CN114606233A

CN114606233A - 靶向长链非编码RNA HOXD-AS2的siRNA及其在肝癌治疗中的应用

Info

Publication number: CN114606233A
Application number: CN202210278276.0A
Authority: CN
Inventors: 孙晋; 李宗芳; 孔光耀; 杨军; 郭瑛; 田红卫; 李君�
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2022-03-21
Filing date: 2022-03-21
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-03-21
Also published as: CN114606233B

Abstract

本发明公开了一种靶向长链非编码RNA HOXD‑AS2的siRNA及其在肝癌治疗中的应用。通过设计并合成靶向HOXD‑AS2的siRNA，将其转染肝癌细胞系，证实利用siRNA靶向抑制HOXD‑AS2的表达可显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移的能力并诱导肝癌细胞周期阻滞于S期。本发明为肝癌治疗药物的研发提供了新靶点和有效途径。

Description

靶向长链非编码RNA HOXD-AS2的siRNA及其在肝癌治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及靶向长链非编码RNA HOXD-AS2(HOXDCluster Antisense RNA 2)的小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)及其在肝癌治疗中的应用。

背景技术

肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，为全球第四大致死性肿瘤，对人类健康构成严重威胁，尤其在东亚、非洲和南欧地区发病率较高。由于发病机制复杂、早期病程隐匿、发病率高、预后差以及术后高复发与高转移等特点，特别是缺乏有效的早期诊断方法和有效的治疗手段，导致患者病死率居高不下。目前，早期手术切除是肝癌最主要和最有效的治疗手段，但大部分患者初次诊断时肝癌就已进入中晚期，极大限制了手术治疗，且手术复发率高。此外，局部消融、放化疗、介入治疗及肝移植等治疗方法，由于在临床应用中受到众多禁忌症的限制，其总体疗效仍然有限。

近年来，肿瘤分子靶向治疗作为一种新型疗法，已逐步成为临床肿瘤治疗的重要手段。由于分子靶向治疗是通过特异性分子干预(封闭或抑制)肿瘤发生关键基因及信号传导通路等分子靶点，从而抑制肿瘤细胞的生长、转移或诱导其凋亡，因此与传统治疗手段相比，具有更好的精准性，能选择性地杀伤肿瘤细胞，对正常组织损伤较低或无损伤、副作用小，并且不易产生耐药性。目前，临床上应用于肝癌治疗的分子靶向药主要有索拉非尼、仑伐替尼、瑞戈非尼、卡博替尼、雷莫芦单抗和阿帕替尼，可见用于肝癌治疗的分子靶向药物非常有限和匮乏，其关键原因在于有效的分子靶点数量不足。因此目前迫切需要开发新的有效分子靶点。

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸但缺乏蛋白编码能力的RNA分子，大量研究表明许多lncRNA在肿瘤中表达失调，可在表观遗传、转录以及转录后水平调控基因表达，进而参与肿瘤的发生发展，已成为肿瘤生物标志物和治疗靶点研发的重要分子靶点类型。但获得可以高效(抑制率大于50％)降低lncRNA表达水平的siRNA仍是较为困难的，例如中国专利CN108546702A中就需要利用多条siRNA降低长链非编码RNA DDX11-AS1的表达，而且这一类专利公开的siRNA临床应用极少，主要原因包括其在动物个体上对肝癌的治疗效果并未证实，客观反映出相应lncRNA作为靶点在肝癌治疗潜力上的不足。

