CN105002108A - 一种生物菌剂的制备方法 - Google Patents

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丁健生
曹玉梅
杨旭
何芳
王胜利
顾燕
肖玲君
付秋玥
李敬敏
周霞
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
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    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/341—Consortia of bacteria

Abstract

本申请公开了生物菌剂的制备方法，能够制备出可降解富营养化水体中藻细胞的细菌，该方法包括富集培养、选择培养、筛选菌种和降解优势菌富集四个阶段。本发明提供的生物菌剂的制备方法，操作简单方便，易于得到降解优势菌且制备成本低廉。在对富营养化水体进行治理时，只需将生物菌剂投放至富营养化水体中即可，与传统方式相比，无论是生物菌剂的制备还是治理操作均较为简单，并且也显著的降低了治理成本。

Description

一种生物菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及生物菌剂培养技术领域，更具体地说，涉及一种生物菌剂的制备方法。
背景技术
水体富营养化(eutrophication)是指在人类活动的影响下，生物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡的现象。
水体富营养化对环境的影响主要体现在：
(1)富营养化水体中过度繁殖的藻类使水产生霉味和臭味，降低了水的质量。
(2)富营养化水体中大量生长繁殖的蓝、绿藻在水体表面形成一层绿色浮渣，使水质变得浑浊，透明度明显降低。
(3)表层密集的藻类使阳光难以透射进入湖泊深层，深层水体的光合作用减弱使溶解氧的来源随之减少。同时，藻类死亡后的腐化分解，加速了水体中溶解氧的消耗速度，水体缺氧成为必然。
(4)富营养化水体中许多藻类能够分泌、释放有毒有害物质，使水的品质下降。
(5)富营养化水体的正常生态平衡被扰乱，生物种群量出现剧烈波动，导致水生生物的稳定性和多样性降低，破坏了水体生态平衡。
(6)富营养化水体中过量的藻类会堵塞滤池，同时由于藻类的新陈代谢以及水藻本身产生的有毒有害物质增加了水处理的技术难度，加大了制水费用。
目前，传统的治理水体富营养化的方法包括采取工程性措施、化学措施和生物性措施。其中，工程性措施指的是使用工程机械挖掘底泥沉积物、进行水体深层曝气、注水冲稀以及在底泥表面敷设塑料等；化学措施指的是采用凝聚沉降和化学药剂进行杀澡的方法，生物性措施是利用大型水生植物吸收利用氮、磷元素进行代谢活动，以去除水体中氮、磷营养物质的方法。但是，上述三种方法在实施的过程中，均需要进行大量的操作，并消耗大量的时间和财力才能实现水体治理的目的，存在操作复杂繁琐、治理成本高的缺陷。
因此，如何解决富营养化水体治理操作复杂繁琐、治理成本高的问题，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种生物菌剂的制备方法，其可以筛选出对富营养化水体中藻细胞具有降解能力的多种细菌，可作为制备复合生物菌剂的菌种，从而利用生物菌剂实现富营养化水体的治理，使治理操作更加简单方便，并降低了成本。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种生物菌剂的制备方法，其用于制备具有降解富营养化水体中藻细胞的能力的细菌，该制备方法包括以下步骤：
11)采集含有多种细菌的富营养化水体的水样，并将所述水样在富集培养基中进行富集培养；
12)取一定量的富集培养后得到的富集培养液作为样本，采用无菌水将所述样本逐次的稀释至不同的浓度级，得到稀释液；
13)取多份所述稀释液，将其一对一的分别加入到多份以破碎藻细胞残体作为唯一氮碳源的选择培养基中进行选择培养；
14)选择培养完完成后，测定每份选择培养液中所述破碎藻细胞残体的浓度，并根据浓度变化数据，选择降解所述破碎藻细胞残体能力强的细菌作为降解优势菌；
15)将所述降解优势菌接种到经过灭菌的所述富集培养基中进行培养，当所述降解优势菌的浓度达到一定值后停止培养，并储存培养有所述降解优势菌的所述富集培养基。
优选地，上述生物菌剂的制备方法中，所述富集培养的操作包括：
21)将所述水样加入到装有富集培养基的锥形瓶中；
22)将所述锥形瓶置于摇床上，在28℃～30℃、150r/min～200r/min的条件下培养2～3天。
优选地，上述生物菌剂的制备方法中，所述富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，其包括牛肉膏2.5g～3.5g，蛋白胨9.5g～10.5g，NaCl 9g～11g，无菌水1000ml，且所述牛肉膏蛋白胨培养基的pH值为7.0～8.0。
优选地，上述生物菌剂的制备方法中，在对所述富集培养基进行稀释时，具体是取1ml的所述富集培养液，逐次将其稀释至10-1、10-2和10-3浓度级。
优选地，上述生物菌剂的制备方法中，所述选择培养的操作包括：
51)将每份所述稀释液分别加入到一个装有选择培养基的锥形瓶中；
52)将所述锥形瓶置于摇床上，在28℃～30℃、150r/min～200r/min的条件下培养7天。
