CN114075538A - 构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种原位原发的子宫内膜癌肿瘤模型制备方法，属于肿瘤动物模型领域。本发明通过将小鼠子宫内膜细胞以特定培养基培养成类器官，再将类器官进行基因编辑，注射回小鼠子宫内膜，使其发展成肿瘤。本发明构建的肿瘤模型有原发、原位、基因型明确的特定，相比基因工程肿瘤动物模型耗时短，成瘤率高；相比移植瘤动物模型，具有肿瘤发生和发展的体内微环境，更接近子宫内膜癌最真实的状态，应用前景优良。

Description

构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法
技术领域
本发明属于肿瘤动物模型领域。
背景技术
子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性。子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一，每年有接近20万的新发病例，并是导致死亡的第三位常见妇科恶性肿瘤(仅次于卵巢癌和宫颈癌)。其发病与生活方式密切相关，发病率在各地区有差异，在北美和欧洲其发生率仅次于乳腺癌、肺癌、结直肠肿瘤，高居女性生殖系统癌症的首位。在我国，随着社会的发展和经济条件的改善，子宫内膜癌的发病率亦逐年升高，目前仅次于宫颈癌，居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位。在研究子宫内膜癌机理，以及开发子宫内膜癌治疗药物过程中，离不开子宫内膜癌模型。
当前常用于科学研究的子宫内膜癌动物模型主要分为三类，包括基因工程动物模型、细胞系移植瘤模型以及人源异种移植瘤模型(PDX，patient derived Xenograftmodel)。
基因工程动物模型具有良好的肿瘤微环境和良好的可重复性，且免疫系统无缺陷，但其需要制备转基因动物，成本高、制备周期长。细胞系移植瘤模型只需将人源肿瘤细胞系植入模型动物，容易制备，可重复性高，但需使用免疫缺陷小鼠，且得到的肿瘤非原位原发性肿瘤，与肿瘤实际发展情况与病理生理情况区别较大。PDX模型是将病人体内肿瘤组织接种于模型动物体内，容易制备，基因型与实际肿瘤接近，但非原位肿瘤，无法提供子宫内膜组织原位微环境，进而可能导致人源肿瘤在实验过程中相关生物学特征丢失，无法模拟人体内的情况，而且目前临床肿瘤标本非常珍贵，一些特殊的临床标本如穿刺标本等小标本可供实验研究的组织细胞量较少，子宫内膜癌PDX模型构建成功率也比较低，无法满足模型构建需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更接近子宫内膜癌生物学特性、且制备周期短的原位原发子宫内膜癌模型。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)人或动物子宫内膜细胞原代培养；
2)使用原代细胞培养成类器官，再将类器官分散成单个细胞和/或细胞团块，再培养成类器官，再将所得类器官分散成单个细胞和/或细胞团块；
3)对步骤2)所得单个细胞和/或细胞团块进行基因编辑，而后培养成类器官；
4)将基因编辑成功的类器官注射到动物子宫壁或子宫腔内；
步骤3)所述基因编辑是指敲除抑癌基因，和/或增加原癌基因的拷贝数。
如前述的构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法，
步骤2)所述的“分散”，是通过在TrypLE中酶解并吹打使细胞分散。
如前述的构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法，
步骤3)的基因编辑选自如下情况中的一种：
I.敲除Trp53基因，过表达Kras突变基因、Myc基因；
II.敲除Trp53、Pten、Pik3r1基因，过表达Kras突变基因、Myc基因；
III.敲除Trp53、Pten、Pik3r1基因，过表达Pik3ca突变基因、Myc基因；
IV.敲除Trp53、Pten基因，过表达Kras突变基因。
如前述的构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法，
所述Kras突变是G12D突变；
和/或，所述Pik3ca突变是E545位的突变或H1047位的突变；
