CN114601913A - 人TSHR A亚基在预防Graves病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人TSHR A亚基在预防Graves病中的应用。本发明通过口服途径给予新生期Balb/c小鼠Graves病的致病关键自身抗原人TSHR A亚基，诱导对Graves病的新生口服耐受，并对TSHR A亚基的服用剂量进行探索，发现高剂量的TSHR A亚基新生期口服可以成功诱导Balb/c雌性小鼠针对Graves病的免疫耐受，这为Graves病和其他自身免疫性疾病的治疗和预防提供新的思路和有效的依据。
Description
技术领域
本发明属于Graves病治疗技术领域，涉及人TSHR A亚基在预防Graves 病中的应用。
背景技术
弥漫性毒性甲状腺肿(diffuse toxic goiter)，又称Graves病(Graves’disease，GD)，是甲状腺机能亢进症中最常见的病因，以甲状腺激素合成和分泌过多以及弥漫性甲状腺肿为其特征，临床表现主要包括甲状腺毒症、弥漫性甲状腺肿、眼征和胫前粘液性水肿等。Graves病的病因至今尚不明确，目前公认其与甲状腺的自身免疫反应有关。其突出特征为患者血液中存在可以与自身甲状腺组织起反应的自身抗体，主要包括促甲状腺素(thyroid stimulating hormone，TSH)受体(TSH receptor，TSHR)抗体(TSH receptorantibody，TRAb)、甲状腺球蛋白抗体(thyroid thyroglobulin antibody，TgAb) 以及甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)，其中， TRAb在Graves病发病过程中发挥主要作用。
Graves病目前有以下几种常见的治疗方法：抗甲状腺药物、放射性131I 及手术治疗。药物治疗主要是抑制与甲状腺激素合成有关的甲状腺过氧化物酶，后两种治疗都是以减少功能性甲状腺组织的数量为主，各有优缺点。一般根据患者的性别、年龄、病情程度、病程长短、并发症、合并症，再结合患者自身情况、当地的医疗条件和医师的经验水平等谨慎选用合适的方案。虽然现在针对Graves病的治疗手段已经比较成熟，但是，以上三种主要的治疗措施均为针对甲状腺毒症的治疗手段，其作用机理主要为抑制甲状腺激素的合成或减少功能性甲状腺细胞，以求在控制甲状腺功能的同时期待患者自身的免疫异常自行缓解纠正，并没有针对病因学即自身免疫异常进行治疗。定位于自身免疫过程进行治疗，主动纠正或者预防自身免疫异常的存在或发生，目前尚无较好的办法。
合适的动物模型是研究疾病发病机制、评估治疗效果的重要工具之一。 Graves病的动物模型相关研究也经过了漫长的发展历程，特别是近年来取得了非常重要的进展，现已获得较为成熟的Graves病动物模型制备方法。而最新的转基因动物模型也在研发过程中，但目前已有的数种转基因小鼠模型仍存在一定的问题。最初的Graves病动物模型尝试是应用从原核或真核表达体系生产的人TSHR胞外段复合蛋白，结果却诱导出了对甲状腺功能有抑制性作用的抗体。1994年Shimojo等第一次制备出了具备甲状腺功能亢进症的Graves病模型，方法是其将成纤维细胞表达的TSHR和MCH II类分子共同注射进小鼠腹腔，结果成功诱导出甲状腺功能亢进和TSHR刺激性抗体。随后研究人员逐渐开始应用表达TSHR胞外段的质粒载体或者病毒载体感染小鼠来诱导Graves病动物模型。2003年Chen等应用编码人TSHR A亚基的腺病毒免疫注射Balb/c小鼠，成功诱导出了TSAb和甲状腺功能亢进。更为重要的是，与之前应用人TSHR全长诱导的Graves病模型相比较，仅编码A亚基的腺病毒免疫注射的小鼠模型发病率明显升高，这一发现再一次证明了TSHR A亚基具有更强的致病性，同时，也让Graves病动物模型走向成熟。近年来，诱导免疫耐受已经成为从病因学角度尝试治疗或预防自身免疫性疾病的新途径。然而，能够成功诱导免疫耐受的方式、时机和影响因素等目前却无定论，在不同的动物模型中也并不统一。在本课题组的前期研究中，曾经通过新生期肌肉注射表达人TSHR A亚基的腺病毒的方式成功诱导出 Balb/c小鼠对Graves病的免疫耐受模型。虽然这一动物模型已经诱导成功，但是由于存在安全性的问题这种方式在人体的应用大大受限。
