CN114561311A - 一种胞外转运视黄醛和视黄醇的酿酒酵母菌株构建及其应用 - Google Patents

一种胞外转运视黄醛和视黄醇的酿酒酵母菌株构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胞外转运视黄醛和视黄醇的酿酒酵母菌株构建及其应用，属于发酵工程技术领域。本发明构建了一株强化视黄醛和视黄醇分泌能力的重组酿酒酵母菌株，所述重组酿酒酵母强化表达了3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶、异戊烯基焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶、内质网大小调节因子INO2和ABC转运蛋白Pdr10；异源表达香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、15‑顺式八氢番茄红素合酶、双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶、15、15’‑加双氧酶；敲除酿酒酵母中的ROX1和GAL80基因；并且下调角鲨烯合酶ERG9的表达；对其进行摇瓶发酵时，该菌株胞外视黄醛、视黄醇含量分别达到43.50mg/L和16.84mg/L，视黄醛和视黄醇总含量为73.40mg/L，因此具有广阔的应用前景。

Description

一种胞外转运视黄醛和视黄醇的酿酒酵母菌株构建及其应用
技术领域
本发明涉及一种胞外转运视黄醛和视黄醇的酿酒酵母菌株构建及其应用，属于发酵工程技术领域。
背景技术
作为发酵工业常用的公认安全(GRAS)的微生物，酿酒酵母(S.cerevisiae)具有培养简单、易于遗传操作、鲁棒性强等诸多优点。因为其具有的甲羟戊酸(MVA)途径可以为萜类化合物提供前体，因此酿酒酵母是众多萜类化合物异源合成的优良平台。
视黄醛和视黄醇是二萜类维生素A化合物，由一个环状基团和一个带有亲水端基的线性链组成，在化妆品制造、维持人体健康等方面发挥着关键作用。目前的研究表明，在大肠杆菌(E.coli)和S.cerevisiae中引入异源合成途径可实现对视黄醛和视黄醇的生产。同时，向培养基中添加有机萃取剂(如十二烷)，在发酵过程中对视黄醛和视黄醇进行原位萃取，可以有效促进视黄醛和视黄醇的分泌并提高其总产量。这表明通过工程化改造提高生产菌株的分泌能力可能是提高视黄醛和视黄醇产量的一个有效策略。然而，目前视黄醛和视黄醇分泌的具体机制尚不明确，因此如何促进它们的高效分泌并且提高产量是现有研究面临的一大挑战。
发明内容
为了探究视黄醛和视黄醇分泌的具体机制，提高生产菌株对它们的分泌能力，并促进视黄醛和视黄醇的产量提高，本发明提供了一种重组酿酒酵母菌株，所述重组酿酒酵母通过基因重组，所述重组酿酒酵母强化表达了截短3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、法尼基焦磷酸合酶ERG20、内质网大小调节因子INO2、ABC转运蛋白Pdr10；异源表达了香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE、八氢番茄红素脱氢酶CrtI、15-顺式八氢番茄红素合酶CrtB、双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶CrtYB、15、15’-加双氧酶BCMO；敲除了麦角甾醇生物合成(ERG)基因的转录抑制因子ROX1和半乳糖/乳糖代谢调节蛋白GAL80；并且下调角鲨烯合酶ERG9的表达。
在本发明的一种实施方式中，所述下调烯合酶ERG9的表达是指通过将PERG9天然启动子更换为PHXT1启动子下调角鲨烯合酶ERG9的表达。
在本发明的一种实施方式中，所述重组酿酒酵母通过PGPD启动子强化表达tHMG1，通过PPGK1启动子强化表达INO2，通过PTEF1启动子强化表达ERG20和IDI1并异源表达CrtB，通过PGAL1,10双向启动子异源表达CrtI和CrtE，通过PGAL7启动子异源表达CrtYB和BCMO，通过PTDH3启动子强化表达Pdr10，通过PHXT1启动子弱化表达ERG9。
在本发明的一种实施方式中，所述强化表达，是指在酿酒酵母BY 4741基因组上强化表达了2个拷贝数的tHMG1、1个拷贝数的IDI1、1个拷贝数的ERG20，并且强化表达了1个拷贝数的INO2和1个拷贝数的Pdr10。所述异源表达，是指在酿酒酵母BY 4741基因组上表达2个拷贝数的CrtE、2个拷贝数的CrtI、1个拷贝数的CrtB、1个拷贝数的CrtYB和1个拷贝数的BCMO。
在本发明的一种实施方式中，以酿酒酵母BY 4741为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述tHMG1的Gene ID为42650、所述IDI1的Gene ID为855986、所述ERG20的Gene ID为853272、所述INO2的Gene ID为851701、所述ROX1的GeneID为856178、所述Pdr10的Gene ID为854506、所述CrtE的Gene ID为45505274、所述CrtI的Gene ID为37729024、所述CrtB的Gene ID为429485116、所述CrtYB的GenBank号为ALK24266.1、所述BCMO的Gene ID为67527050、所述GAL80的Gene ID为854954、所述ERG9的Gene ID为856597。
在本发明的一种实施方式中，所述重组酿酒酵母通过基因重组为：将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1整合至酿酒酵母基因组上的ROX1酶位点；及整合至酿酒酵母基因组上的ERG20位点，所述ERG20位点的Gene ID为853272；
将异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1整合至酿酒酵母基因组上的911b位点，该位点位于第9号染色体，引导序列为GTAATATTGTCTTGTTTCCC；
将PTEF1启动子强化表达的法尼基焦磷酸合酶ERG20整合至酿酒酵母基因组上的ERG20位点，所述ERG20位点的Gene ID为853272；
将酿酒酵母基因组上的内质网大小调节因子INO2的天然启动子替换为PPGK1启动子，所述INO2位点的Gene ID为851701；
将ABC转运蛋白Pdr10整合至酿酒酵母基因组上的208a位点，该位点位于第2号染色体，引导序列为GTCCGCTAAACAAAAGATCT；
将Taxus x media来源的香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE整合至酿酒酵母基因组上的308a位点，该位点位于第3号染色体，引导序列为CACTTGTCAAACAGAATATA及整合至416d位点，该位点位于第4号染色体，引导序列为TAGTGCACTTACCCCACGTT；
将Blakeslea trispora来源的八氢番茄红素脱氢酶CrtI整合至酿酒酵母基因组上的308a位点，该位点位于第3号染色体，引导序列为CACTTGTCAAACAGAATATA及整合至416d位点，该位点位于第4号染色体，引导序列为TAGTGCACTTACCCCACGTT；
将Pantoea agglomerans来源的15-顺式八氢番茄红素合酶CrtB整合至酿酒酵母基因组上的ERG9位点启动子上游，所述ERG9位点的Gene ID为856597；
将Phaffia rhodozyma来源的双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶CrtYB整合至酿酒酵母基因组上的1309a位点，该位点位于第13号染色体，引导序列为CCTGTGGTGACTACGTATCC；
将海洋细菌66A03来源的15,15’-加双氧酶BCMO整合至酿酒酵母基因组上的1014a位点，该位点位于第10号染色体，引导序列为TTATGTGCGTATTGCTTTCA；
同时，敲除了麦角甾醇生物合成(ERG)基因的转录抑制因子ROX1和半乳糖/乳糖代谢调节蛋白GAL80；并且通过将PERG9天然启动子更换为PHXT1启动子下调角鲨烯合酶ERG9的表达。
本发明还提供了上述重组酿酒酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)敲除BY4741基因组上的编码ROX1酶的基因，并将PGPD-tHMG1-TADH1片段整合到BY4741基因组上(即基因组上的ROX1酶位点)，构建得到BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1，命名为酿酒酵母Y1；
