满足预设条件的一个或多个候选浓度曝光时间组合。

在一些实施例中，可基于步骤510确定的一个或多个第一有效显色浓度、步骤510确定的一个或多个第一有效显色曝光时间、步骤520确定的一个或多个第二有效显色浓度、步骤520确定的一个或多个第二有效显色曝光时间、步骤530确定的一个或多个有效去噪浓度和步骤530确定的一个或多个有效去噪曝光时间，来确定满足预设条件的一个或多个候选浓度曝光时间组合。每个候选浓度曝光时间组合中含有第一染色试剂的第一候选浓度，第二染色试剂的第二候选浓度，对应于第一通道的第一候选曝光时间，以及对应于第二通道的第二候选曝光时间。

在一些实施例中，可基于第一有效显色浓度和有效去噪浓度的交集，确定第一染色试剂的第一候选浓度。关于确定第一染色试剂的第一候选浓度的详细内容，可以参照本披露的其他部分，例如流程300的步骤340中的描述。

在一些实施例中，可基于第一有效显色曝光时间和有效去噪曝光时间的交集，确定第一通道对应的第一候选曝光时间。关于确定第一通道对应的第一候选曝光时间，可以参照本披露的其他部分，例如流程400中的步骤440中的描述。

在一些实施例中，第二候选浓度可以是步骤520中确定的一个或多个第二有效显色浓度，也可以是从一个或多个第二有效显色浓度中选取的部分数值。

在一些实施例中，第二候选曝光时间可以是步骤520中确定的一个或多个第二有效显色曝光时间，也可以是从一个或多个第二有效显色曝光时间中选取的部分值。

在一些实施例中，可将第一染色试剂的第一候选浓度和匹配的第一通道的第一候选曝光时间，与第二染色试剂的第二候选浓度和匹配的第二通道的第二候选曝光时间进行组合，确定候选浓度曝光时间组合。

在步骤550中，可确定第一染色试剂对应的一个或多个目标浓度、第二染色试剂对应的一个或多个目标浓度、第一通道对应的一个或多个第一目标曝光时间和第二通道对应的一个或多个第二目标曝光时间。

在一些实施例中，步骤550可以结合流程300中的步骤350和流程400中的步骤450中所描述的方式来进行。例如，处理设备130可以基于一组或多组目标荧光图像，来确定步骤540中确定的一个或多个候选浓度曝光时间组合是否是目标浓度曝光时间组合。每组荧光图像可以包括基于同一染色后的第二死细胞样品的从第一通道采集的一个第一目标荧光图像和从第二通道采集的一个第二目标荧光图像。其中，每组目标荧光图像对应一个候选浓度曝光时间组合。处理设备130可进一步基于目标浓度曝光时间组合，确定第一染色试剂对应的一个或多个目标浓度、第二染色试剂对应的一个或多个目标浓度、第一通道对应的一个或多个第一目标曝光时间和第二通道对应的一个或多个第二目标曝光时间。所述一个或多个目标浓度、一个或多个第一目标曝光时间和一个或多个第二目标曝光时间可以是具体值，也可以是一个取值范围。

具体地，可以使用第一染色试剂和第二染色试剂按照一个或多个候选浓度曝光时间组合中的浓度配制成混合染色液，并使用该混合染色液对一个或多个第二死细胞样品进行染色。对于每一个染色后的第二死细胞样品，荧光成像设备可以通过对应于第一染色试剂的第一通道采集所述第一目标荧光图像，并通过对应于第二染色试剂的第二通道采集所述第二目标荧光图像。

在一些实施例中，处理设备130可以基于一组或多组目标荧光图像中每个荧光图像的平均荧光强度来确定目标浓度曝光时间组合。处理设备130还可以基于用户输入从一组或多组候选浓度曝光时间组合来确定一组或多组目标浓度曝光时间组合。具体可以参照与步骤350和步骤450中类似的方式，此处不再赘述。

流程500还可包括确定第一染色试剂和第二染色试剂的用于制作混合染色液的一个或多个目标混合比例，或混合浓度比例范围。

使用按照上述目标混合浓度比例配制的混合染色液染色的细胞样品进行荧光图像采集，可提高荧光图像的成像质量，有效利用染色试剂之间的荧光共振能量转移效应，使荧光图像对细胞样品中的活细胞和死细胞具有良好的区分效果，从而能够提高后续分析结果(例如活细胞个数、死细胞个数等参数)的准确度。

应当注意的是，上述有关流程500的描述仅仅是为了示例和说明，而不限定本说明书的适用范围。对于本领域技术人员来说，在本说明书的指导下可以对流程500进行各种修正和改变。然而，这些修正和改变仍在本说明书的范围之内。在一些实施例中，流程500中的步骤510-530可以按任意顺序进行，也可以同时进行。

本说明书实施例之一提供了一种用于细胞染色的染色液。在一些实施例中，可以按照如图3及相关描述中的方法来确定该染色液的配比。该染色液可以用于对目标细胞样品110进行染色，荧光成像设备120可以基于染色后的样品获取荧光图像，用于分析该样品的各种参数，如总细胞个数、活细胞个数、死细胞个数、总细胞浓度、活细胞浓度、死细胞浓度以及细胞活率等。在一些实施例中，该染色液可以包括吖啶橙和碘化丙啶。其中，吖啶橙主要用于使活细胞显色，碘化丙啶主要用于使死细胞显色。

在一些实施例中，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.2-5μg/mL范围之内。例如，吖啶橙的质量浓度可以是0.2μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、1.2μg/mL、4.0μg/mL、或5.0μg/mL。在一些实施例中，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-4μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-1.2μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在1.2-4μg/mL范围之内。

在一些实施例中，碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在50-1000μg/mL范围之内。例如，碘化丙啶的质量浓度可以是50μg/mL、80μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL。在一些实施例中，碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-800μg/mL范围之内。在一些实施例中，碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-300μg/mL范围之内。在一些实施例中，碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在300-800μg/mL范围之内。