近年来，口服免疫耐受因其具有高安全性，操作简便等诸多优势越来越多的被用来预防或者治疗自身免疫性疾病，也成为了诱导Graves病免疫耐受模型的新的尝试方向。在前期肌肉注射表达的是TSHR A亚单位完整一段基因，而直接口服TSHR A亚单位蛋白，抗原可经胃肠道的蛋白水解酶裂解成肽片段，虽然有研究证实一些TSHR肽段可以诱导Graves病成年免疫耐受的发生，但是口服的TSHR A亚单位蛋白经胃肠道的蛋白水解酶裂解后，会生成什么样的肽段是个未知数，而这些肽段是否具有抗原性，这些都难以预料，而口服免疫耐受的诱导与多种因素有关，如机体自身的免疫系统状况、抗原类型、抗原性质，抗原剂量，抗原使用时间等。这些也会使耐受成功增加很多未知数。
综上所述，Graves病作为自身免疫性疾病，现有的治疗手段却多是针对功能学治疗，尚无针对病因学即自身免疫的治疗或预防方法使得Graves病得到根治。
发明内容
(一)发明目的
本发明的目的是提供一种通过口服途径给予新生期Balb/c小鼠Graves 病的致病关键自身抗原人TSHR A亚基，诱导对Graves病的新生口服耐受，探索针对Graves病病因学治疗和预防的新途径，发现高剂量的TSHR A亚基新生期口服可以成功诱导Balb/c雌性小鼠针对Graves病的免疫耐受，这为 Graves病和其他自身免疫性疾病的治疗和预防提供新的思路和有效的依据。
(二)技术方案
为解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种人TSHR A亚基在制备预防Graves病的口服药物中的应用。
进一步地，所述人TSHR A亚基为利用酵母表达体系生产纯化的重组人 TSHR A亚基。
进一步地，所述重组人TSHR A亚基的用量为100-1000μg，优选为 500μg-1000μg，更优选为1000μg。，
根据本发明的另一个方面，提供了一种预防Graves病的口服药物组合物，所述组合物的活性成分为人TSHR A亚基。
进一步地，所述人TSHR A亚基为利用酵母表达体系生产纯化的重组人 TSHR A亚基。
进一步地，所述组合物中所述重组人TSHR A亚基的含量为100-1000μg。
进一步地，所述组合物中重组人TSHR A亚基溶液中重组人TSHR A亚基的含量为500-1000μg，优选为1000μg。
根据本发明的又一方面，提供了一种利用人TSHR A亚基诱导对Graves 病新生口服耐受的动物模型的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、在动物出生24小时内，用人TSHR A亚基溶液分次打入所述动物咽部，同时刺激所述动物上颚诱发吞咽反射；
S2、将所述打入重组人TSHR A亚基的动物放回饲养空间内，继续母乳喂养，离乳后继续饲养直至动物成年。
进一步地，所述人TSHR A亚基为利用酵母表达体系生产纯化的重组人 TSHR A亚基。
进一步地，所述重组人TSHR A亚基溶液中重组人TSHR A亚基的含量为100μg-1000μg，优选为500μg-1000μg，更优选为1000μg。
进一步地，所述动物为具有免疫活性的啮齿类动物，优选为小鼠。
根据本发明的又一方面，提供了采用第三方面提供的方法诱导获得的动物模型，以及所述的动物模型在对Graves病口服免疫耐受研究中的应用。
(三)有益效果
本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：
1.以往的研究中，由动物甲状腺组织粗提的TSHR并不具备人体内TSHR的免疫活性，大肠杆菌体系生产的A亚基缺乏糖基化亦不具备免疫活性；而哺乳动物细胞表达的A亚基虽然具备部分免疫活性，但生产成本较高、产率较低，本发明中采用酵母表达体系生产纯化重组人TSHR A亚基，并通过试验证明了纯化蛋白具有人体内TSHR A亚基的免疫活性。
