CN114621874B - 一种微藻培养基及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微藻培养基及应用，每升培养基中包括氮盐60‑120mg，磷盐5‑12mg，铁盐1.5‑5mg，Na2EDTA 5‑15mg，硅酸钠0‑10mg,甲酸钙1‑15mg，醋酸钠0.5‑1.5g，戊二醛5‑50mg，短链脂肪酸盐型防腐剂1.5‑15mg，其余为海水，本方案的培养基中突破性引入非藻类培养领域的防腐剂、菌消毒剂、抗菌剂等，并经过大量实验优选出上述成分、量比关系，在后续实验中发现该方案培养基可在非严格性无菌条件下显著促进微藻的生长，效果出人意料。

Description

一种微藻培养基及应用
技术领域
本发明涉及藻种培养技术领域，具体涉及一种微藻培养基及应用。
背景技术
微藻，大多为大小不超过10微米的浮游单细胞藻类。许多海洋微藻因其体积小，富含不饱和脂肪酸且生态适应性强，长速度快，适于大规模繁殖，被认为是海产动物人工育苗的理想饵料，用作贻贝、牡蛎、泥蚶、对虾等名贵水产品的优质开口饲料。
目前微藻培养的缺点在于：采用传统的自养培养基，藻的浓度生长不够高；而异养培养或兼养培养，都需要严格的无菌条件，需要较高的成本。为降低对无菌性的要求，部分企业在培养基中增加氨苄青霉素、头孢噻肟等抗菌剂，如申请号为CN2018102345230的专利文件公开培养基中加入醚菌酯、氨苄青霉素、头孢噻肟等抗菌剂的方案，成本高，且作用单一，其他企业与也存在在植物培养中加入壳聚糖等用作抗菌的方案，其同样不能对生长速度造成较大的影响。且鉴于微藻的种类多样化以及培养条件的多样化，适用藻类培养的抗菌剂目前公开较少，且适用的微藻种类也不明确，此外不能对微藻繁殖生长速度造成较大的影响。
对此，本司拟开发一种能促进微藻生长而又对无菌条件不那么严格的培养基。
发明内容
为解决上述至少一个技术缺陷，本发明提供了如下技术方案：
本申请文件公开一种微藻培养基，每升培养基中包括氮盐60-120mg，磷盐5-12mg，铁盐 1.5-5mg，Na2EDTA 5-15mg，硅酸钠0-10mg,甲酸钙1-15mg，醋酸钠0.5-1.5g，戊二醛5-50mg，短链脂肪酸盐型防腐剂1.5-15mg，其余为海水。
本方案的培养基中突破性引入非藻类培养领域的防腐剂、菌消毒剂、抗菌剂等，并经过大量实验优选出上述成分、量比关系，在后续实验中发现该方案培养基可在非严格性无菌条件下显著促进微藻的生长，效果出人意料。
常规而言，甲酸钙，常用作饲料添加剂，适用于各类动物，具有酸化、防霉、抗菌等功效，脱氢乙酸钠常用作防腐剂、防腐杀虫剂、食品添加剂，丙酸钠可用于食品防腐，戊二醛用作菌消毒剂，本发明人突破性将动物或食品用的抗菌剂、防腐剂等引入培养基中，并经大量实验后确定了抗菌剂、防腐剂的具体成分及量比关系，降低培养过程对无菌性的要求。方案中醋酸钠常用于藻或菌类培养时的有机碳源，氮盐、磷酸盐起到氮源、磷源等作用。
进一步，所述短链脂肪酸盐型防腐剂包括脱氢乙酸钠、丙酸钠，每升海水中脱氢乙酸钠0.5-5mg、丙酸钠1-10mg。
进一步，所述氮盐包括硝酸盐、铵盐或尿素中一种或多种。
进一步，所述硝酸盐包括硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙中一种或多种，所述铵盐包括硝酸铵、氯化铵、硫酸铵中一种或多种。
进一步，所述铁盐包括氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵中一种或多种。
进一步，所述磷盐包括含磷酸一氢根或磷酸二氢根的钠盐、钾盐中一种或多种。