在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度的比值在0.375:1000-50:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-4μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-800μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶的质量浓度的比值在0.375:1000-5:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-4μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度为800μg/mL。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶的质量浓度的比值在3.75:1000-50:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-4μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度为80μg/mL。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶的质量浓度的比值在0.375:1000-3.75:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度为0.3μg/mL，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-800μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶的质量浓度的比值在5:1000-50:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度为4μg/mL，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-800μg/mL范围之内。

在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度的比值在0.375:1000-15:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-1.2μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-800μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度的比值在1.5:1000-50:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在1.2-4μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-800μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度的比值在1:1000-50:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-4μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-300μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度的比值在1:1000-15:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-1.2μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-300μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度的比值在4:1000-50:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在1.2-4μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在80-300μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度的比值在0.375:1000-13.33:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-4μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在300-800μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度的比值在0.375:1000-4:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在0.3-1.2μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在300-800μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度的比值在1.5:1000-13.33:1000范围之内。例如，吖啶橙在所述染色液中的质量浓度在1.2-4μg/mL范围之内，且碘化丙啶在所述染色液中的质量浓度在300-800μg/mL范围之内。在一些实施例中，吖啶橙和所述碘化丙啶的质量浓度的比值在1:1000-10:1000范围之内。

在一些实施例中，染色液中吖啶橙的质量浓度可以是0.3μg/mL，碘化丙啶的质量浓度可以是80μg/mL。在一些实施例中，染色液中吖啶橙的质量浓度可以是0.3μg/mL，碘化丙啶的质量浓度可以是800μg/mL。在一些实施例中，染色液中吖啶橙的质量浓度可以是1.2μg/mL，碘化丙啶的质量浓度可以是300μg/mL。在一些实施例中，染色液中吖啶橙的质量浓度可以是4.0μg/mL，碘化丙啶的质量浓度可以是80μg/mL。在一些实施例中，染色液中吖啶橙的质量浓度可以是4.0μg/mL，碘化丙啶的质量浓度可以是800μg/mL。

在一些实施例中，染色液的pH值可以调节为接近待检测的目标细胞样品的pH值。在一些实施例中，染色液的pH值可以在7.0-8.0范围之内，例如7.0-7.6、7.2-7.6、7.2-7.4、7.4-7.8、7.4-8.0、或7.6-8.0。

在一些实施例中，染色液还可以包括以下成分中的一种或多种：氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。在一些实施例中，染色液中的pH缓冲试剂可以为磷酸盐。

本说明书还提供了一种染色液的配制方法。该方法包括：获取吖啶橙溶液；获取碘化丙啶溶液；配制缓冲液；以及将所述吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液与缓冲液混合均匀，得到所述染色液，使得所述染色液中吖啶橙与碘化丙啶的质量浓度比满足前述列举的比例。在一些实施例中，也可以使用磷酸盐缓冲液配制不同浓度的吖啶橙得到吖啶橙溶液，并使用磷酸盐缓冲液配制不同浓度的碘化丙啶得到碘化丙啶溶液，然后将吖啶橙溶液与碘化丙啶溶液混合得到所述染色液。

仅作为示例，可以配置浓度为1-10mg/mL的吖啶橙溶液作为吖啶橙母液。可以配置浓度为1-100mg/mL的碘化丙啶溶液作为碘化丙啶母液。在配置染色液时，可以取第一体积的所述吖啶橙母液、第二体积的所述碘化丙啶母液以及第三体积的所述缓冲液混合均匀，得到所述染色液。其中所述吖啶橙和所述碘化丙啶的质量浓度的比值在0.375:1000-50:1000范围之内，并且所述染色液的pH值在7.0-8.0范围之内。还可以参考实施例8所述的方式来配置所述染色液。

本说明书还提供了一种检测细胞样品的特征参数的方法，该方法包括使用前述含有吖啶橙与碘化丙啶两种染色试剂的染色液对细胞样品进行染色。在一些实施例中，可以通过荧光显微成像技术(例如通过细胞样品检测系统100中的荧光成像设备120)获取染色后的细胞样品的AO通道荧光图像和PI通道荧光图像，并基于所述AO通道荧光图像和PI通道荧光图像来确定细胞样品的一个或多个特征参数。

在一些实施例中，特征参数可以包括但不限于以下参数中的一项或多项：总细胞个数、活细胞个数、死细胞个数、总细胞浓度、活细胞浓度、死细胞浓度以及细胞活率。

AO通道荧光图像是指荧光成像设备120在AO通道下得到的荧光图像。在一些实施例中，基于AO荧光图像识别的细胞个数统计为活细胞个数。PI荧光图像是指在荧光成像设备120在PI通道下得到的荧光图像。在一些实施例中，基于PI荧光图像识别的细胞个数统计为死细胞个数。在一些实施例中，基于AO荧光图像识别的细胞个数与基于PI荧光图像识别的细胞个数之和为总细胞个数。在一些实施例中，可以基于总细胞个数和样品体积确定总细胞浓度。在一些实施例中，可以基于活细胞个数和样品体积确定活细胞浓度。在一些实施例中，可以基于死细胞个数和样品体积确定死细胞浓度。在一些实施例中，可以将活细胞个数和总细胞个数之比确定为细胞活率。

在一些实施例中，可以在对应于某一染色试剂的通道中，使用对应波长的入射光照射染色后的细胞样品，并通过滤光片过滤发射光，从而采集对应该染色试剂的荧光图像。此处的入射光主要用于激发细胞样品中的染色试剂，使其发出荧光，因此又称为激发光。

