CN114558061A

CN114558061A - 一种枇杷叶提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114558061A
Application number: CN202210290222.6A
Authority: CN
Inventors: 王岳; 孙崇德; 韩璐阳; 曹锦萍; 舒宜晨
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: CN114558061B

Abstract

本发明提供了一种枇杷叶提取物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明枇杷叶为原料，经甲醇水溶液提取，得到的枇杷叶提取物含有酚酸类化合物、黄酮类化合物、木脂素、香豆素、生物碱、萜类化合物、有机酸脂质、氨基酸及其衍生物和核苷酸及其衍生物等成分。在细胞水平和动物水平证明，枇杷叶提取物具有显著提升生物节律基因震荡的作用，同时显著抑制LPS诱导的L02细胞生物节律基因震荡降低。因此枇杷叶提取物为后续制备因生物节律基因震荡衰弱导致的疾病的药物提供了新思路。

Description

一种枇杷叶提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种枇杷叶提取物及其制备方法和应用。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl)是蔷薇科枇杷属植物，其果实、花、叶都可作为药物治疗疾病。枇杷叶革质，叶背面密生有灰棕色绒毛，味苦，微辛，性微寒，归肺、胃经。在我国民间医学中，枇杷叶自古以来就被用来治疗炎症性疾病，如咳嗽、哮喘等，且药用历史悠久，收载于多部医药典籍，有清肺止咳，和胃利尿，止渴的功效，现在还在临床广泛使用。

昼夜节律又称生物钟，是生物体生命活动的内在节律，由时间结构以及特定的基因和蛋白质决定。昼夜节律的体内平衡对有机体至关重要。昼夜节律基因的功能模式，如表达量和相位，影响基础代谢、器官功能和系统稳态。生物钟处于动态平衡状态，受光周期、炎症因子、营养摄入等多种因素的影响。过度的炎症反应是昼夜节律紊乱的常见原因。研究环境因素对生物钟的影响，特别是炎症因子和天然产物互作对生物钟的影响，有助于揭示生物钟调控机制，指导天然产物的应用。

现有技术中有采用中草药或其提取物制备机体生物节律调控基因蛋白表达的药物或保健品，例如公开号为CN 108721421A的专利报道了，黄连、黄芩、黄柏、龙胆和苦参等苦寒类中药或其他提取物能够有效缓解高脂饮食导致的大鼠生物节律基因Amtl、Per3和Clock的转录活性和表达的抑制程度，促进脂肪代谢，从而达到高血脂症预防和/或治疗的目的。目前针对节律基因的表达的调控策略主要依赖于中草药原料，目前尚未见枇杷叶提取物对生物节律影响的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种枇杷叶提取物及其制备方法和应用，所述枇杷叶提取物的生物节律调控作用，不仅能提升机体中生物节律基因的震荡表达，还能显著降低LPS诱导的生物节律基因的震荡衰退作用，为节律基因失调导致的疾病提供了新的治疗思路。

本发明提供了一种枇杷叶提取物，包括以下质量百分含量的组分：

0.2245％～0.2250％氨基酸及其衍生物、0.0837％～0.0840％酚酸类化合物、0.0915％～0.0920％核苷酸及其衍生物、0.247％～0.248％黄酮类化合物、0.0170％～0.0178％木脂素和香豆素、0.0662％～0.0668％生物碱、0.025％～0.027％萜类化合物、0.085％～0.086％有机酸和0.156％～0.157％脂质。

优选的，包括以下质量百分含量的组分：

0.2248％氨基酸及其衍生物、0.0839％酚酸类化合物、0.0916％核苷酸及其衍生物、0.2475％黄酮类化合物、0.0174％木脂素和香豆素、0.0665％生物碱、0.026％萜类化合物、0.0856％有机酸和0.1563％脂质。

优选的，所述氨基酸及其衍生物包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-正亮氨酸、L-异亮氨酸、1-甲基哌啶-2-羧酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸丁酸酯、L-亮氨酸、L-缬氨酸、2，6-二氨基庚二酸、L-甲硫氨酸亚砜、L-酪氨酸、哌啶酸、L-酪胺、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-丝氨酸、环戊基甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酰-L-亮氨酸、L-亮氨酰-L-亮氨酸、L-组氨酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、N-甘氨酰-L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-甘氨酰-L-异亮氨酸、L-脯氨酰-L-亮氨酸和2-氨基异丁酸；

所述酚酸类化合物包括邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯、咖啡酸、4-硝基苯酚、阿魏酸、2-(甲酰氨基)苯甲酸、2，5-二羟基苯甲酸、对香豆酸、3，4-二羟基苯甲酸、原儿茶酸、邻苯二甲酸酐、覆盆子苷、芥子醛、3，4，5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷、三羟基肉桂酰奎宁酸、丁香酸、香草酸、皂皮酸、丁香醛；4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲醛、3-O-阿魏酰奎宁酸、水杨酸-2-O-葡萄糖苷和1，3，5-苯三酚；

所述核苷酸及其衍生物包括2-羟基腺苷、鸟苷、鸟嘌呤、2′-脱氧腺苷、胞苷、2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧肌苷-5′-单磷酸、胞嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤、6-甲基巯嘌呤、2′-脱氧胞苷、异鸟嘌呤、腺苷、胞嘧啶、胸苷、琥珀酰腺苷、9-(阿拉伯糖基)次黄嘌呤、5-脱氧-5-甲硫腺苷和2-(二甲基氨基)鸟苷；

所述黄酮类化合物包括异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-7-O-葡萄糖苷、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、橙皮素-7-O-新橙皮糖苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、扁蓄苷、异甜橙黄酮、橙皮素-5-O-葡萄糖苷、橘皮素、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、柚皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、甜橙素、紫铆素、槲皮素-3-O-半乳糖苷、川陈皮素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、5，7，8，4′-四甲氧基黄酮、槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、橙皮素-7-O-芸香糖苷、高圣草酚、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素、圣草次苷、山奈酚-3-O-(2″-对香豆酰)半乳糖苷、异柚葡萄糖苷、3′，4′，5，6，7-五甲氧基黄烷酮、山奈酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷、圣草酚、花旗松素-3′-O-葡萄糖苷、5-羟基酸橙黄酮、芹菜素-7-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-阿拉伯糖苷、5，4′-二羟基-3，6，7，3′-四甲氧基黄酮、6-羟基ω奈酚-3，6-O-二葡萄糖苷、柚皮黄素-3-O-(3-羟基-3-甲基戊二酰)葡萄糖苷、荭草素-7-O-葡萄糖苷和丁香亭-7-O-葡萄糖苷；

所述木脂素和香豆素包括7-(6′，7′-二羟基牻牛儿基氧基)香豆素、6′，7′-二羟基佛手素、5，7-二甲氧基香豆素、橙皮内酯、7-甲氧基-5-异戊烯基氧基香豆素和酸橙素烯醇；