优选地，所述Pik3ca突变是E545K、E545D、H1047R、H1047L或H047Y突变。
如前述的构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法，
步骤3)的基因编辑还包括对类器官转入荧光标记基因。
如前述的构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法，
步骤1)和4)所述动物是小鼠。
如前述的构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法，
步骤2)所述类器官的培养方法为：
将子宫内膜细胞与Matrigel混合，待Matrigel凝固后，加入类器官培养基进行培养，即可；
所述培养基是DMEM/F12，加上如下添加剂得到：
B27 50±2倍稀释，EGF 50±2ng/ml，R-spondin 1250±10ng/ml，FGF10 500±20ng/ml，Y-27632 10±1uM，Glutamax 100±5倍稀释，Gastrin 1±0.1nM，HGF 100±5ng/ml，N-acetylcysteine 1±0.1mM，Noggin 100±5ng/ml，A83-01 200±10nM，Nicotinamide10±1mM，WNT3a 50±2ng/ml，N2 100±5倍稀释，Oestrogen 10±1ng/ml。
如前述的构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法：
用于培养步骤2)所述的类器官的培养基是DMEM/F12，加上如下添加剂得到：
B27 50倍稀释，EGF 50ng/ml，R-spondin 1 250ng/ml，FGF10 500ng/ml，Y-2763210uM，Glutamax 100倍稀释，Gastrin 1nM，HGF 100ng/ml，N-acetylcysteine 1mM，Noggin100ng/ml，A83-01 200nM，Nicotinamide 10mM，WNT3a 50ng/ml，N2 100倍稀释，Oestrogen10ng/ml。
前述方法制备得到的动物模型在药物筛选、药物毒性或免疫治疗试验中应用。
一种子宫内膜类器官培养方法，包括如下步骤：
将子宫内膜细胞与Matrigel混合，待Matrigel凝固后，加入类器官培养基进行培养，即可；
所述类器官培养基是DMEM/F12，加上如下添加剂得到：
B27 50±2倍稀释，EGF 50±2ng/ml，R-spondin 1250±10ng/ml，FGF10 500±20ng/ml，Y-27632 10±1uM，Glutamax 100±5倍稀释，Gastrin 1±0.1nM，HGF 100±5ng/ml，N-acetylcysteine 1±0.1mM，Noggin 100±5ng/ml，A83-01 200±10nM，Nicotinamide10±1mM，WNT3a 50±2ng/ml，N2 100±5倍稀释，Oestrogen 10±1ng/ml。
如前述的子宫内膜类器官培养方法，所述的类器官的培养基是DMEM/F12，加上如下添加剂得到：
B27 50倍稀释，EGF 50ng/ml，R-spondin 1 250ng/ml，FGF10 500ng/ml，Y-2763210uM，Glutamax 100倍稀释，Gastrin 1nM，HGF 100ng/ml，N-acetylcysteine 1mM，Noggin100ng/ml，A83-01 200nM，Nicotinamide 10mM，WNT3a 50ng/ml，N2 100倍稀释，0estrogen10ng/ml。
如前述的子宫内膜类器官培养方法，它还包括子宫内膜细胞的分离步骤：
a.使用终浓度2±1mg/mL胶原酶I和1±0.5mg/mL胶原酶IV消化子宫内膜；
b.筛网过滤获得单个细胞或细胞团块，培养基洗涤、离心以终止酶消化反应；
优选地，步骤b所述培养基是DMEM/F12培养基。
本发明的肿瘤模型构建周期较基因工程动物模型大大缩短，且几乎不会导致动物成瘤前死亡，成功率高达100％，总体效率高。
