CN114606192B - Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官培养液及培养方法 - Google Patents

Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官培养液及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肺组织的培养，具体涉及一种Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官培养液及培养方法。所述专用培养液，包括DMEM/F‑12培养基、谷氨酰胺、HEPES缓冲液、青霉素/链霉素双抗、N2添加剂、N‑乙酰‑L‑胱氨酸、烟碱、转化生长因子βI型受体、MAPK信号通路抑制剂、Rho激酶抑制剂、重组人Noggin蛋白、重组人WNT信号通路激活剂、重组人成纤维细胞生长因子‑7、重组人成纤维细胞生长因子‑10、地塞米松、β‑巯基乙醇及liproxstatin‑1。培养液贴合了Lkb1突变型肿瘤的生物学特点，能够促进小鼠Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官的体外生长并维持其基因特征。因此，通过本发明培养方法进行类器官的培养时成功率更高。

Description

Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官培养液及培养方法
技术领域
本发明涉及肺组织的培养和建立，具体涉及一种Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官的专用培养液及其培养方法。
背景技术
肺癌是目前世界范围内发病率排第二，死亡率排第一的恶性肿瘤。以免疫检查点抑制剂为代表的肿瘤免疫治疗正在逐步影响肺癌临床治疗方式，肺癌驱动基因状态与免疫治疗疗效关系密切。在肺腺癌中，LKB1突变率高达15％-30％，且在KRAS突变的肺腺癌中，其共突变率高达三分之一。KRAS/LKB1突变型肺癌，患者基数大，预后差，在免疫治疗时代，LKB1基因失活又成为抗PD-1治疗原发耐药的驱动因素。因此，在免疫治疗迈入肺癌一线疗法的时代，深入开展KRAS/LKB1突变型肺癌免疫治疗耐药机制的研究及针对性地开发新药物以逆转免疫治疗耐药是临床上亟待解决的问题，具有极大研究意义。
传统的肿瘤研究模型，例如肿瘤细胞系、小鼠皮下移植瘤模型、基因工程小鼠模型等，面临的弊端正日益显露。体外培养肿瘤细胞无法考虑肿瘤细胞与肿瘤微环境中其他组分的相互作用，而肿瘤微环境又在肿瘤的发生发展以及对药物的反应性中发挥重要作用。小鼠皮下移植瘤模型无法体现器官特异性的免疫微环境。基因工程小鼠成瘤周期长，难以直观、及时地反应外部治疗对肿瘤的影响。近年来，类器官模型发展迅猛。肿瘤类器官培养技术是一种来源于肿瘤组织，更接近体内生理性状的3D细胞培养技术。肿瘤类器官能保存肿瘤的异质性、组织特性及基因突变信息，能够在体外模拟癌症的发生发展过程，构建疾病模型，进行快速准确的癌症药物筛选，有效补充了传统的肿瘤细胞系模型和肿瘤动物模型，为肿瘤学研究及快速高效研发抗肿瘤药物提供了新的技术平台。
目前已经成功构建出的肿瘤类器官包括结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌等，小鼠肺癌组织类器官培养技术尚不成熟，缺乏标准化的培养基；在维持肿瘤类器官生长的同时，如何在传代中维持肿瘤类器官的基因特征稳定不丢失也尚不清楚，这些都制约了类器官培养技术在研究KRAS/LKB1突变型肺癌免疫治疗耐药机制及解决策略上的应用。开发一种能维持基因特征稳定的小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官模型，对探究LKB1基因失活诱导的原发免疫治疗耐药机制及寻找免疫耐药逆转剂具有重要的临床应用价值。
发明内容
针对上述问题，本发明的第一个目的是提供了一种能维持基因特征稳定的Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官的专用培养液，本发明的第二个目的是提供一种用于Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官培养的试剂盒，本发明的第三个目的是提供一种Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官的培养方法。