2.本发明在新生期诱导针对Graves病的口服耐受，分别在新生期给予了Balb/c雌性小鼠分别口服不同剂量(1000μg大剂量耐受组、500μg中剂量耐受组和100μg低剂量耐受组)的酵母表达体系生产纯化的重组人TSHR A亚基，并在其成年后诱导Graves病模型。结果发现，大剂量耐受组发病率62.5％(10/16)，低于模型组发病率95.2％(20/21)，二者具有统计学差异 (P<0.05)；大剂量耐受组小鼠血清TT4水平、TRAb水平明显低于模型组 (P<0.05)，甲状腺组织病理滤泡上皮细胞增生程度较之模型组为轻，即大剂量耐受组Graves病病情轻于模型组，由此可见，1000μg A亚基新生期口服可以成功诱导Balb/c雌性小鼠针对Graves病的免疫耐受。由此可知新生期口服耐受能否诱导成功与抗原剂量有关，本研究中大剂量抗原较之中、低剂量更容易成功诱导出新生口服耐受。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为纯化蛋白的免疫印迹鉴定图。第1泳道为蛋白Marker，第2泳道为纯化蛋白，第3泳道为去糖基化后的纯化蛋白。
图2为纯化蛋白具有人体内TSHR A亚基部分免疫功能验证图。(A) Elisa试验评估纯化蛋白的免疫活性。Control，健康人血清；Graves’sera，TRAb 阳性的初发初治女性Graves病患者血清；Ab 6048，特异性阳性对照。OD450 值以Mean±SE表示。(B)TRAb检测验证与纯化蛋白结合血清成分。 Normal sera，正常人血清；Graves’sera，Elisa试验中阳性的Graves患者血清；Before为1:400稀释血清原液，After为同稀释倍数与纯化蛋白孵育后回收的上清液。***，P<0.001。
图3为各组小鼠甲状腺功能血清学指标。(A)放免法检测小鼠血清 TT4水平。TT4值以Mean±SE表示。**，P<0.01。(B)放免法检测小鼠血清 TRAb水平。TRAb值以Mean±SE表示。*，P<0.05。Control(n＝13)，对照组；Model(n＝21)，模型组；1000μg(n＝16)，大剂量耐受组；500μg(n＝11)，中剂量耐受组；100μg(n＝17)，低剂量耐受组。
图4为各组小鼠甲状腺组织病理光镜检查(HE)。(A、B)对照组小鼠甲状腺滤泡细胞(分别为×100，×400)，滤泡呈圆形或椭圆形，滤泡腔内充满均质嗜酸性的胶质，滤泡上皮细胞为单层立方；(C、D)模型组小鼠甲状腺滤泡细胞(分别为×100，×400)，滤泡上皮细胞明显增生，呈柱状或立方状，可见乳头状结构；(E、F)大剂量耐受组小鼠甲状腺滤泡细胞(分别为×100，×400)，滤泡上皮细胞呈单层立方，滤泡呈圆形或椭圆形，滤泡腔内充满均质嗜酸性的胶质；(G、H)大剂量耐受组小鼠甲状腺滤泡细胞(分别为×100，×400)，滤泡上皮细胞轻度增生，但无乳头状结构；(I、J)中剂量耐受组小鼠甲状腺滤泡细胞(分别为×100，×400)，滤泡上皮细胞中度增生，呈低柱状，可见乳头状结构；(K、L)小剂量耐受组小鼠甲状腺滤泡细胞(分别为×100，×400)，滤泡上皮细胞明显增生，呈柱状或立方状，可见乳头状结构。
图5流式细胞术检测各组小鼠脾Tregs细胞比例。(A)大剂量耐受组小鼠脾CD4+单核细胞中CD25+FoxP3+细胞比例；(B)中剂量耐受组小鼠脾 CD4+单核细胞中CD25+FoxP3+细胞比例；(C)小剂量耐受组小鼠脾CD4+ 单核细胞中CD25+FoxP3+细胞比例；(D)模型组小鼠脾CD4+单核细胞中 CD25+FoxP3+细胞比例；(E)对照组小鼠脾CD4+单核细胞中 CD25+FoxP3+细胞比例。
图6各组小鼠脾CD4+单核细胞中Tregs比例的比较。Control，对照组； Model，模型组；1000μg，大剂量耐受组；500μg，中剂量耐受组；100μg，低剂量耐受组。*，P<0.05；**，P<0.01。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
定义
本发明所述“TSHR”基因，位于染色体14q31，包括10个外显子和9 个内含子，共编码764个氨基酸，其中前21个氨基酸残基为信号肽。人TSHR 是G蛋白耦联受体家族成员之一，由764个氨基酸残基构成，其分子质量为 84.5kDa。TSHR属于七次跨膜蛋白，由胞外段、跨膜区和胞内段组成。TSHR 无论是结构上还是功能上最神秘的区域是由277～418位氨基酸残基组成的位于胞外段和跨膜区的之间的铰链区。铰链区中存在一段其他类似糖蛋白受体所不具有的大约50个氨基酸残基的区域称之为C肽区。生理状态下，翻译后C肽区自发降解，TSHR从分子内裂开，从将TSHR分为两部分，氨基端 289个氨基酸残基构成A亚基，羧基端剩余的氨基酸残基构成B亚基。A亚基和B亚基之间以二硫键结合。