通过不同的基因编辑策略，本发明的方法可以得到不同亚型的子宫内膜癌模型，例如：用Trp53、Pten、Pik3r1基因敲除，Kras(G12D)和Myc过表达策略构建低分化腺癌；用Trp53、Pten基因敲除，Kras(G12D)基因过表达策略构建粘液性子宫内膜癌。
本发明构建的原位原发的小鼠子宫内膜肿瘤模型，可模拟在人体内由于遗传改变导致正常细胞向肿瘤细胞转化的过程，能动态地表征了肿瘤发生发展地过程，在基因层面、肿瘤微环境、肿瘤发展及病理生理等方面与肿瘤发生发展真实情况更加贴近。
总之，本发明的方法可高效率地制备得到更接近子宫内膜癌特征、符合临床研究需求的子宫内膜癌模型；该模型可以在探究子宫内膜癌发生发展机制、寻找和优化新的子宫内膜癌可能的治疗方式等研究领域提供有利工具。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：类器官生长观察图。A，类器官形态观察；B，类器官上皮标志物CK13蛋白表达观察。
图2：肿瘤模型构建示意图以及实验例1的肿瘤检测图。A，肿瘤模型构建示意图；B，小鼠肿瘤活体成像图；C，HF染色图。
图3：实验例2的肿瘤检测图。A，荧光检测；B，HE染色；C，免疫组织化学染色。
图4：实验例3的肿瘤检测图。A，荧光检测；B，HF染色。
具体实施方式
本发明中的部分英文缩写解释如下：
DMEM：是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养，购买自GIBCO公司。
DMEM/F12：是F12培养基和DMEM培养基按照1∶1结合，称为DMEM/F12培养基。综合了F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度养分的优点。购买自GIBCO公司。
Matrigel，从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出，其主要成分由层粘连蛋白，IV型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。购买自BD公司。
B27，即B27补充剂，市售产品，可用于配制培养基。B27补充剂以50倍的液体浓缩液提供，除其它成分外其包含生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素以及转铁蛋白。购自Life Technologies公司。N-acetylcysteine：N-乙酰半胱氨酸，购买自Sigma公司。
EGF，表皮生长因子，市售产品，购买自R&D公司。
Noggin，细胞生长蛋白成分，市售产品，购买自Peprotech公司。
R-spondin 1，人细胞生长编码蛋白，市售产品，购买自Peprotech公司。
A83-01，TGF-β抑制剂，购买自Tocris Bioscience公司。
FGF10，成纤维细胞生长因子，购买自Peprotech公司。
Nicotinamide，烟酰胺，购买自Sigma公司。
Y-27632，ROCK特异性通路阻断剂。购买自Abmole Bioscience公司。
WNT3a，WNT激动剂，细胞中激活TCF/LEF-介导的转录的因子，购买自PeproTech公司。
Glutamax，市售细胞培养添加剂，购自：GIBCO公司。
N2，N2补充剂以100倍的液体浓缩液提供，其包含500μg/ml人转铁蛋白，500μg/ml
牛胰岛素，0.63μg/ml黄体酮，1611μg/ml腐胺和0.52μg/ml亚硒酸钠。购自LifeTechnologies公司。
Gastrin，胃泌素，购买自Sigma公司。
TrypLE，用于解离贴壁哺乳动物细胞的重组消化酶，购买自GIBCO公司。
实施例1本发明的类器官培养方法
包括如下步骤：
(1)取新鲜小鼠子宫内膜冰上剪碎；
(2)胶原酶(2mg/mL胶原酶I和1mg/mL胶原酶IV)重悬剪碎的组织块，用gentalMACS全自动组织处理器在C tube中运行Mouse Tumor程序1；剪碎的组织块用量为1～2克，胶原酶的用量为10mL；
(3)将胶原酶处理后的组织块，在37℃摇床，速度220rpm，消化30min。使组织细胞充分分散开来；
(4)将经过消化的溶液转移到全自动组织处理器gentalMACS上。在gentalMACS上，运行Mouse Tumor程序2；
(5)将步骤4处理好的含有子宫内膜细胞的液体用100μm细胞筛网过滤细胞；
(6)过滤后，室温，1500rpm，5min离心处理去除上清液；
