CN114588173A - 菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是菸花苷(山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷)或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的新用途。所述化合物对大鼠创伤性脑损伤具有明显保护作用，能够显著减轻伤后大鼠脑水肿程度，改善伤后行为功能，并能改善伤后一段时间内的运动、认知障碍等。因而以菸花苷为代表的该类化合物可用于制备防治创伤性脑损伤的药物。

Description

菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用。

背景技术

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)系外力作用于头部使颅骨、脑血管、脑组织等产生机械形变，多导致暂时或永久性神经功能障碍。其常见致伤原因包括交通事故、坠落或跌倒、暴力攻击等，在军事行动中的发生率往往更高。

TBI的病理进程主要包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段。原发性损伤由外力直接引起，可导致脑膜、括神经元胞体、白质结构和血管床的损害等。继发性损害发生时间较长，是指原发损伤触发的一系列生物化学变化，最终导致运动、认知、情绪、应激等一系列障碍。目前为止，TBI的主要治疗手段以止血、开颅减压、改善脑循环和抗感染等缓解特定症状为主，具体药物以甘露醇、神经营养因子和激素为主，存在药效较短、功能较单一且具有一定副作用的不足。因此，TBI的临床治疗亟需在综合运用多种手段的同时，充分利用TBI继发性损伤的时间窗通过有效药物进行防治，进而改善长期预后。

菸花苷，化学结构异名山柰酚-3-O-芸香糖苷(kaempferol-3-0-rutinoside)，结构式为：

分子式为C₂₇H₃₀O₁₅，为黄色针状结晶(MeOH)，分子量为594，能溶于乙酸乙酯、乙醇、甲醇。该化合物可由菊科植物红花属植物红花(Carthamus tinctorius)、银杏科植物银杏(Ginkgo biloba)、凤仙花科植物凤仙花(Impatiens balsamina)五加科植物异株五加(Acanthopanax sieboldianus)等植物中提取制得。据报道，具有镇痛及抗过敏活性。

我们前期研究表明，复脑素注射液是治疗急性脑卒中的原创性中药一类新药，临床试验批件号：CXZL0600074，CXZL0600073)，已获国家发明专利：复脑素在防治心脑血管疾病中的应用，专利号：ZL 01131942.9)。其对急性脑卒中有显著的治疗效果。

但菸花苷或其类似物对于创伤性脑损伤的防治作用，目前尚无报道。

发明内容

本发明的目的在于扩展菸花苷及其类似物的用途，将其用于制备防治创伤性脑损伤药物。本发明以菸花苷、6-羟基山柰酚和山柰酚-3-葡萄糖苷为例详细阐述，但保护范围不仅仅限于这三个化合物。

本发明人可提取到足够量的菸花苷及其类似物，基于脑水肿、神经功能损伤和血脑屏障破坏使TBI损伤急性期的主要表现，氧化应激和炎性浸润是创伤性脑损伤(TBI)继发损伤的主要途径，以及菸花苷及其类似物的相关活性，提出以该类化合物治疗创伤性脑损伤的设想，经系统药理和药效整体动物实验，取得了肯定的结果。

本发明用作药理和药效试验的化合物有菸花苷、6-羟基山柰酚、山柰酚-3-葡萄糖苷等，都取得了良好的效果，这些化合物均含有三羟基取代的母环山柰酚结构，化学结构通式如式I所示：

本发明选取富含山柰酚及其衍生物的亳州红花、合肥红花为原料。制备方法通常为：按常规将原料用极性溶剂提取，制备植物提取液的浓缩液，将浓缩液进行多种柱层析，然后以不同极性溶剂依次洗脱，收集各化合物的洗脱液，经纯化后进行浓缩干燥或重结晶，即可获得所需化合物。

本发明的第一方面，提供菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用。

进一步的，所述的创伤性脑损伤系外力作用于头部使颅骨、脑血管、脑组织等产生机械形变，多导致暂时或永久性神经功能障碍，包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段。