本发明所述“TSHR A”亚基，为所述“TSHR”基因的289个氨基酸残基构成，具体序列如SEQ ID NO:1所示。
实验方法与步骤
1、酵母培养
1)酵母复苏：(1)从-80℃冰箱中取出保存的酵母菌株，冰上融化后吸取200μL加入含有10mL YPD培养基的50mL离心管中，同时加入10 μL抗生素Zeocine(终浓度为100μg/mL)，放入摇床，稍微放松盖子半圈， 28℃，250rpm，培养16～18小时；待菌液浑浊不透光后取出，4℃短暂保存，留作下一步扩增用；(2)所有相关操作均在超净台进行，注意无菌操作；
2)酵母传代扩增：(1)取若干个2L大三角锥形瓶，每瓶中再加入 BMGY培养基(PH6.0)200mL，再取上一步复苏后的酵母菌液，每瓶中加入1mL；放入摇床，28℃，250rpm，培养24小时；(2)24小时后可见菌液完全浑浊，测OD600值达到10～20，即可进入下一步表达培养；在一定范围内，菌种浓度越大将来蛋白产率越高，但培养时间过长传代次数过多会使酵母老化影响产率。
2、重组人TSHR A亚基的表达
1)浓缩上一步扩增后的酵母菌，将菌液倒入50mL无菌离心管中， 8000g离心5分钟，可见菌体全部沉淀，上清清亮，弃去上清；
2)向离心管中倒入BMMY培养基(PH 7.4)，重悬菌体，总共加入与之前扩增培养时同体积的BMMY培养基，混匀后倒入2L大三角锥形瓶中，每瓶200mL；每瓶中加入3mL甲醇，使其终浓度达到1.5％，诱导酵母菌表达重组人TSHR A亚基；
3)将三角锥形瓶放入摇床，28℃，250rpm，每24小时向每个三角锥形瓶中添加3mL甲醇，共计培养5天。
3、重组人TSHR A亚基的分离与提纯
1)收集上清：5天后将酵母培养液12000g离心10分钟，收集上清，过程中注意保持低温，防止A亚基降解；向沉淀的酵母菌中加入适量的1M NaOH溶液，将酵母菌灭活后方可弃置，不可直接排入下水道防止污染环境；
2)超滤浓缩：(1)分别用蒸馏水及PBS溶液清洗并平衡超滤柱及管道系统；(2)将回收的含A亚基的蛋白上清用蠕动泵泵入超滤柱中，保持适当的流速及压力，由于目的蛋白分子大于超滤膜孔径，可将A亚基截留在滤膜内，而将溶剂及小分子杂质滤出膜外；(3)上样结束后继续用蠕动泵大量泵入PBS溶液，总体积为上清体积的5～10倍，将上清液中的小分子杂质尽可能清除，并将溶剂置换，使A亚基溶解在PBS溶液中；(4)将超滤柱内的液体回收，即为A亚基的PBS溶液，此时蛋白溶液的总体积约为原上清量的 1/10左右，4℃暂存；(5)用蒸馏水清洗超滤柱系统；将超滤柱保存在0.1M 的NaOH溶液中；
3)纯化：应用AKAT蛋白纯化系统和镍离子亲和柱分离并纯化A亚基。 (1)开机，用过滤蒸馏水清洗系统，直至流出液电导值降至0.003以下；(2) 将镍柱连接进纯化系统，用过滤蒸馏水清洗镍柱，将柱床中的20％乙醇溶液洗出；(3)过PBS溶液平衡系统及镍柱，总平衡液体积为4个柱体积；(4) 蛋白上样，将超滤浓缩后的A亚基溶液缓慢过柱，同时观察电导及UV280 变化，若上升过高过快提示可能柱床可到最大负荷，可分批上样洗脱；(5) 再次过PBS溶液平衡系统及镍柱，总平衡液体积为4个柱体积；(6)用50 mM咪唑溶液过柱，将柱床中的杂蛋白洗脱；(7)用250mM咪唑溶液过柱，密切观察UV280值，当UV280迅猛上升时，收集流穿液，直至整个流穿峰结束，此流穿液即为目的蛋白重组的人TSHR A亚基，4℃暂存；(8)用250 mM咪唑溶液过柱，清理柱床上的残留蛋白；(9)用过滤蒸馏水清洗系统及镍柱，直至流出液电导降至0.003以下；(10)过20％乙醇溶液共计4个柱体积，将系统和镍柱均保存在20％乙醇环境中；(11)将镍柱卸下，4℃保存；关闭系统；
4)透析浓缩：将收集的流穿液加入超滤浓缩离心管中，3000g离心，不断添加PBS溶液反复离心，将流穿液中的咪唑洗脱，同时浓缩A亚基溶液，最后将上室中剩余的液体回收，即为浓缩的重组人TSHR A亚基PBS溶液，-80℃低温保存。
4、小鼠的饲养及繁殖