(7)加入5ml DMEM/F12重悬，室温，1500rpm，5min离心，去除上清；
(8)细胞计数后，约每20000个细胞混合30μL Martrigel，滴于48孔板孔的正中；
(9)转移至37℃5％CO2的培养箱，凝固Martrigel，凝固时间为10-20min；
(10)每孔加入150μL细胞培养基(培养基成分如表1)，在细胞培养箱中培养；
表1小鼠/人子宫类器官培养基成分(用DMEM/F12配制)：
Figure BDA0002638589390000061
Figure BDA0002638589390000071
(11)每间隔2-3天更换一次培养基，培养出正常小鼠子宫类器官。
培养得到的类器官如图1所示。由图1A可知，在基质胶(Matrigel)中，细胞逐渐长大，形成细胞团；由图1B可知，子宫类器官中上皮标志CK13蛋白得到表达，表明形成了类器官。
实施例2本发明的造模方法
1.造模方法
1.1预培养
同实施例1。
1.2扩大培养
(1)取培养7天左右的类器官，用TrypLE重悬消化类器官，转移至15mL离心管中，按48孔板的一个孔加3ml TrypLE计算，吹打10～20次直至基质胶完全碎裂，37℃水浴消化5min；
(2)从水浴锅中取出，再次吹打20～30次，37℃消化5min，之后进行第三次吹打(20～30次)。在显微镜下观察类器官时候消化成单个细胞。如果未成单个细胞，则可重复一次水浴和吹打，直至成为单个细胞。
(3)1500rpm，室温离心5min，去除上清液；
(4)细胞计数后，每2000个细胞加入30μL Martrigel重悬，滴于48孔板孔中；
(5)转移至培养箱，凝固Martrigel，凝固时间为10-20min；
(6)每孔加入150μL细胞培养基，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
(7)每间隔2-3天更换一次培养基，培养出足够数量的小鼠子宫类器官。
(8)取培养两周左右的类器官，用TrypLE重悬消化类器官，转移至15mL离心管中，按48孔板的一个孔加3ml TrypLE计算，吹打10～20次直至基质胶完全碎裂，37℃水浴消化10min；
(9)从水浴锅中取出，再次吹打20～30次，37℃消化10min，之后进行第三次吹打(20～30次)。在显微镜下观察类器官时候消化成单个细胞。如果未成单个细胞，则可重复一次水浴和吹打，直至成为单个细胞。1500rpm，室温离心5min，去除上清液。
1.3基因编辑
(1)提前已包装好用于CRISPR/Cas9基因敲除的慢病毒和用于原癌基因过表达的逆转录病毒。敲除抑癌基因的载体上有mCherry，可通过检测红光判断感染效率。在过表达载体上，原癌基因与荧光素酶共表达，在体内外均可通过荧光素反应检测原癌基因的表达情况。
(2)先将400μL-800μL逆转录病毒或慢病毒加入到12孔板的一个孔中。根据实验需求取200μL-500μLDMEMF12重悬消化后类器官细胞加入至事先加入病毒的12孔板中(病毒量及细胞量根据实验需求决定)。基因组合见表2。
表2肿瘤模型的基因组合
敲除的基因 过表达的基因
基因组合1 Trp53 Kras(G12D)Myc
基因组合2 Trp53 Pten Pik3r1 Kras(G12D)Myc
基因组合3 Trp53 Pten Pik3r1 Pik3ca(E545K)Myc
基因组合4 Trp53 Pten Pik3r1 Pik3ca(H1047R)Myc
基因组合5 TrpS3 Pten Kras(G12D)
注：G12D表示蛋白第12个氨基酸由G突变成D，E545K、H1047R以此类推。
(3)1∶1000体积比加入polybrene，2000rpm，31℃，离心60min；转移至培养箱，孵育2～3h；
(4)然后收集细胞，1500rpm，室温离心5min，去除上清；用适量Martrigel重悬，滴于48孔板孔中；转移至培养箱，凝固Martrigel，凝固时间为10-20min；
(5)每孔加入150μL细胞培养基，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；每间隔2-3天更换一次培养基，得类器官。
(6)待细胞长到70％～80％密度时，向孔里加入10μL荧光素酶底物，37℃避光反应10min，用酶标仪对荧光素信号强度进行检测。
