CN114600910A

CN114600910A - 一种铜绿假单胞菌悬浮剂及其制备方法

Info

Publication number: CN114600910A
Application number: CN202210408114.4A
Authority: CN
Inventors: 吴国星; 高熹; 曾舒泉; 施春兰; 杨蕊; 钮徐融; 魏聪聪; 何明川; 兰明先
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-04-19
Also published as: CN114600910B

Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌悬浮剂及其制备方法，属于农业微生物农药领域。该铜绿假单胞菌悬浮剂以重量分数计，包括以下组分：铜绿假单胞菌HZ15菌悬液8‑12％、黄原胶0.1‑0.15％、对羟基苯甲酸甲酯0.06‑0.12％％、糊精0.1‑0.5％、甘油3‑5％、NNO0.5‑1％、吐温80 0.5‑1％、农乳600 0.5‑1％，余量为水。本发明利用绿假单胞菌制备防治烟草黑胫病的生物农药，通过筛选研究获得最优助剂种类及其用量，制得一种稳定性强、悬浮率高、分散性优异且防治效果好的悬浮剂，该制剂制备简便、剂型环保、成本较低，易于推广应用，其为拮抗菌用于大田防治烟草黑胫病提供技术支撑。

Description

一种铜绿假单胞菌悬浮剂及其制备方法

技术领域

本发明属于农业微生物农药技术领域，特别是涉及一种铜绿假单胞菌悬浮剂及其制备方法。

背景技术

烟草黑胫病(Tobacco black shank)是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，又称烟草疫病、“黑杆疯”“黑根”“乌头病”等。中国各主要产烟区均有不同程度发生，平均发病率在10％～20％，严重时损失达75％，甚至绝收。其中云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生普遍，并多与烟草青枯病混合发生，故危害更为严重，已成为我国最重要的烟草病害。烟草黑胫病的防治分为主动防治和被动防治，主动防治以培育抗病品种、水旱轮作、起垄种植为主，被动防治以化学防治为主，主要通过苗床处理、移栽处理、喷药防治等进行。农药的大量滥用和不科学的使用，造成烟田生态系统农残累积，导致病害抗药性迅猛上升，加大防控难度，降低烟叶品质，严重影响烟草的安全生产，同时污染农田环境，破坏生态平衡，从而形成“农药越用越多，防控越来越难，残留越来越多重”的恶性循环。为避免使用大量化学农药造成的“3R”问题，生物防治方法在植物病害治理的舞台上扮演着愈来愈关键的角色，已经成为当前的研究热点。

虽然目前已筛选获得众多对烟草黑胫病病原菌具有拮抗作用的生防菌，如申请人团队在前沿研究中(CN113151097A专利文献)，从鳞翅目昆虫幼虫消化道中分离得到了一株铜绿假单胞菌HZ15，研究发现该铜绿假单胞菌发酵液对烟草疫霉病原菌具有抑制作用；但是铜绿假单胞菌HZ15作为烟草黑胫病的生防菌，是否适合作为一种生物农药投入农业生产，以及制备何种生物农药剂型能够符合目前绿色安全环保的农药研制的要求，现有技术中未有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌悬浮剂及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，该悬浮剂制备简便、剂型环保、成本较低，易于推广应用，并为大田防治烟草黑胫病提供技术支撑。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种铜绿假单胞菌悬浮剂，以重量分数计，包括以下组分：铜绿假单胞菌HZ15菌悬液8-12％、黄原胶0.1-0.15％、对羟基苯甲酸甲酯0.06-0.12％、糊精0.1-0.5％、甘油3-5％、NNO(亚甲基双萘磺酸钠)0.5-1％、吐温80 0.5-1％、农乳6000.5-1％，余量为水。

进一步地，以重量分数计，包括以下组分：铜绿假单胞菌HZ15菌悬液10％、黄原胶0.1％、对羟基苯甲酸甲酯0.08％、糊精0.3％、甘油4％、NNO 0.5％、吐温80 0.5％、农乳6000.5％，余量为水。