LncRNA HOXD-AS2为一条转录于2号染色体q31.1区域HOXD基因簇的非编码转录本。研究发现，lncRNA HOXD-AS2在胶质母细胞瘤中上调表达，其可通过促进细胞增殖、迁移和侵袭促进肿瘤进展，提示lncRNA HOXD-AS2发挥促癌作用；而最近一项在胃癌中的研究发现，lncRNA HOXD-AS2在胃癌中呈现低表达趋势，其过表达可抑制胃癌进展，提示lncRNAHOXD-AS2在胃癌中发挥抑癌作用，可见lncRNA HOXD-AS2在不同肿瘤中的生物学功能存在差异。LncRNA HOXD-AS2在肝癌中的表达情况、对肝癌的发生发展的影响，以及有作为肝癌治疗靶点的潜力目前均不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向长链非编码RNA HOXD-AS2的siRNA及其在肝癌治疗中的应用。该siRNA可以高效抑制LncRNA HOXD-AS2表达水平，应用于肝癌治疗药物开发。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明首先采用荧光定量PCR的方法对临床肝癌组织/癌旁组织、肝癌细胞系/正常肝细胞中的lncRNA HOXD-AS2表达水平进行了检测，发现与癌旁组织和正常肝细胞相比，LncRNA HOXD-AS2在肝癌组织和肝癌细胞系中高表达；其次，针对lncRNA HOXD-AS2基因序列设计并合成多条特异靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA，采用脂质体介导的方法转染肝癌细胞后，通过荧光定量PCR的方法检测siRNA沉默lncRNA HOXD-AS2的效率，结果筛选出了可以通过联合转染对lncRNA HOXD-AS2具有较高的沉默效率的siRNA。

优选的，本发明提供的能高效抑制LncRNA HOXD-AS2表达的siRNA，为序列分别如SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6所示siRNA中3～6条siRNA的混合物(其中6条siRNA联合转染后lncRNA HOXD-AS2表达水平下调70％以上)。

本发明提供的能高效抑制LncRNA HOXD-AS2表达的siRNA可以在制备治疗肝癌的药物中应用。

优选的，通过采用CCK-8、PI染色流式分析、Transwell等实验方法检测siRNA对细胞增殖、周期、侵袭、迁移的影响，结果表明本发明提供的能高效抑制LncRNA HOXD-AS2表达的siRNA，可以在显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的同时诱导细胞周期阻滞在S期(即显著抑制肝癌细胞进展)，结合动物实验明确了上述能高效抑制LncRNA HOXD-AS2表达的siRNA达到治疗肝癌的目的。

本发明提供的用于治疗肝癌的药物制剂，包括上述能高效抑制LncRNA HOXD-AS2表达的siRNA或其核酸序列修饰物及药学上接受的载体。

优选的，所述核酸序列修饰物为通过对靶向LncRNA HOXD-AS2的siRNA(例如SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6中任意一个或多个序列所示的siRNA)进行任意核苷酸的核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或多种修饰后获得的核酸序列修饰物。

优选的，所述载体选自病毒、纳米颗粒、胆固醇或脂质体。

本发明还提供一种用于诊断肝癌或检测细胞中LncRNA HOXD-AS2的表达水平的试剂盒，该试剂盒包括用于采用实时荧光定量PCR方法检测LncRNA HOXD-AS2的表达量的引物对。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA，降低lncRNA HOXD-AS2表达水平，能够有效抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，同时有效诱导肝癌细胞周期阻滞在S期，结合动物实验结果表明lncRNA HOXD-AS2作为肝癌治疗靶点，对于开发新的抗肝癌基因药物和提高肝癌的治疗效果有重要的意义，具有显著的应用前景和经济价值。

进一步的，本发明所提供的siRNA能高效抑制lncRNA HOXD-AS2的表达，抑制率可达70％以上。

附图说明

图1为lncRNA HOXD-AS2在人肝细胞癌及癌旁组织(A)、人肝细胞癌细胞系及正常肝细胞株(B)中的表达，其中：*p<0.05，**p<0.01，差异具有统计学意义。

图2为靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA对肝癌细胞Bel-7402和SMMC-7721中lncRNAHOXD-AS2的抑制效率，其中：**p<0.01，差异具有统计学意义。

图3为靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA对肝癌细胞增殖(A)和克隆形成(B)的影响，其中：**p<0.01，差异具有统计学意义。