进一步的，所述的菸花苷或其类似物均含有三羟基取代的母环山柰酚结构，化学结构通式如式I所示：

进一步的，所述的菸花苷或其类似物的名称和R₁、R₂基团如表1所示。

表1菸花苷部分类似物化学结构式中R₁、R₂基团

进一步的，所述的菸花苷类似物为：山柰酚-3-芸香糖苷、山柰酚、6-羟基山柰酚、山柰酚-3-葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3-葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3，6-二葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3，6，7-三葡萄糖苷。

进一步的，所述的菸花苷或其类似物的制备方法：以富含山柰酚及其衍生物的亳州红花、合肥红花为原料，按常规将原料用极性溶剂提取，制备植物提取液的浓缩液，将浓缩液进行多种柱层析，然后以不同极性溶剂依次洗脱，收集各化合物的洗脱液，经纯化后进行浓缩干燥或重结晶，即可获得所需化合物。

进一步的，所述的防治创伤性脑损伤药物是由菸花苷或其类似物采用常规方法制备得到。本发明的化合物制成的药品，可使用本领域通常采用的任何制备方法，以达到对患者使用后，活性成分发挥最大药效的目的。

进一步的，所述的防治创伤性脑损伤药物为片剂、注射剂、悬浮液或溶液等。

进一步的，所述的防治创伤性脑损伤药物是将菸花苷或其类似物，与载体混合或用载体包埋，制成组合物。

进一步的，所述的载体可以是胶囊、或其他装载形式，载体可为固体、半固体或液体物质，作为菸花苷或其类似物的稀释剂、赋形剂或介质。

进一步的，所述的载体为乳糖、蔗糖、山梨糖、甘露醇、淀粉、聚乙二醇、明胶等。

进一步的，所述的防治创伤性脑损伤药物中还可以加入润滑剂、湿润剂、矫味剂、悬浮剂、防腐剂等辅料。

本发明的有益效果在于：

本发明研究发现，菸花苷及其类似物对于落重法致大鼠闭合性弥漫性TBI模型和开骨窗后液压打击致大鼠TBI模型，具有减轻脑水肿、改善大鼠血脑屏障泄露、改善神经功能损伤、降低脑组织内氧化应激和炎性因子水平等的作用，能够显著减轻伤后大鼠脑水肿程度，改善伤后行为功能，改善大鼠伤后学习记忆能力和自发活动受抑制程度，并能改善伤后一段时间内的运动、认知障碍等。因而以菸花苷为代表的该类化合物可用于制备防治创伤性脑损伤的药物。

附图说明

图1.A.FNS、HKL、KLG对TBI后大鼠神经行为评分的影响；B.FNS、HKL、KLG对TBI后大鼠脑水肿的影响；C.FNS、HKL、KLG对TBI后大鼠血脑屏障泄露的影响；#P<0.05,##P<0.01，###P<0.001v.s.Sham；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001v.s.TBI。

图2.FNS、HKL、KLG对TBI后大鼠脑组织中MDA、GPx、IL-1β水平的影响；##P<0.01，###P<0.001v.s.Sham；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001v.s.TBI。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：菸花苷及其类似物的制备

制备山柰酚、6-羟基山柰酚、山柰酚-3-葡萄糖苷、山柰酚-3-芸香糖苷、6-羟基山柰酚-3-葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3，6-二葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3，6，7-三葡萄糖苷。

合肥红花干燥药材35kg，各用117L 80％乙醇室温浸泡48小时，提取三次，合并提取液，减压回收乙醇，得浓缩液；按常规依次用石油醚、乙醚、水饱和正丁醇萃取，弃石油醚萃取部分，将乙醚和正丁醇萃取部分分别减压浓缩后逐一进行柱层析。

1、将乙醚萃取物进行硅胶柱层析，按常规以石油醚-乙酸乙酯(30：1—1：1)及氯仿-甲醇(10：1—1：1)溶剂系统洗脱(下同)，分别收集氯仿-甲醇8：1和5：1的洗脱液，并各用Sephadex LH-20柱纯化，再浓缩和重结晶，分别得山柰酚140mg，6-羟基山柰酚116mg；