为实现本发明的第一个目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种KrasG12D/+Lkb1fl/fl型(即Kras/Lkb1突变型)非小细胞肺癌类器官的专用培养液，包括DMEM/F-12培养基、谷氨酰胺、HEPES缓冲液、青霉素/链霉素双抗、N2添加剂、N-乙酰-L-胱氨酸、烟碱、转化生长因子βI型受体、MAPK信号通路抑制剂、Rho激酶抑制剂、重组人Noggin蛋白、重组人WNT信号通路激活剂、重组人成纤维细胞生长因子-7、重组人成纤维细胞生长因子-10、地塞米松、β-巯基乙醇及liproxstatin-1；
所述β-巯基乙醇为式I所示的化合物；所述liproxstatin-1为式II所示的化合物；
进一步地，所述地塞米松的浓度为3-5nM；所述β-巯基乙醇的浓度为55-70μM；所述liproxstatin-1的浓度为200-250nM；所述谷氨酰胺浓度为1-2mM；所述的HEPES缓冲液浓度为10-20mM；所述的青霉素/链霉素双抗在培养液中的体积分数是1-3％；所述的N2添加剂浓度是1-2％；所述的N-乙酰-L-胱氨酸在培养液中的浓度是1-3μM；所述的烟碱浓度为3-5mM；所述的转化生长因子βI型受体在培养液中的浓度是0.5-1μM；所述的MAPK信号通路抑制剂在培养液中的浓度是0.5-0.8μM；所述的Rho激酶抑制剂在培养液中的浓度是3-5μM；所述的重组人Noggin蛋白在培养液中的浓度是80-100ng/mL；所述的重组人WNT信号通路激活剂在培养液中的浓度是0.5-0.9μg/mL；所述的重组人成纤维细胞生长因子-7在培养液中的浓度是25-30ng/mL；所述的重组人成纤维细胞生长因子-10在培养液中的浓度是90-100ng/mL。
进一步地，所述地塞米松的浓度为3nM；所述β-巯基乙醇的浓度为55μM；所述liproxstatin-1的浓度为200nM；所述谷氨酰胺浓度为2mM；所述的HEPES缓冲液浓度为10mM；所述的青霉素/链霉素双抗在培养液中的体积分数是1％；所述的N2添加剂浓度是1％；所述的N-乙酰-L-胱氨酸在培养液中的浓度是1μM；所述的烟碱浓度为5mM；所述的转化生长因子βI型受体在培养液中的浓度是0.5μM；所述的MAPK信号通路抑制剂在培养液中的浓度是0.5μM；所述的Rho激酶抑制剂在培养液中的浓度是5μM；所述的重组人Noggin蛋白在培养液中的浓度是100ng/mL；所述的重组人WNT信号通路激活剂在培养液中的浓度是0.5μg/mL；所述的重组人成纤维细胞生长因子-7在培养液中的浓度是25ng/mL；所述的重组人成纤维细胞生长因子-10在培养液中的浓度是100ng/mL。
为实现本发明的第二个目的，本发明所采用的技术方案为：
一种用于Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官培养的试剂盒，包括上述的培养液、IV型胶原酶及基质胶。
进一步地，所述IV型胶原酶的浓度为0.5-1mg/mL。
更进一步地，所述IV型胶原酶的浓度为0.5mg/mL。
为实现本发明的第三个目的，本发明所采用的技术方案为：
一种Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官的培养方法，利用上述的培养液或试剂盒对Kras/Lkb1突变型肺肿瘤组织进行培养。
所述的Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
(1)利用IV型胶原酶消化得到细胞微球体，并建立小鼠Kras/Lkb1突变型肺癌类组织类器官模型；消化组织为微球体时，本方法结合酶消化法和组织块法，相对单一采用酶消化法或者组织块法，后续类器官生长的速度要大大提高，原因在于肺组织富含胶原，肿瘤组织块经IV型胶原酶消化后，细胞更容易从胶原基质中分离下来，合适的消化时间能最大限度地保存细胞活性，提高类器官的培养状态。
(2)利用专用培养液和基质胶对小鼠Kras/Lkb1突变型型肺癌类组织类器官进行传代培养。
进一步地，所述步骤(1)中，用PBS洗涤2～3次微球体后，加入100μL培养液和基质胶为1:1的混合液重悬，待基质胶凝固后加入培养液继续培养。
