CN114574447A

CN114574447A - Her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞、其制备方法及其应用

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Publication number: CN114574447A
Application number: CN202210236949.6A
Authority: CN
Inventors: 王媛媛; 王建刚; 韩倩; 王彦娜; 顾玉超; 吴明远
Original assignee: Kanglitai Biomedical Qingdao Co ltd; Ocean University of China
Current assignee: Kanglitai Biomedical Qingdao Co ltd; Ocean University of China
Priority date: 2022-03-10
Filing date: 2022-03-10
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2042-03-10
Also published as: CN114574447B

Abstract

本发明提出一种HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用，属于抗肿瘤细胞领域，能够解决现有的增强型NK细胞治疗杀伤活性不足，还需要加入外源IL‑12，对人体产生副反应的技术问题。该技术方案中的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞能够同时表达HER2和IL‑12，通过HER2靶向肿瘤细胞，并自分泌IL‑12增强抗肿瘤能力；HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞通过将IL‑12慢病毒和HER2‑CAR慢病毒共同感染NK‑92细胞，然后经过检测与鉴定试验制备得到。本发明能够应用于抗肿瘤药物制备方面，尤其是抗实体瘤药物制备。

Description

HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤细胞技术领域，尤其涉及一种HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用。

背景技术

HER2，又名ErbB2、NEU、CD340，其过度表达可导致细胞过度增殖和表型恶性转化。研究发现有30％的乳腺癌患者HER2基因过度表达，这类高表达的患者恶性程度高，易复发转移，鉴于HER2在正常细胞和肿瘤细胞中的表达水平有显著差异使其成为肿瘤免疫治疗的理想靶点。

近年来，基于NK细胞的CAR-NK疗法发展迅速，相较于CAR-T其具有先天独特的优势，比如，NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥极高的细胞杀伤活性，且不受主要组织相容性复合体(MHC)限制性；已报道的基于异体NK细胞的肿瘤免疫治疗均未见严重非可控移植物排斥宿主反应，表明异体NK细胞治疗的可行性；另外NK细胞相较于T细胞来说，更容易突破实体瘤的肿瘤微环境，对于实体瘤的治疗效果更显著。但是，CAR-NK细胞在进行治疗肿瘤时也存在一定缺陷，主要在于其在缺乏细胞因子信号的情况下，NK细胞无法扩增并增强其效应功能，缺乏抗肿瘤的持久性。

基于CAR-NK细胞存在的上述问题，研究发现白介素-12(简称IL-12)能激活NK细胞，促进其分泌γ-干扰素(IFN-γ)对肿瘤细胞进行杀伤，因此工程化HER2靶向的CAR-NK细胞组成性分泌IL-12是治疗实体瘤，增强NK持续杀伤效应的很好的策略。例如，专利申请WO2020051363A1公开了一种基于NK细胞的治疗组合物和方法，具体公开了采用IL-12靶向嵌合蛋白在体内或体外刺激NK细胞，促进NK细胞功能的方法，但是该方法的局限性在于IL-12体外刺激后除去IL-12再进行输注治疗，NK细胞的效果并不显著；而体内输注刺激时IL-12靶向嵌合蛋白可以依靠靶向作用到达肿瘤部位，但足够数量的NK细胞不一定能到达肿瘤的位置，进而导致治疗效果不显著。

因此，目前采用IL-12靶向嵌合蛋白刺激NK细胞的方式，其对增强肿瘤治疗效果并不显著，如何研发出一种能够直接靶向肿瘤进行杀伤作用的同时，杀伤效果显著且无需加入外源IL-12，从而避免全身注射所引起的副反应的增强型抗肿瘤NK细胞是解决上述问题的关键。

发明内容

本发明针对现有的增强型NK细胞治疗杀伤活性不足，还需要加入外源IL-12，对人体产生副反应的技术问题，提出一种HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞，能够同时表达HER2和IL-12，通过HER2靶向肿瘤细胞，并自分泌IL-12增强抗肿瘤能力；