(2)将PTEF1-IDI1-TCYC1片段整合至Y1菌株基因组上(整合至911b位点，该位点位于第9号染色体，引导序列为GTAATATTGTCTTGTTTCCC)，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1，命名为酿酒酵母Y2；
(3)将PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1片段整合至Y2菌株基因组上(整合至ERG20位点，所述ERG20位点的Gene ID为853272)，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1，命名为酿酒酵母Y3；
(4)将PPGK1-INO2-TINO2片段整合至Y3菌株基因组上(整合至INO2位点，所述INO2位点的Gene ID为851701)，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2，命名为酿酒酵母Y4；
(5)将PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1整合至Y4菌株基因组上替换ERG9的天然启动子(整合至ERG9位点上游，所述ERG9位点的Gene ID为856597)，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9，命名为酿酒酵母Y4L1；
(6)将TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1整合至Y4L1菌株基因组上(整合至308a位点，该位点位于第3号染色体，引导序列为CACTTGTCAAACAGAATATA)，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1，命名为酿酒酵母Y4L2；
(7)敲除Y4L2基因组上的编码GAL80酶的基因，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1，命名为酿酒酵母Y4L3；
(8)将TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1整合至Y4L3菌株基因组上(整合至416d位点，该位点位于第4号染色体，引导序列为TAGTGCACTTACCCCACGTT)，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1，命名为酿酒酵母Y4L4；
(9)将PGAL7-CrtYB-TCYC1整合至Y4L4菌株基因组上(整合至1309a位点，该位点位于第13号染色体，引导序列为CCTGTGGTGACTACGTATCC)，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-PGAL7-CrtYB-TCYC1，命名为酿酒酵母Y4C；
(10)将PGAL7-BCMO-TAOX1整合至Y4C菌株基因组上(整合至1014a位点，该位点位于第10号染色体，引导序列为TTATGTGCGTATTGCTTTCA)，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-PGAL7-CrtYB-TCYC1-PGAL7-BCMO-TAOX1，命名为酿酒酵母Y4R；
(11)将PTDH3-PDR10-TCYC1片段整合至Y4R菌株基因组上(整合至208a位点，该位点位于第2号染色体，引导序列为GTCCGCTAAACAAAAGATCT)，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-PGAL7-CrtYB-TCYC1-PGAL7-BCMO-TAOX1-PTDH3-PDR10-TCYC1，命名为酿酒酵母Y4RZ4；
本发明还提供了一种制备视黄醛和视黄醇的方法，采用上述重组酿酒酵母发酵制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将重组酿酒酵母接种至种子培养基，制备得到种子液，将制备得到的种子液以2％～4％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，并向发酵培养基中添加初始培养基10％体积的正十二烷作为萃取剂，发酵培养，制备得到视黄醛和视黄醇。
在本发明的一种实施方式中，将所述的重组酿酒酵母接种至SD-Trp-His培养基中，于30℃，220rpm条件下，培养16-24h，得到种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述SD-Trp-His培养基每升组分包括：尿嘧啶50mg，亮氨酸50mg、无氨基酵母氮源(YNB)6.7g，无水葡萄糖20g。
在本发明的一种实施方式中，将制备得到的种子液以2％～4％(v/v)的接种量接入发酵培养基(含初始培养基10％体积的正十二烷)，在30℃，220rpm条件下培养84～96h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每升组分包括：大豆蛋白胨50g，无水葡萄糖25g，蔗糖25g，甘油25g，K2HPO4 0.6g。
本发明还提供了一种ABC转运蛋白Pdr10在提高重组酿酒酵母制备视黄醛和视黄醇产量中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述ABC转运蛋白Pdr10的Gene ID为854506。
在本发明的一种实施方式中，所述重组酿酒酵母的构建方法如上述所示。
本发明还提供了一种提高酿酒酵母胞外分泌视黄醛和视黄醇的方法，所述方法为：在酿酒酵母中通过基因重组，强化表达了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、法尼基焦磷酸合酶ERG20、内质网大小调节因子INO2、ABC转运蛋白Pdr10；异源表达了香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE、八氢番茄红素脱氢酶CrtI、15-顺式八氢番茄红素合酶CrtB、双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶CrtYB、15,15’-加双氧酶BCMO；敲除了麦角甾醇生物合成(ERG)基因的转录抑制因子ROX1和半乳糖/乳糖代谢调节蛋白GAL80；并且通过将PERG9天然启动子更换为PHXT1启动子下调菌株生长后期角鲨烯合酶ERG9的表达。
在本发明的一种实施方式中，通过PGPD启动子强化表达tHMG1，通过PPGK1启动子强化表达INO2，通过PTEF1启动子强化表达ERG20和IDI1并异源表达CrtB，通过PGAL1,10双向启动子异源表达CrtI和CrtE，通过PGAL7启动子异源表达CrtYB和BCMO，通过PTDH3启动子强化表达Pdr10，通过PHXT1启动子弱化表达ERG9。
在本发明的一种实施方式中，所述tHMG1的Gene ID为42650、所述IDI1的Gene ID为855986、所述ERG20的Gene ID为853272、所述INO2的Gene ID为851701、所述ROX1的GeneID为856178、所述Pdr10蛋白的Gene ID为854506、所述CrtE的Gene ID为45505274、所述CrtI的Gene ID为37729024、所述CrtB的Gene ID为429485116、所述CrtYB的GenBank号为ALK24266.1、所述BCMO的Gene ID为67527050、所述GAL80的Gene ID为854954、所述ERG9的Gene ID为856597。
在本发明的一种实施方式中，所述重组酿酒酵母通过基因重组为：将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1整合至酿酒酵母基因组上的ROX1酶位点；
将异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1整合至酿酒酵母基因组上的911b位点，该位点位于第9号染色体，引导序列为GTAATATTGTCTTGTTTCCC；
将法尼基焦磷酸合酶ERG20整合至酿酒酵母基因组上的ERG20位点；
将内质网大小调节因子INO2整合至酿酒酵母基因组上的INO2位点，所述INO2位点的Gene ID为851701；
