CN117917247A - 预防桥本甲状腺炎的疫苗及桥本甲状腺炎模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了预防桥本甲状腺炎的疫苗及桥本甲状腺炎模型的构建方法，该疫苗的活性成分是pTg蛋白；桥本甲状腺炎模型的构建方法包括步骤：(1)选取EAT易感品系CBA/J新生小鼠作为预防实验组；(2)在预防实验组小鼠出生24小时内喂服一次50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液，间隔48h后且在出生72小时内再次喂服50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。本发明通过在新生期口服pTg蛋白成功诱导免疫耐受，可以有效预防成年后EAT的发生，具有良好的临床实用性及可操作性，且为将来在临床工作中通过诱导免疫耐受预防桥本甲状腺炎中“耐受时间窗”的选取提供有力的说明。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种预防桥本甲状腺炎的疫苗及桥本甲状腺炎模型的构建方法。
背景技术
桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎(chronic lymphocytic thyroiditis,CLT)或自身免疫性甲状腺炎(autoimmunethyroiditis,AIT)。HT与Graves病(Graves’disease，GD)均属于自身免疫性甲状腺疾病。自身免疫性甲状腺疾病是一组最常见的与甲状腺相关的自身免疫性疾病，核心发病机制为机体自身免疫耐受(self-tolerance)被打破，体液免疫及细胞免疫系统被过度激活而攻击甲状腺自身抗原，造成甲状腺结构及功能的破坏。HT是目前发病率最高的自身免疫性疾病，人群发病率为8/1000至46/1000，年发病率约为1/1000，女性患HT的风险是男性的8-9倍，平均发病率为3.5-5/1000。HT患者主要表现为甲状腺弥漫性肿大，内有大量淋巴细胞浸润，甲状腺滤泡遭到广泛破坏、萎缩，淋巴生发中心纤维化，患者甲状腺功能逐渐转为甲减或亚临床甲减状态，血清甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)及/或甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,TgAb)水平明显升高。HT是临床上引发甲减最常见的原因，可引起90％以上的原发性甲减。同时HT患者生活质量较正常人均有明显下降，其罹患心脑血管疾病、代谢综合征、精神抑郁及甲状腺癌等疾病的风险也显著升高。
目前关于桥本甲状腺炎的研究是基于对6-10周龄(成年)小鼠尾部静脉注射的方式进行建模，但由于成年小鼠的免疫系统发育已经趋于成熟，诱导耐受效果会受到限制；此外，采用尾部静脉注射的方式也会影响耐受效果。因此现有的小鼠桥本甲状腺炎的模型不能用来作为一种有效的人类自身免疫性甲状腺炎预防的研究模型。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种预防桥本甲状腺炎的疫苗及桥本甲状腺炎模型的构建方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：
本发明第一方面，公开了一种pTg蛋白在预防桥本甲状腺炎中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述pTg蛋白通过诱导免疫耐受，调控CD4+Th细胞免疫失衡，预防桥本甲状腺炎的发生。
在本发明的一个实施例中，所述pTg蛋白为浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。
本发明第二方面，公开了一种预防桥本甲状腺炎的疫苗，所述疫苗的活性成分是pTg蛋白。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗是口服制剂。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗为浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗的首次口服时间为新生期24h内，再次口服时间为间隔48h后且在出生72小时内。