1)小鼠的饲养：本实验所用Balb/c小鼠均饲养在SPF级环境中，每只小鼠笼内约饲养6只左右，雌雄分开，同笼小鼠多源于一窝或断奶后即同笼饲养。所食饲料为无菌大小鼠专用饲料，饮用水为无菌蒸馏水，每四天更换一次垫料，室内保持恒温恒湿，每日按节律保持8～10小时光照。
2)小鼠的繁殖：待小鼠体成熟(约60-90日龄)后，按雌性3:1的比例将成年小鼠于傍晚合笼，第二天晨起观察雌鼠有无阴栓并行阴道上皮细胞涂片，判断雌鼠是否受孕。将受孕雌鼠单独放置，2周后可观察到显怀以验证是否怀孕。受孕后3周雌鼠即可分娩，多在夜间进行，产前可观察到雌鼠不安，不停整理产窝。哺乳期约为18～23天，孕期和哺乳期注意加强母鼠营养，必要时可喂食瓜子等，防止母鼠食仔。产后3周将母鼠与幼鼠分开，幼鼠雌雄分笼，继续饲养。
5、诱导新生口服耐受
1)待母鼠分娩后，将-80℃冰箱内保存的重组人TSHR A亚基取出置于冰上，溶化后用PBS溶液分别稀释至13μL，使得A亚基含量分别为100μg、500μg和1000μg；使用前新鲜配制，现配现用，防止A亚基降解；
2)在小鼠出生24小时内，按不同分组将上述配置好的不同含量的A 亚基溶液或同体积PBS溶液缓慢用枪尖分次打入新生鼠咽部，同时轻轻刺激新生鼠上腭，诱发吞咽反射，保证口服效率，防止误吸入气管；口服前将液体放置半小时平衡至室温，防止温度过低伤害新生鼠；同时注意气味保护，防止母鼠食仔。其中，耐受组分别口服不同剂量的A亚基，模型组和对照组均口服等体积PBS溶液；
3)将新生鼠放回鼠窝，继续母乳喂养，离乳后继续饲养直至小鼠成年。
6、诱导Graves病模型
1)用无菌PBS溶液分别稀释Ad-TSHR289腺病毒和Ad-null腺病毒，使终浓度达到108pfu/50μL；
2)分别于小鼠出生后第6、9、12周共三次肌肉注射免疫诱导Graves 病，注射部位为后臀部肌肉，不同剂量耐受组和模型组分别每次每只小鼠肌肉注射Ad-TSHR 289腺病毒108pfu/50μL，对照组分别每次每只小鼠肌肉注射Ad-null腺病毒108pfu/50μL；
3)第三次病毒注射后第四周处理老鼠。
7、小鼠的处理
1)用无菌眼科镊摘除小鼠一侧眼球，收集血液，室温下静置30分钟， 3000rpm离心10分钟，收集血清，-80℃保存；
2)脱颈处死小鼠，用眼科剪剪除小鼠胸腹部毛发，放入75％酒精中浸泡2-3分钟；
3)从酒精中取出小鼠，用图钉固定在泡沫板上，用无菌组织剪剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹腔；
4)换无菌眼科剪和有齿镊，将小鼠脾脏游离并取出，将脾脏剪成2块，分别放入无菌3cm培养皿和无菌无RNA酶的冻存管中，冻存管立即放入液氮中保存；
5)沿前正中线剪开小鼠颈部皮肤，钝性分离颈前肌肉、筋膜，充分暴露、游离气管，从上下两端剪断气管，将气管及附着的甲状腺组织一同浸入10％福尔马林溶液中。
8、放免法检测小鼠血清TT4及TRAb水平
1)血清TT4水平检测：按照放免试剂盒说明，依次向加入标准品、质控品或50μL小鼠血清的γ-计数管中加入200μL125I-T4、200μL抗T4血清37℃水浴孵育45分钟；加入500μL分离剂，充分混匀，3500rpm离心 20分钟，弃去上清，用γ计数仪测定每管沉淀物的放射性计数，依据剂量反应标准曲线查出待测小鼠血清中TT4的浓度；
2)血清TRAb水平检测：按照放免试剂盒说明，依次向加入标准品、质控品或50μL小鼠血清的γ-计数管中加入50μL受体、100μL125I-TSH标记物后室温孵育2小时；加入1000μL沉淀剂，充分混匀，3500rpm离心30分钟，弃去上清，用γ计仪器测定每管沉淀物的放射性计数，依据剂量反应标准曲线查出待测小鼠血清中TRAb的浓度。
9、小鼠甲状腺组织病理
1)制作切片：(1)固定：小鼠甲状腺组织在10％福尔马林溶液中放24 小时后取出，流水冲洗；(2)脱水、透明、浸蜡与包埋：将附着于气管的甲状腺组织依次浸入95％乙醇2-4小时、95％乙醇2小时、无水乙醇1.5小时、无水乙醇1小时、二甲苯+无水乙醇(1:1)20分钟、二甲苯10分钟、二甲苯10分钟、软蜡(50℃)30分钟、软蜡(50℃)1小时、硬蜡(58℃)30 分钟、硬蜡(58℃)30分钟，包埋；(3)切片：用轮转式切片机均匀切片石蜡包块，厚度为3-5μm，将切片平摊于载玻片上；60℃烤片30分钟；