所述生物碱包括精胺、甜菜碱、阿魏酰腐胺、组氨醇、胆碱、N-苯亚甲基异甲胺、苯基乙醇胺、6-脱氧荞麦碱和乙酰胆碱；

所述萜类化合物包括2α，19α-二羟基-3-氧熊果-12-烯-28-酸、山楂酸、2-羟基齐墩果酸、坡模酸、科罗索酸、委陵菜酸和榄香醇；

所述有机酸化合物包括壬二酸、甲基丙二酸、琥珀酸、柠檬酸、2-羟基肉桂酸、异柠檬酸、3-脱氢-L-苏糖酸、己二烯二酸、2-羟基十六烷酸、L-高丝氨酸、2，3-二羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、γ-氨基丁酸、D-木糖酸、3，5-二羟基-3-甲基戊酸、2，3-二羟基-3-甲基丁酸、4-乙酰氨基丁酸、反式乌头酸、异烟酸和己二酸；

所述脂质包括硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18∶1(2n异构)、反油酸、溶血磷脂酰胆碱16∶0、肉豆蔻酸、溶血磷脂酰乙醇胺18∶1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18∶1、11-十八碳烯酸、十八碳-9E，13E，15Z-三烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、溶血磷脂酰胆碱18∶3、溶血磷脂酰胆碱16∶1(2n异构)、溶血磷脂酰乙醇胺18∶3(2n异构)、棕榈醛、溶血磷脂酰乙醇胺16∶1(2n异构)、溶血磷脂酰乙醇胺16∶0、十六烷基鞘胺醇、石榴酸、溶血磷脂酰胆碱16∶0(2n异构)、溶血磷脂酰乙醇胺18∶1、溶血磷脂酰胆碱18∶0、溶血磷脂酰胆碱18∶2、9，10，13-三羟基-11-十八碳烯酸、9S-羟基-10E，12Z-十八碳二烯酸、溶血磷脂酰胆碱17∶2、13-羟基十八烷基-9，11-二烯酸、溶血磷脂酰胆碱16∶1、二十碳烯酸、甘磷酸胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺18∶3、溶血磷脂酰胆碱18∶2(2n异构)、2-亚油酰甘油酯、溶血磷脂酰乙醇胺16∶1和4-羟基鞘氨醇。

本发明提供了所述枇杷叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

将枇杷叶粉末用醇水溶液提取，分离收集液相，去除溶剂后，得到枇杷提取物。

优选的，所述醇水溶液包括甲醇水溶液；

所述甲醇水溶液的体积浓度为68％～72％。

优选的，所述分离的方法包括离心和滤膜过滤；

所述离心的转速为10000～15000rpm；所述离心的时间为5～12min。

本发明提供了所述枇杷叶提取物或所述制备方法制备的枇杷叶提取物在制备促进机体生物节律基因震荡表达的药物中的应用。

优选的，所述生物节律基因包括以下一种或几种：Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cryl、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2。

本发明提供了所述枇杷叶提取物或所述制备方法制备的枇杷叶提取物在制备预防和/或治疗生物节律基因震荡衰弱导致的疾病的药物中的应用。

优选的，所述生物节律基因震荡衰弱导致的疾病包括以下一种或几种疾病：肥胖、失眠、炎症反应、胰岛素抵抗和神经退行性疾病。

本发明提供的枇杷叶提取物，包括以下质量百分含量的组分：0.2245％～0.2250％氨基酸及其衍生物、0.0837％～0.0840％酚酸类化合物、0.0915％～0.0920％核苷酸及其衍生物、0.247％～0.248％黄酮类化合物、0.0170％～0.0178％木脂素和香豆素、0.0662％～0.0668％生物碱、0.025％～0.027％萜类化合物、0.085％～0.086％有机酸和0.156％～0.157％脂质。在细胞水平上，枇杷叶提取物具有显著提升人肝脏细胞系L02细胞生物节律基因震荡的作用，同时显著抑制LPS诱导的L02细胞生物节律基因震荡降低；在动物水平上，枇杷叶提取物具有抑制LPS诱导的小鼠肝脏生物节律基因震荡衰退的作用。可见，枇杷叶提取物能够有效促进机体生物节律基因震荡表达，为后续制备因生物节律基因震荡衰弱导致的疾病的药物提供了新思路。

附图说明

图1为本发明实施例中枇杷叶提取物的液相图谱；

图2为本发明实施例中不同浓度枇杷叶提取物对L02细胞的细胞活力影响；

图3为本发明实施例中不同处理组枇杷叶提取物对L02细胞生物节律振荡的影响；

图4为本发明实施例中枇杷叶提取物对L02细胞生物节律基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2表达的影响；

图5为枇杷叶提取物对LPS诱导的L02细胞生物节律基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2表达震荡衰弱的抑制作用；

图6为枇杷叶提取物对LPS诱导小鼠肝脏生物节律基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2表达震荡衰弱的抑制作用。

具体实施方式

0.2245％～0.2250％氨基酸及其衍生物、0.0837％～0.0840％酚酸类化合物、0.0915％～0.0920％核苷酸及其衍生物、0.247％～0.248％黄酮类化合物、0.0170％～0.0178％木脂素和香豆素、0.0662％～0.0668％生物碱、0.025％～0.027％萜类化合物、0.085％～0.086％有机酸、0.156％～0.157％脂质。