所述HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞通过将IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒共同感染NK-92细胞，然后经过检测与鉴定试验制备得到。

在一实施方式中，所述IL-12慢病毒中包含人工合成的IL-12基因，所述人工合成的IL-12基因是将人的天然IL-12基因的p35亚基基因和p40亚基基因通过连接肽基因连接后得到，所述人工合成的IL-12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示；

所述HER2-CAR慢病毒包含人工合成的HER2-CAR基因，所述人工合成的HER2-CAR基因是将从NCBI数据库获得的人CD8α信号肽基因、靶向HER2单链抗体基因、人CD8α铰链区基因、人CD8α跨膜区基因、4-1BB的胞内区基因以及人CD3ζ胞内信号肽基因序列连接后经密码子优化得到，所述人工合成的HER2-CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一实施方式中，HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的HER2-CAR阳性率在5-85％之间，所述HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞稳定传代期间上清液中IL-12含量在1-10ng/ml之间，IFN-γ含量在1-10ng/ml之间。

本发明还提供了一种HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，包括以下步骤：

慢病毒表达载体构建：将人工合成的IL-12基因和人工合成的HER2-CAR基因分别连接到慢病毒载体质粒I和慢病毒载体质粒II上，构建得到IL-12慢病毒表达载体和HER2-CAR慢病毒表达载体；

慢病毒表达载体包装：将所述IL-12慢病毒表达载体和HER2-CAR慢病毒表达载体分别与包装质粒共转染293T细胞，培养一段时间后，再经收集、浓缩处理，得到IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒；

HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞构建与鉴定：培养传代NK-92细胞，将所述IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒分别按照一定的MOI值共同感染NK-92细胞，培养收集细胞，再经HER2-CAR阳性率检测、细胞因子含量检测以及体外杀伤试验鉴定后，最终得到所述HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞。

在一实施方式中，所述慢病毒载体质粒I和质粒II选自PGMLV质粒、lenti质粒、pCDH质粒、pLVX质粒或pRRLSIN质粒。

在一实施方式中，所述慢病毒表达载体包装步骤中，所述IL-12慢病毒的滴度为(1-10)×10⁸TU/ml，HER2-CAR慢病毒的滴度为(1-10)×10⁸TU/ml。

在一实施方式中，培养传代NK-92细胞、IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒共同感染NK-92细胞后的细胞培养所用培养基为完全培养基，培养条件均为于37℃，5％CO₂培养箱中，按照1.5×10⁵cell/ml密度培养2-3天传代一次；

其中，所述完全培养基包括以下组分：

Alpha MEM培养基、10％～15％马血清、10％～15％胎牛血清、0.1mMβ-巯基乙醇、0.02mM叶酸以及50-200U/ml IL-2。

在一实施方式中，所述完全培养基包括以下组分：

Alpha MEM培养基、12.5％马血清、12.5％胎牛血清、0.1mMβ-巯基乙醇、0.02mM叶酸以及100U/ml IL-2。

在一实施方式中，将所述IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒按照一定的MOI值共同感染NK-92细胞，其中，IL-12慢病毒的MOI值为10-40，HER2-CAR慢病毒的MOI值为20-200。

本发明还提供了一种HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明提出的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞，通过慢病毒介导的方法将IL-12基因和HER2-CAR基因导入NK-92细胞中获得HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞，再结合细胞阳性率、细胞因子含量检测以及体外杀伤试验鉴定后得到，该NK细胞能够在表达HRE2靶向的CAR同时自分泌IL-12，使得NK细胞可以直接靶向肿瘤进行杀伤，同时NK细胞识别自分泌IL-12促进其增殖和分泌杀伤因子增强对肿瘤的杀伤作用，从根本上解决了现有的增强型NK细胞治疗杀伤活性不足，还需要加入外源IL-12，对人体产生副反应的技术问题；