图4为靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA对肝癌细胞周期的影响，其中：**p<0.01，差异具有统计学意义。

图5为靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA对肝癌细胞迁移(Migration)能力的影响，其中：**p<0.01，差异具有统计学意义。

图6为靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA对肝癌细胞侵袭(Invasion)能力的影响，其中：**p<0.01，差异具有统计学意义。

图7为靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA对肝癌细胞在裸鼠体内生长的影响，其中：*p<0.05，差异具有统计学意义。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明为了明确lncRNA HOXD-AS2是否参与肝癌的发生发展，首先通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对HOXD-AS2在临床肝癌组织和肝癌细胞系中的表达水平进行了检测，发现lncRNA HOXD-AS2在肝癌组织和肝癌细胞系中高表达；其次，针对lncRNA HOXD-AS2基因序列设计并合成多条特异靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA，采用脂质体介导的方法将不同siRNA的混合物转染肝癌细胞Bel-7402和SMMC-7721以沉默其lncRNA HOXD-AS2的表达，并观察对细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响。最终对筛选得到一组siRNA中全部6条siRNA通过动物实验进行了治疗肝癌的在体验证。

实验1、LncRNA HOXD-AS2在人肝细胞癌细胞系及正常肝细胞株、肝细胞癌及癌旁组织中的表达

1、材料

细胞：人肝细胞癌细胞系HepG2、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、Bel-7402、Bel-7404及正常肝细胞株L-O2，均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

试剂：DMEM高糖型细胞培养液、青霉素、链霉素购自Hyclone公司，胎牛血清购自Gibco公司，Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)和实时荧光定量试剂TB

Premix Ex Taq^TMII购自TaKaRa公司。qRT-PCR特异性引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

2、方法

2.1、标本来源

收集西安交通大学第二附属医院和宝鸡市中心医院2016年1月～2017年12月手术切除肝癌标本20例，手术切除后30min内取材，每例分别取癌组织和癌旁组织(距肿瘤边缘>2cm)，立即投入液氮保存。所有肿瘤标本经病理证实为肝细胞癌。

2.2、细胞培养

人肝细胞癌细胞系HepG2、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、Bel-7402、Bel-7404和正常肝细胞株L-O2用高糖型DMEM细胞培养液(加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素链霉素双抗)，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

2.3、细胞及组织中总RNA的提取

对于人肝癌细胞及正常肝细胞、肝癌组织及癌旁组织，使用Trizol试剂提取细胞和组织总RNA。利用Nanodrop 2000分光光度法(Thermo Fisher Scientific，USA)和琼脂糖凝胶电泳评估RNA的浓度和质量。总RNA提取方法具体如下：

①将6孔板中培养的细胞去掉培养液，用预冷的PBS洗涤2次，加入1mL Trizol试剂裂解细胞，并移至无酶EP管中；或取100mg组织置入1mL Trizol，匀浆器匀浆，并移至无酶EP管中；

②向无酶EP管中加入200μL氯仿，充分震荡混匀15s，室温静置5min后置于4℃超速离心机，12000rpm离心15min；

③将上层含有RNA的水相移入新的无酶EP管中，作好相应标记，加入500μL异丙醇，振荡器上充分震荡混匀，置于4℃超速离心机，12000rpm离心10min；

④完全弃除上清，沉淀即为RNA，然后加入提前配制的1mL 75％乙醇，振荡器上充分混匀后于4℃超速离心机，7500rpm离心5min；

⑤完全弃除上清，风干沉淀后加入无酶水20μL，并测定RNA浓度及纯度，标记好后置于-80℃超低温冰箱保存。

2.4、反转录

采用TAKARA公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)试剂盒，并按说明书操作，分为两步：

第一步去除提取的总RNA中的基因组DNA，体系如下：提取的总RNA1μg、5×gDNAEraser Buffer 2μL，及gDNA Eraser 1μL，无RNA酶的ddH₂O补到10μL。置于PCR仪中42℃孵育2min，得反应液。