进一步地，所述铜绿假单胞菌HZ15菌悬液中菌体浓度≥1×10⁹CUF/mL。

进一步地，所述铜绿假单胞菌HZ15菌悬液是通过将铜绿假单胞菌HZ15接种于YSP液体培养基上，在温度36℃、pH值为7的条件下培养12-24h，再用无菌水稀释后制得的。

本发明还提供一种上述的铜绿假单胞菌悬浮剂的制备方法，按照配比将组分混合均匀即为铜绿假单胞菌悬浮剂。

进一步地，采用上述制备方法制得的铜绿假单胞菌悬浮剂pH为6.5，杂菌率为1.3％，持久泡沫量(1min后)小于40mL，悬浮率可达94.61％，且分散性优良，倾倒后残余物的质量分数为0.39％，洗涤后残余物的质量分数为0.03％，各项指标结果均符合国家标准。

本发明还提供一种上述的铜绿假单胞菌悬浮剂在防治烟草黑胫病中的应用。

本发明还提供一种上述的铜绿假单胞菌悬浮剂在制备防治烟草黑胫病生物农药中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的铜绿假单胞菌悬浮剂对烟草黑胫病病原菌具有较好的抑制生长效果，平板对峙抑菌率达81.1％，盆栽实验结果显示：该悬浮剂对烟草黑胫病防效达70％左右，对烟草黑胫病具有稳定且较好的防治效果。

本发明利用绿假单胞菌制备防治烟草黑胫病的生物农药，通过筛选研究获得最优助剂种类及其用量，制得一种稳定性强、悬浮率高、分散性优异且防治效果好的悬浮剂，该生物制剂耐受田间高温高紫外线环境，冷热贮稳定性较好，菌体存活率高，且该制剂制备简便、剂型环保、成本较低，易于推广应用，其为拮抗菌用于大田防治烟草黑胫病提供技术支撑，大大推动了烟草黑胫病的生物防治进程，也为假单胞菌的应用开发创造了成功的案例，丰富了假单胞菌的功能和生物农药剂型的研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同温度下保存悬浮剂60d的活菌数统计结果；

图2为平板对峙对烟草黑胫病病原菌的抑制效果；其中，A：空白对照；B：铜绿假单胞菌菌悬液；C：铜绿假单胞菌悬浮剂。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂。

悬浮剂又称水悬浮剂、胶悬浮剂，是在各种助剂作用下，将不溶于水或难溶于水的原药分散到水相介质中形成均匀稳定的分散体系，能流动的黏稠剂型。它可以代替含有大量溶剂的乳油，亦可代替含有大量添加剂的可湿性粉剂，且无粉尘危害、挥发性小、无毒副作用、高效等特点。因此配制悬浮剂是符合目前绿色安全环保的农药研制的发展趋势的。针对一株对烟草黑胫病病原菌具有拮抗作用的铜绿假单胞细菌HZ15，开展其悬浮剂的制备研究，为拮抗菌用于大田防治烟草黑胫病提供技术支撑，研究如下：

实施例1制备铜绿假单胞菌悬浮剂

1.菌悬液的制备

菌株为铜绿假单胞菌HZ15，是申请人在前沿研究中获得，已申请专利，见CN113151097A专利文献。

将该菌株接种于YSP液体培养基上，在温度36℃、pH值为7的条件下培养12-24h，用无菌水稀释，血细胞计数板计数，调整菌悬液浓度为1×10⁹～1×10¹⁰CUF/mL。

2.悬浮剂的配制

向菌悬液中加入助剂(包括防腐剂、增稠剂、分散剂、防冻剂、保护剂)和水混合均匀，即得铜绿假单胞菌悬浮剂。以下各助剂用量％指代其在悬浮剂中的质量分数；以下针对助剂具体种类和用量进行筛选：

2.1防腐剂的筛选

选择苯甲酸钠或对羟基苯甲酸甲酯作为防腐剂，分别取不同量的防腐剂，再将其依次与铜绿假单胞菌HZ15悬液加水混匀，放置于恒温培养箱中，在5d、10d后观察是否有霉层。

如表1所示，对羟基苯甲酸甲酯用量为0.06-0.12％时，不仅能很好的抑制杂菌生长，还能维持较高菌含量，当选择对羟基苯甲酸甲酯用量为0.08％时，对生防菌影响最小，因此防腐剂优选为含量为0.08％的对羟基苯甲酸甲酯。