进一步，每升培养基中包括NaNO3 60-120mg，NaH2PO4 5-12mg，柠檬酸铁铵1.5-5mg， Na2EDTA 5-15mg，硅酸钠0-10mg,甲酸钙1-15mg，脱氢乙酸钠0.5-5mg、丙酸钠1-10mg，醋酸钠0.5-1.5g，戊二醛5-50mg，其余为海水。
本申请公开上述微藻培养基在小球藻、金藻、小硅藻或紫球藻培养中的应用，其中在培养硅藻、金藻时，硅酸钠需添加，在其他微藻培养中硅酸钠可选择性添加。
进一步，所述小硅藻包括海链藻、角毛藻、三角褐指藻、菱形藻。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明培养基中突破性引入抗菌剂、防腐剂等组分，降低培养过程对无菌性的要求，且能大幅促进微藻的生长。
附图说明
图1是培养例1中金藻数量变化示意图；
图2是培养例2中海链藻数量变化示意图；
图3是培养例3中蛋白核小球藻数量变化示意图；
图4是培养例4中金藻数量变化示意图；
图5是培养例5中蛋白核小球藻数量变化示意图；
其中，图中横轴为时间，单位：d；纵轴为数量，单位：104cells/mL。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
下面以多组具体培养例验证本培养基的方案。
一、培养例1
实施例1
本实施例以球等鞭金藻3011种子为例，具体步骤如下：
1.培养容器的消毒，本实施例采用的是18L的PC矿泉水桶，消毒方式为1ppm的有效氯浓度的二氧化氯消毒6h。
2.按照每升培养基中含NaNO3 60mg，NaH2PO4 5mg，柠檬酸铁铵1.5mg，Na2EDTA5mg，硅酸钠5mg,甲酸钙1mg，脱氢乙酸钠0.5mg、丙酸钠1mg，醋酸钠0.5g，戊二醛5mg，其余为海水的标准配置培养基。对照组1的培养基为f/2+5mg/L硅酸钠，对照组2的培养基为f/2+5mg/L 硅酸钠+醋酸钠0.5g/L。实施例及对照组均采用0.22μm的膜过滤灭菌，相同条件下培养。
3.将处于对数期的金藻3011，1.5L分别接入实施例、对照组1、对照组2的18L矿泉水桶中(15L培养基)。
4.将接种好的藻通入未过滤的空气后，放入光照强度约为80μmol/(m2·s)，培养温度控制在22±1℃，每天记录培养液中藻细胞的浓度。
结果如图1所示，经过5天的培养，其浓度达到了300*104cells/mL，而对照1浓度有约 130*104cells/mL，对照2浓度只有约55*104cells/mL。经探究原因，对照2之所以以浓度这么低，与通气培养中藻液污染有关，到第二天时，对照2中的藻液已经出现了白色的絮状物，到第三天时候，对照组2的颜色整个发白，这说明对照2出现了严重的污染状况。
本实施例1中虽然含有较高含量的有机碳，但是在5d的培养中藻液都保持相对干净，没有看到白色絮状物的产生，这说明本申请培养基的成分有较强的抑制污染发生的效果。
二、培养例2
实施例2
本实施例以球等鞭金藻3011种子为例，具体步骤如下：
1.培养容器的消毒，本实施例采用的是18L的PC矿泉水桶，消毒方式为1ppm的有效氯浓度的二氧化氯消毒6h。
2.按照每升培养基中含NaNO3 120mg，NaH2PO4 12mg，柠檬酸铁铵5mg，Na2EDTA12mg，硅酸钠10mg,甲酸钙15mg，脱氢乙酸钠5mg、丙酸钠10mg，醋酸钠1.5g，戊二醛50mg，其余为海水的标准配置培养基。对照组1的培养基为f/2+10mg/L硅酸钠，对照组2的培养基为f/2+10mg/L硅酸钠+醋酸钠1.5g/L。实施例及对照组均采用0.22μm的膜过滤灭菌，相同条件下培养。
3.将处于对数期的金藻3011，1.5L分别接入实施例、对照组1、对照组2的18L矿泉水桶中(15L培养基)。
4.将接种好的藻通入未过滤的空气后，放入光照强度约为80μmol/(m2·s)，培养温度控制在22±1℃，每天记录培养液中藻细胞的浓度。
