CN114617974A - 一种多肽白蛋白纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多肽白蛋白纳米粒及其制备方法和应用。所述多肽白蛋白纳米粒由阳离子双亲性多肽和白蛋白组装形成。所述阳离子双亲性多肽的疏水部分与白蛋白结合，阳离子双亲性多肽所携带的正电荷能够和白蛋白表面的负电荷相互作用，从而使得阳离子双亲性多肽和白蛋白进行组装形成多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒中，阳离子双亲性多肽和白蛋白相互配合，提高了稳定性并降低了溶血毒性，具备高靶向性，同时能够诱导肿瘤细胞胀亡，诱发机体自身抗肿瘤免疫反应，从而实现了高靶向性、高效杀伤肿瘤细胞的效果。

Description

一种多肽白蛋白纳米粒及其制备方法和应用
本申请要求申请号为202011455391.8专利申请的优先权(在先申请的申请日为2020年12月10日，发明名称为一种多肽白蛋白纳米粒及其制备方法和应用)。
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种多肽白蛋白纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
由碱性氨基酸和疏水性氨基酸组成的阳离子双亲性多肽，可以通过其阳离子(正电荷)和双亲性(亲水性和疏水性)特征与生物膜上的磷脂及糖类分子产生静电作用和疏水作用，发挥裂膜或穿膜杀伤的作用。
生物膜功能重要、结构均一且与遗传突变无关，许多研究认为基于裂膜或穿膜杀伤机制的药物并不会引起肿瘤的耐药性，并且肿瘤细胞表面相比正常细胞具有更多的负电荷，含有较多阳离子的双亲性多肽能对肿瘤细胞产生更高的选择性杀伤的效果，因此，阳离子双亲性多肽被认为在抗肿瘤药物领域具有广阔发展前景。然而，阳离子双亲性多肽容易引起溶血反应，并且存在体内动力学、靶向性以及毒副作用等方面的问题，限制了其应用于制备抗肿瘤药物。
目前阳离子双亲性多肽的成药优化方法主要包括化学修饰和采用载体系统。化学修饰如使用非天然的D型氨基酸替换L型氨基酸、多肽环化和保存侧链修改主肽链制备模拟肽等能够一定程度上抵抗酶的降解，然而不能解决安全性及肿瘤靶向性的问题，并且D型多肽的经济成本较高；聚乙二醇修饰(PEGylated)具有减少组织中的非特异性摄取、降低细胞毒性、增加血液半衰期和减少蛋白降解的优点，但降低了多肽的活性；脂类修饰被认为是阳离子双亲性多肽成药化最具优势的一种方法，脂化策略的细微变化，包括脂肪酸类型、脂锚位置或间隔插入等，均会对脂化肽的理化性质、生物活性和药代动力学产生深远的影响，然而设计脂化策略过程复杂，难度高。
采用载体系统改善阳离子双亲性多肽的稳定性、毒性、半衰期以及靶向性是另一种成药化策略。然而由于结构的相似性，一些同样由含疏水端和亲水端的单体组成的聚合物胶束或者脂质体可能会受到阳离子双亲性多肽的破坏，一定程度上增加了递送的难度。目前这类载体系统还停留在基础研究阶段，有研究者报道了二氧化硅纳米粒子作为载药体系负载抗菌肽LL-37，虽然通过将抗菌肽LL-37负载于二氧化硅纳米粒子提高了多肽对酶解的抵抗能力，但仍存在载药量低和溶血毒性等问题(Braun K,Pochert A,Lindén Mika,etal.Membrane interactions of mesoporous silica nanoparticles as carriers ofantimicrobial peptides[J].Journal of Colloid&Interface ence,2016,475:161-170.)。Huang等报道在阳离子双亲性多肽melittin的N端连接一条能够调控纳米结构的α-螺旋肽从而将melittin的阳离子深埋于脂质体的磷脂中，能在一定程度上屏蔽掉melittin的溶血效应，然而这种连接另一条多肽的方法会改变多肽的理化性质，适应范围也有待进一步验证(Huang C,Jin H,QianY,et al.Hybrid melittin cytolytic Peptide-drivenultrasmall lipid nanoparticles block melanoma growth in vivo.[J].Acs Nano,2013,7(7):5791-800.)。也有研究报道通过Au-S键将裂膜肽cTL连接到金纳米笼上，外层再修饰SH-mPEG，该纳米粒子被近红外光照射后溶血毒性明显提升，可使照射过和未照射过的肿瘤细胞均发生损伤，但这类金属载多肽系统存在着当光/近红外触发时对非肿瘤细胞具有细胞毒性的潜在风险，安全性需要进一步评估(Ji-Gang Piao,Dong Liu,Kan Hu,etal.Cooperative Nanoparticle System for Photothermal Tumor Treatment withoutSkin Damage[J].ACS Applied Materials&Interfaces,2016,8(4):acsami.5b11664.)。