在一些实施例中，可以使用400～505nm的入射光照射染色后的细胞样品以获取吖啶橙通道荧光图像。例如入射光的波长可以是450nm、480nm、500nm等。

在一些实施例中，可以使用510～550nm的滤光片过滤AO通道的发射光，以获取染色后细胞样品的吖啶橙通道荧光图像。例如515nm、535nm、540nm的滤光片。

在一些实施例中，可以使用450～550nm的入射光照射染色后的细胞样品以获取碘化丙啶通道荧光图像。例如515nm、525nm、540nm的入射光。

在一些实施例中，可以使用大于580nm的滤光片过滤PI通道的发射光，以获取染色后细胞样品的碘化丙啶通道荧光图像。例如600nm、610nm、620nm的滤光片。

在一些实施例中，在获取吖啶橙通道荧光图像的过程中，吖啶橙通道的曝光时间可以为200-1000ms。例如200ms、500ms、800ms、1000ms。在一些实施例中，在获取吖啶橙通道荧光图像的过程中，吖啶橙通道的曝光时间可以为200-800ms。

在一些实施例中，在获取碘化丙啶通道荧光图像的过程中，碘化丙啶通道的曝光时间可以为100-500ms。例如100ms、200ms、250ms、450ms、500ms。在一些实施例中，在获取所述吖啶橙通道荧光图像的过程中，碘化丙啶通道的曝光时间可以为100-450ms。

在一些实施例中，染色液中吖啶橙和碘化丙啶的浓度和配比可以采取前文所描述的各种范围。可以根据染色液中吖啶橙和碘化丙啶的浓度和配比，选取匹配的曝光时间。例如，染色液中吖啶橙的质量浓度可以在0.3-4μg/mL范围之内，AO通道的曝光时间可以为200ms或800ms。再例如，染色液中碘化丙啶的质量浓度可以在80-800μg/mL范围之内，PI通道的曝光时间可以为100ms或450ms。仅作为示例，吖啶橙和碘化丙啶的浓度及对应通道的曝光时间可以采取下文实施例7表13中所示的各种组合。

在一些实施例中，在对待测的细胞样品进行染色前，可以先对所述细胞样品进行离心，并收集沉淀下来的细胞，再使用重悬液对所述细胞进行重悬。在一些实施例中，所述重悬液可以是培养液、生理盐水或磷酸盐缓冲液中的任意一种。

在一些实施例中，完成重悬后，可以先使用前述含有吖啶橙与碘化丙啶两种染色试剂的染色液对细胞样品进行染色。染色液与重悬后的细胞样品的体积比例范围包括但不限于1:0.1-1:10、1:0.5-1:5、1:0.7-1:1.2。仅作为示例，所述染色液与重悬后的细胞样品的体积比例可以是1:1。例如，可以吸取20μL染色液加入到20μL细胞样品中混匀并静置0-5分钟，以完成染色。又例如，可以吸取100μL染色液加入到100μL细胞样品中混匀并静置0-5分钟，以完成染色。

在一些实施例中，所述重悬液可以为培养基或生理盐水。使用本说明书一些实施例提供的染色液时，用培养基重悬和用生理盐水重悬获得的细胞活率无明显差异，表明使用本说明书一些实施例提供的染色液对重悬液的选择没有明显限制，降低了重悬液对细胞活率测定结果的影响，从而提高了测定结果的稳定性和准确性。更多细节可参考实施例8中的描述。

在一些实施例中，细胞样品可以是来源于人体、动物体的器官或组织的细胞，该细胞是通过标准化收集、处理、储存的样品。

在一些实施例中，细胞样品可以包括癌细胞、免疫细胞、干细胞、上皮细胞、神经细胞、生殖细胞等。

在一些实施例中，细胞样品可以包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肾上皮细胞293、人乳腺癌细胞(MCF-7)等。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

实施例1确定AO有效显色浓度C_AO1范围及AO通道有效显色曝光时间T_AO1范围

1.1获取经AO染色的MCF-7活细胞样品

收集新鲜消化的MCF-7细胞(购自ATCC)，使用含血清的细胞培养液重悬后，获得MCF-7活细胞样品(细胞活率>95％)。

使用染色试剂AO(北京索莱宝，货号A8120)和PBS缓冲液配制不同浓度的AO染色液，AO染色液调节至pH7.5。其中，各AO染色液的AO浓度分别为0.04μg/mL、0.2μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、25.0μg/mL。

取5组MCF-7活细胞样品，按组依次编号，每组5份平行样品，每份样品体积为20μL。按照表1所示的对应关系向各MCF-7活细胞样品中分别加入20μL的AO染色液，轻轻混匀后直接吸取20μL液体加入Countstar Rigel计数板的样品槽内，得到经AO染色的、待检测MCF-7活细胞样品。

表1不同的经AO染色的MCF-7活细胞样品的染色条件

1.2荧光图像采集及分析

选择荧光成像设备。采用Countstar Rigel全自动荧光细胞分析仪进行图像采集，其配置有FL1通道(激发波长480nm，发射波长535nm)和FL2通道(激发波长525nm，发射波长600nm)。其中，FL1通道为绿色荧光通道，匹配染色试剂AO，可激发并采集染色试剂AO发出的荧光，以下称为AO通道；FL2通道为橙色荧光通道，匹配染色试剂PI，可激发并采集染色试剂PI发出的荧光，以下称为PI通道。

将计数板插入细胞分析仪自动进样孔中。分别在50ms、200ms、500ms、1000ms、2000ms的曝光时间条件下，使用AO通道对每份经AO染色的MCF-7活细胞样品进行荧光图像采集，获得第一荧光图像。依据第一荧光图像进行图像分析。不同第一荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度的对应关系如表2所示。

