CN114622033A - 黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记及其应用，SNP标记是yb637005，位于黄瓜Gy14_V2参考基因组第4号染色体637005bp处，yb637005处碱基为C的黄瓜成熟果皮为黄棕色，yfSNP01处碱基为T的黄瓜成熟果皮为白绿色。一组用于检测权利要求1所述的与黄瓜成熟果皮紧密连锁的一个SNP标记的dCAPs引物对，包括yb637005的正向引物5′‑CCAATAAATTACCTGTTTCCAAGG‑3′和yb637005的反向引物5′‑TAACTATTTGAGAGCTGATTTGAAT‑3′。所述的dCAPs引物对在黄瓜成熟果皮颜色分子标记辅助育种中的应用。通过本发明，本发明利用基因组学和群体遗传学筛选到与黄瓜成熟果皮颜色紧密连锁的SNP标记，通过测序转化为dCAPs标记的方法鉴定黄瓜基因型，且该标记为共显性标记，可有效区分纯合体和杂合体，加速黄瓜果皮颜色分子育种进程。

Description

黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及与黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记及其应用，具体为与黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记、检测SNP标记的dCAPS引物对及其应用，属于基因工程及分子生物学领域。

背景技术

黄瓜（Cucumis sativus L.）为葫芦科甜瓜属一年生攀缘性草本植物，起源于温暖湿润的喜马拉雅山南麓，是我国广泛栽培的主要蔬菜作物。随着人们生活水平的逐渐提高，消费者对于黄瓜的外观品质多样性要求也越来越高。果皮颜色作为黄瓜重要的外观品质性状，直接影响着消费者的选择。

黄瓜嫩果皮颜色主要为墨绿、绿、浅绿和乳白色。孙小镭等（2004年于《园艺学报》上发表的题为“黄瓜嫩果皮色与色素含量的关系”文章）通过对黄瓜果皮果色的颜色差异的目测法进行分类以及对果皮色素含量的测定发现叶绿素含量与黄瓜嫩果皮颜色密切相关。黄瓜果实发育30~45天后进入成熟期，果皮颜色主要呈现乳白色、白色、浅绿色、绿色、深绿色、黄色、橙色以及红色等。Hutchins（1940年于Journal of Agricultural Research上发表的题为“Inheritance in the cucumber”文章）最早将成熟果果皮分为红色、橙色、黄色及奶油色四大类型，并推测控制这些颜色形成的是两个显性等位基因R（成熟瓜红色果皮）与C（奶油色果皮基因），当基因型为R_Cc时成熟果皮为红色，R_cc时成熟果皮为橙色，rrC_时成熟果实为黄色，rrcc时成熟果实为奶油色。Peterson和Pike（1992年于 Journal ofthe American Society for Horticultural Science上发表的题为“Inheritance ofGreen Mature Seed-stage Fruit Color in Cucumis sativus L”文章）的研究发现：黄瓜成熟果皮颜色由两个主效基因R和Gn控制，当基因型为R_ _ _ _ _时成熟黄瓜果皮为红色，当基因型为rrgngn时为绿色，当基因型为rrGnGn时为奶油色，当基因型为rrGngn时果皮颜色介于绿色与奶油色之间。Li等（2013年于Theoretical and Applied Genetics上发表的题为“Fine mapping of the pleiotropic locus B for black spine and orangemature fruit color in cucumber identifies a 50 kb region containing a R2R3-MYB transcription factor”文章）认为单显性基因B同时控制黄瓜黑刺与成熟果皮橙色两个性状，并将B基因定位到了4号染色体上~50 kb区间内，推测一个编码R2R3-MYB的转录因子为候选基因。刘书林等（2014年于《园艺学报》上发表的题为“成熟黄瓜果皮红色性状的遗传分析及其基因定位”文章）认为黄瓜成熟果皮红色性状由显性单基因R控制，红色对黄色为显性，并将R基因定位到黄瓜4号染色体上~213.4kb区间内，含有30个候选基因。然而，相比于嫩果皮颜色、果肉胡萝卜素含量等果实品质性状，有关黄瓜成熟果皮颜色性状的遗传机制研究较为匮乏。探明黄瓜成熟果果皮颜色形成的遗传机制、基因效应是今后进行分子遗传改良和育种利用的基础。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有不足，提供一个与黄瓜成熟果皮颜色连锁的SNP标记并提供用于扩增上述SNP标记的dCAPs引物对，即，黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

与黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记，SNP标记是yb637005，位于黄瓜Gy14_V2参考基因组第4号染色体637005bp处；yb637005处碱基为C的黄瓜成熟果皮为黄棕色，碱基为T的黄瓜成熟果皮为白绿色。

一组用于检测所述的与黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记的dCAPs引物对，所述dCAPs引物对包括：

yb637005的正向引物5′-CCAATAAATTACCTGTTTCCAAGG-3′，

yb637005的反向引物5′-TAACTATTTGAGAGCTGATTTGAAT-3′。

前述的dCAPS引物对在黄瓜成熟果皮颜色分子标记辅助育种中的应用，具体方法是：

（1）提取待检测黄瓜基因组DNA；

（2）以待检测黄瓜基因组DNA为模板，利用所述的dCAPs引物对进行PCR扩增；

（3）使用TaqI限制性内切酶对PCR产物进行酶切；

（4）将酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据电泳检测结果确定黄瓜成熟果皮颜色，如果条带与Pepino一致，则成熟果皮为黄棕色品种；如果条带与Zaoer-N一致，则为成熟果皮为白绿色。

所述的dCAPs引物对在克隆黄瓜成熟果皮颜色基因中的应用。

所述的dCAPs引物对在选育黄瓜成熟果黄棕色果皮新品种中的应用。

本发明方法先进科学，相对于现有技术，具有如下有益效果：利用基因组学和群体遗传学筛选到与黄瓜成熟果黄棕色紧密连锁的SNP标记，通过测序和转化为dCAPs标记的方法鉴定黄瓜基因型，且这个SNP标记为共显性标记，可以区分纯合体和杂合体，加速黄瓜果皮颜色的定向选育进程。

与现有的申请号为201811283020.9、名称为一种鉴定与黄瓜嫩果皮色相关的QTL及基因的方法的专利文件研究黄瓜嫩果皮的性状相比，本发明关注成熟果皮颜色。

与现有申请号202110640520.9、名称为种与黄瓜果皮颜色基因连锁的分子标记及应用的申请文件中在3号染色体上的KASP分子标记相比，本发明获得的SNP标记在黄瓜第4号染色体上，位置不同，且分子标记类型不同。

附图说明

图1为亲本及其杂交后代的果皮颜色（Pepino为黄棕色亲本，Zaoer-N为白绿色亲本，F₁：Pepino×Zaoer-N，F₂：F₁自交后代）；

图2为黄瓜黄棕色果皮yb基因的初步定位；

图3为黄瓜黄棕色果皮yb基因的精细定位（左侧为重组株编号，右侧为重组株成熟果皮颜色）；

图4为yb637005在F₂中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测；

图5为yb637005在77份黄瓜自交系中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测（三角型标注的泳道对应的为白绿色果皮自交系，其余均为黄色果皮自交系）。

具体实施方式

以下结合实施例对发明作进一步详细说明。

实施例一

一、遗传群体构建和表型统计

Pepino（父本）是成熟果皮为黄棕色的美国露地型黄瓜，Zaoer-N（母本）成熟果皮为白绿色的华南型黄瓜自交系，表型均稳定遗传（图1）。本实施案例利用两个亲本配置杂交组合F₁及F₂代分离群体。对亲本、F₁、F₂的成熟果实果皮颜色进行统计。根据表型调查，Pepino为黄棕色，Zaoer-N果皮为白绿色，F₁均为黄棕色，在359株F₂代分离群体中，261株为黄棕色果皮表型，98株为白绿色果皮表型，经卡方检验符合3:1孟德尔分离定律（χ²=0.0136），表明成熟黄瓜黄棕色果皮性状由1对显性核基因控制，且黄棕色对白绿色为显性。

二、标记开发及基因定位

1、双亲全基因组重测序

使用Highseq2500测序仪对Pepino和Zaoer-N进行全基因组DNA重测序，以黄瓜GY14_V2为参考基因组分析序列差异。

2、黄瓜基因组DNA提取

采用CTAB法提取亲本、F₁及F₂代分离群体的生长点嫩叶的总DNA。搜集黄瓜嫩叶放入2 mL离心管中，研磨成粉末，加入750 μL CTAB裂解液，混匀后在65℃水浴1h，期间上下颠倒使其充分混匀。向上述匀浆液中加入750 μL氯仿，混匀后室温静置10 min，12000 rpm离心5 min。吸取400 μL上清液至新的1.5 mL离心管，加入等体积的异丙醇，混合均匀后在-20℃放置1h。取出后，12000 rmp离心5 min。弃上清液，加入750 μL的75%乙醇，再次12000 rpm离心5 min，弃上清，室温下干燥直至乙醇完全挥发，加入100 μL双蒸水混合均匀后，置于-20℃备用。