综合上述，现有技术均存在载药体系不稳定、制备难度高、药物载体生物安全性存疑等问题，提供一种具有良好的生物安全性、稳定性、肿瘤靶向性以及肿瘤杀伤作用的阳离子双亲性多肽，用于阳离子膜活性抗肿瘤药物的制剂制备，助其实现药物体内递送和治疗应用，对于制备抗肿瘤药物领域具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种多肽白蛋白纳米粒及其制备方法和应用，所述多肽白蛋白纳米粒具备较高的稳定性和靶向性，溶血毒副作用低，通过胀亡机制杀伤肿瘤细胞，同时诱发机体自身的抗肿瘤免疫反应，在制备抗肿瘤药物中具有广阔的发展前景。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒由阳离子双亲性多肽和白蛋白组装形成。
本发明中，所述阳离子双亲性多肽的疏水部分与白蛋白结合，阳离子双亲性多肽所携带的正电荷能够和白蛋白表面的负电荷相互作用，从而使得阳离子双亲性多肽和白蛋白进行组装形成多肽白蛋白纳米粒(组装示意图如图1所示)。通过组装形成多肽白蛋白纳米粒，将阳离子双亲性多肽包埋于白蛋白中，避免了阳离子双亲性多肽与降解酶和红细胞膜接触，从而提高了阳离子双亲性多肽的稳定性及安全性。
本发明中，多肽白蛋白纳米粒为纳米尺度，具有高渗透长滞留效应，其中的白蛋白会被肿瘤细胞主动吸收富集，因此具备高靶向性，同时其能够诱导肿瘤细胞胀亡，并诱发机体自身抗肿瘤免疫反应，从而实现了高靶向性、高效杀伤肿瘤细胞的效果。
优选地，所述阳离子双亲性多肽包括疏水部分和亲水部分。
优选地，所述亲水部分包括精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)或组氨酸(His，H)中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括精氨酸和赖氨酸的组合、精氨酸和组氨酸的组合或精氨酸、赖氨酸和组氨酸的组合，优选为精氨酸。
优选地，所述疏水部分包括[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf、疏水性氨基酸或脂类中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf和疏水性氨基酸的组合或疏水性氨基酸和脂类的组合。
优选地，所述疏水性氨基酸包括苯丙氨酸(Phe，F)、亮氨酸(Leu，F)、异亮氨酸(Ile，I)、色氨酸(Trp，W)、缬氨酸(Val，V)、甲硫氨酸(Met，M)或丙氨酸(Ala，A)中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和色氨酸的组合、苯丙氨酸、亮氨酸和色氨酸的组合或亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和缬氨酸的组合。
优选地，所述脂类包括胆固醇及其衍生物或脂肪酸及其衍生物中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述阳离子双亲性多肽的结构式如式I或式II所示，其中，n为精氨酸残基的数目，为1～9的整数，包括但不限于2、3、5、6、7或8，优选为5～9，进一步优选为8。
Figure BDA0003287329870000031
Figure BDA0003287329870000032
本发明中，疏水性铱配体[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf和亲水性寡聚精氨酸结合获得双亲性铱配位寡聚精氨酸多肽，所述双亲性铱配位寡聚精氨酸多肽能以静电作用和疏水作用与生物膜上的磷脂及糖类分子发生吸附，发挥裂膜或者穿膜杀伤的作用，提高了抑制肿瘤细胞活性的能力。
优选地，所述阳离子双亲性多肽的一级结构为CH3CO-XRn-CONH2或脂类-Rn-CONH2，其中，X包括Phe、Leu、Ile、Trp、Val、Met或Ala中的任意一种或至少两种的组合，n为精氨酸残基的数目，为1～12的整数，包括但不限于2、3、5、6、8、9或11，优选为3～9，进一步优选为5～9，更进一步优选为8。
优选地，X包括Phe、Leu、Ile、Trp、Val、Met和Ala各1～5个，包括但不限于2、3或4个，优选为Phe、Leu、Ile和Trp各1～5个。
优选地，所述阳离子双亲性多肽的一级结构为CH3CO-FWLFLRRRRRRRR-CONH2或chol-RRRRRRRR-CONH2，chol为胆固醇。
优选地，所述白蛋白包括哺乳动物白蛋白。
优选地，所述哺乳动物白蛋白包括人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)和/或牛血清白蛋白。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的多肽白蛋白纳米粒的制备方法，所述制备方法包括：
分别配制阳离子双亲性多肽溶液和白蛋白溶液，按摩尔比将所述阳离子双亲性多肽溶液和白蛋白溶液混合，得到所述多肽白蛋白纳米粒。
优选地，所述阳离子双亲性多肽溶液的浓度为20～5000μM，包括但不限于30μM、40μM、50μM、60μM、100μM、200μM、500μM、1000μM、2000μM、3000μM、3500μM、4000μM、4200μM、4400μM、4800μM或4900μM。
优选地，所述白蛋白溶液的浓度为20～5000μM，包括但不限于30μM、40μM、50μM、60μM、100μM、200μM、500μM、1000μM、2000μM、3000μM、3500μM、4000μM、4200μM、4400μM、4800μM或4900μM。