表2不同第一荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度(au)的对应关系

注：*代表对应荧光图像过曝。

初步判定染色试剂AO的有效显色浓度C_AO1和AO通道有效显色曝光时间T_AO1的范围。依据荧光图像采集装置的线性范围确定，对于AO通道荧光图像的平均荧光强度而言，图像具有清晰明亮荧光信号的有效阈值范围为1500-15000au。根据第一荧光图像的平均荧光强度以及第一荧光图像的曝光情况(例如，荧光图像是否过曝)，初步判定染色试剂AO的有效显色浓度C_AO1和AO通道有效显色曝光时间T_AO1可在以下基础上进一步缩小取值范围：0.2μg/mL＜C_AO1＜5μg/mL，200ms≤T_AO1＜1000ms。

实施例2筛选出AO有效显色浓度的优选范围及AO通道的有效显色曝光时间的优选范围

2.1获取经AO染色的MCF-7活细胞样品

获取MCF-7活细胞样品，方法参见实施例1的步骤1.1。

配制不同浓度的AO染色液，AO染色液调节至pH7.5。其中，AO染色液的AO浓度在实施例1初步判定的染色试剂AO的有效显色浓度C_ao1的取值范围内选取，分别为0.3μg/mL、1.2μg/mL、4μg/mL。

取3组MCF-7活细胞样品，按组依次编号，每组设置3份平行样品，每份样品体积为20μL。按照表3所示的对应关系向各MCF-7活细胞样品中分别加入20μL的AO染色液，制备不同的经AO染色的MCF-7活细胞样品，制备方法参见实施例1的步骤1.1。

表3不同MCF-7活细胞样品的染色条件

2.2荧光图像采集及分析

将步骤2.1制备的经AO染色的MCF-7活细胞样品的计数板插入细胞分析仪自动进样孔中。在实施例1初步判定的AO通道有效显色曝光时间T_AO1的取值范围内选取待测曝光时间，待测曝光时间分别为200ms、500ms、800ms。

分别在200ms、500ms、800ms的曝光时间条件下，使用AO通道对步骤2.1制备的经AO染色的MCF-7活细胞样品进行荧光图像采集，获得第一荧光图像。依据第一荧光图像进行图像分析。不同第一荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度的对应关系如表4所示。

表4不同第一荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度(au)的对应关系表

进一步判定染色试剂AO的有效显色浓度C_AO1和AO通道有效显色曝光时间T_AO1的优选范围。使AO通道荧光图像具有清晰明亮荧光信号的有效阈值范围为1500-15000au，根据第一荧光图像的平均荧光强度以及第一荧光图像的曝光情况，进一步判定：满足0.3μg/mL≤C_AO1≤4μg/mL，200ms≤T_AO1≤800ms的条件，可使经AO染色的MCF-7活细胞样品在第一荧光图像中有效显色。

实施例3确定PI有效显色浓度C_PI1范围及PI通道有效显色曝光时间T_PI1范围

3.1获取经PI染色的MCF-7死细胞样品

收集新鲜消化的MCF-7细胞，加入终浓度为0.1％Triton后振荡混匀1分钟后，即可获得MCF-7死细胞(细胞活率为0％)。

使用染色试剂PI(北京索莱宝，货号C0080)和PBS缓冲液配制不同浓度的PI染色液，调节至pH7.5。其中，各PI染色液的PI浓度分别为10μg/mL、50μg/mL、250μg/mL、1000μg/mL、5000μg/mL。

取5组MCF-7死细胞样品，按组依次编号，每组5份平行样品，每份样品体积为20μL。按照表5所示的对应关系向各MCF-7死细胞样品中分别加入20μL的PI染色液，轻轻混匀后直接吸取20μL液体加入Countstar Rigel计数板的样品槽内，得到经PI染色的MCF-7死细胞样品。

表5不同的经PI染色的MCF-7死细胞样品的染色条件

3.2荧光图像采集及分析

将经PI染色的MCF-7死细胞样品的计数板插入细胞分析仪自动进样孔中。分别在10ms、50ms、200ms、500ms、1000ms的曝光时间条件下，使用PI通道对每份经PI染色的MCF-7死细胞样品进行荧光图像采集，获得第二荧光图像。依据第二荧光图像进行图像分析。不同第二荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度的对应关系如表6所示。

表6不同第二荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度(单位au)的对应关系

注：*代表对应荧光图像过曝。

初步判定染色试剂PI的有效显色浓度C_PI1和PI通道有效显色曝光时间T_PI1的范围。依据荧光图像采集装置的线性范围确定，对于PI通道荧光图像的平均荧光强度而言，图像具有清晰明亮荧光信号的有效阈值范围为2000-10000au。根据第二荧光图像的平均荧光强度以及第二荧光图像的曝光情况(例如，荧光图像是否过曝)，初步判定染色试剂PI的有效显色浓度C_PI1和PI通道有效显色曝光时间T_PI1可在以下基础上进一步缩小取值范围：50μg/mL＜C_PI1＜1000μg/mL，100ms≤T_PI1＜500ms。

实施例4筛选PI有效显色浓度C_PI1的优选范围及PI通道有效显色曝光时间T_PI1的优选范围

4.1获取经PI染色的MCF-7死细胞样品

获取MCF-7死细胞样品，方法参见实施例3的步骤3.1。

配制不同浓度的PI染色液，PI染色液调节至pH＝7.5。PI染色液的PI浓度在实施3初步判定的染色试剂PI的有效显色浓度C_PI1的取值范围内选取，分别为80μg/mL、300μg/mL、800μg/mL。

取3组MCF-7死细胞样品，按组依次编号，每组设置3份平行样品，每份样品20μL。按照表7所示的对应关系向各MCF-7死细胞样品中分别加入20μL的PI染色液，制备不同的经PI染色的MCF-7死细胞样品，制备方法参见实施例3的步骤3.1。