在本发明中，所述枇杷叶提取物优选包括以下质量百分含量的组分：0.2248％氨基酸及其衍生物、0.0839％酚酸类化合物、0.0916％核苷酸及其衍生物、0.2475％黄酮类化合物、0.0174％木脂素和香豆素、0.0665％生物碱、0.026％萜类化合物、0.0856％有机酸和0.1563％脂质。所述氨基酸及其衍生物优选包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-正亮氨酸、L-异亮氨酸、1-甲基哌啶-2-羧酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸丁酸酯、L-亮氨酸、L-缬氨酸、2，6-二氨基庚二酸、L-甲硫氨酸亚砜、L-酪氨酸、哌啶酸、L-酪胺、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-丝氨酸、环戊基甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酰-L-亮氨酸、L-亮氨酰-L-亮氨酸、L-组氨酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、N-甘氨酰-L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-甘氨酰-L-异亮氨酸、L-脯氨酰-L-亮氨酸、2-氨基异丁酸。所述酚酸类化合物优选包括邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯、咖啡酸、4-硝基苯酚、阿魏酸、2-(甲酰氨基)苯甲酸、2，5-二羟基苯甲酸、对香豆酸、3，4-二羟基苯甲酸、原儿茶酸、邻苯二甲酸酐、覆盆子苷、芥子醛、3，4，5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷、三羟基肉桂酰奎宁酸、丁香酸、香草酸、皂皮酸、丁香醛；4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲醛、3-O-阿魏酰奎宁酸、水杨酸-2-O-葡萄糖苷、1，3，5-苯三酚。所述核苷酸及其衍生物优选包括2-羟基腺苷、鸟苷、鸟嘌呤、2′-脱氧腺苷、胞苷、2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧肌苷-5′-单磷酸、胞嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤、6-甲基巯嘌呤、2′-脱氧胞苷、异鸟嘌呤、腺苷、胞嘧啶、胸苷、琥珀酰腺苷、9-(阿拉伯糖基)次黄嘌呤、5-脱氧-5-甲硫腺苷、2-(二甲基氨基)鸟苷。所述黄酮类化合物优选包括异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-7-O-葡萄糖苷、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、橙皮素-7-O-新橙皮糖苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、扁蓄苷、异甜橙黄酮、橙皮素-5-O-葡萄糖苷、橘皮素、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、柚皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、甜橙素、紫铆素、槲皮素-3-O-半乳糖苷、川陈皮素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、5，7，8，4′-四甲氧基黄酮、槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、橙皮素-7-O-芸香糖苷、高圣草酚、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素、圣草次苷、山奈酚-3-O-(2″-对香豆酰)半乳糖苷、异柚葡萄糖苷、3′，4′，5，6，7-五甲氧基黄烷酮、山奈酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷、圣草酚、花旗松素-3′-O-葡萄糖苷、5-羟基酸橙黄酮、芹菜素-7-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-阿拉伯糖苷、5，4′-二羟基-3，6，7，3′-四甲氧基黄酮、6-羟基山奈酚-3，6-O-二葡萄糖苷、柚皮黄素-3-O-(3-羟基-3-甲基戊二酰)葡萄糖苷、荭草素-7-O-葡萄糖苷、丁香亭-7-O-葡萄糖苷。所述木脂素和香豆素包括7-(6′，7′-二羟基牻牛儿基氧基)香豆素、6′，7′-二羟基佛手素、5，7-二甲氧基香豆素、橙皮内酯、7-甲氧基-5-异戊烯基氧基香豆素、酸橙素烯醇。所述生物碱包括精胺、甜菜碱、阿魏酰腐胺、组氨醇、胆碱、N-苯亚甲基异甲胺、苯基乙醇胺、6-脱氧荞麦碱、乙酰胆碱。所述萜类化合物包括2α，19α-二羟基-3-氧熊果-12-烯-28-酸、山楂酸、2-羟基齐墩果酸、坡模酸、科罗索酸、委陵菜酸、榄香醇。所述有机酸化合物包括壬二酸、甲基丙二酸、琥珀酸、柠檬酸、2-羟基肉桂酸、异柠檬酸、3-脱氢-L-苏糖酸、己二烯二酸、2-羟基十六烷酸、L-高丝氨酸、2，3-二羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、γ-氨基丁酸、D-木糖酸、3，5-二羟基-3-甲基戊酸、2，3-二羟基-3-甲基丁酸、4-乙酰氨基丁酸、反式乌头酸、异烟酸、己二酸。所述脂质包括硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18∶1(2n异构)、反油酸、溶血磷脂酰胆碱16∶0、肉豆蔻酸、溶血磷脂酰乙醇胺18∶1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18∶1、11-十八碳烯酸、十八碳-9E，13E，15Z-三烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、溶血磷脂酰胆碱18∶3、溶血磷脂酰胆碱16∶1(2n异构)、溶血磷脂酰乙醇胺18∶3(2n异构)、棕榈醛、溶血磷脂酰乙醇胺16∶1(2n异构)、溶血磷脂酰乙醇胺16∶0、十六烷基鞘胺醇、石榴酸、溶血磷脂酰胆碱16∶0(2n异构)、溶血磷脂酰乙醇胺18∶1、溶血磷脂酰胆碱18∶0、溶血磷脂酰胆碱18∶2、9，10，13-三羟基-11-十八碳烯酸、9S-羟基-10E，12Z-十八碳二烯酸、溶血磷脂酰胆碱17∶2、13-羟基十八烷基-9，11-二烯酸、溶血磷脂酰胆碱16∶1、二十碳烯酸、甘磷酸胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺18∶3、溶血磷脂酰胆碱18∶2(2n异构)、2-亚油酰甘油酯、溶血磷脂酰乙醇胺16∶1、4-羟基鞘氨醇。

在本发明中，所述醇水溶液优选包括甲醇水溶液。所述甲醇水溶液的体积浓度优选为68％～72％，更优选为70％。枇杷叶粉末的质量和醇水溶液的体积比优选为1mg∶0.01～0.015mL，更优选为1mg∶0.012mL。所述提取的时间优选为10～14h，更优选为12h。所述提取的温度优选为4℃。所述枇杷叶粉末是将枇杷叶经真空冷冻干燥和粉碎得到。所述粉碎的方法优选采用研磨仪在30Hz条件下研磨15min。

在本发明中，所述分离的方法优选包括离心和滤膜过滤。所述离心的转速优选为10000～15000rpm，更优选为12000rpm；所述离心的时间优选为5～12min，更优选为10min。所述滤膜过滤的滤膜孔径有选为0.22μm。滤膜过滤后，收集滤液部分成分，经过干燥得到枇杷叶提取物。

在本发明中，为了进一步分析枇杷叶提取物中活性成分及其含量。将枇杷叶提取物经色谱甲醇溶解后，使用UPLC-MS/MS进行物质检测。其中，UPLC检测条件如下：以ACQUITYUPLC HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)为固定相；流动相为含有1％甲酸的水(流动相A)和含有1％甲酸的乙腈(流动相B)。梯度洗脱程序为：0～20min，5～95％B；20～22min，95％B；22～23min，95～5％B；23～25min，5％B。扫描波长为254和280nm，流速为0.3mL/min，柱温为50℃，进样体积为2μL。质谱分析的条件优选如下：LIT和三重四极杆(QQQ)扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪(Q TRAP)，AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口，可由Analyst 1.6.3软件(AB Sciex)控制运行正负两种离子模式。ESI源操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度550℃；离子喷雾电压(IS)5500V(正离子模式)/-4500V(负离子模式)；离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25.0psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。

在本发明中，所述枇杷叶提取物在细胞中的工作浓度优选为12.5～100μg/mL，更优选为100μg/mL。

在本发明中，所述生物节律基因优选包括以下一种或几种：Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cryl、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2。本发明实施例中，分别检测L02细胞在经过枇杷叶提取物(100μg/mL)处理，LPS(0.1μg/mL)处理或LPS(0.1μg/mL)+枇杷叶提取物(100μg/mL)联合处理后，0、24、48、72、96、120h时，Per2基因震荡情况，结果表明，与空白对照相比，枇杷叶提取物处理可以显著提升生物节律相关基因Per2的震荡表达，提高其表达的振幅，而LPS处理能诱导了Per2的表达的衰退，振幅大幅度降低；而LPS+枇杷叶提取物处理可以抑制LPS处理引起的生物节律衰退。同时采用qPCR检测，枇杷叶提取物能不同程度的增强生物节律基因震荡表达。因此，所述枇杷叶提取物在调控机体生物节律基因震荡表达中应用。