结果见图2，可以看出，接入本申请实施例培养基的藻，经过5天的培养，其浓度达到了330*104cells/mL，而对照1浓度有约125*104cells/mL，对照2浓度只有约50*104cells/mL。对照2之所以以浓度这么低，与通气培养中藻液污染有关。到第二天时，对照2中的藻液已经出现了白色的絮状物，到第三天时候，对照组2的颜色整个发白，这说明对照2出现了严重的污染状况。本实施例中虽然含有较高含量的有机碳，但是在5d的培养中藻液都保持相对干净，没有看到白色絮状物的产生。这说明本申请培养基的成分有较强的抑制污染发生的效果。
三、培养例3
实施例3
本实施例以威氏海链藻为例，具体步骤如下：
1.培养容器的消毒，本实施例采用的是18L的PC矿泉水桶，消毒方式为1ppm的有效氯浓度的二氧化氯消毒6h。
2.按照每升培养基中含NaNO3 120mg，NaH2PO4 12mg，柠檬酸铁铵5mg，Na2EDTA12mg，硅酸钠10mg,甲酸钙15mg，脱氢乙酸钠5mg、丙酸钠10mg，醋酸钠1.5g，戊二醛50mg，其余为海水配成培养基，采用0.22μm的膜过滤灭菌，对照培养基分别为f/2+5mg/L硅酸钠培养基(对照组1)和f/2+10mg/L硅酸钠+醋酸钠1.5g/L(对照组2)，对照组培养基都经过相同的膜过滤器处理，其中对照组2是在超净台中加入培养液和接藻。
3.将处于对数期的威氏海链藻1.5L分别接入18L矿泉水桶中(15L培养基)上述三种培养基中。
4.将接种好的藻通入未过滤的空气后，放入光照强度约为80μmol/(m2·s)，培养温度控制在22±1℃，每天记录培养基中藻细胞的浓度。
结果如图3所示，其结果基本同培养例1。本实施例培养基对藻生长和抑制污染发生同时起着作用。此外，我们检测实施例中的醋酸钠含量时，基本到5d时，其醋酸钠含量几乎没有了。
四、培养例4
实施例4
本实施例以威氏海链藻为例进行培养试验，具体步骤如下：
1.培养容器的消毒，本实施例采用的是18L的PC矿泉水桶，消毒方式为1ppm的有效氯浓度的二氧化氯消毒6h。
2.、按照每升培养基中含NaNO3 60mg，NaH2PO4 5mg，柠檬酸铁铵1.5mg，Na2EDTA5mg，硅酸钠5mg,甲酸钙1mg，脱氢乙酸钠0.5mg，丙酸钠1mg，醋酸钠0.5g，戊二醛5mg，其余为海水配成培养基，采用0.22μm的膜过滤灭菌，对照培养基分别为f/2+5mg/L硅酸钠培养基(对照组1)和f/2+5mg/L硅酸钠+醋酸钠0.5g/L(对照组2)，对照培养基都经过相同的膜过滤器处理，其中对照2是在超净台中加入培养液和接藻。
3.将处于对数期的威氏海链藻1.5L分别接入18L矿泉水桶中(15L培养基)上述三种培养基中。
4.将接种好的藻通入未过滤的空气后，放入光照强度约为80μmol/(m2·s)，培养温度控制在22±1℃，每天记录培养基中藻细胞的浓度。
本实施例的结果见图4，其结果基本同实施例1。可见，本实施例培养基对藻生长和抑制污染发生同时起着作用。此外，我们检测实施例中的醋酸钠含量时，基本到5d时，其醋酸钠含量几乎没有了。
五、培养例5
实施例5
本实施例以蛋白核小球藻为例进行培养试验，具体步骤如下：
1.培养容器的消毒，本实施例采用的是18L的PC矿泉水桶，消毒方式为1ppm的有效氯浓度的二氧化氯消毒6h。
2.、按照每升培养基中含NaNO3 60mg，NaH2PO4 5mg，柠檬酸铁铵1.5mg，Na2EDTA5mg，甲酸钙5mg，脱氢乙酸钠5mg、丙酸钠10mg，醋酸钠0.5g，戊二醛50mg，其余为海水配成培养基，采用0.22μm的膜过滤灭菌，对照培养基分别为f/2+培养基(对照组1)和f/2+醋酸钠0.5g/L(对照组2)，对照组培养基都经过相同的膜过滤器处理。
3、将处于对数期的威氏海链藻1.5L分别接入18L矿泉水桶中(15L培养基)上述三种培养基中。