本发明第三方面，公开了一种基于EAT易感品系CBA/J小鼠的桥本甲状腺炎模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)选取EAT易感品系CBA/J新生小鼠作为预防实验组；
(2)在预防实验组小鼠出生24小时内喂服一次50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液，间隔48h后且在出生72小时内再次喂服50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。
在本发明的一个实施例中，在步骤(2)后还包括步骤：
(3)在预防实验组成年后采用pTg+LPS免疫诱导造模，从甲状腺病理形态及EAT评分、血清TgAb、TPOAb浓度及脾脏T淋巴细胞体外刺激增殖水平衡量耐受效果，观察新生期口服pTg诱导免疫耐受对成年小鼠EAT发病的预防作用及对EAT中CD4+Th细胞免疫失衡的干预效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.桥本甲状腺炎小鼠可通过在新生期口服pTg蛋白诱导免疫耐受，预防成年后EAT的发生。此种免疫预防策略具有良好的临床实用性及可操作性，为将来在临床工作中通过诱导免疫耐受预防桥本甲状腺炎发生以及针对桥本甲状腺炎的免疫学干预治疗提供了新的思路。
2.研究者通过在新生期(出生24h之内)给予CBA/J小鼠喂服pTg蛋白实现免疫耐受的成功诱导，这为将来在临床工作中通过诱导免疫耐受预防桥本甲状腺炎中“耐受时间窗”的选取提供了有力的说明。
3.研究者通过观察小鼠甲状腺病理形态及EAT评分、血清TgAb、TPOAb浓度及脾脏T淋巴细胞体外刺激增殖水平(S.I.)衡量耐受效果，同时检测脾脏及外周血三种不同分子表型Treg(CD4+Foxp3+、CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25-Foxp3+)的细胞比例、脾脏CD4+T淋巴细胞亚群比例，特异性转录因子表达水平，及血清细胞因子表达水平，证实新生期口服pTg诱导免疫耐受对成年小鼠EAT发病具有预防作用，可提高小鼠脾脏及外周血中Treg细胞数量、降低脾脏Th1、Th17细胞免疫反应、重塑Th1/Th2及Th17/Treg平衡。这为将来研究桥本甲状腺炎免疫耐受的具体机制提供了较为坚实的理论依据及实验数据支撑。
附图说明
图1是新生CBA/J雌鼠口服pTg诱导免疫耐受的实验流程图；
图2(a)是体重称计数归零；
图2(b)是八只新生CBA/J小鼠称重；
图2(c)是新生CBA/J小鼠体长对比；
图2(d)是用10μL移液枪吸取4μL pTg溶液自新生雌鼠一侧嘴角轻柔打入；
图3(a)是小鼠甲状腺HE染色(200×，比例尺200μm；400×，比例尺100μm)；
图3(b)是小鼠甲状腺EAT评分散点图；
图3(c)是小鼠甲状腺EAT评分柱状图；
图3(d)是小鼠S.I.柱状图。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
图4(a)是第8周各组小鼠血清TgAb相对浓度柱状图；
图4(b)是第10周各组小鼠血清TgAb相对浓度柱状图；
图4(c)是第12周各组小鼠血清TgAb相对浓度柱状图；
图4(d)是第8-12周各组小鼠血清TgAb相对浓度变化折线图；
图4(e)是第8周各组小鼠血清TPOAb浓度柱状图；
图4(f)是第10周各组小鼠血清TPOAb浓度柱状图；
图4(g)是第12周各组小鼠血清TPOAb浓度柱状图；
图4(h)是第8-12周各组小鼠血清TPOAb浓度变化折线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例提供了pTg蛋白在预防桥本甲状腺炎中的应用。具体原理为pTg蛋白通过诱导免疫耐受，调控CD4+Th细胞免疫失衡，预防桥本甲状腺炎的发生。pTg蛋白优选为浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。采用口服方式给药，当用药对象为小鼠时，口服方式为在小鼠出生24小时内喂服一次50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液，间隔48h后且在出生72小时内再次喂服50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。