进一步地，所述步骤(2)中，传代培养在基质胶内的类器官密度达到80％-90％时进行。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明所述的Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官的专用培养液中，含有特定浓度的地塞米松，β-巯基乙醇及liproxstatin-1。Lkb1突变的肿瘤由于肿瘤细胞内氧化还原系统失衡，易导致活性氧堆积，更容易发生铁死亡。该特定浓度的地塞米松，β-巯基乙醇及liproxstatin-1，贴合了Lkb1突变型非小细胞肺癌这一特殊类型肿瘤的生物学特点，能够解除活性氧对肿瘤细胞的危害，抑制细胞铁死亡，能够促进小鼠Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官的体外生长并维持其基因特征。
2.本发明所提供的Kras/Lkb1突变型非小细胞肺癌类器官的培养方法，培养成功率高，能提高肿瘤纯度，减少正常组织对肿瘤组织的营养争夺，能最大限度地保存细胞活性，较好地维持类器官状态；能够在体外模拟KRAS/LKB1突变型肺癌的发生发展过程，利于深入开展KRAS/LKB1突变型肺癌免疫治疗耐药机制的研究，及进行快速准确的癌症药物筛选以逆转免疫治疗耐药，满足科学研究的需要。
附图说明
图1为本发明KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的构建流程；
图2为本发明实施例中用MRI确定转基因小鼠成瘤情况图；
图3为本发明实施例中通过Western Blot实验检测LKB1缺失状态图，从左到右分别是阳性对照组织，原组织与类器官培养后的组织；
图4为本发明KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官培养过程中第1天，第2天，第5天，第6天显微镜下照片；
图5为本发明实施例中通过免疫荧光检测KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官中panCK的蛋白表达情况。
具体实施方式
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
本发明实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
本发明实施例中为标注具体实验温度时，均默认实验温度为室温(24℃左右)。
下述实施例中所涉及的实验材料及其来源如下：
DMEM/F-12培养基是Gibco的产品，货号是C11330500BT。
青霉素/链霉素双抗是Gibco的产品，货号是15140-122。
谷氨酰胺是Stemcell的产品，货号是7100。
HEPES缓冲液是Gibco的产品，货号是15630-080。
N2添加剂是Stemcell的产品，货号是7152。
N-乙酰-L-胱氨酸是Abmole的产品，货号是M7588。
烟碱是Abmole的产品，货号是M4896。
转化生长因子βI型受体是Abmole的产品，货号是M5037。
MAPK信号通路抑制剂是Abmole的产品，货号是M2062。
Rho激酶抑制剂是Abmole的产品，货号是M1817。
重组人Noggin蛋白是Peprotech的产品，货号是250-38-20。
重组人WNT信号通路激活剂是Peprotech的产品，货号是315-32-20。
重组人成纤维细胞生长因子-7是Peprotech的产品，货号是100-19-10。
重组人成纤维细胞生长因子-10是Peprotech的产品，货号是100-26-5。
地塞米松是Selleckchem的产品，货号是1322。
β-巯基乙醇是Sigma的产品，货号是60-24-2。
liproxstatin-1是Sigma的产品，货号是950455-15-9。
基质胶Matrigel是Corning的产品，货号为354248。
IV型胶原酶是索莱宝的产品，货号是C8160。
基质胶回收液是R&D Systems的产品，货号是3700-100-01。
下述实施例中所涉及的Kras G12D/+Lkb1fl/fl型小鼠构建方法如下：