2、将正丁醇萃取物过大孔树脂柱，依次以水、20％、50％、70％、95％乙醇洗脱，弃水洗脱液，分别收集不同浓度乙醇洗脱液。

(1)将20％乙醇洗脱液进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶剂系统洗脱，分别收集氯仿-甲醇6：1和4：1洗脱液，并各用Sephadex LH-20柱纯化，浓缩和重结晶，得山柰酚-3-葡萄糖苷1586mg，山柰酚-3-芸香糖苷3030mg；

(2)将50％乙醇洗脱液进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶剂系统洗脱，分别收集氯仿-甲醇5：1、3：1和2：1洗脱液，并各用Sephadex LH-20柱纯化，浓缩和重结晶，得6-羟基山柰酚-3-葡萄糖苷474mg、6-羟基山柰酚-3，6-二葡萄糖苷346mg、6-羟基山柰酚-3,6,7-三葡萄糖苷302mg。

上述化合物药理或药效学实验的方法基本相同，以下实施例以菸花苷(山柰酚-3-O-芸香糖苷，以下简称为FNS)，6-羟基山柰酚(简称HKL)和山柰酚-3-葡萄糖苷(简称KLG)为例详述。

实施例2：FNS、HKL、KLG对落重法致大鼠闭合性弥漫性脑损伤的保护作用

1、试验材料

1.1实验仪器

铁架台、PVC管、砝码。

1.2供试样品

戊巴比妥钠、0.9％生理盐水、FNS、HKL、KLG纯度均大于95.2％。配制：临用前将HKL、KLG溶于乙醇：吐温-80：H₂O为1：1：8的溶剂中待用。

2、试验动物

品系：雄性Wistar大鼠，260～290克

饲养：恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2℃。

3、分组及给药

84只大鼠随机分成7组，分别为：假手术组(1)、TBI组(2)、FNS-L(3)、FNS-M(4)、FNS-H(5)、KLH-H(6)、KLG-H(7)。其中(3)～(7)TBI造模后药物处理组，L、M、H对应的剂量分别为2.5、5.0、10.0mg/kg/d，模型组给予等体积生理盐水，给药体积均为1.0ml/kg，致伤后20min内尾静脉注射给药。下文中假手术组以Sham组代称。

4、试验方法

4.1TBI模型建立

大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，实验者用手将大鼠脑颅骨朝上固定于水平桌面上，将50g砝码沿PVC套管从80cm高度自由下落，垂直砸向大鼠大脑，制备闭合性颅脑损伤模型。致伤后大鼠立即产生大脑强直状态、呼吸抑制现象，提示模型成功。Sham组大鼠只行麻醉。

4.2脑含水量检测

分别在TBI后不同时间点将大鼠麻醉，而后快速断头取鼠大脑，在冰冷的操作台上迅速用刀片切除脑干和小脑，切取伤侧大脑半球，置于已称重的干燥小烧杯中，85℃下烘干72h至恒重，以干湿比法计算脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。

5、结果

大鼠TBI后第8h、第24h均可检测到显著脑水肿，且脑含水量在24h达到峰值，72h时无明显水肿。与模型组相比，给药组大鼠损伤后的脑水肿程度均有不同程度的降低，在TBI后第8h、第24h，FNS-M、FNS-H、HKL-H、KLG-H均能显著缓解大鼠脑水肿。提示相应剂量的化合物对落重法致大鼠闭合性弥漫性脑损伤具有保护作用(表2)。

表2各组大鼠伤侧脑组织含水量随时间变化(％)

(注：n＝10，

#P<0.05v.s.Sham，##P<0.01v.s.Sham；*P<0.05v.s.TBI，**P<0.01v.s.TBI)

实施例3：FNS、HKL、KLG对液压打击模型致大鼠脑损伤的保护作用

1、试验材料

1.1实验仪器

STRONG-90牙科钻，ALC-FP6液压打击仪(Alcott Biotech，上海)，保温加热垫，Tissuclyscr-48多样品组织研磨机(上海净信公司)，10S紫外分光光度计(ThermoFisherScientific)，Pico 17高速离心机(Thermo Fisher Scientific)。