实施例2
本实施例提供了一种预防桥本甲状腺炎的疫苗，其活性成分是pTg蛋白；进一步地，该疫苗是口服制剂，优选为浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。本发明的疫苗采用口服方式给药，为了保证最佳预防效果，该疫苗的首次口服时间为新生期24h内，再次口服时间为间隔48h后且在出生72小时内。当用药对象为小鼠时，口服方式为在小鼠出生24小时内喂服一次50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液，间隔48h后且在出生72小时内再次喂服50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。
实施例3
本实施例提供了一种基于EAT易感品系CBA/J小鼠的桥本甲状腺炎模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)选取EAT易感品系CBA/J新生小鼠作为预防实验组；
(2)在预防实验组小鼠出生24小时内喂服一次50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液，间隔48h后且在出生72小时内再次喂服50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。
进一步地，还可以包括步骤：
(3)在预防实验组成年后采用pTg+LPS免疫诱导造模，从甲状腺病理形态及EAT评分、血清TgAb、TPOAb浓度及脾脏T淋巴细胞体外刺激增殖水平衡量耐受效果，观察新生期口服pTg诱导免疫耐受对成年小鼠EAT发病的预防作用及对EAT中CD4+Th细胞免疫失衡的干预效果。
其中，给予新生CBA/J小鼠喂服pTg的方法如下：
(1)口服半小时前应取出pTg溶液及无菌PBS，平衡至室温，再行操作，防止低温引起新生小鼠胃肠不适；操作时戴无菌手套，注意气味保护，避免母鼠食仔。
(2)依照不同分组(耐受组分别口服不同剂量的pTg，造模组及空白对照组口服等体积无菌PBS)，先将每笼雌性小鼠挑出，再将上述配置好的pTg无菌溶液，及等体积(4μL)无菌PBS，用无菌10μL移液枪自新生小鼠一侧嘴角轻柔打入咽部，刺激上腭，诱发小鼠吞咽反射，保证口服pTg效率，同时也防止误吸入气管引起小鼠呛咳。
(3)操作完毕后，将新生小鼠放回鼠窝，母鼠继续哺乳喂养，待1周后再次判定性别并做记录，3周时离乳饲养直至小鼠8周龄。
上述给予新生CBA/J小鼠喂服pTg的方法中分辨CBA/J新生小鼠性别的方法如下：
在出生0-24h内，判定新生幼鼠性别并分组。通常以幼鼠外生殖器至肛门距离远近判定性别，近雌远雄。此外，幼鼠1周龄时，雌鼠外生殖器形状较扁平，在生殖器至肛门之间有一无毛小沟，雄鼠外生殖器略微凸起，在生殖器至肛门间长有少量毛发，可有助判定。待2-3周龄时，根据乳头数目再次判断，雌鼠乳头数显著多于雄鼠。在3周龄时也可通过体型帮助判断，雌鼠体型偏小偏瘦长。综合以上几种方法，判定小鼠性别的准确率，在3周龄时可达100％。
下面对本发明基于EAT易感品系CBA/J小鼠的桥本甲状腺炎模型的构建方法详细说明如下：
(1)繁殖饲养得到50只CBA/J新生雌鼠：
取24只8-10周龄CBA/J雌鼠，与12只同样周龄雄鼠，按照2:1比例在傍晚5-6点统一合笼，共计12笼。于合笼后第二日早上6点前，检查雌鼠有无受孕迹象，具体操作：固定雌鼠，观察阴道口附近有无乳白色团块状的阴道栓，若有，证明发生交配行为，雌鼠可能受孕，记录为孕第1天。在合笼后第14天再次观察所有雌性小鼠，若下腹部膨隆突出，判定为怀孕，将孕鼠一只一笼单独放置。待孕第19-20天时，每天早晚各观察一次孕鼠，如有烦躁不安、不停整理产窝等行为，表明即将分娩。在出生0-24h内，依据生殖器距肛门距离远近判定新生幼鼠性别(近雌远雄)并将新生雌鼠分组实施操作。
(2)配制浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液：
将保存在-20℃冰箱中的pTg取出，放置于冰上，用无菌PBS溶液稀释至4μL，配制浓度为12.5μg/μL的pTg溶液。临用前现配，保持pTg溶液新鲜无菌。