将ABC转运蛋白Pdr10整合至酿酒酵母基因组上的208a位点，该位点位于第2号染色体，引导序列为GTCCGCTAAACAAAAGATCT；
将Taxus x media来源的香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE整合至酿酒酵母基因组上的308a位点，该位点位于第3号染色体，引导序列为CACTTGTCAAACAGAATATA及整合至416d位点，该位点位于第4号染色体，引导序列为TAGTGCACTTACCCCACGTT；
将Blakeslea trispora来源的八氢番茄红素脱氢酶CrtI整合至酿酒酵母基因组上的308a位点，该位点位于第3号染色体，引导序列为CACTTGTCAAACAGAATATA及整合至416d位点，该位点位于第4号染色体，引导序列为TAGTGCACTTACCCCACGTT；
将Pantoea agglomerans来源的15-顺式八氢番茄红素合酶CrtB整合至酿酒酵母基因组上的PERG9位点，所述PERG9位点的Gene ID为856597；
将Phaffia rhodozyma来源的双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶CrtYB整合至酿酒酵母基因组上的1309a位点，该位点位于第13号染色体，引导序列为CCTGTGGTGACTACGTATCC；
将海洋细菌66A03来源的15,15’-加双氧酶BCMO整合至酿酒酵母基因组上的1014a位点，该位点位于第10号染色体，引导序列为TTATGTGCGTATTGCTTTCA；
同时，敲除了麦角甾醇生物合成(ERG)基因的转录抑制因子ROX1和半乳糖/乳糖代谢调节蛋白GAL80；并且通过将ERG9天然启动子更换为HXT1启动子下调角鲨烯合酶ERG9的表达。
本发明还提供了上述重组酿酒酵母，或上述方法在制备含有视黄醛和视黄醇产品中的应用。
有益效果
本发明构建了一株可向胞外高效转运视黄醛和视黄醇的重组S.cerevisiae菌株Y4RZ4，利用其进行250mL摇瓶双相发酵时，视黄醛总产量达到53.89mg/L(分泌量43.50mg/L)，视黄醇总产量达到19.50mg/L(分泌量16.84mg/L)。在该菌株中，通过过表达Pdr10转运蛋白，将视黄醛和视黄醇的总分泌量和总产量分别提高至对照Y4R菌株的2.24和2.21倍，减少了视黄醛和视黄醇胞内储存带来的细胞毒性、代谢负担和反馈抑制；由本发明构建的重组菌株具有更强的视黄醛和视黄醇胞外分泌能力和更高的产量，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：不同重组酿酒酵母的视黄醛和视黄醇胞外分泌量(mg/L)及反应结束后的生物量(OD600)。
图2：不同重组酿酒酵母的视黄醛和视黄醇总产量(mg/L)。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的BY4741菌株购自北京华越洋生物。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：每升含10g胰蛋白胨、10g NaCl和5g酵母提取物。
SD His培养基：每升含尿嘧啶50mg，色氨酸50mg，亮氨酸50mg，无氨基酵母氮源6.7g，无水葡萄糖20g。
SD-Trp-His培养基：每升含尿嘧啶50mg，亮氨酸50mg，无氨基酵母氮源6.7g，无水葡萄糖20g。
发酵培养基：每升含大豆蛋白胨50g，无水葡萄糖25g，蔗糖25g，甘油25g，K2HPO40.6g。
SD-Trp平板：YNB培养基6.7g/L，葡萄糖20g/L，L-亮氨酸50mg/L，L-组氨酸50mg/L，尿嘧啶50mg/L，琼脂粉20g/L。
SD-Leu平板：YNB培养基6.7g/L，葡萄糖20g/L，L-色氨酸50mg/L，L-组氨酸50mg/L，尿嘧啶50mg/L，琼脂粉20g/L。
SD-Trp-Leu平板：YNB培养基6.7g/L，葡萄糖20g/L，L-组氨酸50mg/L，尿嘧啶50mg/L，琼脂粉20g/L。
YPD固体平板：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1.5％琼脂粉。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
视黄醛、视黄醇含量的检测：
将发酵后的菌液离心，把位于上层的十二烷吸出，用滤膜过滤进入液相瓶；将剩余菌体和培养基摇匀后加入破碎管中，并加入等体积的乙酸乙酯作为萃取相，使用玻璃珠研磨破碎细胞，离心后将上层的乙酸乙酯吸出，适当比例稀释后用滤膜过滤进入液相瓶；使用安捷伦1200液相色谱仪和赛默飞C18 ODS色谱柱在352nm波长处对视黄醛和视黄醇产量进行检测，流动相成分为5％HPLC级乙腈和95％HPLC级甲醇，检测柱温20℃，流速为0.8mL·min-1；其中高效液相色谱(HPLC)条件为：使用Agilent 1260进行高效液相色谱检测，色谱柱为C18 ODS(5μm,250×4.6mm,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。流动相：5％HPLC级乙腈和95％HPLC级甲醇，流速0.8mL·min-1，柱温20℃，波长为352nm，进样体积为10μL。
重组酿酒酵母OD600的检测方法：
将培养16-24h的酵母种子液按1％的接种量接种于装有25mL发酵培养基和2.5mL十二烷的250mL摇瓶中，置于30℃，220rpm培养。取样时按适当比例稀释后使用紫外分光光度计测量OD600。
下述实施例中所涉及质粒的构建在E.coli JM109中进行，质粒构建完成后作为模板扩增表达框，同时扩增整合位点上下游同源臂和两端含有LoxP位点的营养缺陷型标记，转化到角鲨烯高产菌株中进行Pdr10的过表达。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：
表1：引物序列
Figure BDA0003568079100000061
Figure BDA0003568079100000071
Figure BDA0003568079100000081
实施例1：构建酿酒酵母菌株Y1
具体步骤如下：
(1)片段的合成：
人工合成基因片段PGPD-tHMG1-TADH1(序列记载于公开号为：CN 113684141 A的发明专利中)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物ROX1-UP-F、ROX1-UP-R扩增得到基因片段ROX1-UP；
用引物ROX1-DOWN-F、ROX1-DOWN-R扩增得到基因片段ROX1-DOWN；
以质粒pMHyLp-His(序列记载于公开号为：CN 113684141 A的发明专利中)为模板，采用引物ROX1-loxH-F、ROX1-loxH-R扩增得到ROX1-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PGPD-tHMG1-TADH1、ROX1-UP、ROX1-DOWN、ROX1-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有ROX1上下游同源臂的融合基因片段ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1。
(3)将步骤(2)中的融合基因片段转化入酿酒酵母BY4741菌株感受态中，在SD His平板上于30℃培养2-3天，使用表1所述的引物YZ-tHMG1-F、YZ-tHMG1-R进行单菌落PCR验证。挑选条带正确的单菌落，得到菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-His。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre(序列记载于公开号为：CN 113684141 A的发明专利中)质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-FOA的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1，命名为酿酒酵母Y1。
实施例2：构建酿酒酵母菌株Y2
(1)人工合成基因片段PTEF1-IDI1-TCYC1(序列记载于公开号为：CN 113684141 A的发明专利中)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用如表1所示的引物序列，用引物911b-UP-F、911b-UP-R扩增得到基因片段911b-UP；