(7)传代时取约100万个细胞，用TNES和蛋白酶K消化细胞，提取细胞基因组，进行T7E1酶切鉴定，判断靶向基因是否敲除成功。
1.4移植
(1)待细胞密度长到80％～90％时，用上述1.2节步骤(1)-(3)的方法对类器官进行消化和离心，离心后用PBS和Martrigel混合液(体积比1∶1)重悬细胞。48孔板的一个孔的细胞约用20μL混合液重悬。重悬后的细胞置于冰上。
(2)采用异氟烷呼吸麻醉法麻醉小鼠。麻醉后，左侧位固定小鼠。用胰岛素针抽取步骤(1)所得细胞悬液。
(3)沿小鼠侧腹部凹陷处剪开皮肤、肌肉和腹膜。找到卵巢附近的白色脂肪垫，牵拉出卵巢和子宫。立即用PBS润湿暴露出的卵巢和子宫。
(4)一只手持弯头镊固定子宫。另一只手持胰岛素针，针筒与子宫几乎平行，角度小于5度。
(5)子宫壁移植：针头穿入子宫壁中，不要穿透子宫壁。推动胰岛素针活塞，将细胞悬液注射入子宫壁。
(6)子宫腔移植：针头穿透子宫壁，进入子宫腔中。推动胰岛素针活塞，将细胞悬液注射入子宫腔中。
2.小鼠子宫内膜癌模型的鉴定
(1)移植后每周进行一次小动物荧光素酶活体成像以监测肿瘤。
(2)取小鼠新鲜肿瘤组织，用4％PFA固定。用H&E染色的方法，鉴定肿瘤组织的病理类型。
(3)4％PFA固定后，用免疫组织化学(IHC)染色的方法对肿瘤组织的mKi67、P63、ERα、PR等蛋白进行染色。
3.药效评价试验方法
该模型可被应用于药物筛选、药物毒性试验、免疫治疗试验等。利用该模型进行体内药物试验的具体步骤如下。
(1)将本项目构建的子宫内膜癌小鼠进行配对分组：分为不同浓度给药组和溶剂组。
(2)用腹腔注射或灌胃等方式给药。
(3)于不同时间点通过荧光素酶活体成像系统，观察并统计小鼠肿瘤负荷的情况。分别记录每组小鼠生存情况，并绘制给药后存活曲线。
以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。
实验例1一种子宫内膜腺癌模型的构建
使用实施例2的方法构建子宫内膜癌模型，其中基因编辑部分选择表2的基因组合1。即培养Trp53基因敲除，Kras(G12D)和Myc过表达的子宫内膜癌类器官，原位移植到小鼠子宫内，构建子宫内膜癌动物模型。移植135天后，3只小鼠均长出了肿瘤。
构建过程示意图如图2A所示。
图2B展示了移植95天后小鼠的肿瘤活体成像结果，可见转入基因编辑类器官的小鼠子宫部位有肿瘤形成。
图2C显示，该肿瘤呈现低分化腺癌的特征。
实验例2一种子宫内膜癌模型的构建
使用实施例2的方法构建子宫内膜癌模型，其中基因编辑部分选择表2的基因组合2。即培养Trp53、Pten、Pik3ca基因敲除，Kras(G12D)和Myc过表达的子宫内膜癌类器官，原位移植到小鼠子宫内，构建子宫内膜癌动物模型。移植35天后，3只小鼠均长出了肿瘤。
通过白光显微观察，见小鼠移植侧(左侧)子宫有肿瘤占位，未移植侧(右侧)子宫形态正常；而荧光显微观察显示，占位肿瘤呈GFP、mCherry阳性(图3A)。
HE染色显示，肿瘤细胞核形态不规则，核质比大，呈现低分化腺癌的特征(图3B)。
免疫组织化学(IHC)染色显示，肿瘤组织呈细胞角蛋白5(cytokeratin 5，CK5)、细胞增殖标记物mKi67和雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性(图3C)。
实验例3一种粘液性子宫内膜癌模型的构建
使用实施例2的方法构建子宫内膜癌模型，其中基因编辑部分选择表2的基因组合5。即培养Trp53、Pten基因敲除，Kras(G12D)基因过表达的子宫内膜癌类器官，原位移植到小鼠子宫内，构建子宫内膜癌动物模型。移植40天后，4只小鼠均长出了肿瘤。
显微观察结果如图4A所示，小鼠移植侧(左侧)子宫有肿瘤占位，未移植侧子宫形态正常(图4A左)，肿瘤呈mCherry(图4A中)、GFP(图4A右)阳性。
肿瘤组织切片HE染色(图4B)显示，肿瘤的病理类型是粘液性子宫内膜癌。
综上，本发明的方法可高效率地制备得到更接近子宫内膜癌特征、符合临床研究需求的子宫内膜癌模型；该模型可以在探究子宫内膜癌发生发展机制、寻找和优化新的子宫内膜癌可能的治疗方式等研究领域提供有利工具。

Claims (10)

1.一种构建原位原发子宫内膜癌动物模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)人或动物子宫内膜细胞原代培养；