表1

2.2增稠剂的筛选

在保持上述筛选结果的情况下，分别加入不同浓度的黄原胶、CMC和硅酸镁铝，制成悬浮剂，比较其流动性、分散性等性质。

如表2所示，用量为质量分数0.1％的黄原胶最好，该类型的增稠剂成本较小，且该浓度下分散性为优、无分层现象、且流动性为优，且相比于其他增稠剂，0.1％黄原胶对生防菌活性影响较小，因此其是比较理想的增稠剂。

表2

2.3润湿分散剂的初筛

通过本实验的铜绿假单胞菌菌悬液与K12、吐温20、木质素磺酸钠、PEG8000、NNO、吐温80、拉开粉、OP-10、农乳600等助剂的生物相容性测定以及对加入这几种助剂后制剂悬浮率、生物相容性的测定来筛选适合的润湿分散剂。

如表3所示，K12、吐温20、拉开粉、OP-10、木质素磺酸钠和PEG8000对生防菌的生长有抑制作用。所以选择NNO、吐温80和农乳600三种对生防菌生长无明显抑制效果的润湿分散剂做下一步正交试验。

表3

2.4润湿分散剂的复筛

采用正交试验的方法将上述筛选出对菌液生长活性无显著影响的润湿分散剂进行复配，对悬浮率和生物相容性进行测定以评价润湿分散剂复配效果和最佳配比。

如表4所示，根据K值结果，选取复配比例为NNO 0.5％、农乳600 0.5％、吐温800.5％。

表4

2.5防冻剂的筛选

在保持上述筛选结果的情况下，将甘油按不同的比例配成制剂，通过比较添加不同防冻剂后的制剂在-20℃低温环境保存一定时间后是否有无结冰现象和生防菌有效菌液浓度，筛选出效果最优的防冻剂质量添加比。

如表5所示，当甘油用量为质量分数4％时，低温保存后悬浮剂未结冰，生防菌菌含量显著高于空白对照。

表5

2.6保护剂的筛选

将保护剂按比例分别加到已制备的悬浮剂中，测定添加保护剂后的生防菌含量，以不加保护剂为对照，在紫外灯下照射，计算铜绿假单胞菌存活率。

如表6所示，当以质量分数0.3％糊精为保护剂时，经紫外灯照射后，悬浮剂的有效菌含量都显著高于空白对照。且考虑到糊精对其他助剂溶解度的影响，所以选用0.3％的用量。可见，以质量分数0.3％糊精为保护剂可显著提高铜绿假单胞菌抗紫外线能力。

表6

综合上述，本发明制备的铜绿假单胞菌悬浮剂优选后的组分用量为(％均为质量分数)：HZ15菌悬液10％(1×10⁹CUF/mL)、黄原胶0.1％、对羟基苯甲酸甲酯0.08％、糊精0.3％、甘油4％、NNO 0.5％、吐温80 0.5％、农乳600 0.5％，其余成分为水。

实施例2铜绿假单胞菌悬浮剂悬浮剂指标测定

1.指标测定方法

1.1浮率测定：按GB/T 14825-2006方法，测定悬浮率。

1.2pH值测定：pH测定按照GB/T 1601-1993农药pH值测定方法进行。

1.3起泡性：按照HG/T 2467.5-2003方法进行测定。

1.4有效活菌数和杂菌率：参照农用微生物菌剂GB 20287-2006中方法测定。

1.5倾倒性测定：参照GB/T 31737-2015方法进行测定。

1.6冷热贮稳定测定参照GB/T 19137-2003和GB/T 19136-2003中方向对悬浮剂在冷热环境下稳定性的测定。

采用上述方法对按照实施例1优选条件制备的铜绿假单胞菌悬浮剂的各项理化指标进行测定，如表7所示，制备的铜绿假单胞菌悬浮剂各项指标结果均符合国家相关标准：所制铜绿假单胞菌悬浮剂pH为6.5，杂菌率为1.3％，持久泡沫量(1min后)小于40mL，悬浮率可达94.61％，且分散性优异，倾倒后残余物的质量分数为0.39％，洗涤后残余物的质量分数为0.03％。