表7不同MCF-7死细胞样品的染色条件

样品组编号	1	2	3
				PI染色液的PI浓度	80μg/mL	300μg/mL	800μg/mL

4.2荧光图像采集及分析

将步骤4.1制备的经PI染色的MCF-7死细胞样品的计数板插入细胞分析仪自动进样孔中。在实施例3初步判定的PI通道有效显色曝光时间T_PI1的取值范围内选取待测曝光时间，待测曝光时间分别为100ms、250ms、450ms。

分别在100ms、250ms、450ms的曝光时间条件下，使用PI通道对步骤4.1制备的经PI染色的MCF-7死细胞样品进行荧光图像采集，获得第二荧光图像。依据第二荧光图像进行图像分析。不同第二荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度的对应关系如表8所示。

表8不同第二荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度(au)的对应关系表

进一步判定染色试剂PI的有效显色浓度C_PI1和PI通道有效显色曝光时间T_PI1的优选范围。使PI通道荧光图像具有清晰明亮荧光信号的有效阈值范围为2000-10000au，根据第二荧光图像的平均荧光强度以及第二荧光图像的曝光情况，进一步判定：满足80μg/mL≤C_PI1≤800μg/mL，100ms≤T_PI1≤450ms的条件，可使经PI染色的MCF-7死细胞样品在第二荧光图像中有效显色。

实施例5确定AO有效去噪浓度C_AO2的范围及PI通道有效去噪曝光时间T_PI2的范围

5.1获取经AO染色的MCF-7死细胞样品

获取MCF-7死细胞样品，方法参见实施例3的步骤3.1。

使用染色试剂AO和PBS缓冲液配制不同浓度的AO染色液，AO染色液调节至pH＝7.5。其中，各AO染色液的AO浓度分别为0.2μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL。

取3组MCF-7死细胞样品，按组依次编号，每组5份平行样品，每份样品20μL。按照表8所示的对应关系向各MCF-7死细胞样品中分别加入20μL的AO染色液，得到经AO染色的MCF-7死细胞样品。

表8不同的经AO染色的MCF-7死细胞样品的染色条件

5.2荧光图像采集及分析

将经AO染色的MCF-7死细胞样品的计数板插入细胞分析仪自动进样孔中。分别在10ms、50ms、200ms、500ms、1000ms的曝光时间条件下，使用PI通道对每份经AO染色的MCF-7死细胞样品进行荧光图像采集，获得第三荧光图像。依据第三荧光图像进行图像分析。不同第三荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度的对应关系如表9所示。

表9不同第三荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度(单位au)的对应关系

初步判定染色试剂AO有效去噪浓度C_AO2的范围及PI通道有效去噪曝光时间T_PI2的范围。依据荧光图像采集装置的线性范围确定，对于PI通道荧光图像的平均荧光强度而言，图像无荧光信号的有效阈值范围为0-100au。平均荧光强度低于100au则认为PI通道荧光图像无荧光信号或无明显荧光信号。根据第三荧光图像的平均荧光强度以及第三荧光图像的曝光情况(例如，荧光图像是否过曝)，初步判定染色试剂AO的有效去噪浓度C_AO2的范围及PI通道有效去噪曝光时间T_PI2可在以下基础上进一步缩小取值范围：0.3μg/mL＜C_AO2＜4μg/mL，100ms≤T_PI2＜450ms。

实施例6筛选AO有效去噪浓度C_AO2的优选范围及PI通道有效去噪曝光时间T_PI2的优选范围

6.1获取染过AO染色液的MCF-7死细胞

获取MCF-7死细胞样品，方法参见实施例3的步骤3.1。

配制不同浓度的AO染色液，AO染色液调节至pH＝7.5。其中，AO染色液的AO浓度在实施例5初步判定的染色试剂AO的有效去噪浓度C_AO2的取值范围内选取，分别为0.3μg/mL、1.2μg/mL、4.0μg/mL。

取3组MCF-7死细胞样品，按组依次编号，每组设置3份平行样品，每份样品体积为20μL。按照表10所示的对应关系向各MCF-7死细胞样品中分别加入20μL的AO染色液，制备不同的经AO染色的MCF-7死细胞样品，制备方法参见实施例5的步骤5.1。

表10不同的经AO染色的MCF-7死细胞样品的染色条件

样品组编号	1	2	3
				AO染色液的AO浓度	0.3μg/mL	1.2μg/mL	4.0μg/mL

6.2荧光图像采集及分析

将步骤6.1制备的经AO染色的MCF-7死细胞样品的计数板插入细胞分析仪自动进样孔中。在实施例5初步判定的AO通道有效去噪曝光时间T_PI2的取值范围内选取待测曝光时间，待测曝光时间分别为100ms、250ms、450ms。

分别在100ms、250ms、450ms的曝光时间条件下，使用PI通道对步骤6.1制备的经AO染色的MCF-7死细胞样品进行荧光图像采集，获得第三荧光图像。依据第三荧光图像进行图像分析。不同第三荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度的对应关系如表11所示。

表11不同第三荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度的对应关系表

进一步判定染色试剂AO的有效去噪浓度C_AO2的优选范围及PI通道有效去噪曝光时间T_PI2的优选范围。使PI通道荧光图像无荧光信号的有效阈值范围为0-100au，根据第三荧光图像的平均荧光强以及第三荧光图像的曝光情况，进一步判定：满足0.3μg/mL≤C_AO2≤4.0μg/mL，100ms≤T_PI2≤450ms的条件，可使经AO染色的MCF-7死细胞样品在第三荧光图像中无荧光信号显示或无明显荧光信号显示，即可使经AO染色的MCF-7死细胞样品在第三荧光图像中为非显色状态。

实施例7利用AO/PI双染色法筛选AO染色液目标浓度C_AO和PI染色液目标浓度C_PI的范围，以及AO通道目标曝光时间T_AO和PI通道的目标曝光时间T_PI的范围