2、本发明提出的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法操作简单，利用该方法制备得到的NK细胞杀伤效果好、阳性率高，具体地，其HER2-CAR阳性率在5-85％之间，其在稳定传代期间上清液中IL-12含量在1-10ng/ml之间，IFN-γ含量在1-10ng/ml之间；

3、本发明提出的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞在抗肿瘤药物制备领域，尤其是抗实体瘤药物制备领域具备广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的人工合成的IL-12基因结构示意图；

图2为本发明实施例所提供的人工合成的HER2-CAR基因结构示意图；

图3为本发明实施例所提供的IL-12慢病毒表达载体图谱；

图4为本发明实施例所提供的HER2-CAR慢病毒表达载体图谱；

图5为本发明实施例所提供的NK92细胞和HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞的流式细胞检测结果示意图；

图6为本发明实施例所提供的HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞连续传代培养期间上清液中细胞因子IL-12和INF-γ的含量图；

图7为本发明实施例所提供的增强型抗肿瘤NK-92细胞对SK-BR3细胞的杀伤效果对比图；

图8为本发明实施例所提供的杀伤试验上清中IFN-γ含量测定结果示意图；

图9为本发明实施例所提供的HER2-CAR慢病毒MOI的筛选与确定实验中的流式细胞检测结果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞，能够同时表达HER2和IL-12，通过HER2靶向肿瘤细胞，并自分泌IL-12增强抗肿瘤能力；

在一具体实施方式中，所述IL-12慢病毒中包含人工合成的IL-12基因，所述人工合成的IL-12基因是将人的天然IL-12基因的p35亚基基因和p40亚基基因通过连接肽基因连接后得到，所述人工合成的IL-12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

在一具体实施方式中，HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的HER2-CAR阳性率在5-85％以上，所述HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞稳定传代期间上清液中IL-12含量在1-10ng/ml之间，IFN-γ含量在1-10ng/ml之间。

S1、慢病毒表达载体构建：将人工合成的IL-12基因和人工合成的HER2-CAR基因分别连接到慢病毒载体质粒I和慢病毒载体质粒II上，构建得到IL-12慢病毒表达载体和HER2-CAR慢病毒表达载体；

S2、慢病毒表达载体包装：将所述IL-12慢病毒表达载体和HER2-CAR慢病毒表达载体分别与包装质粒共转染293T细胞，培养一段时间后，再经收集、浓缩处理，得到IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒；

S3、HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞构建与鉴定：培养传代NK-92细胞，将所述IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒分别按照一定的MOI值共同感染NK-92细胞，培养收集细胞，再经HER2-CAR阳性率检测、细胞因子含量检测以及体外杀伤试验鉴定后，最终得到所述HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞。

在一具体实施方式中，所述慢病毒载体质粒I和质粒II选自PGMLV质粒、lenti质粒、pCDH质粒、pLVX质粒或pRRLSIN质粒。

在一具体实施方式中，所述慢病毒表达载体包装步骤中，所述IL-12慢病毒的滴度为(1-10)×10⁸TU/ml，HER2-CAR慢病毒的滴度为(1-10)×10⁸TU/ml。

在一具体实施方式中，培养传代NK-92细胞、IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒共同感染NK-92细胞后的细胞培养所用培养基为完全培养基，培养条件均为于37℃，5％CO₂培养箱中，按照1.5×10⁵cell/ml密度培养2-3天传代一次；

其中，所述完全培养基包括以下组分：

在一具体实施方式中，所述完全培养基包括以下组分：

在一具体实施方式中，将所述IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒按照一定的MOI值共同感染NK-92细胞，其中，IL-12慢病毒的MOI值为10-40，HER2-CAR慢病毒的MOI值为20-200。

本发明还提供了一种HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其应用于抗实体瘤药物制备中。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

本实施例提供了HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法中的慢病毒表达载体的构建步骤，具体为：