4、将接种好的藻通入未过滤的空气后，放入光照强度约为80μmol/(m2·s)，培养温度控制在22±1℃，每天记录培养基中藻细胞的浓度。
本实施例的结果见图5。其结果基本同实施例1和实施例2。本实施例培养基中的藻在 5d的培养中，其浓度高于对照1和对照2的4倍，与前面不同的是，本实施例中培养基的有机碳源在4d时候已经检测不到了，这可能就是本实施例中申请培养基中藻5d时生长变缓的原因。
之后，还以蛋白核小球藻为例，依据上述实施例5的培养方法，依据如下培养基配方进行试验。
第一、每升培养基中含NaNO3 100mg，NaH2PO4 10mg，柠檬酸铁铵3mg，Na2EDTA10mg，甲酸钙10mg，脱氢乙酸钠3mg，丙酸钠6mg，醋酸钠1g，戊二醛30mg，其余为海水的标准配置培养基。
第二、按照每升培养基中含NaNO3 80mg，NaH2PO4 6mg，柠檬酸铁铵3mg，Na2EDTA10mg，甲酸钙8mg，脱氢乙酸钠2mg，丙酸钠6mg，醋酸钠0.7g，戊二醛50mg，其余为海水的标准配置培养基。
结果与实施例5基本一致，均表明本申请限定组分及量比的培养基可显著降低对无菌环境的要求，同时大幅提高藻类的生长速度。
此外，本司还探索了甲酸钙、脱氢乙酸钠、丙酸钠、戊二醛在常见藻类如海水小球藻、微绿球藻、海水金藻、小硅藻(角毛藻、海链藻、菱形藻、骨条藻等)、紫球藻等的耐受浓度，具体而言，将含不同浓度的甲酸钙、脱氢乙酸钠、丙酸钠或戊二醛的藻液分别加入LB培养基中培养，观察藻液中染菌情况，最后得出浓度范围分别为甲酸钙1-15mg/L，脱氢乙酸钠0.5-5mg/L，丙酸钠1-10mg/L，戊二醛5-50mg/L，不加这些物质的试验中LB培养基中染菌程度很高。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种微藻培养基，其特征在于，每升培养基中包括氮盐60-120mg，磷盐5-12mg，铁盐1.5-5mg，Na2EDTA 5-15mg，硅酸钠0-10mg,甲酸钙1-15mg，醋酸钠0.5-1.5g，戊二醛5-50mg，短链脂肪酸盐型防腐剂1.5-15mg，其余为海水，所述短链脂肪酸盐型防腐剂为脱氢乙酸钠、丙酸钠，每升海水中脱氢乙酸钠0.5-5mg、丙酸钠 1-10mg。
2.如权利要求1所述的一种微藻培养基，其特征在于：所述氮盐包括硝酸盐、铵盐或尿素中一种或多种。
3.如权利要求1所述的一种微藻培养基，其特征在于：所述硝酸盐包括硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙中一种或多种，所述铵盐包括硝酸铵、氯化铵、硫酸铵中一种或多种。
4.如权利要求1所述的一种微藻培养基，其特征在于：所述铁盐包括氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵中一种或多种。
5.如权利要求1所述的一种微藻培养基，其特征在于：所述磷盐包括含磷酸一氢根或磷酸二氢根的钠盐、钾盐中一种或多种。
6.如权利要求1所述的一种微藻培养基，其特征在于：每升培养基中包括NaNO3 60-120mg， NaH2PO4 5-12mg，柠檬酸铁铵1.5-5mg，Na2EDTA 5-15mg，硅酸钠0-10mg,甲酸钙1-15mg，脱氢乙酸钠0.5-5mg、丙酸钠 1-10mg，醋酸钠0.5-1.5g，戊二醛5-50mg，其余为海水。
7.如权利要求1-6任一项所述的微藻培养基在小球藻、金藻、小硅藻或紫球藻培养中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述小硅藻包括海链藻、角毛藻、三角褐指藻、菱形藻。
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