7.1获取经AO/PI双染色的MCF-7死细胞

获取MCF-7死细胞样品，方法参见实施例3的步骤3.1。

使用染色试剂AO、PI和PBS缓冲液配制不同浓度的AO/PI混合染色液，调节至pH＝7.5。其中，各AO/PI混合染色液的AO浓度在实施例6初步判定的染色试剂AO的有效去噪浓度C_AO2的取值范围内选取，分别为0.3μg/mL、1.2μg/mL、4.0μg/mL；各AO/PI混合染色液的PI浓度在实施例4初步判定的染色试剂PI的有效显色浓度C_PI1的取值范围内选取，分别为80μg/mL、300μg/mL、800μg/mL。

取3组MCF-7死细胞样品，按组依次编号，每组8份平行样品，每份样品体积20μL。按照表12所示的对应关系向各MCF-7死细胞样品中分别加入20μL的AO/PI混合染色液，轻轻混匀后直接吸取20μL液体加入Countstar Rigel计数板的样品槽内，得到经AO/PI双染色的MCF-7死细胞样品。

表12不同的经AO/PI双染色的MCF-7死细胞样品的染色条件

7.2荧光图像采集及分析

选取待测曝光时间。在实施例2优选的AO通道有效显色曝光时间T_AO1的取值范围内选取AO通道待测曝光时间，AO通道待测曝光时间分别为200ms、800ms。根据实施例4优选的PI通道有效显色曝光时间T_PI1的取值范围和实施例6优选的PI通道有效去噪曝光时间T_PI2的取值范围的交集确定PI通道待测曝光时间的取值范围为100-450ms，在该取值范围内选取PI通道待测曝光时间，分别为100ms、450ms。

将步骤7.1制备的经AO/PI双染色的MCF-7死细胞样品置于细胞分析仪载物台上。分别在200ms、800ms的曝光时间条件下，使用AO通道对步骤7.1制备的经AO/PI双染色的MCF-7死细胞样品进行荧光图像采集，获得第一目标荧光图像。分别在100ms、450ms的曝光时间条件下，使用PI通道对步骤7.1制备的经AO/PI双染色的MCF-7死细胞样品进行荧光图像采集，获得第二目标荧光图像。依据第一目标荧光图像及其匹配的二目标荧光图像进行图像分析。不同第一、二目标荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度的对应关系如表13所示。

表13不同第一、二目标荧光图像的染色条件及曝光条件与平均荧光强度(单位au)的对应关系表

注：组合1：0.3μg/mL(AO)+80μg/mL(PI)；组合2：0.3μg/mL(AO)+800μg/mL(PI)；组合3：4.0μg/mL(AO)+80μg/mL(PI)；组合4：4.0μg/mL(AO)+800μg/mL(PI)；FL1：AO通道；FL2:PI通道。

进一步判定AO/PI混合染色液的AO目标浓度C_AO和PI目标浓度C_PI的范围，以及AO通道目标曝光时间T_AO和PI通道目标曝光时间T_PI的范围。

确定判定阈值范围：对于AO通道荧光图像的平均荧光强度而言，其图像无荧光信号的有效阈值范围为0-500au；对于PI通道荧光图像的平均荧光强度而言，其图像具有清晰明亮荧光信号的有效阈值范围为2000-10000au。根据第一、二目标荧光图像的平均荧光强以及第二目标荧光图像的曝光情况，进一步判定：满足0.3μg/mL≤C_AO≤4.0μg/mL，80μg/mL≤C_PI≤800μg/mL，200ms≤T_AO≤800ms，100ms≤T_PI≤450ms的条件，可使经AO/PI双染色的MCF-7死细胞样品在第一、二目标荧光图像中有效显色，即在第一目标荧光图像中，经AO/PI双染色的死细胞无荧光信号显示，在第二目标荧光图像中，经AO/PI双染色的死细胞有清晰明亮的荧光信号显示。

图10是根据本说明书一些实施例所示的使用含4.0μg/mL染色试剂AO和800μg/mL染色试剂PI的混合染色液进行染色的死细胞样品分别在AO通道和PI通道采集的荧光图像。图10A为AO通道采集的图像，几乎观察不到荧光信号。图10B为PI通道采集的图像，荧光信号清晰明亮。

实施例8不同AO/PI混合染色液成分配比对细胞活率测试准确性的影响

8.1CHO细胞处理

收集贴壁生长的CHO细胞(购自ATCC)，加入0.25％的胰酶，在37℃条件下消化3min后终止消化。使用含10％血清的CHO培养液洗涤离心后重悬，获得新鲜消化的CHO细胞。消化后的CHO细胞放置于4℃冰箱中，后续步骤分别取放置0天、6天、7天、18天的CHO细胞作为待测CHO细胞进行染色及活率检测实验。

8.2用对照混合染色液对CHO细胞进行染色实验

收集步骤8.1的待测CHO细胞，将待测CHO细胞一式两份，每份细胞体积为100μL，离心后分别用100μL CHO培养液和生理盐水重悬，并分别加入100μL对照混合染色液(含0.1μg/mL染色试剂AO和200μg/mL染色试剂PI)，轻轻混匀后直接加入Countstar Rigel计数板的样品槽内。

8.3对照混合染色液染色的CHO细胞活率检测

选择细胞活率检测方法。使用荧光成像设备采集细胞样品的AO通道荧光图像和PI通道荧光图像，基于AO通道及PI通道荧光图像的图像分析，统计计算细胞活率。

选择荧光成像设备及曝光时间。采用Countstar Rigel全自动荧光细胞分析仪进行图像采集。AO通道曝光时间设定为600ms，PI通道曝光时间设定为250ms。

对于培养基重悬的经对照混合染色液染色的CHO细胞样品：在其染色重悬后立即(放置0分钟)进行第一次细胞活率检测，重复检测三次，实验结果见表14；在其染色重悬并放置5min后进行第二次细胞活率检测，重复检测三次，实验结果见表15。