第二步进行反转录反应，体系如下：上一步的反应液10μL、5×PrimescriptBuffer2(for Real Time)4μL、Primescript RT Enzyme Mix I 1μL、RT Primer Mix 1μL，及ddH₂O4μL，总体积20μL。置于PCR仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s灭活逆转录酶，得到cDNA。

2.5、qRT-PCR

采用TAKARA公司TB

Premix Ex Taq^TM II试剂盒，其反应体系如下：SYBR10μL、lncRNA-HOXD-AS2正向引物(5`-AACTGCTCTGGTGAACTCC-3`)0.4μL、lncRNA-HOXD-AS2反向引物(5`-TTCTTGTGTCCTCTGCTTCC-3`)0.4μL、cDNA 2μL、ROX Reference Dye II 0.4μL，及ddH₂O 6.8μL，总体积20μL。

内参基因β-Actin的正向引物为：5`-TGGCACCCAGCACAATGAA-3`，反向引物为：5`-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3`。

反应条件如下：95℃30s预变性；95℃5s变性，60℃34s退火并延伸，40个循环。熔解曲线分析：60～95℃，每0.4℃读1次。同时以内参β-Actin基因作为校对，使用ABI7500 fast进行qRT-PCR和数据收集，采用2-ΔΔCt进行数据分析。

3、结果

LncRNA HOXD-AS2在癌旁组织中表达水平较低，而在肝癌组织中呈现高表达，并达到显著差异(p＜0.05、图1A)。LncRNA HOXD-AS2在HCC细胞系(HepG2、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、Bel-7402、Bel-7404)中表达显著高于正常肝细胞柱LO-2(图1B)。这些结果表明lncRNA HOXD-AS2在HCC组织和细胞中异常上调表达，提示其可能具有促癌作用。

实验2、siRNA抑制LncRNA HOXD-AS2表达后对肝癌细胞生物学功能的影响

1材料

细胞：人肝细胞癌细胞系Bel-7402和SMMC-7721，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

试剂：转染试剂Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher Scientific公司，CCK-8试剂购自日本DOJINDO公司，细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司。

2、方法

2.1细胞培养

同实验1。

2.2靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA序列的设计与合成

在NCBI获得lncRNA HOXD-AS2基因序列(NR_038435.1)，然后利用BLOCK-iT RNAiDesigner软件(Thermo Fisher Scientific)设计特异靶向HOXD-AS2的siRNA(siHOXD-AS2)，从结果中选择不同siRNA的序列进行合成并制成siRNA混合物(等摩尔比)，以下展示了最终通过动物实验验证的6条siRNA的序列(于2016年03月完成设计)：

siRNA1：5`-CGCTCATGTTGGTGAAGAA-3`

siRNA2：5`-ACAAGAAGCTTGGATGTGA -3`

siRNA3：5`-CCACCTCTGCAGAGACAAA-3`

siRNA4：5`-GCGATTCTTACCCGAAGGCT-3`

siRNA5：5`-AGGAACTGCTCTGGTGAACT-3`

siRNA6：5`-ATGCAGCCTTCAGAACCTTC-3`

上述6条靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA由广州锐博生物科技有限公司合成，其混合物称为siHOXD-AS2。

实验用到的阴性对照序列(siNC，在人基因组上无作用靶点)购自广州锐博生物科技有限公司。

2.3细胞转染

将人肝细胞癌细胞系Bel-7402和SMMC-7721接种于6孔板中，37℃、5％CO₂培养过夜，在转染前生长至汇合度30～50％，参照Lipofectamine 3000(Thermo FisherScientific)说明书进行转染48h。具体步骤如下：

a)将5μL siHOXD-AS2/siNC(终浓度50nm)和3.75μL lipo3000转染试剂分别加入至125μL无血清DMEM培养液中，分别混匀后，将含有siRNA的DMEM培养液加入至含有lipo3000转染试剂的DMEM培养液中，小心混匀，静置5min，得转染液；