用引物911b-DOWN-F、911b-DOWN-R扩增得到基因片段911b-DOWN；
以质粒pMHyLp-His为模板，采用引物IDI1-loxH-F、IDI1-loxH-R扩增得到IDI1-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PTEF1-IDI1-TCYC1、911b-UP、911b-DOWN、IDI1-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有911b上下游同源臂的融合基因片段911b-PTEF1-IDI1-TCYC1。
(3)将步骤(2)中的基因片段转化入实施例1制备得到的Y1菌株感受态中，在SDHis平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-IDI1-F、YZ-IDI1-R进行单菌落PCR验证。挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y1-PTEF1-IDI1-TCYC1-His。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-FOA的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1，命名为酿酒酵母Y2。
实施例3：构建酿酒酵母菌株Y3
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1(序列记载于公开号为：CN 113684141 A的发明专利中)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物ERG20-UP-F、ERG20-UP-R扩增得到基因片段ERG20-UP；
用引物ERG20-DOWN-F、ERG20-DOWN-R扩增得到基因片段ERG20-DOWN；
以质粒pMHyLp-His为模板，采用引物ERG20-loxH-F、ERG20-loxH-R扩增得到ERG20-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1、ERG20-UP、ERG20-DOWN、ERG20-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有ERG20上下游同源臂的融合基因片段ΔERG20-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例2制备得到的Y2菌株的感受态中，在SD His平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-ERG20-F、YZ-ERG20-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y2-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-His。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1，命名为酿酒酵母Y3。
实施例4：构建酿酒酵母菌株Y4
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PPGK1-INO2-TINO2(序列记载于公开号为：CN 113684141 A的发明专利中)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物INO2-UP-F、INO2-UP-R扩增得到基因片段INO2-UP；
用引物INO2-DOWN-F、INO2-DOWN-R扩增得到基因片段INO2-DOWN；
以质粒pMHyLp-His为模板，采用引物INO2-loxH-F、INO2-loxH-R扩增得到INO2-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PPGK1-INO2-TINO2、INO2-UP、INO2-DOWN、INO2-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有INO2上下游同源臂的融合基因片段ΔPINO2-PPGK1-INO2-TINO2；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例3制备得到的Y3菌株的感受态中，在SD His平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-INO2-F、YZ-INO2-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y3-PPGK1-INO2-TINO2-His。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2，命名为酿酒酵母Y4。
实施例5：构建酿酒酵母菌株Y4L1
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物PERG9-UP-F、PERG9-UP-R扩增得到基因片段PERG9-UP；
用引物PERG9-DOWN-F、PERG9-DOWN-R扩增得到基因片段PERG9-DOWN；
以质粒pMHyLp-Trp(该质粒将pMHyLp-His质粒上207-2068位的His-LoxP序列替换为Trp-LoxP序列，Trp-LoxP核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为模板，采用引物PERG9-loxT-F、PERG9-loxT-R扩增得到PERG9-Trp片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1、PERG9-UP、PERG9-DOWN、PERG9-Trp采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有PERG9上下游同源臂的融合基因片段ΔPERG9-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例4制备得到的Y4菌株的感受态中，在SD Trp平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-CrtB-F、YZ-CrtB-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y4-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-Trp。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD Trp、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9，命名为酿酒酵母Y4L1。
实施例6：构建酿酒酵母菌株Y4L2
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物308a-UP-F、308a-UP-R扩增得到基因片段308a-UP；
用引物308a-DOWN-F、308a-DOWN-R扩增得到基因片段308a-DOWN；
以质粒pMHyLp-Leu(该质粒将pMHyLp-His质粒上207-2068位的His-LoxP序列替换为Leu-LoxP序列，Leu-LoxP核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)为模板，采用引物308a-loxL-F、308a-loxL-R扩增得到308a-Leu片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1、308a-UP、308a-DOWN、308a-Leu采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有308a上下游同源臂的融合基因片段308a-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例5制备得到的Y4L1菌株的感受态中，在SD Leu平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-CrtEI-1F、YZ-CrtEI-1R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y4L1-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-Leu。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD Leu、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1，命名为酿酒酵母Y4L2。