2.分别在4、28和42℃环境下按照国家标准相关操作保存悬浮剂，60d后对悬浮剂的有效活菌数进行检测，如图1所示，菌体活性都未受到较大影响，菌落数均高于标准(2.0×10⁹CFU/mL)。可见，本发明制备的铜绿假单胞菌悬浮剂能够降低保藏期间以及田间使用过程中高温或低温对铜绿假单胞菌活性和存活率的影响，冷热贮稳定性较好，有利于提高产品的使用效果。

表7

实施例3防治烟草黑胫病效果测定

1.平板对峙对烟草黑胫病病原菌的抑菌效果测定

采用平板对峙的方法对悬浮剂进行平板抑菌效果的测定，以不接拮抗菌作为空白对照，计算抑菌率，以铜绿假单胞菌HZ15菌悬液处理作为阳性对照。上述每组处理各设置3个重复。

如图2C所示，铜绿假单胞菌HZ15悬浮剂对烟草黑胫病病原菌的抑菌率可以达到81.1％，图2B所示，铜绿假单胞菌HZ15菌悬液对烟草黑胫病病原菌的抑菌率为77.8％。

2.室内盆栽对烟草黑胫病的防效测定

使用铜绿假单胞菌HZ15菌株悬浮剂经20倍稀释后取100mL对烟草植株进行灌根，48h后再接种烟草黑胫病病原体。以清水处理的盆栽苗为空白对照，以HZ15菌悬液(1×10⁸CUF/mL)和化学杀菌剂处理为阳性对照。上述处理14d后，按照烟草黑胫病分级标准调查病株数和发病级数，计算发病率、病情指数及防治效果。设置3个重复，每处理15盆烟苗。

病害分级标准：调查发病分级标准参考GB/T23222-2008进行。

如表8所示，在分别使用铜绿假单胞菌HZ15悬浮剂、铜绿假单胞菌HZ15菌悬液和68％精甲霜·锰锌对烟草植株进行灌根处理48h后接种烟草疫霉，14d后三者对烟草黑胫病的平均防治效果存在显著性差异。其中，铜绿假单胞菌悬浮剂对烟草黑胫病的防效最高，显著高于化学农药68％精甲霜·锰锌对烟草黑胫病的防效。

表8

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种铜绿假单胞菌悬浮剂，其特征在于，以重量分数计，包括以下组分：铜绿假单胞菌HZ15菌悬液8-12％、黄原胶0.1-0.15％、对羟基苯甲酸甲酯0.06-0.12％、糊精0.1-0.5％、甘油3-5％、NNO 0.5-1％、吐温80 0.5-1％、农乳600 0.5-1％，余量为水。

2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌悬浮剂，其特征在于，以重量分数计，包括以下组分：铜绿假单胞菌HZ15菌悬液10％、黄原胶0.1％、对羟基苯甲酸甲酯0.08％、糊精0.3％、甘油4％、NNO 0.5％、吐温80 0.5％、农乳600 0.5％，余量为水。

3.根据权利要求1-2任一项所述的铜绿假单胞菌悬浮剂，其特征在于，所述铜绿假单胞菌HZ15菌悬液中菌体浓度≥1×10⁹CUF/mL。

4.根据权利要求3所述的铜绿假单胞菌悬浮剂，其特征在于，所述铜绿假单胞菌HZ15菌悬液是通过将铜绿假单胞菌HZ15接种于YSP液体培养基上，在温度36℃、pH值为7的条件下培养12-24h，再用无菌水稀释后制得的。

5.一种权利要求1-2任一项所述的铜绿假单胞菌悬浮剂的制备方法，其特征在于，按照配比将组分混合均匀即为铜绿假单胞菌悬浮剂。

6.一种权利要求1-2任一项所述的铜绿假单胞菌悬浮剂在防治烟草黑胫病中的应用。

7.一种权利要求1-2任一项所述的铜绿假单胞菌悬浮剂在制备防治烟草黑胫病生物农药中的应用。