c)转染：将上述转染液加入上述6孔板(含有2mL培养液)中，置于37℃、5％CO₂培养箱孵育；

d)转染后收集细胞，采用qRT-PCR检测siRNA对lncRNA HOXD-AS2的干扰效果，或进行细胞增殖、周期、侵袭与迁移实验。

2.4qRT-PCR检测siRNA对lncRNA HOXD-AS2的干扰效果

转染48h后，收集转染后的实验组细胞(转染siHOXD-AS2的肝癌细胞)和对照组细胞(转染siNC的肝癌细胞)，进行细胞总RNA提取，反转录及qRT-PCR，方法同实验1。

2.5细胞增殖实验

采用CCK-8实验和平板克隆形成实验检测细胞增殖活性。

CCK-8实验具体操作方法：收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组细胞，加入完全培养液重悬，细胞计数，以3000个/孔密度接种于96孔板中，实验组和对照组各设置5行，每行4个复孔，37℃、5％CO₂培养。设置24h、48h、72h及96h 4个时间点，检测时每孔加入10μLCCK-8试剂并在37℃培养箱中孵育1小时30分钟后，通过酶标仪检测450nm处各孔的光密度(OD)。在无细胞孔中加入完全培养基作为调零孔。

克隆形成实验具体操作方法：收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组细胞，加入完全培养液重悬，细胞计数，以1000个/孔密度接种于6孔板，实验组和对照组各3孔，培养7天后吸去各孔培养基，PBS洗涤2次，每孔加1mL 4％多聚甲醛固定20min，吸去多聚甲醛，PBS洗涤2次，每孔加入1mL结晶紫染色液，20min后吸去，自来水下冲洗6孔板，晾干后计算集落。

2.6细胞周期实验

根据试剂盒说明书，细胞接种于6孔板中，收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组细胞，并用预冷的70％乙醇于4℃下固定过夜，用PBS洗涤细胞后，用碘化丙啶(PI)染色溶液(含RNase A)重悬细胞沉淀并在37℃避光孵育30分钟，通过流式细胞仪(BD FACSCantoII)测定细胞DNA含量，并用FlowJo软件(Treestar，USA)根据DNA含量进行各阶段细胞百分数分析。

2.7细胞侵袭与迁移实验

收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组细胞，加入完全培养液重悬，细胞计数。在未铺和预铺基质胶的Transwell小室内加入100μL细胞悬液(含1％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养液，每孔约4×10⁴个细胞)，将小室放入24孔板细胞培养板内，在下层中加入600μL含20％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养液，37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度培养细胞24～48h。取出小室，弃除24孔板内的培养液，加入600μL 90％乙醇固定10min，用无菌棉签轻轻拭去小室内部残留的乙醇和细胞，待风干后加入600μL0.1％结晶紫染液，染色10min。使用倒置显微镜，于低倍镜下，每个小室随机选取5～8个视野进行观察并拍照、计数。

3结果

3.1siHOXD-AS2对肝癌细胞lncRNA HOXD-AS2的抑制效率

如图2所示，与转染siNC的对照组相比，肝癌细胞系Bel-7402和SMMC-7721转染siHOXD-AS2后，沉默效果显著，Bel-7402和SMMC-7721细胞中LncRNA HOXD-AS2的表达水平分别下调了71％和77％，表明siHOXD-AS2转染肝癌细胞可显著抑制lncRNA HOXD-AS2的表达水平。

3.2siHOXD-AS2对肝癌细胞的增殖和克隆形成能力的影响

如图3A所示，与siNC对照组相比，转染siHOXD-AS2可明显抑制肝癌细胞的增殖能力，且平板克隆形成实验结果与CCK8实验结果一致，转染siHOXD-AS2后肝癌细胞的平板克隆形成能力显著减弱(图3B)，表明siHOXD-AS2可抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成能力。