实施例7：构建酿酒酵母菌株Y4L3
具体步骤如下：
(1)以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物GAL80-UP-F、GAL80-UP-R扩增得到基因片段GAL80-UP；
用引物GAL80-DOWN-F、GAL80-DOWN-R扩增得到基因片段GAL80-DOWN；
以质粒pMHyLp-His为模板，采用引物GAL80-loxH-F、GAL80-loxH-R扩增得到GAL80-His片段。
(2)将步骤(1)中的三个片段GAL80-UP、GAL80-DOWN、GAL80-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有GAL80上下游同源臂的融合基因片段ΔGAL80。
(3)将步骤(2)中的融合基因片段转化入实施例6制备得到的Y4L2菌株的感受态中，在SD His平板上于30℃培养2-3天，使用表1所述的引物YZ-ΔGAL80-F、YZ-ΔGAL80-R进行单菌落PCR验证。挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y4L2ΔGAL80-His。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有含有浓度为1mg/mL的5-FOA的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1，命名为酿酒酵母Y4L3。
实施例8：构建酿酒酵母菌株Y4L4
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物416d-UP-F、416d-UP-R扩增得到基因片段416d-UP；
用引物416d-DOWN-F、416d-DOWN-R扩增得到基因片段416d-DOWN；
以质粒pMHyLp-His为模板，采用引物416d-loxH-F、416d-loxH-R扩增得到416d-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1、416d-UP、416d-DOWN、416d-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有416d上下游同源臂的融合基因片段416d-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例7制备得到的Y4L3菌株的感受态中，在SD His平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-CrtEI-1F、YZ-CrtEI-2R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y4L3-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-His。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1，命名为酿酒酵母Y4L4。
实施例9：构建酿酒酵母菌株Y4C
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PGAL7-CrtYB-TCYC1(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物1309a-UP-F、1309a-UP-R扩增得到基因片段1309a-UP；
用引物1309a-DOWN-F、1309a-DOWN-R扩增得到基因片段1309a-DOWN；
以质粒pMHyLp-Leu为模板，采用引物1309a-loxL-F、1309a-loxL-R扩增得到1309a-Leu片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PGAL7-CrtYB-TCYC1、1309a-UP、1309a-DOWN、1309a-Leu采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有1309a上下游同源臂的融合基因片段1309a-PGAL7-CrtYB-TCYC1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例8制备得到的Y4L4菌株的感受态中，在SD Leu平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-CrtYB-F、YZ-CrtYB-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y4L4-PGAL7-CrtYB-TCYC1-Leu。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD Leu、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-PGAL7-CrtYB-TCYC1，命名为酿酒酵母Y4C。
实施例10：构建酿酒酵母菌株Y4R
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PGAL7-BCMO-TAOX1(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物1014a-UP-F、1014a-UP-R扩增得到基因片段1014a-UP；
用引物1014a-DOWN-F、1014a-DOWN-R扩增得到基因片段1014a-DOWN；
以质粒pMHyLp-His为模板，采用引物1014a-loxH-F、1014a-loxH-R扩增得到1014a-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PGAL7-BCMO-TAOX1、1014a-UP、1014a-DOWN、1014a-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有1014a上下游同源臂的融合基因片段1014a-PGAL7-BCMO-TAOX1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例9制备得到的Y4C菌株的感受态中，在SD His平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-BCMO-F、YZ-BCMO-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y4C-PGAL7-BCMO-TAOX1-His。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-PGAL7-CrtYB-TCYC1-PGAL7-BCMO-TAOX1，命名为酿酒酵母Y4R。
实施例11：构建酿酒酵母菌株Y4RZ4
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PTDH3-PDR10-TCYC1(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物208a-UP-F、208a-UP-R扩增得到基因片段208a-UP；
用引物208a-DOWN-F、208a-DOWN-R扩增得到基因片段208a-DOWN；