2)使用原代细胞培养成类器官，再将类器官分散成单个细胞和/或细胞团块，再培养成类器官，再将所得类器官分散成单个细胞和/或细胞团块；
3)对步骤2)所得单个细胞和/或细胞团块进行基因编辑，而后培养成类器官；
4)将基因编辑成功的类器官注射到动物子宫壁或子宫腔内；
步骤3)所述基因编辑是指敲除抑癌基因，和/或增加原癌基因的拷贝数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2)所述的分散是通过在TrypLE中酶解并吹打使细胞分散。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤3)的基因编辑选自如下情况中的一种：
I.敲除Trp53基因，过表达Kras突变基因、Myc基因；
II.敲除Trp53、Pten、Pik3r1基因，过表达Kras突变基因、Myc基因；
III.敲除Trp53、Pten、Pik3r1基因，过表达Pik3ca突变基因、Myc基因；
IV.敲除Trp53、Pten基因，过表达Kras突变基因。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述Kras突变是G12D突变；
和/或，所述Pik3ca突变是E545位的突变或H1047位的突变；
优选地，所述Pik3ca突变是E545K、E545D、H1047R、H1047L或H047Y突变。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤3)的基因编辑还包括对类器官转入荧光标记基因。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)和4)所述动物是小鼠。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2)所述类器官的培养方法为：
将子宫内膜细胞与Matrigel混合，待Matrigel凝固后，加入类器官培养基进行培养，即可；
所述培养基是DMEM/F12，加上如下添加剂得到：
B27 50±2倍稀释，EGF 50±2ng/ml，R-spondin 1 250±10ng/ml，FGF10 500±20ng/ml，Y-27632 10±1uM，Glutamax 100±5倍稀释，Gastrin 1±0.1nM，HGF 100±5ng/ml，N-acetylcysteine 1±0.1mM，Noggin 100±5ng/ml，A83-01 200±10nM，Nicotinamide 10±1mM，WNT3a 50±2ng/ml，N2 100±5倍稀释，Oestrogen 10±1ng/ml；
优选地，用于培养步骤2)所述的类器官的培养基是DMEM/F12，加上如下添加剂得到：
B27 50倍稀释，EGF 50ng/ml，R-spondin 1 250ng/ml，FGF10 500ng/ml，Y-2763210uM，Glutamax 100倍稀释，Gastrin 1nM，HGF 100ng/ml，N-acetylcysteine 1mM，Noggin100ng/ml，A83-01 200nM，Nicotinamide 10mM，WNT3a 50ng/ml，N2 100倍稀释，Oestrogen10ng/ml。
8.权利要求1～7任一所述的方法制备得到的动物模型在药物筛选、药物毒性或免疫治疗试验中应用。
9.一种子宫内膜类器官培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将子宫内膜细胞与Matrigel混合，待Matrigel凝固后，加入类器官培养基进行培养，即可；
所述类器官培养基是DMEM/F12，加上如下添加剂得到：
B27 50±2倍稀释，EGF 50±2ng/ml，R-spondin 1 250±10ng/ml，FGF10 500±20ng/ml，Y-27632 10±1uM，Glutamax 100±5倍稀释，Gastrin 1±0.1nM，HGF 100±5ng/ml，N-acetylcysteine 1±0.1mM，Noggin 100±5ng/ml，A83-01 200±10nM，Nicotinamide 10±1mM，WNT3a 50±2ng/ml，N2 100±5倍稀释，Oestrogen 10±1ng/ml；