对于生理盐水重悬的经对照混合染色液染色的CHO细胞样品：在其染色重悬后立即(放置0分钟)进行第一次细胞活率检测，重复检测三次，实验结果见表16；在其染色重悬并放置5min后进行第二次细胞活率检测，重复检测三次，实验结果见表17。

表14.细胞活率结果统计(％)

表15.细胞活率结果统计(％)

表16.细胞活率结果统计(％)

表17.细胞活率结果统计(％)

8.4用测试混合染色液对CHO细胞进行染色实验

收集步骤8.1的待测CHO细胞，将待测CHO细胞一式两份，每份细胞体积为100μL，离心后分别用100μL CHO培养液和生理盐水重悬，并分别加入100μL测试混合染色液(含1μg/mL染色试剂AO和400μg/mL染色试剂PI)，轻轻混匀后直接加入Countstar Rigel计数板的样品槽内。

测试混合染色液的配置方法如下：

1)配置AO母液：称取500mg AO，溶于PBS中并用PBS定容至500mL，混合均匀，得到终浓度为1mg/mL的AO母液，-20℃避光保存；

2)配置PI母液：称取500mg PI，溶于PBS中并用PBS定容至500mL，混合均匀，得到终浓度为1mg/mL的PI母液，-20℃避光保存；

3)配置AO/PI混合染色液：取0.5mL的AO母液、200mL的PI母液与PBS混合，并用PBS定容至500mL，混合均匀，得到所述测试混合染色液。

8.5测试混合染色液染色的CHO细胞活率检测

细胞活率检测方法、荧光成像设备及曝光时间的选择参见步骤8.3。

对于培养基重悬的经测试混合染色液染色的CHO细胞样品：在其染色后立即(放置0分钟)进行第一次细胞活率检测，重复检测三次，实验结果见表18；在其染色并放置5min后进行第二次细胞活率检测，重复检测三次，实验结果见表19。

对于生理盐水重悬的经测试混合染色液染色的CHO细胞样品：在其染色后立即(放置0分钟)进行第一次细胞活率检测，重复检测三次，实验结果见表20；在其染色并放置5min后进行第二次细胞活率检测，重复检测三次，实验结果见表21。

表18.细胞活率结果统计(％)

表19.细胞活率结果统计(％)

表20.细胞活率结果统计(％)

表21.细胞活率结果统计(％)

图6是根据本说明书一些实施例所示的对照染色液在不同条件下测试的细胞活率曲线图，图6是根据表14至表17的统计数据绘制的。图7是根据本说明书一些实施例所示的对照染色液在不同重悬条件下的荧光图像。图7A至图7D为培养基重悬的经对照混合染色液染色的CHO细胞样品的AO通道荧光图像；在细胞消化后至染色重悬前，图7A至图7D所对应的CHO细胞样品在4℃条件下分别放置0、6、7、18天。图7E至图7H为生理盐水重悬的经对照混合染色液染色的CHO细胞样品的AO通道荧光图像；在细胞消化后至染色重悬前，图7E至图7H所对应的CHO细胞样品在4℃条件下分别放置0、6、7、18天。由图6和图7可以看出，使用对照染色液时，用培养基重悬和用生理盐水重悬获得的细胞活率有明显差异，表明使用对照染色液对重悬液的选择有明显限制，重悬液对细胞活率测定结果有明显影响。当采用生理盐水作为重悬液时，测得的细胞活率相对于培养基来说明显更低，不够准确。

图8是根据本说明书所提出的测试染色液在不同条件下测试的细胞活率曲线图，图8是根据表18至表21的统计数据绘制的。图9是根据本说明书一些实施例所示的测试染色液在不同重悬条件下的荧光图像。图9A至图9D为培养基重悬的经测试混合染色液染色的CHO细胞样品的AO通道荧光图像；在细胞消化后至染色重悬前，图9A至图9D所对应的CHO细胞样品在4℃条件下分别放置0、6、7、18天。图9E至图9H为生理盐水重悬的经测试混合染色液染色的CHO细胞样品的AO通道荧光图像；在细胞消化后至染色重悬前，图9E至图9H所对应的CHO细胞样品在4℃条件下分别放置0、6、7、18天。由图8和图9可以看出，使用本说明书提供的染色液并采用生理盐水作为重悬液时，测得的细胞活率显著高于对照染色液，说明结果更加准确。并且，使用本说明书一些实施例提供的染色液时，用培养基重悬和用生理盐水重悬获得的细胞活率无明显差异，表明使用本说明书一些实施例提供的染色液对重悬液的选择没有明显限制，降低了重悬液对细胞活率测定结果的影响。

由图6至图9的对比结果可知，在图像采集条件相同的前提下，使用对照混合染色液时，与培养基重悬相比，生理盐水重悬后的CHO细胞样品荧光强度有明显下降。可以理解的是，当图像局部的荧光强度降低至机器识别线性范围以外时，可能会导致特征参数(如活细胞数量、细胞活率)检测计算的准确性降低。

具体的说，就对照染色液而言，与培养基重悬相比，生理盐水重悬使CHO细胞样品经染色试剂AO染色发出的荧光明显减弱，即生理盐水重悬对染色试剂AO染色的影响高于染色试剂PI，这可能导致检测计算的活细胞数量、细胞活率偏低，影响准确率。本说明书一些实施例提供的染色液可改善上述问题。在培养基重悬和生理盐水重悬条件下，本说明书一些实施例提供的染色液可使参数计算结果保持基本一致，生理盐水重悬所导致的荧光强度变化较小，减少了因调整重悬液导致特征参数检测及计算结果的一致性和准确性降低的隐患，从而使结果更加准确。