在自然条件下，生物节律基因的表达受环境信号(如外部光/暗环境、食物和温度等)的调控，从而维持细胞的正常运转和各种生命现象。生物节律不仅调控生物体睡眠和活动的周期，生物体内的体温、血压、激素分泌、新陈代谢等生理过程也都表现出了24h的节律特性。当外界环境或食物温度等变化引起机体内生物节律基因震荡衰弱，导致细胞和生物体的各种生理和病理变化。因此，本发明提供了所述枇杷叶提取物或所述制备方法制备的枇杷叶提取物在制备预防和/或治疗生物节律基因震荡衰弱导致的疾病的药物中的应用。

在本发明中，所述生物节律基因震荡衰弱导致的疾病优选包括以下一种或几种疾病：肥胖、失眠、炎症反应、胰岛素抵抗和神经退行性疾病。许多人类疾病显示出生物节律的紊乱与细胞和生物体的各种生理和病理变化密切相关，例如睡眠障碍、肥胖、炎症反应、胰岛素抵抗和神经退行性疾病等。以睡眠障碍为例，嗜睡或者失眠常由生物节律与作息时间不匹配导致，甚至会引起睡眠时相前移综合征(Advanced sleep-wake phase syndrome，ASPS)或睡眠时相推迟综合征(Delayed sleep-wake phase syndrome，DSPS)^[1]，环境与生物节律的不匹配则会产生类似时差造成的睡眠障碍。同样的，许多代谢综合征的发生就与生物节律与代谢途径的不匹配相关，例如，胰腺β细胞内生物节律基因Bmal1的功能缺失会导致胰岛素抵抗或2型糖尿病^[2]。另外，一些疾病的发生也与生物的24h节律相关，例如，哮喘和心脏疾病在夜间或清晨发生的概率显著高于一天中的其他时段^[3]。

在本发明中，生物节律基因震荡衰弱导致的疾病包括肥胖。例如公开号为CN108721421A的专利公开了。高脂饮食能够抑制大鼠生物节律基因Arntl、Per3和Clock的转录活性和表达，进而减少脂质代谢，促进脂肪在机体的积累，造成机体血液中甘油三酯升高。通过逆转生物节律基因的表达，取得降低机体血清甘油三酯水平的效果。本申请制备的枇杷叶提取物具有增强机体生物节律基因震荡表达，因此，也能治疗生物节律基因震荡衰弱导致的肥胖。

在本发明中，所述药物的剂型包括颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、膏剂和口服液体制剂中的一种。所述药物还包括药学上可接受的辅料。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的不同剂型药物的制备方法即可。

参考文献

[1]Reid K J，Zee P C.Circadian Rhythm Disorders.Seminars in Neurology[J]，2009，29：393-405.

[2]Marcheva B，Ramsey K M，Buhr E D，Kobayashi Y，Su H，Ko C H，Ivanova G，Omura C，Mo S，Vitaterna M H，Lopez JP，Philipson L H，Bradfield C A，Crosby S D，JeBailey L，Wang X Z，T akahashi J S，Bass J.Disruption of the clock componentsCLOCK and BMAL1leads to hypoinsulinaemia and diabetes.Nature[J]，2010，466：627-631

[3]Stephenson R.Circadian rhythms and sleep-related breathingdisorders.Sleep Medicine[J]，2007，8：681-687.

下面结合实施例对本发明提供的一种枇杷叶提取物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

枇杷叶提取物提取方法和检测方法

取当年生‘白沙’枇杷叶，洗净后于室温晾干，放置于冻干机(Scientz-100F)中真空冷冻干燥，利用研磨仪(MM 400，Retsch)研磨(30Hz，1.5分钟)至粉末状，称取100mg的粉末，溶解于1.2mL 70％甲醇提取液中，每30分钟涡旋一次，每次持续30秒，共涡旋6次，样本置于4℃冰箱过夜，离心(转速12000rpm，10分钟)后，吸取上清，用微孔滤膜(0.22μm poresize)过滤样品，水平离心干燥后并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

检测方法：

将粉末溶于色谱甲醇(1mg/mL)中进行物质检测。使用UPLC-MS/MS进行物质检测，检测方法如下：

UPLC检测条件如下：以ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)为固定相；流动相为含有1％甲酸的水(流动相A)和含有1％甲酸的乙腈(流动相B)。梯度洗脱程序为：0～20min，5～95％B；20～22min，95％B；22～23min，95～5％B；23～25min，5％B。扫描波长为254和280nm，流速为0.3mL/min，柱温为50℃，进样体积为2μL。

质谱条件：LIT和三重四极杆(QQQ)扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪(QTRAP)，AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口，可由Analyst 1.6.3软件(AB Sciex)控制运行正负两种离子模式。ESI源操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度550℃；离子喷雾电压(IS)5500V(正离子模式)/-4500V(负离子模式)；离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25.0psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的DP和CE优化，完成了各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。

结果见表1～9。枇杷叶提取物中包含0.2248％氨基酸及其衍生物、0.0839％酚酸类化合物、0.0916％核苷酸及其衍生物、0.2475％黄酮类化合物、0.0174％木脂素和香豆素、0.0665％生物碱、0.026％萜类化合物、0.0856％有机酸、0.1563％脂质。

表1枇杷叶提取物中的氨基酸及其衍生物

表2枇杷叶提取物甲的酚酸类

表3枇杷叶提取物中的核苷酸及其衍生物

表4枇杷叶提取物中的黄酮

表5枇杷叶提取物中的木脂素和香豆素

表6枇杷叶提取物中的生物碱

类别

分子量

特征碎片离子

分子式

离子模式

物质

含量比例

生物碱

202216

83

C10H26N4

[M+H]+

精胺

175％

生物碱

117.079

59

C5H1 1NO2

[M+H]+

甜菜碱

154％

生物碱

264147

177.06

C14H20N2O3

[M+H]+

阿魏酰腐胺

151％

生物碱

141.09

124.09

C6H1 1N3O

[M+H]+

组氨醇

096％

生物碱

103.091

60.1

C5H13NO

[M+H]+

胆碱

054％

生物碱

119.073

103.05

C8H9N

[M+H]+

N-苯亚甲基异甲胺

011％

生物碱

137.084

1211

C8H11NO

[M+H]+

苯基乙醇胺

009％

生物碱

131.095

571

C6H13NO2

[M+H]+

6-脱氧荞麦碱

008％

生物碱

146.118

87.2

C7H16NO2

[M+H]+

乙酰胆碱

007％

表7枇杷叶提取物中的萜类

表8枇杷叶提取物中的有机酸

表9枇杷叶提取物中的脂质

实施例2

枇杷叶提取物对L02细胞中生物节律基因Per2震荡表达的调节作用

实验方法：

本实施例旨在以人肝脏细胞系L02为实验对象，评价枇杷叶提取物(Loquat Leaf，LL)对细胞节律基因Per2的震荡表达作用和对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导Per2震荡表达衰退的抑制作用。