(3)在小鼠出生后24h以内，用无菌10μL移液枪吸取4μL的pTg蛋白溶液自新生雌鼠一侧嘴角轻柔打入咽部，刺激上腭，诱发小鼠吞咽反射，防止误吸入气管引起小鼠呛咳。
(4)间隔48h之后，再次重复上述(3)步骤；
(5)在小鼠8周龄时开始EAT造模(具体方案为，在满8周龄后的第0、7、14天尾静脉注射含有100μg pTg的100μL PBS，间隔3h注射含25μg LPS的100μL PBS，第28天处死)；
(6)在小鼠12周龄时处死小鼠，从甲状腺病理形态及EAT评分、血清TgAb、TPOAb浓度及脾脏T淋巴细胞体外刺激增殖水平(S.I.)衡量耐受效果。
其中，小鼠甲状腺组织病理检查及EAT模型评分具体实施操作：
1)小鼠解剖处理及标本留取
小鼠禁食禁水4h后处理。
(1)使用4％水合氯醛麻醉小鼠，用镊子摘取单侧眼球留取外周血，室温条件下静置2h后，离心收集上层血清，冻存在-80℃冰箱备用；
(2)颈椎离断法处死小鼠，浸泡于75％酒精中消毒3min，取出并固定，用无菌镊子和剪刀剪开颈部皮肤，逐层分离皮下组织、筋膜及肌肉层，暴露气管，取甲状腺软骨上缘至胸廓入口处气管部分(甲状腺附着其上)，浸泡于福尔马林中，石蜡包埋。
(3)分离并暴露小鼠腹腔，换另一套无菌镊子及剪刀，取出脾脏均分为二，一份放入盛有无菌1640溶液的小培养皿中，制备脾脏单细胞悬液，一份放入预先装有1mL TRIzol的1.5mL无RNA酶EP管中，用以提取RNA。
2)制作甲状腺石蜡切片：
(1)固定：将小鼠甲状腺组织浸泡在10％福尔马林中24h，取出后流水冲洗24h，再放置于75％乙醇中24h；
(2)脱水：将组织依次浸入75％乙醇溶液10min、80％乙醇2h、95％乙醇2h、95％乙醇2h、无水乙醇1.5h、无水乙醇1h，二甲苯+无水乙醇(1:1等体积混合)20min、二甲苯10min、二甲苯10min梯度脱水；
(3)浸蜡：依次浸入50℃软蜡30min、50℃软蜡1h、60℃硬蜡30min、60℃硬蜡30min；
(4)包埋：注入加热融化后的石蜡于包埋框中，使用加热后的镊子捏取浸蜡后的甲状腺组织，置于包埋框内，待蜡块稍凝固，将包埋框放入冷水中加速凝固；
(5)切片：将冷却后的包埋蜡块置于切片机上，设置切片厚度为4mm，均匀切出薄片，将切下的薄片用毛笔轻柔托起放入热水中展平，再贴附在载玻片上，空气中干燥5min后放入45℃恒温箱中烘干。
3)HE染色：
(1)脱蜡洗涤：切片浸泡入二甲苯10min，重复1遍；浸泡入无水乙醇中5min，重复1遍；依次浸泡入95％乙醇溶液2min，重复1遍，80％乙醇2min，70％乙醇1min；蒸馏水洗涤1min；
(2)染色：泡入苏木精染色5min，自来水冲洗2min；浸入1％盐酸酒精溶液10s，自来水下冲洗1min，显微镜下观察洗涤效果；0.5％伊红溶液染色10s，蒸馏水洗涤3遍；
(3)脱水：浸入70％乙醇溶液2min；泡入80％乙醇溶液2min；95％乙醇溶液5min；无水乙醇10min；泡入二甲苯脱水10min；
4)树胶封片：晾干后中性树胶封片，60℃烘烤60min，37℃烘烤持续48h；
5)显微镜下观察HE染色后的小鼠甲状腺切片，由两名熟悉小鼠甲状腺炎病理变化特征的医师，参照既往小鼠EAT模型评分标准，独立评分后取平均数，若有严重分歧则讨论后再次评分。甲状腺淋巴细胞浸润面积占比用Image J软件计算。评分标准如表1所示：
表1小鼠EAT模型甲状腺病理评分标准
其中，小鼠血清甲状腺自身抗体水平检测具体操作如下：
1)ELISA法检测血清TgAb相对浓度
(1)初筛阳性血清：
a)取提前配制的包被缓冲液10mL，加入100μg的pTg蛋白，配制浓度为10μg/mL的pTg包被液，取96孔酶标板，每孔加入pTg包被液100μL，用封板膜密封后放入4℃冰箱，静置12h；
b)将酶标板取出，倒掉孔中pTg包被液，在吸水纸上轻柔拍干，每孔加入提前配制的洗涤缓冲液200μL，轻振酶标板，注意勿将孔中液体洒出，静置1min，倒掉孔中洗涤液，吸水纸上轻拍沥干，再重复洗涤2遍；
c)每孔加入封闭液200μL，封板膜密封后，4℃静置12h；
c)将酶标板取出，倒掉孔中封闭液，在吸水纸上轻拍干，每孔加入洗涤缓冲液200μL，轻振荡板，静置1min后倒掉液体，吸水纸上轻拍沥净，共洗涤3次；
d)取提前在4℃冰箱静置稳定6h以上的小鼠血清样品，按1：999比例与PBS溶液混匀稀释，每孔加入稀释后的血清样品100μL，每个小鼠血清样品设置三个复孔，密封后4℃静置12h；