以质粒pMHyLp-Trp为模板，采用引物208a-loxT-F、208a-loxT-R扩增得到208a-Trp片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PTDH3-PDR10-TCYC1、208a-UP、208a-DOWN、208a-Trp采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到含有208a上下游同源臂的融合基因片段208a-PTDH3-PDR10-TCYC1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例10制备得到的Y4R菌株的感受态中，在SD Trp平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-PDR10-F、YZ-PDR10-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y4R-PTDH3-PDR10-TCYC1-Trp。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入pY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD Trp、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-△GAL80-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-IDI1-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-PTEF1-CrtB-TCYC1-PHXT1-ERG9-TERG9-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-TCYC1-CrtI-PGAL1,10-CrtE-TADH1-PGAL7-CrtYB-TCYC1-PGAL7-BCMO-TAOX1-PTDH3-PDR10-TCYC1，命名为酿酒酵母Y4RZ4。
实施例12：不同的转运蛋白得到的重组菌株
具体实施方式同实施例1～11，区别在于，分别将实施例11中的PDR10转运蛋白更新为PDR5(NCBI上的Gene ID为854324)、SNQ2(NCBI上的Gene ID为851574)和YOR1转运蛋白(NCBI上的Gene ID为853198)，引物序列如表1所示。
分别制备得到酿酒酵母Y4RZ1、Y4RZ2、Y4RZ3。
实施例13：摇瓶发酵条件下重组菌株的视黄醛、视黄醇产量
具体步骤如下：
(1)分别将上述重组酿酒酵母菌株Y4R、Y4RZ1、Y4RZ2、Y4RZ3、Y4RZ4在30℃，220rpm条件下培养16～24h，制备得到种子液，将制备得到的种子液按2％(v/v)的接种量接种于装有25mL发酵培养基和2.5mL十二烷的250mL锥形瓶，在30℃，220rpm条件下培养96h，制备得到发酵液。
(2)计算胞外视黄醛、视黄醇的产量：
将发酵液离心后吸净上层十二烷，经滤膜过滤于液相进样瓶，进行高效液相色谱检测，通过与视黄醛、视黄醇标品峰面积进行换算得出工程菌株发酵产量。将吸净十二烷的发酵液重悬，吸取发酵液稀释100倍后使用紫外分光光度计测量OD600。
结果如表2及图1所示，过表达Pdr10蛋白的Y4RZ4菌株胞外十二烷中视黄醛、视黄醇含量分别达到43.50mg/L和16.84mg/L，OD600达到85.66。
表2：不同重组酿酒酵母胞外分泌视黄醛、视黄醇产量及反应结束后的OD600
菌株 胞外视黄醛(mg/L) 胞外视黄醇(mg/L) OD<sub>600</sub>
Y4R 12.99 13.92 80.88
Y4RZ1 42.05 12.23 93.18
Y4RZ2 39.36 18.58 91.54
Y4RZ3 19.28 21.44 78.50
Y4RZ4 43.50 16.84 85.66
(3)计算胞内视黄醛、视黄醇的产量：
吸取600μL重悬发酵液，使用等量去离子水洗涤并重悬后，与600μL乙酸乙酯和适量直径0.5mm玻璃珠放入破碎管，使用全细胞研磨仪破碎细胞。离心后吸取乙酸乙酯，适当稀释后经滤膜过滤于液相进样瓶，进行高效液相色谱检测，通过与视黄醛、视黄醇标品峰面积进行换算得出工程菌株发酵产量，结果如表3及图2所示。
表3：不同重组酿酒酵母胞内视黄醛、视黄醇产量及视黄醛和视黄醇的总产量
Figure BDA0003568079100000141
结果显示，Y4RZ4菌株胞内视黄醛、视黄醇含量分别为10.40mg/L和2.66mg/L，胞内外视黄醛和视黄醇总含量为73.40mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种胞外转运视黄醛和视黄醇的酿酒酵母菌株构建及其应用
<130> BAA220188A
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2667
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60
tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120
tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180
tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240
tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg 300
tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc 360
ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt tatggaagtt ggttctaaat 420
cttttgctac tgcttctaaa ttgtttgatg ctaaaactag aagatctgtt ttgatgttgt 480
atgcttggtg tagacattgt gatgatgtta ttgatgatca agttttgggt ttttctaatg 540
atactccatc tttgcaatct gctgaacaaa gattggctca attggaaatg aaaactagac 600
aagcttatgc tggttctcaa atgcacgaac ctgcttttgc tgcttttcaa gaagttgcta 660
tggctcatga tattttgcct gcttatgctt ttgatcattt ggctggtttt gctatggatg 720
ttcatgaaac tagatatcaa actttggatg atactttgag atattgttat catgttgctg 780
gtgttgttgg tttgatgatg gctcaaatta tgggtgttag agataatgct actttggata 840
gagcttgtga tttgggtttg gcttttcaat tgactaatat tgctagagat attgttgaag 900
atgctgaagc tggtagatgt tatttgcctg ctgcttggtt ggctgaagaa ggtttgacta 960
gagaaaattt ggctgatcca caaaatagaa aagctttgtc tagagttgct agaagattag 1020
ttgaaactgc tgaaccatat tatagatctg cttctgctgg tttgcctggt ttgccattga 1080
gatctgcttg ggctattgct actgctcaac aagtttatag aaaaattggt atgaaagttg 1140
ttcaagctgg ttctcaagct tgggaacaaa gacaatctac ttctactcct gaaaaattgg 1200
ctttgttggt tgctgcttct ggtcaagctg ttacttcaag agttgcaaga cacgctccaa 1260
gatctgctga tttgtggcaa agacctgttt aatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca 1320
ttcacgccct ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt 1380
ctaggtccct atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca 1440
aatttttctt ttttttctgt acagacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt 1500
gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc ggcctgcagg tctcatctgg 1560