优选地，所述阳离子双亲性多肽溶液中阳离子双亲性多肽和所述白蛋白溶液中白蛋白的摩尔比为(0.1～10):1，包括但不限于0.2:1、0.8:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
优选地，所述混合的温度为5～100℃，包括但不限于6℃、7℃、9℃、10℃、15℃、30℃、40℃、50℃、70℃、80℃、85℃、90℃、92℃、94℃、或98℃。
优选地，所述混合的时间为0.5～120min，包括但不限于0.6min、0.7min、0.9min、1.5min、2min、5min、10min、20min、30min、50min、60min、80min、90min、100min、110min或115min。
作为优选的技术方案，所述多肽白蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)将阳离子双亲性多肽加入到水、40～60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液或10～20mM磷酸盐缓冲液中，获得20～5000μM阳离子双亲性多肽溶液；将白蛋白加入到水或10～20mM磷酸盐缓冲液中，获得20～5000μM白蛋白溶液；
(2)按阳离子双亲性多肽和白蛋白的摩尔比为(0.1～10):1将阳离子双亲性多肽溶液和白蛋白溶液混合，加入水或磷酸盐缓冲液，于5～100℃混合0.5～120min，得到所述多肽白蛋白纳米粒。
本发明中，在常压条件下简单混合阳离子双亲性多肽溶液和白蛋白溶液即可得到所述多肽白蛋白纳米粒，不需要额外的化学修饰，成本低，且具备良好的可重复性。
第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的多肽白蛋白纳米粒。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供第一方面所述的多肽白蛋白纳米粒或第三方面所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中，所述阳离子双亲性多肽的疏水部分与白蛋白结合，阳离子双亲性多肽所携带的正电荷能够和白蛋白表面的负电荷相互作用，从而使得阳离子双亲性多肽和白蛋白进行组装形成多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒中，阳离子双亲性多肽和白蛋白相互配合，提高了稳定性并降低了溶血毒性，具备高靶向性，同时能够诱导肿瘤细胞胀亡，诱发机体自身抗肿瘤免疫反应，从而实现了高靶向性、高效杀伤肿瘤细胞的效果；
(2)本发明的多肽白蛋白纳米粒能够有效抑制酶降解，在血液中的消除半衰期长，具备较高的稳定性；溶血作用低，安全性高；能够使肿瘤细胞肿胀并吐出胞内容物，具有诱发胀亡的杀伤肿瘤机制；能够有效在肿瘤部位蓄积，具备高靶向性；能够促进淋巴结的树突状细胞成熟，增加T细胞(CD8+)，诱导机体自身抗肿瘤免疫反应；
(3)本发明中，在常压条件下简单混合阳离子双亲性多肽溶液和白蛋白溶液即可得到所述多肽白蛋白纳米粒，不需要额外的化学修饰，成本低，且具备良好的可重复性。
附图说明
图1为本发明多肽白蛋白纳米粒的组装示意图，其中i)为多肽结合白蛋白模型，ii)为多肽白蛋白复合物表面静电展示模型，iii)、iv)为多肽白蛋白复合物组装成纳米粒；
图2为Ir-cR8-HSA纳米粒的水合粒径分布图；
图3为Ir-cR5-HSA纳米粒的水合粒径分布图；
图4为Ir-aR8-HSA纳米粒的水合粒径分布图；
图5为FR-HSA纳米粒的水合粒径分布图；
图6为CR-HSA纳米粒的水合粒径分布图；
图7为Ir-cr8-HSA纳米粒的水合粒径分布图；
图8为Ir-mK8-HSA纳米粒的水合粒径分布图；
图9为Ir-cK8-HSA纳米粒的水合粒径分布图；
图10为Ir-cR8-HSA纳米粒的透射电镜图；
图11为Ir-cR5-HSA纳米粒的透射电镜图；
图12为Ir-aR8-HSA纳米粒的透射电镜图；
图13为FR-HSA纳米粒的透射电镜图；
图14为CR-HSA纳米粒的透射电镜图；
图15为阳离子双亲性多肽的电荷数及阳离子双亲性多肽和白蛋白的比例对多肽白蛋白纳米粒组装的影响图；
图16为有无竞争化合物下Ir-cR8与白蛋白组装的水合粒径分布图；
图17为Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒对4T1细胞的活性抑制作用图；
图18为Ir-cR5及Ir-cR5-HSA纳米粒对4T1细胞的活性抑制作用图；
图19为Ir-aR8及Ir-aR8-HSA纳米粒对4T1细胞的活性抑制作用图；
图20为Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒孵育的4T1细胞胀亡图；
图21为Ir-cR5-HSA纳米粒孵育的4T1细胞胀亡图；
图22为Ir-aR8-HSA纳米粒孵育的4T1细胞胀亡图；
图23为Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒在不同pH下的释放曲线图；
图24为Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒的血清稳定性图；
图25为不同时间点Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒在血液中的浓度图；