优选地，上述生物菌剂的制备方法中，每份所述选择培养基包括：CuCl20.0004g～0.0006g，FeSO40.0045g～0.0055g，ZnCl20.0045g～0.0055g，MnCl2·4H2O0.0045g～0.0055g，CaCl20.015g～0.025g，K2HPO43.9g～4.1g，MgSO4·7H2O0.5g～1.5g，NaCl 0.5g～1.5g，KH2PO40.48g～0.52g，无菌水1000mL，破碎藻细胞残体10ml。
优选地，上述生物菌剂的制备方法中，所述选择培养基中所述破碎藻细胞残体的浓度为1×105cells/ml～1×106cells/ml，并且所述选择培养基的pH值为7～8。
优选地，上述生物菌剂的制备方法中，采用流体细胞计数器对所述选择培养基中的所述破碎藻细胞残体的浓度进行测定。
优选地，上述生物菌剂的制备方法中，所述破碎藻细胞残体为蓝藻细胞在高速离心条件下制备而成。
优选地，上述生物菌剂的制备方法中，当所述降解优势菌在所述富集培养基中达到1010～1012个/ml后停止培养并储存。
本发明提供的生物菌剂的制备方法，能够培养出降解富营养化水体中藻细胞的细菌，实现利用生物菌剂治理富营养化水体的目的，相对于传统的治理方法，其为一种全新的治理富营养化水体的方法。生物菌剂在制备的过程中，大体分为富集培养、选择培养和筛选菌种三个阶段。在进行富集培养时，首先需要采集含有多种细菌的富营养化水体的水样，然后将该水样在富集培养基中进行富集培养；富集培养完成后进行选择培养，在选择培养过程中，先取一定量的含有多种细菌的富集培养液作为样本，并将样本进行多次的逐级稀释，得到稀释液，之后再取多份的稀释液一一对应的加入到多份选择培养基中，该选择培养基为以破碎藻细胞残体作为唯一氮碳源的培养基，选择培养完成后测定每份选择培养基中剩余的破碎藻细胞残体数量，筛选出降解破碎藻细胞残体能力强的细菌作为降解优势菌；最后再富集培养降解优势菌以备用。本发明提供的生物菌剂的制备方法，操作简单方便，易于得到降解优势菌且制备成本低廉。在对富营养化水体进行治理时，只需将生物菌剂投放至富营养化水体中即可，与传统方式相比，无论是生物菌剂的制备还是治理操作均较为简单，并且也显著的降低了治理成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的生物菌剂的制备方法的阶段制备流程图；
图2为本发明实施例提供的生物菌剂的制备方法的具体制备流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种生物菌剂的制备方法，其可以筛选出对富营养化水体中藻细胞具有降解能力的多种细菌，可作为制备复合生物菌剂的菌种，从而利用生物菌剂实现富营养化水体的治理，使治理操作更加简单方便，并降低了成本。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1和图2所示，本发明实施例提供的生物菌剂的制备方法，能够制备出可降解富营养化水体中藻细胞的细菌，该方法包括富集培养、选择培养、筛选菌种和降解优势菌富集四个阶段：
富集培养：
S101、采集含有多种细菌的富营养化水体的水样，并将水样加入到富集培养基中进行富集培养。
在富集培养过程中，富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，富集培养基配方为：牛肉膏2.5g～3.5g，优选为3g，蛋白胨9.5g～10.5g，优选为10g，NaCl9.0g～11.0g，优选为10.0g，无菌水优选为1000ml，并且令富集培养基的pH值保持在7.0～8.0之间。具体操作是将装有水样和液态的富集培养基的锥形瓶置于摇床上，保持28℃～30℃，优选为30℃，以r/min150～200r/min培养2天～3天，优选为2天。采用牛肉膏蛋白胨培养基可以富集的细菌种类更多。
选择培养：
S102、取一定量的富集培养后得到的富集培养液(该富集培养液指的是培养基液体与水样的混合液)作为样本，采用无菌水将样本逐次的稀释至不同的浓度级，得到稀释液；
S103、取多份稀释液，将其一对一的分别加入到多份选择培养基中进行选择培养，该液态的选择培养基以破碎藻细胞残体作为唯一氮碳源。
取1ml的富集培养液，用无菌水依次稀释到10-1,10-2,10-3浓度级，取一定量的稀释液分别加入到不同的装有选择培养基的锥形瓶中，在28℃～30℃，优选为30℃，150r/min～200r/min的条件下，用摇床培养7天～8天，优选为7天。其中选择培养基采用以破碎藻细胞残体作为唯一氮碳源的无机盐营养基，其配方为：破碎藻细胞残体9.0ml～11.0ml，CuCl20.0004g～0.0006g，FeSO40.0045g～0.0055g，ZnCl20.0045g～0.0055g，MnCl2·4H2O 0.0045g～0.0055g，CaCl20.015g～0.025g，K2HPO43.9g～4.1g，MgSO4·7H2O 0.5g～1.5g，NaCl0.5g～1.5g，KH2PO40.48g～0.52g，无菌水1000mL。优选的破碎藻细胞残体为10ml(在选择培养基中的浓度为1×105cells/ml～1×106cells/ml)，CuCl2为0.0005g，FeSO4为0.005g，ZnCl2为0.005g，MnCl2·4H2O为0.005g，CaCl2为0.02g，K2HPO4为4.0g，MgSO4·7H2O为1.0g，NaCl为1.0g，KH2PO4为0.5g，无菌水为1000mL，并令选择培养基的pH值为7～8,优选为7.5。