aatataattc ccccctcctg aagcaaattt ttcctttgag ccggaatttt tgatattccg 1620
agttcttttt ttccattcgc ggaggttatt ccattcctaa acgagtggcc acaatgaaac 1680
ttcaattcat atcgaccgac tatttttctc cgaaccaaaa aaatagcagg gcgagattgg 1740
agctgcggaa aaaagaggaa aaaatttttt cgtagttttc ttgtgcaaat tagggtgtaa 1800
ggtttctagg gcttattggt tcaagcagaa gagacaacaa ttgtaggtcc taaattcaag 1860
gcggatgtaa ggagtattgg tttcgaaagt ttttccgaag cggcatggca gggactactt 1920
gcgcatgcgc tcggattatc ttcatttttg cttgcaaaaa cgtagaatca tggtaaatta 1980
catgaagaat tctctttttt tttttttttt tttttttttt acctctaaag agtgttgacc 2040
aactgaaaaa acccttcttc aagagagtta aactaagact aaccatcata acttccaagg 2100
aattaatcga tatcttgcac tcctgatttt tcttcaaaga gacagcgcaa aggattatga 2160
cactgttgca ttgagtcaaa agtttttccg aagtgaccca gtgctctttt tttttttccg 2220
tgaaggactg acaaatatgc gcacaagatc caatacgtaa tggaaattcg gaaaaactag 2280
gaagaaatgc tgcagggcat tgccgtgccg atcttttgtc tttcagatat atgagaaaaa 2340
gaatattcat caagtgctga tagaagaata ccactcatat gacgtgggca gaagacagca 2400
aacgtaaaca tgagctgctg cgacatttga tggcttttat ccgacaagcc aggaaactcc 2460
accattatct aatgtagcaa aatatttctt aacacccgaa gttgcgtgtc cccctcacgt 2520
ttttaatcat ttgaattagt atattgaaat tatatataaa ggcaacaatg tccccataat 2580
caattccatc tggggtctca tgttctttcc ccaccttaaa atctataaag atatcataat 2640
cgtcaactag ttgatatacg taaaatc 2667
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cgacattact atatatataa tataggaagc atttaataga cagcatcgta atatatgtgt 240
actttgcagt tatgacgcca gatggcagta gtggaagata ttctttattg aaaaatagct 300
tgtcacctta cgtacaatct tgatccggag cttttctttt tttgccgatt aagaattaat 360
tcggtcgaaa aaagaaaagg agagggccaa gagggagggc attggtgact attgagcacg 420
tgagtatacg tgattaagca cacaaaggca gcttggagta tgtctgttat taatttcaca 480
ggtagttctg gtccattggt gaaagtttgc ggcttgcaga gcacagaggc cgcagaatgt 540
gctctagatt ccgatgctga cttgctgggt attatatgtg tgcccaatag aaagagaaca 600
attgacccgg ttattgcaag gaaaatttca agtcttgtaa aagcatataa aaatagttca 660
ggcactccga aatacttggt tggcgtgttt cgtaatcaac ctaaggagga tgttttggct 720
ctggtcaatg attacggcat tgatatcgtc caactgcatg gagatgagtc gtggcaagaa 780
taccaagagt tcctcggttt gccagttatt aaaagactcg tatttccaaa agactgcaac 840
atactactca gtgcagcttc acagaaacct cattcgttta ttcccttgtt tgattcagaa 900
gcaggtggga caggtgaact tttggattgg aactcgattt ctgactgggt tggaaggcaa 960
gagagccccg aaagcttaca ttttatgtta gctggtggac tgacgccaga aaatgttggt 1020
gatgcgctta gattaaatgg cgttattggt gttgatgtaa gcggaggtgt ggagacaaat 1080
ggtgtaaaag actctaacaa aatagcaaat ttcgtcaaaa atgctaagaa atagggtacc 1140
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aactataaaa aaataaatag ggacctagac ttcaggttgt ctaactcctt ccttttcggt 180
tagagcggat cttagctagc cgcggtacca agcttactcg aggtcttctt cggaaatcaa 240
cttctgttcc atgtcgactc agattctgat gtcgttggag ttttgaactt ggaaaacgtt 300
tggcaacaat tggttaatga aggaagcagg agtggtagtg tcatcacgtg ggaagaaata 360
aaagaaaagg aaagtgacga agtaacaagc caaacagtag taaatccagt gagactcagt 420
ctttctggtt tgttctgggg cgtatttttt ttgagaatct tgcaactttc ttggcaatgg 480
gttttgaccg aaagacttac agacttggtc agaagtcaac ttagaaccag ccaagacgat 540
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caagatggaa ccacgccaga gattgaactt agattgccag acagatgggt cgttaacttc 720
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aaccatcttt ctagctctgt taaccaattc tggataattt tcttcagcag agttaccggt 840
ttttgatttc atgtgaccaa tcgggaccaa aacgatgatg gaatccttgt ttggtggagc 900
ggcggattcg tcaattctgg aaggaacatt gacatagaag gaagcttcag atggcaaacc 960
gaaatcgttg aaaatttcat cgaagctttc cttgtaggct tcagccaaga agatgttgtg 1020
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ttggtatcta aattcagcac cgtacttctt ggaagcaata gattccaact tttggacgac 1320
catgttgaaa ccacctcttg ggtaccagat accttcggca aattcggtgt attgcaatag 1380