e)取出酶标板，倒掉孔中血清样品，洗涤3次；
f)取HRP标记山羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)，按1：5000比例与PBS稀释，每孔加入100μL稀释后的IgG-HRP，轻柔振荡酶标板，用封板膜密封后室温静置1h；
g)倒掉板中液体，洗涤3次后每孔加入100μLTMB显色剂，密封避光静置5min；
h)每孔立刻加入2M硫酸50μL，终止显色；
i)即刻使用酶标仪检测，读取各孔在450nm波长下的OD值；
j)取所检测的每只小鼠血清样品的三孔平均值定义为该样品的OD值。以对照组小鼠血清样品的OD值的(均值±2倍标准差)分别定义正常值的上下限，若造模组OD值超出上限则定义为阳性，以此初步筛选出TgAb为阳性的小鼠血清样品。
(2)绘制TgAb浓度标准曲线：
a)任取上一步筛选出的小鼠TgAb阳性血清3份各100μL，混合均匀；
b)采用梯度稀释方法，将混合血清稀释为1:300,1:900,1:2700,1:8100,1:24300,1:72900，1:218700的梯度浓度，其相对浓度依次定义为218700，72900，24300，8100，2700，900和300，绘制浓度标准曲线；
c)重复(1)中实验步骤，检测各组小鼠血清TgAb水平，设置3个复孔。按照绘制出的标准曲线，计算各孔TgAb相对浓度，取三孔平均值为该样品TgAb相对浓度。
2)ELISA法检测血清TPOAb
(1)按试剂盒说明书，取出酶标板，室温静置1h。设置空白孔、标准品孔及待测样品孔，分别处理：空白孔不加试剂，标准品孔加入不同浓度的标准品50μL，样本孔加入已提前在4℃冰箱中静置6h稳定后的小鼠血清样品50μL；
(2)除外空白孔，其余孔每孔加入HRP标记的抗体100μL，用封板膜密封后，放入37℃恒温箱孵育1h；
(3)取出酶标板，弃去孔中液体，吸水纸上轻拍、沥干，每孔加洗涤液350μL，轻震荡10s，静置1min后弃去液体，吸水纸上拍干，重复洗涤板子5次；
(4)每孔加入显色底物A+B各50μL，37℃，避光孵育15min后，每孔加入终止液50μL；
(5)立即使用酶标仪检测各孔在450nm处的OD值，根据各标准品OD值绘制标准浓度曲线，计算各血清样品TPOAb浓度值。
其中，小鼠脾脏T淋巴细胞体外培养及刺激增殖具体操作如下：
以下操作均在无菌环境下实施。
1)脾脏单细胞悬液制备
(1)取一直径3cm的无菌小培养皿置于超净台上，皿内盛有1mL无菌1640溶液。取已灭菌200目滤网，剪成若干正方形块，大小为4cm×4cm，取一块覆盖于皿上；
(2)将二分之一块脾脏置于滤网上，用无菌眼科剪将其剪碎，并用无菌5mL注射器枕芯轻研磨碎组织，使绝大部分组织渗漏于滤网之下，进入1640溶液中，滤网上仅剩少许白色结缔组织；
(3)弃去滤网，将小培养皿中含有脾脏细胞的1640转移至一无菌15mL离心管中，再用1640溶液每次1mL冲洗培养皿，共2次，将冲洗液一并转入离心管中；
(4)4℃，500g，离心5min，弃上清，轻柔涡旋，加入4mL红细胞裂解液，吹打混匀，室温静置4min；
(5)加入10mL的PBS溶液稀释混匀，室温静置1min；
(6)4℃，500g，离心5min，弃去上清，观察管底细胞沉淀颜色，若仍含较多红细胞，则重复裂红一次；
(7)加入2mL的PBS溶液重悬细胞，取10μL细胞悬液置于一含990μL的PBS的1.5mLEP管中，涡旋混匀，用一次性细胞计数板配合全自动细胞计数仪计数，分别计数细胞总数及活细胞数目。
2)脾脏T淋巴细胞体外刺激增殖
(1)取上述含6×105个细胞的单细胞悬液体系，4℃，500g，离心5min，弃上清后，用提前配制好的620μL的T淋巴细胞基础增殖培养基重悬细胞，并种植于无菌96孔细胞培养板中，200μL/孔，每只小鼠种3孔；
(2)重复上述步骤，以T淋巴细胞刺激增殖培养基代替基础增殖培养基；
(3)将上述两个96孔细胞培养板置于37℃、5％ CO2细胞培养箱中，培养72h；
(4)取出细胞培养板，每孔加入20μL CCK-8，避光，轻振荡培养板，继续37℃、5％CO2培养3h；
(5)取出96孔板，使用酶标仪检测各孔在450nm处的OD值；
(6)计算每只小鼠脾脏T淋巴细胞刺激增殖指数(stimulation index,S.I.)。
S.I.＝T淋巴细胞刺激增殖培养基的OD值的3孔平均值/T淋巴细胞基础增殖培养基的OD值的3孔平均值。