购买获得Kras基因G12D条件性点突变小鼠品系，该小鼠与Cre小鼠交配后可获得G12D点突变小鼠。构建携带Cre元件及sgTomato或sgLkb1元件的慢病毒，采用气管内注射的方式将慢病毒注射到小鼠肺部，5个月后对小鼠肺部进行MRI检测，MRI图像显示有明显的肿瘤的形成，Western Blot证实Lkb1在肺肿瘤中的条件性缺失。
实施例1
KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的专用培养液以及制备方法
培养液由DMEM/F-12培养基，谷氨酰胺，HEPES缓冲液，青霉素/链霉素双抗，N2添加剂，N-乙酰-L-胱氨酸，烟碱，转化生长因子βI型受体，MAPK信号通路抑制剂，Rho激酶抑制剂，重组人Noggin蛋白，重组人WNT信号通路激活剂，重组人成纤维细胞生长因子-7和重组人成纤维细胞生长因子-10，地塞米松，β-巯基乙醇及liproxstatin-1组成。其中，DMEM/F-12培养基为母液，以所述DMEM/F-12培养基为基准，地塞米松的浓度为3nM，β-巯基乙醇的浓度为55μM，liproxstatin-1的浓度为200nM，谷氨酰胺浓度为2mM，HEPES缓冲液浓度为10mM，青霉素/链霉素双抗在培养液中的体积分数是1％，N2添加剂浓度是1％，N-乙酰-L-胱氨酸在培养液中的浓度是1μM，烟碱浓度为5mM，转化生长因子βI型受体在培养液中的浓度是0.5μM，MAPK信号通路抑制剂在培养液中的浓度是0.5μM，Rho激酶抑制剂在培养液中的浓度是5μM，重组人Noggin蛋白在培养液中的浓度是100ng/ml，重组人WNT信号通路激活剂在培养液中的浓度是0.5μg/ml，重组人成纤维细胞生长因子-7在培养液中的浓度是25ng/ml，重组人成纤维细胞生长因子-10在培养液中的浓度是100ng/ml。
实施例2
KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的培养方法
小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官培养方法的流程图如图1所示，具体步骤如下
1.获取小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型肺癌组织：MRI确定转基因小鼠成瘤后(如图2)，脱颈处死荷瘤小鼠，酒精浸泡3分钟后，固定于解剖台上，从胸骨角向两侧腋窝剪开前胸壁皮肤，沿两侧腋前线剪开肋骨，切勿剪开腹腔，损伤消化道，带来后期污染风险。分离前胸廓上的膈肌，暴露胸腔，仔细辨认正常组织和肿瘤组织，要尽量提取富含血管(呈现粉红色)和含有上皮细胞的部位，剔除坏死组织(黄色或黑色)、脂肪以及肌肉组织。取少量肿瘤组织提取组织蛋白做Western Blot实验，用KrasG12D/+型小鼠非小细胞肺癌肿瘤组织蛋白作为阳性对照(如图3，左边)，确定小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型肺癌组织的LKB1蛋白缺失(如图3，中间)。
2.利用IV型胶原酶将所述肺癌组织消化为微球体：将肿瘤组织用高压灭菌后的眼科剪剪成2mm3薄片，浸泡到消化液，即RPMI-1640培养基中(含有10％FBS、1％青霉素/链霉素双抗、0.5mg/ml IV型胶原酶)，37℃恒温水平摇床中以120rpm速率摇30分钟。用移液枪充分吹打RPMI-1640培养基，再将RPMI-1640培养基依次用100μm和20μm的滤网过滤，取直径20-100μm的微球体，用PBS将滤网内的微球体冲回收集管内。
3.利用所述微球体建立小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官模型：将步骤2中获得的微球体4℃300g离心5分钟，弃上清，收集沉淀，加入PBS吹打，4℃300g离心5分钟，重复一次PBS洗涤操作。在洗涤完成后的微球体沉淀中加入100μl培养液和基质胶混合液重悬(提前一天将冻于-20℃的基质胶置于4℃融化)，肺癌类器官培养液和基质胶的体积比是1:1。按每孔50μl的体积接种于96孔板中，于37℃培养箱放置10分钟，待基质胶凝固后加入100μl培养液继续培养。培养过程中每3-4天更换培养液，培养3-4天，显微镜可观察见类球体细胞团形成，即获得小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官。