2)HE染色：(1)将切片泡入二甲苯中10分钟脱蜡，重复1次；(2) 泡入无水乙醇5分钟洗去二甲苯，重复1次；(3)分别泡入95％乙醇溶液10 分钟、80％乙醇溶液10分钟，自来水洗1分钟，蒸馏水洗1分钟；(4)泡入苏木素中染色4分钟，自来水洗2分钟；(5)泡入1％盐酸乙醇20秒，流水过洗至返蓝；(6)泡入0.5％伊红溶液染色90秒，蒸馏水快速冲洗2秒； (7)分别泡入80％乙醇溶液10秒、95％乙醇溶液10秒、无水乙醇5分钟脱水；(8)泡入无水乙醇10分钟；(9)泡入二甲苯10分钟，重复1次；(10) 中性树胶封片；
3)显微镜下观察甲状腺组织病理改变。
10、制备脾单核细胞悬液
1)将分离的小鼠脾脏组织从3cm培养皿中取出来，放入置有200目钢网的6cm无菌培养皿中，并加入4mL含10％小牛血清(fetal calf serum， FCS)的完全1640培养基；
2)用组织剪将脾脏组织剪碎成小米粒大小；用大玻璃注射器针芯轻轻研磨脾脏碎粒，研磨过程中可再加入少许1640培养基，获得细胞悬液；
3)将6cm培养皿里的脾细胞悬液吸入7mL无菌离心管中，1200rpm 离心5分钟；弃去上清；
4)离心管中加入2mL红细胞裂解液，重悬沉淀，室温下静置3分钟， 1200rpm离心5分钟，弃去上清；
5)洗涤细胞：离心管中加入3mL 1640培养基，重悬沉淀，1200rpm离心5分钟，弃去上清，重复3次；
6)离心管中加入3mL 1640培养基，重悬沉淀，制成细胞悬液；
7)细胞计数(1)取10μL细胞悬液加入1.5mL EP管中，再加入1640 培养基稀释至1mL；(2)取15μL稀释后的细胞悬液轻轻沿边缘滴入盖有盖玻片的细胞计数板内，使细胞悬液均匀布满细胞计数板；(3)将细胞计数板放在显微镜下，计数细胞，并标记浓度。细胞密度(个/ml)＝(∑四个大格细胞数/4)*104。
11、流式细胞术
1)稀释细胞悬液：用1640完全培养基稀释上一步得到的脾脏单核细胞悬液，使其终浓度为2×107/mL，并分别吸取500μL置入2个2mL EP管中；
2)细胞染色：(1)重悬细胞：将上述EP管中的细胞悬液400g离心5分钟，弃去上清，弹松沉淀细胞，加入100μL Staining Buffer重悬；(2)表面染色：向每管中分别加入0.3μL的FITC anti-mouse CD4和0.3μL的APC anti-mouse CD25，涡旋混匀，4℃避光孵育30分钟；(3)洗涤细胞：每管加入1.5mL Staining Buffer，混匀，400g离心5分钟，弃去上清，重复2次； (4)通透细胞：每管中加入1mL新鲜配制的Fixation/Permeabilization工作液重悬细胞，涡旋混匀，4℃避光孵育30分钟；400g离心5分钟，弃去上清；(5)洗涤细胞：每管加入1.5mL Permeabilization Buffer，混匀，400g离心5分钟，弃去上清，重复2次；(6)封闭：每管加入100μL Permeabilization Buffer重悬细胞，分别加入2μL anti-mouse CD16/32，4℃避光孵育15分钟； (7)胞内染色：每管分别加入2.5μL PE anti-mouse FOXP3和 2.5μLanti-mouse FOXP3同型对照，混匀，4℃避光孵育30分钟；(8)洗涤细胞：每管加入1.5mLPermeabilization Buffer，混匀，400g离心5分钟，弃去上清，重复2次；(9)固定：每管分别加入1mL 4％多聚甲醛室温固定20 分钟；(10)洗涤细胞：每管加入1.5mL StainingBuffer，混匀，400g离心5 分钟，弃去上清；(11)准备上样：每管加入500μL StainingBuffer重悬细胞，混匀，避光，准备上机。
3)流式细胞仪检测Treg细胞：将上一步细胞悬液上FAcscan流式细胞仪分析，以CD4和SSC设门，选择CD4+细胞分析CD25、FOXP3表达，结果以阳性细胞的百分率计算。
12、统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析处理。选用行列表的χ2检验比较不同组别小鼠Graves的发病率。选用Dunnett-t检验比较各组TT4水平、TRAb 水平、脾Tregs比例及刺激指数。P<0.05表示差异有统计学意义。