(1)IL-12基因的合成：根据NCBI网站数据库检索结果，将天然的IL-12基因的P35亚基基因和P40亚基基因通过连接肽基因连接获得的IL-12基因，即IL-12P40 leader-IL-12P40-2A-IL-12P35，其基因结构示意图如图1所示，IL-12基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该连接过程是委托基因合成公司按照基因工程常规方法合成获得；

(2)HER2-CAR基因的合成：从NCBI网站数据库检索到的人CD8α信号肽基因、靶向HER2单链抗体基因、人CD8α铰链区基因、人CD8α跨膜区基因、4-1BB的胞内区基因、人CD3ζ胞内信号肽基因的序列信息，将这些基因连接后进行密码子优化，全合成基因序列得到HER2-CAR基因，即CD8αleader-HER2-scFv-CD8αHinge-CD8α-TM-4-1BB-CD3ζ，其基因结构示意图如图2所示，该HER2-CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，该连接过程是委托基因合成公司按照基因工程常规方法合成获得；

(3)慢病毒表达载体的构建：将人工合成IL-12基因连接到PGMLV质粒(Genomeditech公司)上，构建得到IL-12慢病毒表达载体，即PGMLV-IL-12；将人工合成HER2-CAR基因后连接到lenti质粒(Genomeditech公司)上，构建得到HER2-CAR慢病毒表达载体，即lenti-HER2-CAR。该连接过程是委托基因合成公司按照基因工程常规方法合成获得，质粒图谱如图3-4所示。

实施例2

本实施例提供了HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法中的慢病毒的包装和滴度的测定步骤，具体为：

(1)293T细胞培养：慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞；

(2)质粒转染：转染前一天，将细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到70％-80％时准备转染。转染前1-2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，12ml/10cm皿，取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管，慢病毒表达质粒为PGMLV-IL-12和lenti-HER2-CAR，分别单独包装，转染体系见表1：

表1转染体系

混匀后，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO₂培养箱中培养，转染10-12h后，均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染，100μl/皿；

转染18-20h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml新鲜的细胞培养基继续培养。

(3)病毒收集浓缩：换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，4500g离心5min，上清液用0.22μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到浓缩装置中，4℃，4500g，离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃，4500g，离心20min，此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液，将病毒分装后保存于-80℃。

(4)滴度的测定：

将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含10％FBS的细胞培养基。细胞胰酶消化计数后，按照每孔2×10⁵细胞接种12孔板，37℃培养过夜，感染时细胞长至20-40％的融合密度；感染前1-2h将需要感染的细胞换成新鲜的培养基，0.91ml每孔，聚凝胺(polybrene)浓度为1μg/ml。第二天，对12孔板当天转染时，将保存于-80℃冰箱中慢病毒液冰浴融化，用含有10％FBS的细胞培养基进行10倍梯度稀释：选取所需的细胞孔，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，取90μl加入每孔细胞中，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养，采用已知滴度的病毒作为对照病毒。第三天，去除含慢病毒的培养液，加入1ml的完全培养基；4天后，抽提RNA做RT-qPCR。加入不同病毒量的细胞样品，通过比较对照组标准曲线和试验组的Ct值差异判断滴度值。

测定结果表明：本实施例慢病毒包装均可获得滴度约为1×10⁸TU/ml的IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒。

实施例3

本实施例提供了HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法中的增强型抗肿瘤NK-92细胞的构建步骤，具体为：