agagtagaca gctggagcat cgtatggaga catacccatg tacatggttt ggaaagtgaa 1440
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gtggtgaata aaagaacaac gaccaccgga gaagtcgttc ttttcaacga cggtaactct 1920
gaaaccttct ctggccaatc tagcagcagt ggcagtacca ccaataccgg caccgataac 1980
aactatgtgc ttcttttgat cggacatgga tccggggttt tttctccttg acgttaaagt 2040
atagaggtat attaacaatt ttttgttgat acttttatta catttgaata agaagtaata 2100
caaaccgaaa atgttgaaag tattagttaa agtggttatg cagtttttgc atttatatat 2160
ctgttaatag atcaaaaatc atcgcttcgc tgattaatta ccccagaaat aaggctaaaa 2220
aactaatcgc attatcatcc tatggttgtt aatttgattc gttcatttga aggtttgtgg 2280
ggccaggtta ctgccaattt ttcctcttca taaccataaa agctagtatt gtagaatctt 2340
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<212> DNA
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<212> DNA
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ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct 5460
atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt 5520
ttttttctgt acagacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag 5580
gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc ggcc 5614

Claims (10)

1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母通过基因重组，强化表达了截短3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、法尼基焦磷酸合酶ERG20、内质网大小调节因子INO2、ABC转运蛋白Pdr10；并异源表达了Taxus x media来源的香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE、Blakeslea trispora来源的八氢番茄红素脱氢酶CrtI、Pantoea agglomerans来源的15-顺式八氢番茄红素合酶CrtB、Phaffia rhodozyma来源的双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶CrtYB和海洋细菌66A03来源的15,15’-加双氧酶BCMO；同时敲除了麦角甾醇生物合成(ERG)基因的转录抑制因子ROX1和半乳糖/乳糖代谢调节蛋白GAL80；并且下调角鲨烯合酶ERG9的表达。
2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母通过PGPD启动子强化表达tHMG1，通过PPGK1启动子强化表达INO2，通过PTEF1启动子强化表达ERG20和IDI1并异源表达CrtB，通过PGAL1,10双向启动子异源表达CrtI和CrtE，通过PGAL7启动子异源表达CrtYB和BCMO，通过PTDH3启动子强化表达Pdr10，通过将PERG9天然启动子更换为PHXT1启动子弱化表达ERG9。
3.如权利要求1或2所述的重组酿酒酵母，其特征在于，以酿酒酵母BY 4741为出发菌株。
4.如权利要求1～3任一所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述tHMG1的Gene ID为42650，所述IDI1的Gene ID为855986，所述ERG20的Gene ID为853272，所述INO2的Gene ID为851701，所述ROX1的Gene ID为856178，所述Pdr10蛋白的Gene ID为854506，所述CrtE的Gene ID为45505274，所述CrtI的Gene ID为37729024，所述CrtB的Gene ID为429485116，所述CrtYB的GenBank号为ALK24266.1，所述BCMO的Gene ID为67527050，所述GAL80的Gene ID为854954，所述ERG9的Gene ID为856597。
5.一种制备视黄醛和视黄醇的方法，其特征在于，采用权利要求1～4任一所述的重组酿酒酵母发酵制备得到。
6.ABC转运蛋白Pdr10在提高重组酿酒酵母制备视黄醛和视黄醇产量中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述ABC转运蛋白Pdr10的Gene ID为854506。
8.一种提高酿酒酵母胞外分泌视黄醛和视黄醇的方法，其特征在于，所述方法为：在酿酒酵母中强化表达截短3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、法尼基焦磷酸合酶ERG20、内质网大小调节因子INO2和ABC转运蛋白Pdr10；异源表达香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE、八氢番茄红素脱氢酶CrtI、15-顺式八氢番茄红素合酶CrtB、双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶CrtYB、15、15’-加双氧酶BCMO；敲除酿酒酵母中的ROX1和GAL80基因；并且下调角鲨烯合酶ERG9的表达。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，通过PGPD启动子强化表达tHMG1，通过PPGK1启动子强化表达INO2，通过PTEF1启动子强化表达ERG20和IDI1并异源表达CrtB，通过PGAL1,10双向启动子异源表达CrtI和CrtE，通过PGAL7启动子异源表达CrtYB和BCMO，通过PTDH3启动子强化表达Pdr10，通过PHXT1启动子弱化表达ERG9。
10.权利要求1～4任一所述的重组酿酒酵母，或权利要求5，8～9任一所述的方法在制备含有视黄醛和视黄醇产品中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115975833A (zh) * 2022-10-25 2023-04-18 厦门大学 一种生产香兰素的酿酒酵母重组菌株及其构建方法
CN116144518A (zh) * 2023-03-15 2023-05-23 江南大学 一种生产视黄醇的酿酒酵母菌株及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113684141A (zh) * 2021-08-12 2021-11-23 江南大学 一种胞外转运维生素d3前体角鲨烯的酿酒酵母菌株构建及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113684141A (zh) * 2021-08-12 2021-11-23 江南大学 一种胞外转运维生素d3前体角鲨烯的酿酒酵母菌株构建及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115975833A (zh) * 2022-10-25 2023-04-18 厦门大学 一种生产香兰素的酿酒酵母重组菌株及其构建方法
CN116144518A (zh) * 2023-03-15 2023-05-23 江南大学 一种生产视黄醇的酿酒酵母菌株及其应用

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