图26为Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒的溶血毒性图；
图27为尾静脉注射Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒24小时后在小鼠体内的组织分布图；
图28为尾静脉注射PBS、HSA、Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒对小鼠树突状细胞的促成熟率图；
图29为肿瘤组织中T细胞的比例图；
图30为各实验组肿瘤生长曲线图；
图31为第22天各实验组的肿瘤大小及Ir-cR8-HSA纳米粒组的小鼠照片图，圆圈代表小鼠之前已死亡，方框代表无肿瘤；
图32为再次接种肿瘤细胞后小鼠肿瘤的生长曲线图；
图33为再次接种肿瘤细胞后第30天小鼠照片图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒由铱配位寡聚精氨酸多肽和人血清白蛋白(HSA)组装形成，所述多肽白蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)于37℃，按摩尔比为1:1将寡聚精氨酸多肽与[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf在50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)中混合12h，获得铱配位寡聚精氨酸多肽(Ir-cR8)，如式Ⅲ所示；
Figure BDA0003287329870000061
(2)将Ir-cR8加入到超纯水中，得到500μM的Ir-cR8溶液，取人血清白蛋白，将其用水溶解并制备成同浓度的人血清白蛋白溶液；
(3)按照摩尔比为1:1为将Ir-cR8溶液和人血清白蛋白溶液混合，加入等体积的磷酸盐缓冲液(1×PBS)，室温下混合2h，再加入1倍当前体积的1×PBS，获得Ir-cR8-HSA纳米粒。
实施例2
本实施例提供一种多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒由铱配位寡聚精氨酸多肽和人血清白蛋白组装形成，所述多肽白蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)于37℃，按摩尔比为1:1将寡聚精氨酸多肽与[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf在50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)中混合12h，获得铱配位寡聚精氨酸多肽(Ir-cR5)，如式Ⅳ所示；
Figure BDA0003287329870000062
(2)将Ir-cR5加入到超纯水中，得到500μM的Ir-cR5溶液，取人血清白蛋白，将其用水溶解并制备成同浓度的人血清白蛋白溶液；
(3)按照摩尔比为3:1为将Ir-cR5溶液和人血清白蛋白溶液混合，加入等体积的超纯水，室温下混合2h，再加入1倍当前体积的1×PBS，获得Ir-cR5-HSA纳米粒。
实施例3
本实施例提供一种多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒由铱配位寡聚精氨酸多肽和人血清白蛋白组装形成，所述多肽白蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)于37℃，按摩尔比为1:1将寡聚精氨酸多肽与[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf在50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)中混合12h，获得铱配位寡聚精氨酸多肽(Ir-aR8)，如式V所示；
Figure BDA0003287329870000071
(2)将Ir-aR8加入到超纯水中，得到500μM的Ir-aR8溶液，取人血清白蛋白，将其用超纯水溶解并制备成同浓度的人血清白蛋白溶液；
(3)按照摩尔比为2:1为将Ir-aR8溶液和人血清白蛋白溶液混合，加入等体积的超纯水，室温下混合2h，再加入1倍当前体积的1×PBS，获得Ir-aR8-HSA纳米粒。
实施例4
本实施提例供一种多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒由CH3CO-FWLFLRRRRRRRR-CONH2(FR)和人血清白蛋白组装形成，所述多肽白蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)将FR加入到超纯水中，得到500μM的FR溶液，取人血清白蛋白，将其用超纯水溶解并制备成同浓度的人血清白蛋白溶液；
(2)按照摩尔比为1:1为将FR溶液和人血清白蛋白溶液混合，加入等体积的超纯水，50℃水浴1min，逐滴加入1×PBS至澄清，再加入1倍当前体积的超纯水，获得FR-HSA纳米粒。
实施例5
本实施例提供一种多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒由chol-RRRRRRRR-CONH2(CR)和人血清白蛋白组装形成，所述多肽白蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)将CR加入到超纯水中，得到500μM的CR溶液，取人血清白蛋白，将其用超纯水溶解并制备成同浓度的人血清白蛋白溶液；