1.细胞培养和活力测定

L02细胞使用RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清)置于恒温恒温培养箱中培养(37℃，5％CO₂)。细胞活力的测定使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)进行。L02细胞以每孔5×10⁴细胞的密度接种于96孔板上，用100μL RPMI-1640培养基培养过夜。在培养基中加入不同浓度的DMSO溶解的枇杷提取物，并与细胞共培养72h。然后，取出培养基，用PBS洗涤细胞两次。将CCK-8试剂在无FBS的RPMI-1640培养基中稀释并添加到孔中。在培养箱中培养1h后，使用酶标仪读取450nm和620nm处的吸光度。按照公式I计算细胞活力：

细胞活力(％)＝(OD_{450(处理组)}-OD_{620(处理组)})/(OD_{450(对照组)}-OD_{620(对照组)})×100％。

DMSO作为溶剂对照，每个试验独立重复三次。

2.慢病毒荧光素酶报告体的构建方法

使用

Max Master Mix(Dye Plus)P525以如下引物进行PCR扩增Per2启动子DNA片段(SEQ ID NO：1，543bp)，反应体系：ddH₂O：20μL；2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)：25μL；正向引物(10μM)：2μL；反向引物(10μM)：2μL；模板DNA；1μL；反应程序为：(a)95℃，3min；(b)95℃，15s；(c)60℃，15s；(d)72℃，90s；(b)～(d)重复35个循环；(e)72℃，5min产物经1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收。将纯化后PCR产物连接到pENTR5′-TOPO载体并转化至DH5α大肠杆菌感受态(Takara，大连)，在筛选培养基上培养12h后挑选阳性单克隆进行测序验证，于-20℃保存正确的阳性克隆质粒p E N T R 5′-P(P e r 2)。

正向引物：5′-TCGGGTCACTAGAGGCAAGT-3′(SEQ ID NO：2)；

反向引物：5′-CCATCTATGTCTGGGCCTGC-3′(SEQ ID NO：3)。

dLuc(SEQ ID NO：1，773bp)包含萤火虫荧光素酶基因和一个C端PEST序列，可用于快速降解蛋白质。使用

Max Master Mix(Dye Plus)P525以如下引物(SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6)进行PCR扩增Per2启动子DNA片段(SEQ ID NO：4，543bp)，程序为：(a)95℃，3min；(b)95℃，15s；(c)60℃，15s；(d)72℃，90s；(b)～(d)35个循环；(e)72℃，5min产物经1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收，并pENTR^TM/D-TOPOT^M克隆试剂盒(Thermofisher)将其克隆到pENTR/D-TOPO载体，生成pENTR/D-dLuc。

正向引物：5′-CACCATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA-3′(SEQ ID NO：5)；

反向引物：5′-GACGTTGATCCTGGCGCTG-3′(SEQ ID NO：6)；

在25℃条件下LR反应16h，反应体系：pENTR5′-P(Per2)：15.02ng；pENTR/D-dLuc：15.02ng；母载体pLV7-Bsd：60.28ng；LR clonase：1μL；TE buffer：补充至5μL。加入0.5μL蛋白酶K于37℃终止反应10min。转化LR反应产物到大肠杆菌Stbl3，菌落PCR筛选阳性克隆，反应体系：10×Taq Buffer with(NH₄)₂SO₄：3μL；dNTP Mixture(2μmol)：3μL；MgCl₂：2μL；引物-F(10μmol)：1.2μL；引物-R(10μmol)：1.2μL；Taq DNAPolymerase：1.5μL；模板DNA：2μL；灭菌水：16.1μL；总体积：30μL。程序为(a)95℃，3min；(b)95℃，30s；(c)60℃，30s；(d)72℃，90s；b～d29个循环；(e)72℃，5min。挑取阳性克隆质粒pLV7-Bsd-P(Per2)-dLuc。

引物-F：TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG(SEQ ID NO：7)；

引物-R：GGAGGAGTAGAAGGTGGGCG(SEQ ID NO：8)。

3.慢病毒颗粒的产生

低培养代数的人胚肾细胞系293T细胞使用DMEM培养基培养，培养条件为37℃，5％CO₂，培养基含有10％胎牛血清和1×双抗-谷氨酰胺。细胞转染前，向6孔板中加入1mL含有0.001％的多聚赖氨酸(poly-L-lysine)，在室温下培养20min，然后吸走溶液，并使用1×PBS冲洗一次。将6孔板中每孔加入7.5×10⁶个细胞，并添加完全培养基至2mL。

当6孔板细胞融合度至80～90％时，移去293T培养基，换成2mL新鲜培养基，放回培养箱培养10min以平衡培养基pH。将质粒转染混合物(2μg慢病毒报告质粒DNA和3种包装载体：1.3μgGag/P_ol，0.5μgRev和0.7μgVSVG)。在慢病毒绿色荧光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)表达载体转染中增加一个孔，转染pLV156-CMV-EGFP，作为转染和后续试验的对照。在混合物中加入100μL 0.25M CaCl₂(使用DNase/RNase-free双蒸水稀释)，然后加入100μL 2×BSS溶液(50mM BES，280mM NaCl，1.5mM Na₂HPO₄，pH 6.95)并混合均匀，室温培养15min。将转染混合物逐滴加入293T细胞，轻旋培养板，在显微镜下观察微粒形成，培养过夜。

转染后约16h，细胞融合度达到100％，去除培养基并更换至新鲜的DMEM完全培养基，再次培养过夜，通过观察对照细胞中的EGFP表达评估转染效率。收集含有感染性病毒颗粒的培养基，3000g离心5分钟，收取上清液。

4.L02细胞的感染

在12孔板中种板L02细胞，浓度为4000个/孔，培养过夜。向含有病毒微粒的培养基中添加聚凝胺，使其终浓度为5μg/mL。将融合度为20％～30％的L02细胞作为转染目标细胞，吸出培养基，加入含有微粒和聚凝胺的培养基混合物，培养过夜。

感染后24h，从培养孔中吸出含有病毒微粒和聚凝胺的混合物，使用1×PBS洗涤，然后更换新的培养基，培养过夜，恢复细胞生长。细胞融合度至100％后，将细胞传代并进行培养过夜。在细胞融合度低于50％时吸出培养基，换为含有10μg/mL杀稻瘟菌素的培养基，选择稳定转导的细胞。每隔2～3天更换新鲜含有杀稻瘟菌素的培养基，约2次后获得稳定的抗杀稻瘟菌素的细胞。