4.小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的传代培养：待显微镜下观察到基质胶内类器官密度达到80％-90％时，可予传代。吸走培养基，用预冷的基质胶回收液吹打基质胶，把类器官收集到管子里，0℃恒温摇床中摇2-3小时以溶解基质胶。待基质胶完全消化后，吸走上层的类器官悬浮液，加入DMEM/F12洗涤，4℃500g离心5分钟，将沉淀下来的类器官专用培养液和基质胶的混合液重悬(培养液：基质胶＝1：1)，并以1：2-1：4的比例重新接种于96孔板中，于37℃培养箱放置10分钟，待基质胶凝固后每孔加入100μl培养液继续培养。
实施例3
小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的形态鉴定
建好小鼠Kras G12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官后，在光镜下观察模型建成后第1天，第2天，第5天，第6天培养体系的生长情况，结果如图4所示，可见经过1周的培养时间，逐渐有细胞增殖长出，并形成圆形囊泡样三维组织结构，符合肿瘤类器官的形态学特点。
实施例4
小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的病理鉴定及LKB1蛋白鉴定
通过免疫荧光技术、Western Blot检测上述方法建立的小鼠KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官模型，以对其进行鉴定。具体步骤如下：
用移液枪把96孔板中原有的类器官培养基吸走，加入200μl的PBS溶液，吹打胶滴，使其从培养皿底部脱离，收集类器官和胶滴于15ml离心管，4℃300g离心5分钟，弃上清。取一部分沉淀于1.5ml离心管内，PBS清洗3次，每次5分钟，清洗好的沉淀物用以提取类器官蛋白，Western Blot跑LKB1蛋白，结果如图3(右)所示，类器官保持了原组织LKB1缺失的特点。在剩余的沉淀中，加入3ml 4％多聚甲醛，室温固定30分钟。室温下用PBS清洗3次，每次5分钟。将类器官转移到30％蔗糖溶液4℃孵育过夜。次日，移除蔗糖溶液，在OCT中孵育15分钟。将类器官转移至组织模具中，置于-20℃，继续在OCT中包埋，进行冰冻切片，切片厚度大约为5微米。
冰冻切片免疫荧光染色的步骤如下：将冰冻切片置于PBS中浸泡10分钟，去除OCT；用组化笔将待染色的类器官圈好；在片子上加入50μl 0.5％TritonX-100(PBS配制)，室温放置20分钟；用PBS洗片子1次，用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时；把封闭液吸干，加入50μl panCK抗体(稀释比例是1：100)，4℃在湿盒中孵育过夜；把湿盒放在室温复温30分钟，用PBS洗片子3次，每次10分钟；加入50μl荧光标记的二抗(1:200)，37℃孵育1小时，此时注意要进行避光操作；用PBS洗片子3次，每次10分钟；在载玻片的四周点指甲油，在切片上加入50μl即用型DAPI试剂染核并封片，避光孵育5分钟后，即可在荧光显微镜下观察拍照。图5中，用panCK标记肿瘤细胞，定位在细胞浆，DAPI标记细胞核，经鉴定，本发明培养出的细胞团肿瘤标志物阳性，说明成功培养出了小鼠肿瘤类器官。
以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；本技术领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；这些修改或者替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的专用培养液，其特征在于，由DMEM/F-12培养基、谷氨酰胺、HEPES缓冲液、青霉素/链霉素双抗、N2添加剂、N-乙酰-L-胱氨酸、烟碱、转化生长因子βI型受体、MAPK信号通路抑制剂、Rho激酶抑制剂、重组人Noggin蛋白、重组人WNT信号通路激活剂、重组人成纤维细胞生长因子-7、重组人成纤维细胞生长因子-10、地塞米松、β-巯基乙醇及liproxstatin-1组成；
所述地塞米松的浓度为3-5nM；
所述β-巯基乙醇的浓度为55-70μM；