(1)培养基

NK-92细胞采用完全培养基，其包括以下组分：

Alpha MEM培养基、12.5％马血清、12.5％胎牛血清、0.1mMβ-巯基乙醇、0.02mM叶酸以及100U/ml IL-2；

(2)构建步骤

慢病毒的感染：NK-92细胞采用完全培养基，按照1.5×10⁵cell/ml密度2-3天传代一次，37℃，5％CO₂培养箱中培养，离心收集NK-92细胞，配制5×10⁵cell/ml的细胞悬液，24孔板中每孔加入200ul细胞悬液，分别设置空白孔(NK-92细胞)、对照孔(HER2-CAR慢病毒单独感染NK-92细胞)和实验孔(IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒共同感染NK-92细胞)，将保存于-80℃冰箱中的慢病毒液冰浴融化，在实验孔中分别按照MOI＝20加入IL-12慢病毒20ul和按照MOI＝100加入HER2-CAR慢病毒100ul，在对照孔中加入HER2-CAR慢病毒100ul，空白孔加入完全培养基100ul，混匀后于37℃，5％CO₂培养箱中培养1-2h，然后补加完全培养基至1ml，并按照终浓度8ug/ml加入聚凝胺(polybrene)。24h后补加完全培养基1ml，48h和day4后分别更换新鲜培养基按照上述传代方法对细胞进行传代培养。对照孔和试验孔中慢病毒感染后的细胞分别命名为HER2-CAR-NK-92细胞和HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞。

实施例4

本实施例提供了HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的流式细胞术检测，具体为：

(1)收集慢病毒感染48h的HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞，并将未进行感染的NK-92细胞作为阴性对照；

(2)清洗细胞：采用预冷的0.1％BSA-PBS将细胞清洗1遍，4℃，1800rpm离心8min，弃掉上清；

(2)染色及孵育：加入100ul的0.1％BSA-PBS重悬细胞，加入FITC-Labeled HumanHer2 Protein(ACRO公司)5ul混匀，4℃避光孵育15min；

(4)洗涤：加入0.1％BSA-PBS清洗2遍，1800rpm离心8min，弃掉上清后加入200μl0.1％BSA-PBS重悬细胞；

(5)流式细胞仪上机检测。

检测结果参见图5：从图5所示结果可知，采用慢病毒感染48h的HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞阳性率可高达40％，远高于本领域常见NK细胞的20％左右，利于后期阳性细胞分选。

实施例5

本实施例提供了HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的细胞因子的ELISA检测，具体为：

将慢病毒感染后的NK-92、HER2-CAR-NK-92和HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞采用完全培养基(Alpha MEM培养基+12.5％马血清+12.5％胎牛血清+0.1mMβ-巯基乙醇+0.02mM叶酸+100U/ml IL-2)，按照1.5×10⁵cell/ml密度每2天传代一次，传代前收集上清冻存于-20℃用于检测IL-12和IFN-γ的含量，实验流程根据试剂盒Human IL-12(P70)PrecoatedELISA Kit(达科为；1111202)和Human IFN-γ Precoated ELISA Kit(达科为；1111002)说明书操作。

具体操作步骤如下：

(1)在预包被的酶标板中加入100ul Cytokine standard至标准品孔、100ul的样品至样品孔，100ul的Dilution buffer R(1×)至空白对照孔，然后每孔加入50ul的Biotinylated antibody，混匀后盖上封板膜，室温孵育2-3h；

(2)去除孔内液体，加入300ul 1×Washing buffer后，弃去孔内液体，重复4次。每孔加入100ul Streptavidin-HRP，盖上封板膜，室温孵育20min；

(3)去除孔内液体，加入300ul 1×Washing buffer后，弃去孔内液体，重复4次。每孔加入100ul TMB，室温避光孵育，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)加入100ul Stopsolution终止反应；

(4)终止后10min之内，使用MD SpectraMax M2酶标仪选择波长450nm进行读数并处理数据。

检测结果参见图6：从图6所示结果可知，NK-92细和HER2-CAR-NK-92培养上清中IL-12和IFN-γ的含量低于试剂盒的检测下限(几乎不表达)，HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞传代期间上清液中的IL-12含量平均值为1.79ng/ml，IFN-γ含量平均值为8.72ng/ml，该检测结果进一步证明了HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞构建成功且具有增强型抗肿瘤的潜能。

实施例6

本实施例提供了HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的体外细胞杀伤试验，具体为：

(1)靶细胞选择：

SK-BR3细胞，即人乳腺腺癌细胞，该细胞贴壁生长，且高表达HER2基因。Calceinacetoxymethy1酯(Calcein-AM，钙黄绿素)是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共育，离心清洗细胞后荧光显微镜拍照观察杀伤效果。