5.血清休克法诱导生物节律的发生

荧光素酶生物发光报告基因检测中，将稳定转染的L02细胞以1×10⁴细胞/孔的浓度接种于96孔板中。血清休克时，用富含血清的培养基(RPMI-1640含50％马血清)替换培养基，2h后用无血清的RPMI-1640培养基替换培养基。血清休克前24h进行100μg/mL的枇杷叶提取物处理，将枇杷叶提取物溶于二甲基亚砜(DMSO)中，DMSO终浓度为0.05％v/v，与细胞共孵育。富含血清和不含血清的培养基中所含的枇杷叶提取物的浓度与先前处理的相同。L02细胞系的传代数不超过7代。每个实验独立重复3次。DMSO作为溶剂对照。

6.报告系统的生物学发光

将抗杀稻瘟素的L02细胞接种在96孔板中并孵育过夜。然后，用枇杷提取物处理细胞并在血清休克前孵育24小时。用记录介质替换血清休克处理的细胞：RPMI-1640培养基、1×谷氨酰胺、1μM毛喉素、1mM荧光素和25mM HEPES，pH 7.4。更换培养基后，用真空油脂覆盖并密封96孔板。用酶标仪记录发光，每15分钟计数一次；温度设置为36℃；基线为原始发光值。

7.LPS诱导诱导的生物节律紊乱诱导

LPS用作诱导昼夜节律紊乱造模药物。LPS以0.1μg/mL的浓度溶解在DMSO中，与细胞一起孵育。处理顺序如下：100μg/mL枇杷叶提取物与细胞一起孵育12小时；然后加入LPS，在血清休克前将LPS和枇杷叶提取物与细胞共孵育12小时。DMSO用作阴性对照。每个实验独立重复3次。

实验结果：

不同浓度枇杷叶提取物对L02细胞的细胞活力影响见图2。如图2所示，在12.5～100μg/mL的浓度范围内，枇杷叶提取物(LL)对人肝脏细胞系L02的细胞活性没有显著抑制作用，细胞活性均在90％以上。LPS共孵育时，LL的最高抑制浓度不变。因此，在后续细胞实验中，选择100μg/mL作为处理浓度。

枇杷叶提取物对L02细胞生物节律振荡的影响见图3。如图3所示，与对照组相比，LL处理可以显著提升生物节律相关基因Per2的震荡表达，提高其表达的振幅。这说明LL对生物节律震荡具有增强作用。LPS处理诱导了Per2的表达的衰退，振幅大幅度降低，而同时孵育LL时，可以抑制这种生物节律衰退作用。

以上结果说明，枇杷叶提取物具有增强生物节律震荡和抑制LPS诱导的生物节律衰退的作用。

实施例3

枇杷叶提取物对L02细胞中生物节律基因的调节作用

实验方法：

本实施例旨在以人肝脏细胞系L02为实验对象，评价枇杷叶提取物对细胞节律基因表达的调节作用。

细胞培养和处理方法见实施例1，用于昼夜节律基因检测的L02细胞，将L02细胞以每孔2×10⁵个细胞的浓度接种在6孔板中，并在枇杷提取物处理前培养96小时。使用Trizo1试剂提取总RNA，使用Invitrogen试剂盒进行逆转录，然后在实时PCR系统中遵循标准定量PCR程序进行实验，qRT-PCR引物如下：

Gapdh

正向引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′(SEQ ID NO：9)；

反向引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′(SEQ ID NO：10)；

Clock

正向引物：5′-TGCGAGGAACAATAGACCCAA--3′(SEQ ID NO：11)；

反向引物：5′-ATGGCCTATGTGTGCGTTGTA-3′(SEQ ID NO：12)；

Bmal1

正向引物：5′-AAGGGAAGCTCACAGTCAGAT-3′(SEQ ID NO：13)；

反向引物：5′-GGACATTGCGTTGCATGTTGG-3′(SEQ ID NO：14)；

Per1

正向引物：5′-GCCAACCAGGAATACTACCAGC-3′(SEQ ID NO：15)；

反向引物：5′-GTGTGTACTCAGACGTGATGTG-3′(SEQ ID NO：16)；

Per2

正向引物：5′-GACATGAGACCAACGAAAACTGC-3′(SEQ ID NO：17)；

反向引物：5′-AGGCTAAAGGTATCTGGACTCTG-3′(SEQ ID NO：18)；

Per3

正向引物：5′-GCAGAGGAAATTGGCGGACA-3′(SEQ ID NO：19)；

反向引物：5′-GGTTTATTGCGTCTCTCCGAG-3′(SEQ ID NO：20)；

Cry1

正向引物：5′-CTCCTCCAATGTGGGCATCAA--3′(SEQ ID NO：21)；

反向引物：5′-CCACGAATCACAAACAGACGG-3′(SEQ ID NO：22)；

Cry2

正向引物：5′-TCCCAAGGCTGTTCAAGGAAT-3′(SEQ ID NO：23)；

反向引物：5′-TGCATCCCGTTCTTTCCCAAA--3′(SEQ ID NO：24)；

Rev-erbα

正向引物：5′-TGGACTCCAACAACAACACAG-3′(SEQ ID NO：25)；

反向引物：5′-GATGGTGGGAAGTAGGTGGG-3′(SEQ ID NO：26)；

Rev-erbβ

正向引物：5′-TTTAGTGGCATGGTTCTACTGTG-3′(SEQ ID No：27)；

反向引物：5′-AGCCTTCGCAAGCATGAACT-3′(SEQ ID NO：28)；

Rorα

正向引物：5′-ACTCCTGTCCTCGTCAGAAGA-3′(SEQ ID NO：29)；

反向引物：5′-CATCCCTACGGCAAGGCATTT-3′(SEQ ID NO：30)；

Dbp

正向引物：5′-CTGATCTTGCCCTATCAAGCATT-3′(SEQ ID NO：31)；

反向引物：5′-CGATGTCTTCGAGGGTCAAAG-3′(SEQ ID NO：32)；

Npas2

正向引物：5′-CGTGTTGGAAAAGGTCATCGG-3′(SEQ ID NO：33)；

反向引物：5′-TCCAGTCTTGCTGAATGTCAC-3′(SEQ ID NO：34)。

qPCR总体系为50μL配制如下：10μL SYBR Green1染料、正向引物1μL、反向引物1μL，dNTP 1μL，Taq聚合酶2μL，待测样品cDNA 5μL，ddH₂O30μL。轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。反应程序为93℃，2min预变性；93℃1min，55℃1min，72℃1min 40个循环；72℃，7min延伸。以Gapdh对照。采用比较(2^-ΔΔCT)法计算基因表达的相对水平。