3、分子标记开发及基因定位

在F₂分离群体中随机挑选成熟果皮黄棕色植株和成熟果皮白绿色植株各20株，构建黄棕色果皮池和白绿色果皮池。基于Ren等(2009)和Cavagnaro等(2010)发表的黄瓜SSR标记，采用实验室前期合成的平均分布于黄瓜7条染色体上的221对SSR分子标记在黄棕色果皮池和白绿色果皮池中进行PCR扩增，其反应体系为：基因组DNA 200 ng，引物1 μL2 uM，0.2 μL2.5 mM dNTPs，1.0 μL 10×PCR Buffer，0.5 U rTaq酶，总反应体系为10 μL。采用梯度PCR体系进行扩增，反应程序为：95℃预变性3 min，94℃变性45 s，68-58℃退火1min，72℃延伸1 min，循环6次；94℃变性30 s，58-50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环8次；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环20次；72℃延伸7 min，4℃保存。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，最终将成熟果皮黄棕色基因初步定位在4号染色体SSR22231和InDel166394（图2）。

随后采用SSR22231和InDel166394对1800株F₂代群体进行基因型鉴定，获得12个重组株。在区间内开发了12个新的SNP分析标记并对所有重组株进一步分型，结合表型最终将短节间基因定位至最SNP11与SNP12之间，物理距离17 kb（图3）。通过对双亲区间内的序列进行克隆与比对分析，仅发现一个多态性SNP，因而将该其命名为yb637005。利用该标记有助于在黄瓜苗期鉴定黄瓜表型，加快黄瓜果皮颜色的遗传育种进程。

实施例二：

（1）选取43株Pepino×Zaoer-N已知果皮颜色表型的F₂单株，其中31株为黄色果皮表型，12株为白绿色果皮表型；

（2）分别提取上述43株单株及亲本基因组DNA，使用yb637005所衍生的dCAPs标记进行PCR扩增，然后用TaqI限制性内切酶对扩增产物进行酶切；

（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明：成熟果皮为黄棕色的F₂单株与Pepino酶切结果一致或为杂合带型（与F₁一致），可以将成熟果皮黄棕色单株中的纯合株和杂合株区分开，成熟果皮白绿色F₂单株与Zaoer-N酶切一致（图4）。

实施例三：

（1）随机选取77份黄瓜种质资源，包括12份绿色果皮自交系和65份黄色色果皮自交系；

（2）分别提取上述77个品种及Pepono和Zaoer-N的基因组DNA，使用yb637005所衍生的dCAPS标记进行PCR扩增，然后用TaqI限制性内切酶对扩增产物进行酶切；

（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明：60份成熟果皮黄棕色株自交系与Pepino酶切条带完全一致，5份成熟果皮黄棕色株自交系为兼有Pepino与Zaoer-N的杂合带型，12份成熟果皮为白绿色自交系与Zaoer-N酶切条带完全一致（图5）。

本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明保护的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaataaatt acctgtttcc aagg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aactatttga gagctgattt gaat 24

Claims (6)

1.与黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记，其特征在于，SNP标记是yb637005，位于黄瓜Gy14_V2参考基因组第4号染色体637005bp处；yb637005处碱基为C的黄瓜成熟果皮为黄棕色，碱基为T的黄瓜成熟果皮为白绿色。

2.一组用于检测权利要求1所述的与黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个SNP标记的dCAPs引物对，其特征在于，所述dCAPs引物对包括：

yb637005的正向引物5′-CCAATAAATTACCTGTTTCCAAGG-3′，

yb637005的反向引物5′-TAACTATTTGAGAGCTGATTTGAAT-3′。

3.权利要求2所述的dCAPs引物对在黄瓜成熟果皮颜色分子标记辅助育种中的应用。

4.如权利要求3述的应用，其特征在于，具体方法是：

（1）提取待检测黄瓜基因组DNA；

（2）以待检测黄瓜基因组DNA为模板，利用dCAPs引物对，进行PCR扩增；

（3）使用TaqI限制性内切酶对yb637005引物扩增的PCR产物进行酶切；

（4）将酶切后的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果条带与Pepino一致，则为成熟果皮为黄棕色；如果条带与Zaoer-N一致，则成熟果皮为白绿色。

5.权利要求2所述的dCAPs引物对在克隆黄瓜成熟果皮颜色基因中的应用。

6.权利要求2所述的dCAPs引物对在选育不同果皮颜色黄瓜新品种中的应用。

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