所述liproxstatin-1的浓度为200-250nM；
所述谷氨酰胺浓度为1-2mM；
所述的HEPES缓冲液浓度为10-20mM；
所述的青霉素/链霉素双抗在培养液中的体积分数是1-3％；
所述的N2添加剂浓度是1-2％；
所述的N-乙酰-L-胱氨酸在培养液中的浓度是1-3μM；
所述的烟碱浓度为3-5mM；
所述的转化生长因子βI型受体在培养液中的浓度是0.5-1μM；
所述的MAPK信号通路抑制剂在培养液中的浓度是0.5-0.8μM；
所述的Rho激酶抑制剂在培养液中的浓度是3-5μM；
所述的重组人Noggin蛋白在培养液中的浓度是80-100ng/mL；
所述的重组人WNT信号通路激活剂在培养液中的浓度是0.5-0.9μg/mL；
所述的重组人成纤维细胞生长因子-7在培养液中的浓度是25-30ng/mL；
所述的重组人成纤维细胞生长因子-10在培养液中的浓度是90-100ng/mL；
所述β-巯基乙醇为式I所示的化合物；所述liproxstatin-1为式II所示的化合物；
2.根据权利要求1所述的KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的专用培养液，其特征在于，
所述地塞米松的浓度为3nM；
所述β-巯基乙醇的浓度为55μM；
所述liproxstatin-1的浓度为200nM；
所述谷氨酰胺浓度为2mM；
所述的HEPES缓冲液浓度为10mM；
所述的青霉素/链霉素双抗在培养液中的体积分数是1％；
所述的N2添加剂浓度是1％；
所述的N-乙酰-L-胱氨酸在培养液中的浓度是1μM；
所述的烟碱浓度为5mM；
所述的转化生长因子βI型受体在培养液中的浓度是0.5μM；
所述的MAPK信号通路抑制剂在培养液中的浓度是0.5μM；
所述的Rho激酶抑制剂在培养液中的浓度是5μM；
所述的重组人Noggin蛋白在培养液中的浓度是100ng/mL；
所述的重组人WNT信号通路激活剂在培养液中的浓度是0.5μg/mL；
所述的重组人成纤维细胞生长因子-7在培养液中的浓度是25ng/mL；
所述的重组人成纤维细胞生长因子-10在培养液中的浓度是100ng/mL。
3.一种用于KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官培养的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的培养液、IV型胶原酶及基质胶。
4.根据权利要求3所述的用于KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官培养的试剂盒，其特征在于，所述IV型胶原酶的浓度为0.5-1mg/mL。
5.根据权利要求4所述的用于KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官培养的试剂盒，其特征在于，所述IV型胶原酶的浓度为0.5mg/mL。
6.一种KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的培养方法，其特征在于，利用权利要求1所述的培养液或权利要求4所述的试剂盒对KrasG12D/+Lkb1fl/fl型肺肿瘤组织进行培养。
7.根据权利要求6所述的KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用IV型胶原酶消化得到的细胞微球体建立小鼠Kras G12D/+Lkb1fl/fl型肺癌类组织类器官模型；
(2)利用专用培养液和基质胶对小鼠Kras G12D/+Lkb1fl/fl型肺癌类组织类器官进行传代培养。
8.根据权利要求7所述的KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，用PBS洗涤2～3次微球体后，加入100μL专用培养液和基质胶为1:1的混合液重悬，待基质胶凝固后加入培养液继续培养。
9.根据权利要求7或8所述的KrasG12D/+Lkb1fl/fl型非小细胞肺癌类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，传代培养须在基质胶内的类器官密度达到80％-90％时进行。
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