(2)体外细胞杀伤试验：

(2-1)靶细胞SK-BR3的标记：采用索莱宝公司(货号CA1630)《Calcein-AM_PI活细胞_死细胞双染试剂盒》中的Calcein-AM，参照说明书，配制清洗缓冲液和染色工作液。SK-BR-3细胞胰酶消化后用清洗缓冲液充分清洗细胞2次以充分去除残留的酯酶活性，然后制备密度约为1×10⁶cell/ml细胞悬液。取100μl染色工作液加入200μl细胞悬液内，混匀，37℃水浴孵育30min，标记后用清洗缓冲液清洗细胞2遍以去除多余的染色液。

(2-2)效-靶细胞作用：平底96孔培养板中，加入1×10⁵cell/ml SK-BR3靶细胞100μl，按E/T比例10/1加入效应细胞100μl/孔，并设置SK-BR3靶细胞对照孔。效应细胞分为三个组，分别为NK-92组、HER2-CAR-NK-92组、HER2-CAR-IL-12-NK-92组。

(2-3)96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱孵育过夜后，1500rpm，5min后收集上清，用于IFN-γ的含量检测，细胞用PBS清洗2遍后轻轻震荡混匀后荧光显微镜下拍照观察。

实验结果：杀伤活性结果如图7所示，HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞对SK-BR3细胞的杀伤活性最显著，明显高于HER2-CAR-NK-92和NK-92细胞。杀伤试验上清中IFN-γ含量如图8所示，HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞组(9333.7pg/ml)远高于HER2-CAR-NK-92组(28.2pg/ml)和NK-92细胞(7.8pg/ml)，间接证明了HER2-CAR-IL-12-NK-92细胞对肿瘤的杀伤潜能。

实施例7

本发明对IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒MOI值进行了筛选试验，具体如下：

(1)IL-12慢病毒MOI的筛选与确定

为了确定IL-12慢病毒的MOI的范围共进行了两次瞬时感染实验，具体地：

实验一：离心收集NK-92细胞，用完全培养基稀释接种于96孔板中；根据接种的细胞数量和不同的MOI值(0、10、20、40、80)加入不同体积的IL-12慢病毒，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；48h后更换新鲜的完全培养基0.5ml并观察细胞生长状态，再培养72h后收集培养上清。

实验二：离心收集NK-92细胞，用完全培养基稀释接种于24孔板中；根据接种的细胞数量和不同的MOI值(0、2、5、10)加入不同体积的IL-12慢病毒，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；48h后更换新鲜的完全培养基2ml并观察细胞生长状态，再培养72h后收集培养上清，其中，培养上清中IFN-γ和IL-12的含量检测方法同实施例5。

实验结果：IL-12慢病毒瞬时感染NK-92细胞培养上清中IL-12和IFN-γ的浓度数据如表2所示：

表2IL-12慢病毒感染NK-92细胞培养上清中IL-12和IFN-γ的浓度

由表2中数据可知，随着MOI的增加，IL-12的表达量呈梯度增加，但IFN-γ的量无明显梯度变化，推测原因是IL-12的量刺激NK-92细胞产生IFN-γ是过饱和的状态。另外通过光学显微镜观察发现，过高的MOI值(＞40)加入慢病毒对细胞的生长状态也会有影响(如NK-92散细胞较多，结团松散)，也会间接影响IFN-γ的表达。因此根据细胞生长状态和IL-12的表达量共同确定MOI的范围为10-40。

(二)HER2-CAR慢病毒MOI的筛选与确定

采用不同HER2-CAR慢病毒的MOI进行了两次实验，即分别根据接种的细胞数量和不同的MOI值(0、20、100、200)加入不同体积的CAR-NK慢病毒，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；48h-72h后观察细胞状态并收集细胞进行流式细胞仪检测，检测方法同实施例4。