本发明实施例提供的预防桥本甲状腺炎的疫苗及桥本甲状腺炎模型的构建方法，具有以下有益效果：
1.桥本甲状腺炎小鼠可通过在新生期口服pTg蛋白诱导免疫耐受，预防成年后EAT的发生。此种免疫预防策略具有良好的临床实用性及可操作性，为将来在临床工作中通过诱导免疫耐受预防桥本甲状腺炎发生以及针对桥本甲状腺炎的免疫学干预治疗提供了新的思路。
2.研究者通过在新生期(出生24h之内)给予CBA/J小鼠喂服pTg蛋白实现免疫耐受的成功诱导，这为将来在临床工作中通过诱导免疫耐受预防桥本甲状腺炎中“耐受时间窗”的选取提供了有力的说明。
3.研究者通过观察小鼠甲状腺病理形态及EAT评分、血清TgAb、TPOAb浓度及脾脏T淋巴细胞体外刺激增殖水平(S.I.)衡量耐受效果，同时检测脾脏及外周血三种不同分子表型Treg(CD4+Foxp3+、CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25-Foxp3+)的细胞比例、脾脏CD4+T淋巴细胞亚群比例，特异性转录因子表达水平，及血清细胞因子表达水平，证实新生期口服pTg诱导免疫耐受对成年小鼠EAT发病具有预防作用，可提高小鼠脾脏及外周血中Treg细胞数量、降低脾脏Th1、Th17细胞免疫反应、重塑Th1/Th2及Th17/Treg平衡。这为将来研究桥本甲状腺炎免疫耐受的具体机制提供了较为坚实的理论依据及实验数据支撑。
下面给出具体的实验过程及效果评价结果：
图1是新生CBA/J雌鼠口服pTg诱导免疫耐受的实验流程图；
新生小鼠实验分组、新生期口服pTg溶液及成年后EAT造模等处理的实验流程如图1所示，分别在小鼠满8周龄后的第0、7、14天尾静脉注射含有100μg pTg的100μL PBS，间隔3h注射含25μg LPS的100μL PBS，第28天处死。
图2(a)是体重称计数归零；
图2(b)是八只新生CBA/J小鼠称重；
图2(c)是新生CBA/J小鼠体长对比；
图2(d)是用10μL移液枪吸取4μL pTg溶液自新生雌鼠一侧嘴角轻柔打入；
如图2(a)-图2(d)所示，对八只新生CBA/J小鼠进行称重、体长对比及实施口服pTg溶液的操作。
图3(a)是小鼠甲状腺HE染色(200×，比例尺200μm；400×，比例尺100μm)；
图3(b)是小鼠甲状腺EAT评分散点图；
图3(c)是小鼠甲状腺EAT评分柱状图；
图3(d)是小鼠S.I.柱状图。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
1)耐受组小鼠甲状腺炎性浸润程度较EAT组显著降低
如图3(a)所示，NC组小鼠甲状腺滤泡大小较为均一，形态完整无破坏，滤泡间质无淋巴细胞浸润表现；EAT组小鼠甲状腺滤泡破坏较多，形态不规则，滤泡间有空腔产生，伴随明显淋巴细胞浸润表现，程度较重；各耐受组小鼠中，甲状腺炎性浸润程度存在较大差异，部分小鼠甲状腺滤泡完整无明显破坏，无明显炎性浸润或浸润程度较轻，EAT评分≤1分(浸润面积≤20％)，部分小鼠淋巴细胞浸润程度较重，伴有明显滤泡破坏，炎性浸润呈局灶状，EAT评分可达2分(浸润面积在20％-40％之间)，但总体甲状腺内炎性浸润程度较EAT组显著减轻，EAT评分未有达到3分者。
如图3(b)所示，NC组10只小鼠甲状腺EAT评分均为0分；EAT组10只小鼠中有1只评分为1分，7只为2分，2只为3分；耐受三组中，50μg高剂量组甲状腺EAT评分均不超过2分，其中8只≤1分，有1只小鼠甲状腺完全正常，评分为0分。10μg中剂量组10只小鼠中有9只评分不超过2分，其中7只≤1分。2μg低剂量组中，9只评分不超过2分，5只≤1分。EAT组及高、中、低三组耐受组的EAT评分均较NC组显著升高(P<0.001)。
如图3(c)所示，耐受三组EAT评分均低于EAT组(50μg组：0.95±0.64vs.2.10±0.57，P<0.01；10μg组：1.20±0.86vs.2.10±0.57，P<0.05；2μg组：1.40±0.81vs.2.10±0.57，P>0.05)，三组组间无显著性差异(F＝0.85，P＝0.44)。
如图3(d)所示，与EAT组相比，50μg组及10μg组S.I.显著降低(50μg组：1.15±0.10vs.1.31±0.15，P<0.05；10μg组：1.16±0.08vs.1.31±0.15，P<0.05)，2μg组与EAT组相比，S.I.无统计学差异(P>0.05)。