(2)按照摩尔比为2:1为将CR溶液和人血清白蛋白溶液混合，加入等体积的超纯水，50℃水浴1min，逐滴加入1×PBS至澄清，再加入1倍当前体积的超纯水，获得CR-HSA纳米粒。
实施例6
本实施例提供一种多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒由铱配位寡聚精氨酸多肽和人血清白蛋白组装形成，所述多肽白蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)于37℃，按摩尔比为1:1将寡聚精氨酸(D型)多肽CH3CO-hrrrrrrrrh-CONH2与[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf在50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)中混合2h，获得铱配位寡聚精氨酸多肽(Ir-cr8)，如式VI所示；
Figure BDA0003287329870000081
(2)将Ir-cr8加入到超纯水中，得到500μM的Ir-cr8溶液，取人血清白蛋白，将其用水溶解并制备成同浓度的人血清白蛋白溶液；
(3)按照摩尔比为1:1为将Ir-cr8溶液和人血清白蛋白溶液混合，加入等体积的超纯水，室温下混合2h，再加入1倍当前体积的1×PBS，获得Ir-cr8-HSA纳米粒。
实施例7
本实施例提供一种多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒由铱配位寡聚多肽和人血清白蛋白组装形成，所述多肽白蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)于37℃，按摩尔比为1:1将寡聚多肽CH3CO-KKKKHHKKKK-CONH2与[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf在50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)中混合2h，获得铱配位寡聚精氨酸多肽(Ir-mK8)，如式Ⅶ所示；
Figure BDA0003287329870000082
(2)将Ir-mK8加入到超纯水中，得到500μM的Ir-mK8溶液，取人血清白蛋白，将其用水溶解并制备成同浓度的人血清白蛋白溶液；
(3)按照摩尔比为1:1为将Ir-mK8溶液和人血清白蛋白溶液混合，加入等体积的超纯水，室温下混合60min，再加入1倍当前体积的1×PBS，获得Ir-mK8-HSA纳米粒。
实施例8
本实施例提供一种多肽白蛋白纳米粒，所述多肽白蛋白纳米粒由铱配位寡聚多肽和人血清白蛋白组装形成，所述多肽白蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)于37℃，按摩尔比为1:1将寡聚多肽CH3CO-HKKKKKKKKH-CONH2与[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf在50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)中混合2h，获得铱配位寡聚精氨酸多肽(Ir-cK8)，如式Ⅷ所示；
Figure BDA0003287329870000091
(2)将Ir-cK8加入到超纯水中，得到500μM的Ir-cK8溶液，取人血清白蛋白，将其用水溶解并制备成同浓度的人血清白蛋白溶液；
(3)按照摩尔比为1:1为将Ir-cK8溶液和人血清白蛋白溶液混合，加入等体积的超纯水，室温下混合60min，再加入1倍当前体积的1×PBS，获得Ir-cK8-HSA纳米粒。
试验例1
本试验例使用动态光散射仪和透射电镜检测实施例1-8制备的多肽白蛋白纳米粒的粒径。
使用1×PBS分别将Ir-cR8-HSA纳米粒、Ir-cR5-HSA纳米粒、Ir-aR8-HSA纳米粒、Ir-cr8-HSA纳米粒、Ir-mK8-HSA纳米粒和Ir-cK8-HSA纳米粒稀释至10μM，将FR-HSA纳米粒和CR-HSA纳米粒稀释至20μM，于25℃使用动态光散射仪进行检测，只计算所形成多肽白蛋白纳米粒的峰，结果如图2-图9所示。
由图2-图9可知，Ir-cR8-HSA纳米粒的平均水合粒径为155.6nm，Ir-cR5-HSA纳米粒的平均水合粒径为240.6nm，Ir-aR8-HSA纳米粒的平均水合粒径为258.7nm，Ir-cr8-HSA纳米粒的平均水合粒径为144.9nm，Ir-mK8-HSA纳米粒的平均水合粒径为266.5nm，Ir-cK8-HSA纳米粒的平均水合粒径为322.4nm，FR-HSA纳米粒的平均水合粒径为396.1nm，CR-HSA纳米粒的平均水合粒径为295.3nm。
使用1×PBS分别将Ir-cR8-HSA纳米粒、Ir-cR5-HSA纳米粒、Ir-aR8-HSA纳米粒、FR-HSA纳米粒和CR-HSA纳米粒稀释至500μM，分别滴于300目的碳支持膜上，待液滴将干未干时再滴加一滴3％的磷钨酸染液负染1～2min，吸去染液，用水清洗3遍，晾干，使用透射电镜分析，结果如图10-图14所示。