实施例1纯化蛋白是重组人TSHR A亚基蛋白
我们首先用BCA法检测了浓缩后的纯化蛋白的浓度，依据绘制标准曲线计算得高度浓缩后的纯化蛋白浓度为79.5mg/mL，共分装500μL，15个批次总产量为39.75mg。每个批次生产的纯化蛋白和混合后的纯化蛋白分别做 Western Blot试验以验证纯化蛋白是否为目的蛋白重组人TSHR A亚基蛋白。结果显示，纯化蛋白呈长拖尾状，能与抗人TSHR抗体Ab6048(与A 亚基氨基端22-35位氨基酸残基特异性结合)特异性结合，与前期实验结果一致，如图1所见，可知纯化蛋白即为酵母表达生产的重组人TSHR A亚基蛋白。
实施例2纯化蛋白具有人体内TSHR A亚基部分免疫功能
为检测纯化的目的蛋白与人体内的TSHR A亚基是否具有相同的免疫原性，或者免疫功能是否相似，本研究从临床上收集了15份TRAb(+)的初发初治女性Graves病患者血清，用Elisa方法检测纯化蛋白是否可以与患者血清特异性结合，以OD值大于阴性对照组2.1倍以上即为阳性，以验证纯化蛋白功能。结果显示，15份病人血清样本中有8份为阳性(图2中A图，P＝0.066)，提示纯化蛋白的免疫功能与人体内的TSHR A亚基免疫功能存在部分重叠，从酵母表达体系内纯化的重组人TSHR A亚基具有部分活性免疫表位。为了进一步验证Elisa试验中与底物纯化蛋白结合的病人血清成分确实是TRAb而非其他，本研究收集Elisa试验中阳性组孵育完一抗后的上清液，与同样稀释倍数的病人血清原液，同时分别放免法检测TRAb值，比较与底物结合前后血清(上清)中TRAb的变化情况。结果显示，与正常人血清相比，Graves病患者血清在与底物结合后其TRAb含量明显减少(图 2中B图，P<0.001)，证实上述Elisa试验中与纯化蛋白结合的病人血清成分确实是TRAb，说明了纯化蛋白具有人体内TSHR A亚基的免疫活性。
实施例3新生期大剂量A亚基口服可诱导Graves病免疫耐受
为了研究新生期口服重组人TSHR A亚基蛋白是否可以诱导Balb/c小鼠成年后对Graves病免疫耐受，本研究分别在新生24小时内给予Balb/c雌性小鼠大剂量(1000μg)、中剂量(500μg)和低剂量(100μg)的A亚基口服，同时模型组和对照组相同时间节点口服相同体积的PBS溶液，在小鼠成年后，各耐受组和模型组均多次免疫注射Ad-TSHR腺病毒诱导Graves病，对照组相同时间节点注射相同剂量的Ad-null腺病毒，观察各组小鼠的甲状腺功能(TT4、TRAb)和甲状腺组织病理评价Graves病发病状态，评估各组耐受是否成功。其中血清TT4水平以对照组血清TT4水平的Mean±2SD为正常范围，即以3.10～62.07μg/L为甲功正常值范围；血清TRAb水平以>10 U/L为TRAb阳性；小鼠甲状腺组织病理以是否有甲状腺滤泡上皮细胞增生、乳头形成等判断阳性。各组结果以Mean±SE表示。结果如图3及表1所示。
表1各组小鼠甲状腺功能相关指标阳性率评价
Control，对照组；Model，模型组；1000μg，大剂量耐受组；500μg，中剂量耐受组；100μg，低剂量耐受组；甲亢发生率，血清TT4水平高于正常范围；TRAb阳性率，血清TRAb阳性；甲状腺组织增生阳性率，甲状腺滤泡上皮细胞增生。
甲功即血清TT4结果(图3中A、表1)显示，模型组小鼠血清TT4水平为143.101±9.755μg/L，其中1/21的小鼠血清TT4水平在正常范围内；大剂量耐受组即1000μg口服组的小鼠血清TT4水平为6.542±13.774μg/L，明显低于模型组小鼠血清TT4水平(P<0.01)，其中有6/16的小鼠血清TT4水平在正常范围内；中剂量耐受组即500μg口服组的小鼠血清TT4水平为 155.479±25.051μg/L，低剂量耐受组即100μg口服组的小鼠血清TT4水平为 141.999±14.334μg/L，两组均与模型组无统计学差异，其中，中剂量组有3/11 的小鼠血清TT4水平在正常范围内，低剂量组有2/17的小鼠血清TT4水平在正常范围内。