由此说明，使用pTg诱导耐受可使小鼠甲状腺炎病理表现显著减轻、同时显著降低脾脏T淋巴细胞刺激增殖指数。
图4(a)是第8周各组小鼠血清TgAb相对浓度柱状图；
图4(b)是第10周各组小鼠血清TgAb相对浓度柱状图；
图4(c)是第12周各组小鼠血清TgAb相对浓度柱状图；
图4(d)是第8-12周各组小鼠血清TgAb相对浓度变化折线图；
图4(e)是第8周各组小鼠血清TPOAb浓度柱状图；
图4(f)是第10周各组小鼠血清TPOAb浓度柱状图；
图4(g)是第12周各组小鼠血清TPOAb浓度柱状图；
图4(h)是第8-12周各组小鼠血清TPOAb浓度变化折线图；
如图4(a)-(d)所示，造模2次后，在第10周时，三组耐受组TgAb相对浓度较EAT组均显著降低(50μg组：8128.21±1620.80vs.15956.72±2465.46，P<0.001；10μg组：11148.90±2136.91vs.15956.72±2465.46，P<0.01；2μg组：6873.26±1988.75vs.15956.72±2465.46，P<0.001)。第12周时，与EAT组相比，三组耐受组中，50μg组小鼠血清TgAb相对浓度显著降低(10731.42±4031.93vs.20504.09±4499.52，P<0.001)。
如图4(e)-(h)所示，在第10周时，2μg低剂量组较EAT组血清TPOAb浓度显著降低(13.66±4.29U/mL vs.19.46±6.17U/mL，P<0.05)，50μg组及10μg组虽低于EAT组，但无统计学意义(P>0.05)。但在第12周时，50μg组血清TPOAb浓度显著低于EAT组(19.40±3.22U/mL vs.24.99±5.70U/mL，P<0.05)。由此可说明，使用pTg诱导耐受可使小鼠血清TgAb及TPOAb浓度显著下降。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.pTg蛋白在预防桥本甲状腺炎中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述pTg蛋白通过诱导免疫耐受，调控CD4+Th细胞免疫失衡，预防桥本甲状腺炎的发生。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述pTg蛋白为浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。
4.一种预防桥本甲状腺炎的疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分是pTg蛋白。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是口服制剂。
6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。
7.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的首次口服时间为新生期24h内，再次口服时间为间隔48h后且在出生72小时内。
8.基于EAT易感品系CBA/J小鼠的桥本甲状腺炎模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取EAT易感品系CBA/J新生小鼠作为预防实验组；
(2)在预防实验组小鼠出生24小时内喂服一次50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液，间隔48h后且在出生72小时内再次喂服50μg剂量浓度为12.5μg/μL的无菌pTg蛋白溶液。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)后还包括步骤：
(3)在预防实验组成年后采用pTg+LPS免疫诱导造模，从甲状腺病理形态及EAT评分、血清TgAb、TPOAb浓度及脾脏T淋巴细胞体外刺激增殖水平衡量耐受效果，观察新生期口服pTg诱导免疫耐受对成年小鼠EAT发病的预防作用及对EAT中CD4+Th细胞免疫失衡的干预效果。
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