由图10-图14可知Ir-cR8-HSA纳米粒的粒径分布于40～100nm之间，Ir-cR5-HSA纳米粒的粒径分布于50～200nm之间，Ir-aR8-HSA纳米粒的粒径分布于40～200nm之间，FR-HSA纳米粒的粒径分布于40～400nm之间，CR-HSA纳米粒的粒径分布于40～400nm之间。
试验例2
本试验例考察阳离子双亲性多肽的电荷数以及阳离子双亲性多肽和人血清白蛋白的比例对多肽白蛋白纳米粒组装的影响。
分别取Ir-cR3(如式Ⅸ所示)、Ir-cR5和Ir-cR8与人血清白蛋白按照摩尔比为2:1、1:1、1:2和1:3混合，人血清白蛋白的终浓度为10μM，使用动态光散射仪检测多肽白蛋白混合溶液的水和粒径分布情况，结果如图15所示，可知阳离子双亲性多肽亲水部分正电荷数量越多(精氨酸个数越多)，白蛋白比例越小，阳离子双亲性多肽与白蛋白越容易组装成多肽白蛋白纳米粒。
Figure BDA0003287329870000101
试验例3
本试验例检测铱配位寡聚精氨酸多肽对肿瘤细胞活性的抑制能力。
取人宫颈癌细胞Hela细胞，将其用含10％胎牛血清的DMEM培养基分散后铺至96孔板，每孔8000个细胞，待细胞贴壁后加入2、4、8、16、32、64和128μM的Ir-cR5、Ir-cR8和Ir-aR8以及相应的寡聚精氨酸多肽cR5、cR8和aR8，孵育24h，采用噻唑蓝法检测细胞活性，并计算半数抑制浓度(IC50)，结果如表1所示，铱配位寡聚精氨酸多肽的半数抑制浓度(IC50)相比于配位前的寡聚精氨酸多肽显著减小，对Hela细胞的杀伤毒性明显提升。
表1
实验组 IC<sub>50</sub>(μM)
Ir-cR5 23.5
Ir-cR8 7.3
Ir-aR8 7.3
cR5 >100
cR8 >100
aR8 >100
试验例4
人血清白蛋白是一条单链多肽，可分为AB两个亚结构域，每个亚结构域进一步还可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个区域。它具有3种主要的药物结合位点，分别为位于ⅡA的药物结合位点1(也称为Sudlow位点1)、位于ⅢA的药物结合位点2(也称Sudlow位点2)以及位于ⅠB的药物结合位点3。本试验例检测Ir-cR8在人血清白蛋白上的结合位置。制备10μM人血清白蛋白的水溶液以及10μM人血清白蛋白与人血清白蛋白的药物结合位点1、2、3的竞争化合物保泰松、布洛芬和利多卡因的混合溶液，混合5分钟后分别加入0、2、4、6、8、和10μM的Ir-cR8，用280nm的光激发，扫描其在300～450nm的激发光谱，根据公式(1)计算Ir-cR8在有无竞争化合物存在下与白蛋白的结合常数及结合位点数：
lg(FO-F)/F＝＝lgKa+nlgc (1)
其中F0表示未添加竞争化合物时体系的荧光强度，F表示添加竞争化合物时体系的荧光强度，Ka为结合常数，c为淬灭剂浓度，n为结合位点数。
结果如表2所示，可知Ir-cR8在人血清白蛋白上的结合位点数为1，主要结合在位点1。
表2
竞争化合物 结合常数Kb(L/mol) 结合位点(n)
\ 1.33×10<sup>6</sup> 1.19
保泰松 1.09×10<sup>6</sup> 1.18
布洛芬 1.69×10<sup>6</sup> 1.22
利多卡因 1.35×10<sup>6</sup> 1.20
为了进一步验证上述结论，将10μM人血清白蛋白与各位点竞争化合物以1:4的摩尔比混合，然后加入10μM的Ir-cR8，以等浓度未加竞争化合物时的人血清白蛋白与Ir-cR8的混合溶液作为对照，采用动态光散射仪检测各竞争化合物存在条件下及无竞争化合物时的多肽白蛋白纳米粒组装情况，结果如图16所示，进一步验证了Ir-cR8在人血清白蛋白上的主要结合位点为位点1。
试验例5
本试验例对Ir-cR8-HSA纳米粒、Ir-cR5-HSA纳米粒和Ir-aR8-HSA纳米粒的肿瘤杀伤能力和杀伤机制进行研究。
取小鼠乳腺癌细胞4T1，用含10％胎牛血清的DMEM培养基分散后铺至96孔板，每孔8000个细胞，待细胞贴壁后分别加入2、4、8、16、32、64、128μM的Ir-cR8-HSA纳米粒、Ir-cR5-HSA纳米粒和Ir-aR8-HSA纳米粒和Ir-cR8、Ir-cR5和Ir-aR8，孵育24h，采用噻唑蓝法检测细胞活性，结果如图17-图19所示，可知，Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒的半数抑制浓度分别为10.1μM和13.9μM，Ir-cR5及Ir-cR5-HSA纳米粒的半数抑制浓度分别为25.45μM和29.64μM，Ir-aR8及Ir-aR8-HSA纳米粒的半数抑制浓度分别为13.16μM和16.20μM，表明将阳离子双亲性多肽制备成多肽白蛋白纳米粒后对肿瘤细胞的杀伤活性并没有受到显著的影响。
取玻片直径15mm的玻底皿，加入3×105个4T1细胞，待其贴壁后，分别加入1mL半数抑制浓度Ir-cR8-HSA纳米粒、Ir-cR5-HSA纳米粒、Ir-aR8-HSA纳米粒和Ir-cR8(均含5μg/mL的碘化丙啶)，于405nm及561nm激发激光共聚焦，观察细胞的死亡过程，结果如图20-图22所示，肿瘤细胞表现为细胞肿胀并吐出胞内容物，表明多肽白蛋白纳米粒具有诱发胀亡的杀伤肿瘤机制。
试验例6
本试验例对Ir-cR8-HSA纳米粒的稳定性和安全性进行分析。