实验结果：

枇杷叶提取物对L02细胞生物节律基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2表达的影响见图4。如图4所示，当对L02细胞进行枇杷叶提取物(LL)处理时，生物节律震荡基因的表达均在24h内的一段时间内呈现显著的增强作用。即相对于control组，LL处理组在某些时间点的表达显著升高或在某些时间点的表达显著降低，其中包括：Clock基因在6h点的显著下调表达和14h的显著上调表达；Bmal1基因在14、18、22h点的显著上调表达；Per1基因在6h和10h的显著上调表达；Per2基因在10、14、18h的显著上调表达；Per3基因在6、10、14h的显著上调表达；Cry1基因在14h和18h的显著上调表达；Cry2基因在10、18、22h的显著上调表达和2、26h的显著下调表达；Rev-erbα基因在2h的显著下调表达和在6h的显著上调表达；Rev-erbβ基因在6、10、14h的显著上调表达；Rorα基因在10h和14h的显著上调表达；Dbp基因在6、10、14h的显著上调表达；Npas2在6h的显著下调表达和在14、18h的显著上调表达。

以上结果说明，枇杷叶提取物具有增强生物节律基因震荡表达的作用。

实施例4

枇杷叶提取物抑制LPS诱导的L02细胞中生物节律基因震荡衰退的作用

实验方法：

本实施例旨在以人肝脏细胞系L02为实验对象，评价枇杷叶提取物对LPS诱导的细胞节律基因表达震荡减弱的抑制作用。细胞培养、LPS诱导方法、枇杷叶预处理方法和基因表达量检测方法见实施例2和实施例3。

实验结果：

枇杷叶提取物对LPS诱导的L02细胞生物节律基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2表达震荡衰弱的抑制作用见图5。如图5所示，与control组相比，LPS处理显著抑制了生物节律基因的震荡表达，这些基因包括Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2。当使用枇杷叶提取物进行共孵育处理时，L02细胞生物节律基因的震荡表达交LPS组显著增强，即相对于LPS组，LPS+LL处理组在某些时间点的表达显著升高或在某些时间点的表达显著降低，其中包括：Clock基因在14h的显著上调表达；Bmal1基因在6h点的显著下调表达和14、18、22h点的显著上调表达；Per1基因在10h和14h的显著上调表达；Per2基因在10、14、18h的显著上调表达；Per3基因在10h和14h的显著上调表达；Cry1基因在10、14、18、22h的显著上调表达；Cry2基因在14h的显著上调表达；Rev-erbα基因在2h的显著下调表达和在10、18h的显著上调表达；Rev-erbβ基因在6h和10h的显著上调表达；Rorα基因在6、10、14、22h的显著上调表达；Dbp基因在6h和14h的显著上调表达；Npas2在6h的显著下调表达和在14、18、22h的显著上调表达。

以上结果说明，枇杷叶提取物具有抑制LPS诱导的L02细胞生物节律基因震荡衰退的作用。

实施例4

实验方法：

本实施例旨在以C57BL/6J小鼠为实验对象，评价枇杷叶提取物对LPS诱导的细胞节律基因表达震荡减弱的抑制作用。

实验方法：6周龄雄性C57BL/6J小鼠(25+2g)来自浙江省实验动物中心。小鼠被安置在动物设施中，于SPF级环境中饲养，可自由获取饲料和饮用水，温度保持在22±2℃，光暗周期12h。试验前，让小鼠适应环境两周。小鼠分为21组：control组、LPS组、LPS+LL组三种处理分别在ZT1(08∶00)、ZT5(12∶00)、ZT9(16∶00)、ZT13(20∶00)、ZT17(24∶00)、ZT21(04∶00)和ZT25(08∶00)时间点各设置一组，每组5只。造模方法为，通过连续9天每天腹腔注射LPS(0.25mg/kg生理盐水溶解)，建立LPS诱导的小鼠肝脏生物节律紊乱模型，对照组注射生理盐水。枇杷叶提取物处理组以200mg/kg的剂量连续灌胃小鼠21天后，用LPS处理小鼠，并且保持枇杷叶提取物给药，共同处理9天(枇杷叶提取物共给药30天)，最后一次LPS注射后24h，在ZT1、ZT5、ZT9、ZT1 3、ZT17、ZT21和ZT25时间点颈椎脱臼处死小鼠，解剖后取肝脏组织测定生物节律相关指标。小鼠肝脏研磨后，用Trizol试剂提取总RNA，用iScript合成试剂盒合成cDNA，qRT-PCR引物参见实施例2记载的扩增引物。qPCR总体系为50μL配制如下：10μLSYBR Greenl染料、正向引物1μL、反向引物1μL，dNTP 1μL，Taq聚合酶2μL，待测样品cDNA 5μL，ddH₂O30μL。轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。反应程序为93℃，2min预变性；93℃1min，55℃1min，72℃1min 40个循环；72℃，7min延伸。以Gapdh对照。采用比较(2-^ΔΔCT)法计算基因表达的相对水平。

实验结果：

枇杷叶提取物对LPS诱导小鼠肝脏生物节律基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2表达震荡衰弱的抑制作用见图6。如图6所示，腹腔注射LPS显著抑制了小鼠肝脏的生物节律基因的震荡表达，这些基因包括Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2。而口服饲喂枇杷叶提取物时，小鼠肝脏的生物节律基因震荡表达显著增强，LPS的诱导作用被抑制。即，当给C57小鼠灌胃枇杷叶提取物时，小鼠肝脏生物节律基因的震荡表达交LPS组显著增强，即相对于LPS组，LPS+LL处理组在某些时间点的表达显著升高或在某些时间点的表达显著降低，其中包括：Clock基因在5h的显著下调表达和21h的显著上调表达；Bmal1基因在5、9、13h点的显著下调表达和17h点的显著上调表达；Per1基因在5h和9h的显著上调表达；Per2基因在5h和9h的显著上调表达；Per3基因在9h和13h的显著上调表达；Cryl基因在13、17、21h的显著上调表达；Cry2基因在5、9、13h的显著上调表达；Rev-erbα基因在13h和17h的显著下调表达；Rev-erbβ基因在5h和9h的显著上调表达；Rorα基因在9h和13h的显著上调表达；Dbp基因在5h的显著上调表达；Npas2在5h的显著下调表达和在13、17、21h的显著上调表达。

以上结果说明，枇杷叶提取物具有抑制LPS诱导的小鼠肝脏生物节律基因震荡衰退的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种枇杷叶提取物及其制备方法和应用

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1773

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60

accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120

gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180

gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240

tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300

gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360

agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420

aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480

ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540

ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600

agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660

catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720

gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780

cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840

aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900

atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960

aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020

ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080

gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140

acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200

tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260

ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320

ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380

caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440

cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500

tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560

gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620

aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg aattctcacg gcttccctcc cgaggtggag 1680

gagcaggccg ccggcaccct gcccatgagc tgcgcccagg agagcggcat ggatagacac 1740

cctgctgctt gcgccagcgc caggatcaac gtc 1773

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgggtcact agaggcaagt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatctatgt ctgggcctgc 20