3.3siHOXD-AS2对肝癌细胞周期的影响

如图4所示，在肝癌细胞系Bel-7402和SMMC-7721中转染靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA(即siHOXD-AS2)后，细胞周期阻滞在S期，表明siHOXD-AS2导致肝癌细胞周期发生阻滞。

3.4siHOXD-AS2对肝癌细胞的迁移与侵袭的影响

如图5、图6所示，与转染siNC的对照组相比，肝癌细胞系Bel-7402和SMMC-7721中转染靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA(即siHOXD-AS2)，发生迁移和侵袭的细胞数量显著减少，提示siHOXD-AS2可显著抑制肝癌细胞的迁移与侵袭能力。

上述结果表明本发明提供的靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA，具有良好的lncRNAHOXD-AS2表达抑制效果，转染后可显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，同时可诱导肝癌细胞周期阻滞。

实验3、siHOXD-AS2对肝癌细胞在裸鼠体内生长的影响

细胞：人肝细胞癌细胞系Bel-7402，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

利用脂质体将siHOXD-AS2/siNC(工作浓度均为50nM)转染至肝癌细胞Bel-7402后，按5×10⁶个细胞/只的剂量将肝癌细胞移植至裸鼠皮下，并观测皮下荷瘤组织的生长情况(体积和重量)。

如图7所示，与siNC对照组相比，siHOXD-AS2可显著抑制肝癌细胞Bel-7402在裸鼠皮下生长能力。

总之，本发明首次提供了对HOXD-AS2具有较高的沉默效率的siRNA，可显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力，以及诱导细胞周期阻滞，肝癌的治疗提供了有效的药物靶点，从而使得靶向lncRNA HOXD-AS2的siRNA可明确用于开发新的肝癌治疗药物，具有良好的应用前景。

<110> 西安交通大学

<120> 靶向长链非编码RNA HOXD-AS2的siRNA及其在肝癌治疗中的应用

<160> 10

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> siRNA1

<400> 1

cgctcatgtt ggtgaagaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> siRNA2

<400> 2

acaagaagct tggatgtga 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> siRNA3

<400> 3

ccacctctgc agagacaaa 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> siRNA4

<400> 4

gcgattctta cccgaaggct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> siRNA5

<400> 5

aggaactgct ctggtgaact 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> siRNA6

<400> 6

atgcagcctt cagaaccttc 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> lncRNA-HOXD-AS2正向引物

<400> 7

aactgctctg gtgaactcc 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> lncRNA-HOXD-AS2反向引物

<400> 8

ttcttgtgtc ctctgcttcc 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213>内参基因β-Actin正向引物

<400> 9

tggcacccag cacaatgaa 19

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213>内参基因β-Actin反向引物

<400> 10

ctaagtcata gtccgcctag aagca 25

Claims

1.一种siRNA，其特征在于：该siRNA抑制长链非编码RNA HOXD-AS2的表达。

2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA使肝癌细胞中长链非编码RNAHOXD-AS2的表达水平下调70％以上。

3.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述长链非编码RNA HOXD-AS2上的siRNA靶点个数为3～6个。

4.一种靶向长链非编码RNA HOXD-AS2的siRNA在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述siRNA选自SEQ.ID.NO.1～6中的三种以上。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述siRNA通过抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭并诱导细胞周期阻滞治疗肝癌。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述siRNA使肝癌细胞周期阻滞在S期。

8.一种用于治疗肝癌的药物制剂，其特征在于：该药物制剂包括siRNA或其核酸序列修饰物及载体，所述siRNA或其核酸序列修饰物抑制长链非编码RNA HOXD-AS2的表达。

9.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于：所述核酸序列修饰物是通过对所述siRNA进行任意核苷酸的核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或多种修饰而获得的；所述载体选自病毒、纳米颗粒、胆固醇或脂质体。

10.一种用于诊断肝癌或检测细胞中长链非编码RNA HOXD-AS2的表达水平的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于采用实时荧光定量PCR方法检测长链非编码RNA HOXD-AS2的表达量的引物对。