取500μL的Ir-cR8及Ir-cR8-HSA纳米粒(200μM)，分别置于8000～14000D分子量的透析袋中，将透析袋置于15mL的离心管中，每个离心管中分别加入5mLpH为5.0、6.5和7.4的PBS缓冲液，将离心管放置于37℃、200rpm的恒温振荡器中，分别在1h、2h、4h、6h、16h和24h取出500μL缓冲液并补充500μL新鲜的缓冲液于离心管中，于328nm波长激发检测所取的缓冲液在350～550nm的发射光谱，根据Ir-cR8在缓冲液中的荧光标曲定量缓冲液中的Ir-cR8浓度，结果如图23所示，可知Ir-cR8-HSA纳米粒中的Ir-cR8相比于游离Ir-cR8更不易释放出来。
将100μL Ir-cR8和Ir-cR8-HSA纳米粒(160μM)分别与900μL含10％胎牛血清的PBS溶液混合孵育2、4、16和24h，将孵育后的混合溶液加入铺好4T1细胞的96孔板中，孵育24h，加入噻唑蓝检测细胞抑制活性，与未经血清处理过的Ir-cR8和Ir-cR8-HSA纳米粒的细胞抑制活性比较，结果如图24所示，Ir-cR8-HSA纳米粒保留了87.05％的细胞抑制活性，而Ir-cR8仅剩余42.74％的细胞抑制活性，表明通过制备多肽白蛋白纳米粒，能够抑制血清中各种酶对阳离子双亲性多肽的降解，有利于阳离子双亲性多肽在体内的循环。
取36只Bal b/c小鼠，均分为2组，尾静脉分别注射500μM的Ir-cR8及其Ir-cR8-HSA纳米粒各100μL，分别于0.5h、2h、4h、8h、24h和48h摘眼球取血，10000rpm离心10min，取100μL离心后的血清，加入1mL高氯酸和3mL王水，260℃消解2h，加水至10mL，使用ICP-MASS检测各时间点血液中金属铱的含量，结果如图25所示，结果表明Ir-cR8在血液中的消除半衰期小于0.5h，而Ir-cR8-HSA纳米粒在血液中的消除半衰期为12.75h，Ir-cR8-HSA纳米粒在血液中的循环时间明显提升。
取1mL小鼠血液，加入1mLPBS，吹打均匀后于1000rpm离心5min，重复上述步骤，弃掉PBS，加入52.5mL新鲜的PBS，设置空白对照组(140μLPBS/孔)，阴性对照组(70μL红细胞悬液+70μL PBS/孔)，阳性对照组(70μL红细胞的纯水裂解液+70μL纯水/孔)，实验组(70μLIr-cR8或Ir-cR8-HSA纳米粒+70μL红细胞悬液)，于37℃、87rpm振荡2h，3000rpm离心5min，取90μL上清检测其在405nm处的吸收值，结果如图26所示，Ir-cR8在浓度为78.125μM时造成52.87％的溶血，而Ir-cR8-HSA纳米粒在浓度为625μM时只造成15.70％的溶血，表明将阳离子双亲性多肽制备成多肽白蛋白纳米粒能够明显降低多肽本身的溶血作用，提高了生物安全性。
试验例7
本试验例对Ir-cR8-HSA纳米粒的肿瘤靶向性和激发机体自身抗肿瘤免疫反应的效果进行研究。
在Bal b/c小鼠腹股沟处皮下注射106个4T1细胞，构建Bal b/c小鼠皮下瘤模型，待肿瘤体积(体积＝L×D2/2，L为肿瘤长度，D为肿瘤宽度)达到100mm3，尾静脉各注射100μL500μM的Ir-cR8和Ir-cR8-HSA纳米粒，24h后处死小鼠，分别取心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，称重后剪碎加入1mLPBS匀浆破碎，10000rpm离心10分钟，取上清用328nm波长激发，测各样品在502nm处的荧光发射强度，根据Ir-cR8和Ir-cR8-HSA纳米粒的PBS溶液在同样激发条件下的502nm处的荧光发射强度计算各组织上清液中Ir-cR8和Ir-cR8-HSA纳米粒的浓度。结果如图27所示，Ir-cR8-HSA纳米粒在肿瘤部位的浓度为12.19μg/g，Ir-cR8在肿瘤部位的浓度为4.14μg/g，尾静脉注射24h后Ir-cR8-HSA纳米粒在肿瘤部位的蓄积量约为Ir-cR8的3倍，表明Ir-cR8-HSA纳米粒相比Ir-cR8在肿瘤部位具有更好的蓄积作用，具备高靶向性。
在Bal b/c小鼠腹股沟处皮下注射106个4T1细胞，构建Bal b/c小鼠皮下瘤模型，待肿瘤体积(体积＝长*宽^2/2)达到100mm3，连续4天各尾静脉注射100μL 500μM的HSA、Ir-cR8、Ir-cR8-HSA纳米粒，尾静脉注射同样体积的PBS作为对照。在给药后的第5天，取肿瘤侧的腹股沟淋巴结，分散成单个细胞，过70μm滤器，于4℃用抗小鼠CD11c-FITC、CD80-PE和CD86-APC的抗体在细胞染色缓冲液中染色15min，再用细胞染色缓冲液洗3遍，用500μL细胞染色缓冲液重悬，使用流式细胞仪检测，结果如图28所示，Ir-cR8-HSA纳米粒能够在肿瘤处蓄积，其通过胀亡杀伤肿瘤细胞使得附近腹股沟淋巴结的树突状细胞(Dendritic Cells，DC)摄取肿瘤相关抗原并成熟得更多。
在Bal b/c小鼠腹股沟处皮下注射106个4T1细胞，构建Bal b/c小鼠皮下瘤模型，待肿瘤体积(体积＝长*宽^2/2)达到100mm3，连续4天分别尾静脉注射100μL 500μM的HSA、Ir-cR8和Ir-cR8-HSA纳米粒，尾静脉注射同样体积的PBS作为对照。在给药后的第7天，取肿瘤，分散成单个细胞，过70μm滤器，于4℃用抗小鼠CD3-FITC、CD4-Percp-Cy5.5和CD8a-APC的抗体在细胞染色缓冲液中染色15min，并用细胞染色缓冲液洗3遍，用500μL的细胞染色缓冲液重悬，采用流式细胞仪检测。结果如图29所示，由于Ir-cR8-HSA纳米粒促进了腹股沟淋巴结中树突状细胞的成熟及肿瘤部位死亡的肿瘤细胞碎片，使得肿瘤部位细胞毒T细胞(CD8+)显著增加，抗肿瘤免疫进一步增强。