上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。

同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。

此外，除非权利要求中明确说明，本说明书所述处理元素和序列的顺序、数字字母的使用、或其他名称的使用，并非用于限定本说明书流程和方法的顺序。尽管上述披露中通过各种示例讨论了一些目前认为有用的发明实施例，但应当理解的是，该类细节仅起到说明的目的，附加的权利要求并不仅限于披露的实施例，相反，权利要求旨在覆盖所有符合本说明书实施例实质和范围的修正和等价组合。例如，虽然以上所描述的系统组件可以通过硬件设备实现，但是也可以只通过软件的解决方案得以实现，如在现有的服务器或移动设备上安装所描述的系统。

同理，应当注意的是，为了简化本说明书披露的表述，从而帮助对一个或多个发明实施例的理解，前文对本说明书实施例的描述中，有时会将多种特征归并至一个实施例、附图或对其的描述中。但是，这种披露方法并不意味着本说明书对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。

一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。

针对本说明书引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本说明书作为参考。与本说明书内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外，对本说明书权利要求最广范围有限制的文件(当前或之后附加于本说明书中的)也除外。需要说明的是，如果本说明书附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本说明书所述内容有不一致或冲突的地方，以本说明书的描述、定义和/或术语的使用为准。

最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。

Claims (11)

1.一种确定染色液成分配比的方法，其特征在于，所述染色液包括第一染色试剂和第二染色试剂，所述方法包括：

基于一组或多组目标荧光图像，确定所述第一染色试剂在所述染色液中的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂在所述染色液中的一个或多个目标浓度，其中：

所述一组或多组目标荧光图像是使用一种或多种混合染色液对一个或多个死细胞样品分别染色后采集的，

所述一种或多种混合染色液是用所述第一染色试剂和所述第二染色试剂按照一个或多个候选浓度组合配制而成的，并且

所述候选浓度组合是由以下步骤确定的：

确定所述第一染色试剂的用于活细胞显色的一个或多个第一有效显色浓度；

确定所述第二染色试剂的用于死细胞显色的一个或多个第二有效显色浓度；

确定所述第一染色试剂的一个或多个有效去噪浓度；以及

基于所述一个或多个第一有效显色浓度、所述一个或多个第二有效显色浓度和所述一个或多个有效去噪浓度，确定所述第一染色试剂和所述第二染色试剂的满足预设条件的一个或多个候选浓度组合。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定所述第一染色试剂的用于活细胞显色的一个或多个第一有效显色浓度包括：

基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效浓度中确定所述一个或多个第一有效显色浓度，其中，所述一个或多个第一荧光图像，是以使用一种或多种第一染色液对一个或多个活细胞样品染色后通过对应于所述第一染色试剂的第一通道采集的，所述一种或多种第一染色液是用所述第一染色试剂按照所述一个或多个第一候选有效浓度配制而成的。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基于一个或多个第一荧光图像，从一个或多个第一候选有效浓度中确定所述一个或多个第一有效显色浓度包括：

对于所述一个或多个第一荧光图像中每个第一荧光图像，

确定所述第一荧光图像的平均荧光强度；

确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；

响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第一荧光图像的第一候选有效浓度为一个所述第一有效显色浓度。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定第二染色试剂的用于死细胞显色的一个或多个第二有效显色浓度包括：

基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效浓度中确定所述一个或多个第二有效显色浓度，其中，所述一个或多个第二荧光图像，是以使用一种或多种第二染色液对一个或多个活细胞样品染色后通过对应于所述第二染色试剂的第二通道采集的，所述一种或多种第二染色液是用所述第二染色试剂按照所述一个或多个第二候选有效浓度配制而成的。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基于一个或多个第二荧光图像，从一个或多个第二候选有效浓度中确定所述一个或多个第二有效显色浓度包括：

对于所述一个或多个第二荧光图像中每个第二荧光图像，

确定所述第二荧光图像的平均荧光强度；

确定所述平均荧光强度是否处于预设范围内；以及

响应于确定所述平均荧光强度处于预设范围内，指定对应于所述第二荧光图像的第二候选有效浓度为一个所述第二有效显色浓度。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定所述第一染色试剂和所述第二染色试剂的满足预设条件的一个或多个候选浓度组合包括：

基于所述一个或多个第一有效显色浓度与所述一个或多个有效去噪浓度的交集，确定所述第一染色试剂的一个或多个候选有效浓度；以及

基于所述第一染色试剂的一个或多个候选有效浓度和所述第二染色试剂的一个或多个第二有效显色浓度，确定所述一个或多个候选浓度组合。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一组或多组目标荧光图像中的每组目标荧光图像包括：

第一目标荧光图像和第二目标荧光图像，其中所述第一目标荧光图像是通过对应于第一染色试剂的第一通道采集的，所述第二目标荧光图像是通过对应于第二染色试剂的第二通道采集的。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基于一组或多组目标荧光图像，确定所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂的一个或多个目标浓度包括：

对于所述一组或多组目标荧光图像中的每组目标荧光图像，

获取所述第一目标荧光图像的第一平均荧光强度以及所述第二目标荧光图像的第二平均荧光强度；

确定所述第一平均荧光强度是否在第一预设范围内；

确定所述第二平均荧光强度是否在第二预设范围内；

响应于确定所述第一平均荧光强度在所述第一预设范围内且所述第二平均荧光强度在所述第二预设范围内，确定所述第一目标荧光图像和所述第二目标荧光图像对应的候选浓度组合作为目标浓度组合；

基于一个或多个所述目标浓度组合，确定所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂的一个或多个目标浓度。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，当所述第一染色试剂的荧光基团与所述第二染色试剂的荧光基团之间的距离小于距离阈值时，存在荧光共振能量转移效应。

10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，还包括：

基于所述第一染色试剂的一个或多个目标浓度和所述第二染色试剂的一个或多个目标浓度，确定所述第一染色试剂和所述第二染色试剂的用于制作混合染色液的一个或多个目标混合浓度比例。

11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一染色试剂为吖啶橙，所述第二染色试剂为碘化丙啶。

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