血清TRAb结果(图3中B、表1)显示，模型组小鼠血清TRAb水平为197.253±20.837U/L，其中所有的小鼠血清TRAb均为阳性；大剂量耐受组的小鼠血清TRAb水平为122.734±17.574U/L，低于模型组小鼠血清TRAb 水平(P<0.05)，其中有1只小鼠血清TRAb为阴性；中剂量耐受组的小鼠血清TRAb水平为171.661±19.673U/L，低剂量耐受组的小鼠血清TRAb水平为194.133±20.837U/L，两组均与模型组无统计学差异。
甲状腺组织病理HE染色光镜检查结果(图4、表1)显示，模型组小鼠甲状腺滤泡上皮细胞明显增生，呈柱状或立方状，形成乳头状结构；大剂量耐受组有8/16的小鼠甲状腺滤泡上皮细胞无增生，与对照组相似，有8/16 的小鼠甲状腺滤泡上皮细胞轻度增生，但无乳头状结构；中剂量耐受组小鼠甲状腺可见滤泡上皮细胞增生，呈低柱状，有乳头状结构形成，但增生程度较模型组稍轻；小剂量耐受组小鼠甲状腺滤泡上皮明显增生，呈柱状，有乳头状结构形成，增生程度与模型组相似。
实施例4大剂量耐受组小鼠脾Tregs细胞比例升高
为评估Tregs与免疫耐受诱导的关系，本研究利用流式细胞术检测小鼠脾CD4+单核细胞群中CD25+FoxP3+细胞亚群比例，数值以Mean±SE表示。结果(图5、6)显示，对照组小鼠脾Tregs细胞比例为10.22±0.41％，模型组小鼠脾Tregs细胞比例为9.66±0.31％；大剂量耐受组小鼠脾Tregs细胞比例为11.63±0.27％，高于对照组(P<0.05)和模型组(P<0.01)；中剂量耐受组小鼠脾Tregs细胞比例为10.04±0.31％，小剂量耐受组小鼠脾Tregs细胞比例为10.03±0.51％，这两组与对照组、模型组比较均无统计学差异。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (12)
1.人TSHR A亚基在制备预防Graves病的口服药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人TSHR A亚基为利用酵母表达体系生产纯化的重组人TSHR A亚基。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组人TSHR A亚基的用量为100-1000μg，优选为1000μg。
4.一种预防Graves病的口服药物组合物，其特征在于，所述组合物的活性成分为人TSHR A亚基。
5.根据权利要求4所述的口服药物组合物，其特征在于，所述人TSHR A亚基为利用酵母表达体系生产纯化的重组人TSHR A亚基。
6.根据权利要求5所述的口服药物组合物，其特征在于，所述组合物中所述重组人TSHRA亚基的含量为100-1000μg。
7.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其特征在于，所述组合物中重组人TSHR A亚基溶液中重组人TSHR A亚基的含量为500-1000μg，优选为1000μg。
8.一种利用人TSHR A亚基诱导对Graves病新生口服耐受的动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、在动物出生24小时内，用人TSHR A亚基溶液分次打入所述动物咽部，同时刺激所述动物上颚诱发吞咽反射；
S2、将所述打入重组人TSHR A亚基的动物放回饲养空间内，继续母乳喂养，离乳后继续饲养直至动物成年。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述人TSHR A亚基为利用酵母表达体系生产纯化的重组人TSHR A亚基。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述重组人TSHR A亚基溶液中重组人TSHR A亚基的含量为100μg-1000μg，优选为500μg-1000μg。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述动物为具有免疫活性的啮齿类动物，优选为小鼠。
12.权利要求8-11任一所述的方法诱导获得的动物模型在对Graves病口服免疫耐受研究中的应用。
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