取6周的成年雌性Bal b/c小白鼠，在其背部皮下种植106个4T1细胞构建皮下瘤小鼠模型，待肿瘤体积达到50～60mm3时将小鼠分为4组，每组5只，分别连续4天尾静脉注射PBS以及500μM的HSA、Ir-cR8和Ir-cR8-HSA纳米粒各100μL，观察各小鼠肿瘤的生长情况，结果如图30和图31所示，Ir-cR8-HSA纳米粒组具有良好的肿瘤抑制效果，能够使小鼠的肿瘤完全消退，而其他组则无法有效地抑制肿瘤的生长。
取第一次皮下瘤已消除的Ir-cR8-HSA纳米粒组小鼠5只，再次在另一边皮下接种8×105个4T1细胞，取年龄相同的未受任何处理的小鼠5只作为对照组(未治疗)，同样在皮下接种8×105个4T1细胞，观察两组的肿瘤生长情况，结果如图32和图33所示，已接受过Ir-cR8-HSA纳米粒治疗的小鼠对肿瘤形成了抗肿瘤免疫记忆，不易再受到肿瘤的二次侵害，表明本发明的多肽白蛋白纳米粒能够能诱导机体自身抗肿瘤免疫反应。
综上所述，本发明的多肽白蛋白纳米粒能够有效抑制酶降解，在血液中的消除半衰期长，具备较高的稳定性；溶血作用低，安全性高；能够使肿瘤细胞肿胀并吐出胞内容物，具有诱发胀亡的杀伤肿瘤机制；能够有效在肿瘤部位蓄积，具备高靶向性；能够促进淋巴结的树突状细胞成熟，增加T细胞(CD8+)，诱导机体自身抗肿瘤免疫反应。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种多肽白蛋白纳米粒，其特征在于，所述多肽白蛋白纳米粒由阳离子双亲性多肽和白蛋白组装形成。
2.根据权利要求1所述的多肽白蛋白纳米粒，其特征在于，所述阳离子双亲性多肽包括疏水部分和亲水部分；
优选地，所述亲水部分包括精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的任意一种或至少两种的组合，优选为精氨酸；
优选地，所述疏水部分包括[Ir(ppy)2(H2O)2]OTf、疏水性氨基酸或脂类中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述脂类包括胆固醇及其衍生物或脂肪酸及其衍生物中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述阳离子双亲性多肽的结构式如式I或式II所示；
Figure FDA0003287329860000011
其中，n为精氨酸残基的数目，为1～9的整数；
优选地，所述阳离子双亲性多肽的一级结构为CH3CO-XRn-CONH2或脂类-Rn-CONH2；
其中，X包括苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸中的任意一种或至少两种的组合，n为精氨酸残基的数目，为1～12的整数。
3.根据权利要求1或2所述的多肽白蛋白纳米粒，其特征在于，所述白蛋白包括哺乳动物白蛋白；
优选地，所述哺乳动物白蛋白包括人血清白蛋白和/或牛血清白蛋白。
4.一种权利要求1-3任一项所述的多肽白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
分别配制阳离子双亲性多肽溶液和白蛋白溶液，将所述阳离子双亲性多肽溶液和白蛋白溶液混合，得到所述多肽白蛋白纳米粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述阳离子双亲性多肽溶液的浓度为20～5000μM；
优选地，所述白蛋白溶液的浓度为20～5000μM。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述阳离子双亲性多肽和所述白蛋白的摩尔比为(0.1～10):1。
7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述混合的温度为5～100℃；
优选地，所述混合的时间为0.5～120min。
8.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将阳离子双亲性多肽加入到水、40～60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液或10～20mM磷酸盐缓冲液中，获得20～5000μM阳离子双亲性多肽溶液；将白蛋白加入到水或10～20mM磷酸盐缓冲液中，获得20～5000μM白蛋白溶液；
(2)按阳离子双亲性多肽和白蛋白的摩尔比为(0.1～10):1将阳离子双亲性多肽溶液和白蛋白溶液混合，加入水或磷酸盐缓冲液，于5～100℃混合0.5～120min，得到所述多肽白蛋白纳米粒。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述的多肽白蛋白纳米粒；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.权利要求1-3任一项所述的多肽白蛋白纳米粒或权利要求9所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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