实验结果：如图9所示，随着MOI的增加，CAR-NK阳性细胞率也随之增加，显微镜下观察细胞状态无明显差异。MOI＝20即可获得阳性的HER-CAR细胞，但高的CAR阳性细胞率更有利于后期分选和治疗，因此，确定HER2-CAR慢病毒MOI的范围为20-200。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国海洋大学；康立泰生物医药（青岛）有限公司

<120> HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用

<130> 20220112

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工合成的IL-12基因核苷酸序列

<400> 1

gccaccatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt tctggcatct 60

cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg tcgtagaatt ggattggtat 120

ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga agatggtatc 180

acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg gcaaaaccct gaccatccaa 240

gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga ggttctaagc 300

cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt ggtccactga tattttaaag 360

gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg aggccaagaa ttattctgga 420

cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt tgacattcag tgtcaaaagc 480

agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag ctgctacact ctctgcagag 540

agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga ggacagtgcc 600

tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt tcacaagctc 660

aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc tgacccaccc 720

aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag ctgggagtac 780

cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt tcaggtccag 840

ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc agccacggtc 900

atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg accgctacta tagctcatct 960

tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagg ggcggaggcg gaagcggagg cggaggaagc 1020

ggcggtggcg gcagcagaaa cctccccgtg gccactccag acccaggaat gttcccatgc 1080

cttcaccact cccaaaacct gctgagggcc gtcagcaaca tgctccagaa ggccagacaa 1140

actctagaat tttacccttg cacttctgaa gagattgatc atgaagatat cacaaaagat 1200

aaaaccagca cagtggaggc ctgtttacca ttggaattaa ccaagaatga gagttgccta 1260

aattccagag agacctcttt cataactaat gggagttgcc tggcctccag aaagacctct 1320

tttatgatgg ccctgtgcct tagtagtatt tatgaagact tgaagatgta ccaggtggag 1380

ttcaagacca tgaatgcaaa gcttctgatg gatcctaaga ggcagatctt tctagatcaa 1440

aacatgctgg cagttattga tgagctgatg caggccctga atttcaacag tgagactgtg 1500

ccacaaaaat cctcccttga agaaccggat ttttataaaa ctaaaatcaa gctctgcata 1560

cttcttcatg ctttcagaat tcgggcagtg actattgata gagtgatgag ctatctgaat 1620

gcttcctaa 1629

<210> 2

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工合成的IL-12基因氨基酸序列

<400> 2

Ala Thr Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val

1 5 10 15

Phe Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val

20 25 30

Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val

35 40 45

Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu

50 55 60

Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln

65 70 75 80

Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly

85 90 95

Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly

100 105 110

Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys

115 120 125

Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys

130 135 140

Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser

145 150 155 160

Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr

165 170 175

Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser

180 185 190

Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu

195 200 205

Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn

210 215 220

Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro

225 230 235 240

Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val

245 250 255

Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser

260 265 270

Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys

275 280 285

Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys

290 295 300

Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser

305 310 315 320

Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly

325 330 335

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr

340 345 350

Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu

355 360 365

Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe

370 375 380

Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp

385 390 395 400

Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn

405 410 415

Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser

420 425 430

Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser

435 440 445

Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met

450 455 460

Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln

465 470 475 480

Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn

485 490 495

Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr

500 505 510

Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg

515 520 525

Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser

530 535 540

<210> 3

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工合成HER2-CAR基因的核苷酸序列

<400> 3

gccaccatgg ctctgcccgt gaccgccctg ctgctccctc tggccctgct cctgcacgcc 60

gctagacccg acatccagat gacccagagc cccagcagcc tgtcagcttc tgtgggcgac 120

agagtgacaa tcacctgcag agcctcccag gacgtgaaca ccgccgtggc ctggtaccag 180

cagaaacctg gcaaagcccc caagctgctg atctacagcg ccagcttcct gtacagcggc 240

gtgcctagcc ggttctccgg cagcagaagc ggaacagatt ttacactgac catcagcagc 300

ctacagcctg aagacttcgc cacatactac tgccagcaac actacaccac ccctcctaca 360

ttcggccagg gcaccaaggt ggaaatcaag ggcggaggcg gatctggagg cggcggctct 420

ggcggaggag gctccgaggt gcagctggtt gagagcggcg gaggcctggt gcagcctggc 480

ggatctctga gactgagctg cgccgccagc ggatttaaca tcaaggacac atacatccac 540

tgggtgcggc aggccccagg aaagggcctg gaatgggtcg ccagaatcta tcctactaac 600

ggctacacca gatacgccga cagcgtcaag ggtagattta ccattagcgc cgacaccagc 660

aagaacacag cctacctgca aatgaacagc ctgcgggctg aagataccgc cgtgtactac 720

tgtagcagat ggggagggga tggcttctac gccatggact actggggcca aggaaccctg 780

gtgaccgtgt ccagcaccac aacccctgcc cctagacctc caacaccggc tcctaccatc 840

gccagccagc ccctgagcct gcggcctgag gcctgcagac ctgctgctgg cggcgccgtg 900

cacaccagag gcctggactt cgcctgcgac atttacatct gggcccctct ggccggcacc 960

tgtggcgtgc tgctgctgag cctggttatc acactgtact gcaatcacag aaacaagaga 1020

ggccggaaaa agctgctgta catcttcaag cagcccttca tgcggccagt gcagaccacg 1080

caggaggaag atggctgtag ctgccggttc cccgaggaag aggaaggcgg ctgcgagctg 1140

cgcgtgaaat tcagcaggtc cgccgatgcc cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg 1200

tataatgagc tgaacctggg cagacgcgag gaatacgacg tgctggacaa gagaaggggc 1260

agagatcctg agatgggcgg caagcctaga cggaagaatc ctcaggaggg cctgtacaac 1320

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tatagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1380

agacggggca agggccacga cggcctgtac caaggcctgt ctaccgccac caaagataca 1440

tacgacgctc tgcatatgca ggctctgccc cccagataa 1479

<210> 4

<211> 542

<212> PRT

<213> 人工合成HER2-CAR基因的氨基酸序列

<400> 4

Ala Thr Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

20 25 30

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp

165 170 175

Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His

325 330 335

Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

340 345 350

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

355 360 365

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

Claims

1.HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，能够同时表达HER2和IL-12，通过HER2靶向肿瘤细胞，并自分泌IL-12增强抗肿瘤能力；

2.根据权利要求1所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，所述IL-12慢病毒中包含人工合成的IL-12基因，所述人工合成的IL-12基因是将人的天然IL-12基因的p35亚基基因和p40亚基基因通过连接肽基因连接后得到，所述人工合成的IL-12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3.根据权利要求1所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，其HER2-CAR阳性率在5％～85％之间，所述HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞稳定传代期间上清液中IL-12含量在1-10ng/ml之间，IFN-γ含量在1～10ng/ml之间。

4.根据权利要求1-3所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒载体质粒I和质粒II选自PGMLV质粒、lenti质粒、pCDH质粒、pLVX质粒或pRRLSIN质粒。

6.根据权利要求4所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体包装步骤中，所述IL-12慢病毒的滴度为(1-10)×10⁸TU/ml，HER2-CAR慢病毒的滴度为(1-10)×10⁸TU/ml。

7.根据权利要求4所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，培养传代NK-92细胞、IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒共同感染NK-92细胞后的细胞培养所用培养基为完全培养基，培养条件均为于37℃，5％CO₂培养箱中，按照1.5×10⁵cell/ml密度培养2-3天传代一次；

其中，所述完全培养基包括以下组分：

8.根据权利要求7所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，所述完全培养基包括以下组分：

9.根据权利要求4所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，将所述IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒按照一定的MOI值共同感染NK-92细胞，其中，IL-12慢病毒的MOI值为10-40，HER2-CAR慢病毒的MOI值为20-200。

10.如权利要求1-3中任一项所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。