1.2供试样品

伊文思蓝、甲酰胺(大连美仑生物技术有限公司)。

2、试验动物

同实施例2，动物数量依各部分实验所需。

3、分组及给药

同实施例2。

4、试验方法

4.1TBI模型建立

用戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧位固定于手术台的加热垫上。随后，使用动物剃毛器剪去头顶部毛发，酒精棉球消毒头皮。使用剪刀沿大鼠头正中线剪开长1.5-2.0cm的皮肤切口，分离骨膜，暴露颅骨。在其右侧颅顶冠状缝后2mm，矢状缝旁开2mm处，用牙科钻磨开一直径为3mm的圆形骨窗，保持硬脑膜的完整。将自制的打击管用牙科水泥(聚羧酸锌)粘接固定于圆形骨窗上，用加热、风干使其凝固。待打击管固定牢固后，用37℃生理盐水将打击管注满，将打击管与液压打击仪打击端连接，调整液压打击仪，使实际打击强度在2.0atm。打击后，去除打击管，皮肤消毒后缝合头皮，将大鼠放回笼中饲养。Sham组仅在麻醉后剪开头皮，分离骨膜，磨出骨窗，不进行液压打击，直接消毒缝合。

4.2神经功能评分

伤后3d内观察大鼠行为学变化，以独木桥实验进行mNSS神经行为学评分，标准为：0分，在木条上站稳，无摇晃(120s)；1分，在木条上站稳，左右摇晃，未滑下；2分，在木条上站立，下滑至一侧，未掉下；3分，在木条上站立不到2min；4分，试图在木条上站稳，但数秒即掉下；5分，无任何站立能力。

4.3脑含水量检测

在“实施例2”中测得TBI后脑水肿最显著的第24h将大鼠麻醉、断头取脑，其余操作同“实施例2”中“4.2”项。

4.4伊文思蓝含量检测

TBI后24h，大鼠处死前20min尾iv 2％伊文思蓝(EB)溶液4ml/kg，20min后以戊巴比妥麻醉，用止血钳、剪刀等手术器械快速打开大鼠胸腔，暴露心脏，夹闭腹主动脉，用0.9％生理盐水通过5ml输液器针头注入左心室，同时用眼科剪打开右心房，进行灌注。直至右心房流出液体清亮及肺脏变白后停止灌注。断头取伤侧脑组织，称质量，置于装有5ml甲酰胺的试管中剪碎，50℃孵育箱中孵育36h，离心，吸取提取液，在623nm处测定吸光度(A)值，绘制标准曲线，计算EB的脑内浓度。

4.5丙二醛含量、谷胱甘肽过氧化物酶活性和白介素1β的含量测定

TBI后24h将大鼠深度麻醉，依4.4中方法灌注取脑。所得新鲜伤侧脑组织按组织:匀浆液1:10mg/μl充分研磨，在4℃低温离心机中以12000g离心10min，取上清用于各项指标测定。用上海碧云天生物技术公司生产的试剂盒测定单位组织蛋白中丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性，大鼠IL-1β(IL-1β)酶联免疫吸附检测试剂盒。所有操作严格按照说明书步骤进行，蛋白浓度按照BCA方法进行检测，换算得到蛋白总量。MDA含量单位为nmol/mg蛋白，GPx活性单位为U/mg蛋白。

5、结果

给药组大鼠在mNSS评分上优于TBI组，特别损伤后24h，FNS-M、H，KLH-H和KLG-H治疗组大鼠的神经行为损伤得到显著改善，脑水肿程度显著降低。三种化合物高剂量治疗组大鼠TBI后血脑屏障泄露均显著减轻(图1)。此外，10.0mg/kg/d的FNS、HKL、KLG能够明显降低大鼠TBI后24h时脑组织内氧化应激和炎性因子水平(图2)。