优选地，所述的类器官的培养基是DMEM/F12，加上如下添加剂得到：
B27 50倍稀释，EGF 50ng/ml，R-spondin 1 250ng/ml，FGF10 500ng/ml，Y-2763210uM，Glutamax 100倍稀释，Gastrin 1nM，HGF 100ng/ml，N-acetylcysteine 1mM，Noggin100ng/ml，A83-01 200nM，Nicotinamide 10mM，WNT3a 50ng/ml，N2 100倍稀释，Oestrogen10ng/ml。
10.如权利要求9所述的培养方法，其特征在于，它还包括子宫内膜细胞的分离步骤：
a.使用终浓度2±1mg/mL胶原酶I和1±0.5mg/mL胶原酶IV消化子宫内膜；
b.筛网过滤获得单个细胞或细胞团块，培养基洗涤、离心以终止酶消化反应；
优选地，步骤b所述培养基是DMEM/F12培养基。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115125187A (zh) * 2022-06-14 2022-09-30 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种子宫内膜炎症的类器官体外模型及其建立方法和应用
CN115491357A (zh) * 2022-10-27 2022-12-20 扈晖 一种子宫内膜癌类器官无血清专用培养基
CN116716236A (zh) * 2023-06-29 2023-09-08 重庆大学附属肿瘤医院 一种宫颈癌类器官的构建方法及应用
CN116751736A (zh) * 2023-07-18 2023-09-15 首都医科大学附属北京妇产医院 一种子宫内膜类器官培养基及其长期传代培养方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967672A (zh) * 2017-03-24 2017-07-21 四川大学华西医院 一种肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967672A (zh) * 2017-03-24 2017-07-21 四川大学华西医院 一种肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吕巧英等: "子宫内膜癌肿瘤微环境的免疫调控机制进展", 《复旦学报(医学版)》 *
吴迪等: "来曲唑联合睾酮对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖及凋亡的影响", 《中国全科医学》 *
范秀华等: "子宫内膜癌动物模型的构建", 《河北医药》 *
贾玖丽等: "人子宫内膜癌瘤组织块活体移植瘤动物模型的建立", 《现代肿瘤医学》 *
都红蕾等: "肝细胞生长因子对子宫内膜癌细胞增殖影响的实验研究", 《广东药学院学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115125187A (zh) * 2022-06-14 2022-09-30 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种子宫内膜炎症的类器官体外模型及其建立方法和应用
CN115125187B (zh) * 2022-06-14 2023-04-07 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种子宫内膜炎症的类器官体外模型及其建立方法和应用
CN115491357A (zh) * 2022-10-27 2022-12-20 扈晖 一种子宫内膜癌类器官无血清专用培养基
CN116716236A (zh) * 2023-06-29 2023-09-08 重庆大学附属肿瘤医院 一种宫颈癌类器官的构建方法及应用
CN116751736A (zh) * 2023-07-18 2023-09-15 首都医科大学附属北京妇产医院 一种子宫内膜类器官培养基及其长期传代培养方法

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