筛选菌种：
S104、选择培养完完成后，测定每份选择培养液中破碎藻细胞残体的浓度，并根据浓度变化数据，选择降解破碎藻细胞残体能力强的细菌作为降解优势菌。
降解优势菌富集：
S105、破碎藻细胞残体浓度下降大的锥形瓶中，其可降解破碎藻细胞残体的细菌含量大，可以认为其中某些菌的生长速度快，其降解能力强，所以选择破碎藻细胞残体浓度下降大的锥形瓶中的细菌(即降解优势菌)，将其接种到经过灭菌的富集培养基中进行培养，当降解优势菌在富集培养基中达到1010～1012个/ml后停止培养，并储存培养有降解优势菌的富集培养基。储存的菌种用于生物菌剂的制备，其优选为混合菌液，因为混合菌液对培养基的适应性强，从而扩大了培养基选择的范围，降低了成本。
微生物菌剂是一类含有活微生物的特定制品，主要利用微生物的活动来改善营养条件。目前微生物菌剂的研究主要在微生物增肥、生物固氮、增强植物抗病能力等方面，在富营养化水体水处理方面研究还没有。而本发明则采用微生物菌剂来治理富营养化水体的方式，是有别于传统治理方法的一种全新的治理方式，为了实现采用微生物菌剂来治理富营养化水体的目的，本发明提供上述生物菌剂的制备方法，该方法操作简单方便，易于得到降解优势菌，且制备成本低廉。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种生物菌剂的制备方法，其特征在于，用于制备具有降解富营养化水体中藻细胞的能力的细菌，该制备方法包括以下步骤：
11)采集含有多种细菌的富营养化水体的水样，并将所述水样在富集培养基中进行富集培养；
12)取一定量的富集培养后得到的富集培养液作为样本，采用无菌水将所述样本逐次的稀释至不同的浓度级，得到稀释液；
13)取多份所述稀释液，将其一对一的分别加入到多份以破碎藻细胞残体作为唯一氮碳源的选择培养基中进行选择培养；
14)选择培养完完成后，测定每份选择培养液中所述破碎藻细胞残体的浓度，并根据浓度变化数据，选择降解所述破碎藻细胞残体能力强的细菌作为降解优势菌；
15)将所述降解优势菌接种到经过灭菌的所述富集培养基中进行培养，当所述降解优势菌的浓度达到一定值后停止培养，并储存培养有所述降解优势菌的所述富集培养基。
2.根据权利要求1所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述富集培养的操作包括：
21)将所述水样加入到装有富集培养基的锥形瓶中；
22)将所述锥形瓶置于摇床上，在28℃～30℃、150r/min～200r/min的条件下培养2～3天。
3.根据权利要求1所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，其包括牛肉膏2.5g～3.5g，蛋白胨9.5g～10.5g，NaCl 9g～11g，无菌水1000ml，且所述牛肉膏蛋白胨培养基的pH值为7.0～8.0。
4.根据权利要求1所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，在对所述富集培养基进行稀释时，具体是取1ml的所述富集培养液，逐次将其稀释至10-1、10-2和10-3浓度级。
5.根据权利要求1所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述选择培养的操作包括：
51)将每份所述稀释液分别加入到一个装有选择培养基的锥形瓶中；
52)将所述锥形瓶置于摇床上，在28℃～30℃、150r/min～200r/min的条件下培养7天。
6.根据权利要求1所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，每份所述选择培养基包括：CuCl20.0004g～0.0006g，FeSO40.0045g～0.0055g，ZnCl20.0045g～0.0055g，MnCl2·4H2O 0.0045g～0.0055g，CaCl20.015g～0.025g，K2HPO43.9g～4.1g，MgSO4·7H2O 0.5g～1.5g，NaCl 0.5g～1.5g，KH2PO40.48g～0.52g，无菌水1000mL，破碎藻细胞残体10ml。
7.根据权利要求6所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述选择培养基中所述破碎藻细胞残体的浓度为1×105cells/ml～1×106cells/ml，并且所述选择培养基的pH值为7～8。
8.根据权利要求6所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，采用流体细胞计数器对所述选择培养基中的所述破碎藻细胞残体的浓度进行测定。
9.根据权利要求6所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述破碎藻细胞残体为蓝藻细胞在高速离心条件下制备而成。
10.根据权利要求1～9中任意一项所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，当所述降解优势菌在所述富集培养基中达到1010～1012个/ml后停止培养并储存。
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