以上试验结果说明菸花苷(FNS)及其类似物6-羟基山柰酚(HKL)和山柰酚-3-葡萄糖苷(KLG)等对液压打击所致创伤性脑损伤(TBI)具有脑保护作用，能够明显减轻伤后大鼠的脑水肿程度及神经功能损伤，显著改善血脑屏障破坏。此外，以上化合物能够明显降低伤后24h脑组织内氧化应激和关键炎性因子水平，从而有效减缓TBI继发损伤进程。因此，FNS及其类似物可用于制备预防和治疗脑损伤类疾病的药物。

进一步的研究还表明菸花苷及其类似物能够改善大鼠伤后学习记忆能力和自发活动受抑制程度等。

结论

综上所述，通过上述实验可证实，菸花苷及其类似物对落重法致大鼠闭合性弥漫性TBI以及液压打击模型所致大鼠TBI都有很好的防治作用，能够减轻伤急性期内大鼠创伤后脑水肿、改善大鼠血脑屏障泄露、改善神经功能损伤，并能够改善大鼠伤后学习记忆能力和自发活动受抑制程度等，说明菸花苷及其类似物可用于防治创伤性脑损伤、保护神经功能。

以上所述为本发明的较佳实例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以，凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。比如，菸花苷的类似物山柰酚及其其他衍生物等，由于他们起作用的活性基团主要是母核山柰酚，所以，只要是菸花苷的类似物，都在本发明的保护范围内。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用，其特征在于，所述的菸花苷或其类似物均含有三羟基取代的母环山柰酚结构，化学结构通式如式I所示：

3.根据权利要求2所述的菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用，其特征在于，所述的菸花苷或其类似物的名称和R₁、R₂基团如下：

编号 化合物名称 R₁ R₂ 1 山柰酚-3-O-芸香糖苷 葡糖鼠李糖基 氢 2 山柰酚-3-葡萄糖苷 葡萄糖基 氢 3 山柰酚-3-芸香糖苷 鼠李葡糖基 氢 4 山柰酚-3-葡糖鼠李糖苷 葡糖鼠李基 氢 5 山柰酚-3-鼠李糖苷 鼠李糖基 氢 6 山柰酚-3-阿拉伯糖苷 阿拉伯糖基 氢 7 山柰酚-3-半乳糖糖苷 半乳糖基 氢 8 山柰酚-3-木糖苷 木糖基 氢 9 山柰酚-3-葡萄糖醛酸酯 葡糖醛酸基 氢 10 山柰酚-3-香豆酰阿拉伯糖苷 香豆酰阿拉伯糖基 氢 11 山柰酚-3-阿魏酰阿拉伯糖苷 阿魏酰阿拉伯糖基 氢 12 山柰酚-3-(3,4,5-三羟)苯甲酰葡萄糖苷 3,4,5-三羟苯甲酰葡萄糖基 氢 13 山柰酚 氢 氢 14 6-羟基山柰酚 氢 羟基 15 6-羟基山柰酚-3-葡萄糖苷 葡萄糖基 羟基 16 6-羟基山柰酚-3，6-二葡萄糖苷 葡萄糖基 葡萄糖基 17 6-羟基山柰酚-3，6，7-三葡萄糖苷 葡萄糖基 6,7-葡萄糖基

。

4.根据权利要求1所述的菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用，其特征在于，所述的防治创伤性脑损伤药物为片剂、注射剂、悬浮液或溶液。

5.根据权利要求1所述的菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用，其特征在于，所述的防治创伤性脑损伤药物是将菸花苷或其类似物，与载体混合或用载体包埋，制成组合物。

6.根据权利要求5所述的菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用，其特征在于，所述的载体为乳糖、蔗糖、山梨糖、甘露醇、淀粉、聚乙二醇、明胶。

7.根据权利要求5所述的菸花苷或其类似物在制备防治创伤性脑损伤药物中的应用，其特征在于，所述的防治创伤性脑损伤药物中还可以加入润滑剂、湿润剂、矫味剂、悬浮剂、防腐剂。

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