<210> 4

<211> 543

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgggtcact agaggcaagt tgtccttgtc tcaccctgag accctggaca caggtgcccg 60

cgcccttgag gtcacctctg tgagctggct gagggtctcc ctgccaggag ctgccaccat 120

gccaagctgg ggtcagccgt aggtcagcgc tgggttcaag ggaggctgga gagtaagggt 180

tgggcattat catctccaat gtccctaggc ccaagaaagg ggctccagca ctagggggcc 240

agaaagcttg acagtgtccc ctccatctct ttagagagac tttgctggcc accacctcct 300

ccatttgcag agggaattct cttcctagcc gcctgtcctt tggccctcca gctagccaac 360

ccgcaaacca tgccacctac aatgagagga agcagtgatc agcacagttg cctggtacat 420

agtagttgct cagtaaacaa ttggctgggt gcatgagtga atgagagggc cagtgagtgg 480

actggcaagg gcatggaggc ctgggtgcag agaggcccta caggcaggcc cagacataga 540

tgg 543

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccatggaa gatgccaaaa acattaaga 29

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacgttgatc ctggcgctg 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgggaggtct atataagcag ag 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaggagtag aaggtgggcg 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgcgaggaac aatagaccca a 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggcctatg tgtgcgttgt a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagggaagct cacagtcaga t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggacattgcg ttgcatgttg g 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gccaaccagg aatactacca gc 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtgtgtactc agacgtgatg tg 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gacatgagac caacgaaaac tgc 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggctaaagg tatctggact ctg 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcagaggaaa ttggcggaca 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggtttattgc gtctctccga g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctcctccaat gtgggcatca a 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccacgaatca caaacagacg g 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcccaaggct gttcaaggaa t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgcatcccgt tctttcccaa a 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tggactccaa caacaacaca g 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gatggtggga agtaggtggg 20

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tttagtggca tggttctact gtg 23

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agccttcgca agcatgaact 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

actcctgtcc tcgtcagaag a 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

catccctacg gcaaggcatt t 21

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ctgatcttgc cctatcaagc att 23

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cgatgtcttc gagggtcaaa g 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cgtgttggaa aaggtcatcg g 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tccagtcttg ctgaatgtca c 21

Claims

1.一种枇杷叶提取物，其特征在于，包括以下质量百分含量的组分：

2.根据权利要求1所述枇杷叶提取物，其特征在于，包括以下质量百分含量的组分：

3.根据权利要求1所述枇杷叶提取物，其特征在于，所述氨基酸及其衍生物包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-正亮氨酸、L-异亮氨酸、1-甲基哌啶-2-羧酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸丁酸酯、L-亮氨酸、L-缬氨酸、2,6-二氨基庚二酸、L-甲硫氨酸亚砜、L-酪氨酸、哌啶酸、L-酪胺、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-丝氨酸、环戊基甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酰-L-亮氨酸、L-亮氨酰-L-亮氨酸、L-组氨酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、N-甘氨酰-L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-甘氨酰-L-异亮氨酸、L-脯氨酰-L-亮氨酸和2-氨基异丁酸；

所述酚酸类化合物包括邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯、咖啡酸、4-硝基苯酚、阿魏酸、2-(甲酰氨基)苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、对香豆酸、3,4-二羟基苯甲酸、原儿茶酸、邻苯二甲酸酐、覆盆子苷、芥子醛、3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷、三羟基肉桂酰奎宁酸、丁香酸、香草酸、皂皮酸、丁香醛；4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛、3-O-阿魏酰奎宁酸、水杨酸-2-O-葡萄糖苷和1,3,5-苯三酚；

所述核苷酸及其衍生物包括2-羟基腺苷、鸟苷、鸟嘌呤、2'-脱氧腺苷、胞苷、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧肌苷-5'-单磷酸、胞嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤、6-甲基巯嘌呤、2'-脱氧胞苷、异鸟嘌呤、腺苷、胞嘧啶、胸苷、琥珀酰腺苷、9-(阿拉伯糖基)次黄嘌呤、5-脱氧-5-甲硫腺苷和2-(二甲基氨基)鸟苷；

所述黄酮类化合物包括异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-7-O-葡萄糖苷、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素-7-O-新橙皮糖苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、扁蓄苷、异甜橙黄酮、橙皮素-5-O-葡萄糖苷、橘皮素、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、柚皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、甜橙素、紫铆素、槲皮素-3-O-半乳糖苷、川陈皮素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、5,7,8,4'-四甲氧基黄酮、槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、橙皮素-7-O-芸香糖苷、高圣草酚、木犀草素-4'-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素、圣草次苷、山奈酚-3-O-(2”-对香豆酰)半乳糖苷、异柚葡萄糖苷、3',4',5,6,7-五甲氧基黄烷酮、山奈酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷、圣草酚、花旗松素-3'-O-葡萄糖苷、5-羟基酸橙黄酮、芹菜素-7-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-阿拉伯糖苷、5,4′-二羟基-3,6,7,3′-四甲氧基黄酮、6-羟基山奈酚-3,6-O-二葡萄糖苷、柚皮黄素-3-O-(3-羟基-3-甲基戊二酰)葡萄糖苷、荭草素-7-O-葡萄糖苷和丁香亭-7-O-葡萄糖苷；

所述木脂素和香豆素包括7-(6',7'-二羟基牻牛儿基氧基)香豆素、6',7'-二羟基佛手素、5,7-二甲氧基香豆素、橙皮内酯、7-甲氧基-5-异戊烯基氧基香豆素和酸橙素烯醇；

所述萜类化合物包括2α,19α-二羟基-3-氧熊果-12-烯-28-酸、山楂酸、2-羟基齐墩果酸、坡模酸、科罗索酸、委陵菜酸和榄香醇；

所述有机酸化合物包括壬二酸、甲基丙二酸、琥珀酸、柠檬酸、2-羟基肉桂酸、异柠檬酸、3-脱氢-L-苏糖酸、己二烯二酸、2-羟基十六烷酸、L-高丝氨酸、2,3-二羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、γ-氨基丁酸、D-木糖酸、3,5-二羟基-3-甲基戊酸、2,3-二羟基-3-甲基丁酸、4-乙酰氨基丁酸、反式乌头酸、异烟酸和己二酸；

所述脂质包括硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18:1(2n异构)、反油酸、溶血磷脂酰胆碱16:0、肉豆蔻酸、溶血磷脂酰乙醇胺18:1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18:1、11-十八碳烯酸、十八碳-9E,13E,15Z-三烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱16:1(2n异构)、溶血磷脂酰乙醇胺18:3(2n异构)、棕榈醛、溶血磷脂酰乙醇胺16:1(2n异构)、溶血磷脂酰乙醇胺16:0、十六烷基鞘胺醇、石榴酸、溶血磷脂酰胆碱16:0(2n异构)、溶血磷脂酰乙醇胺18:1、溶血磷脂酰胆碱18:0、溶血磷脂酰胆碱18:2、9,10,13-三羟基-11-十八碳烯酸、9S-羟基-10E,12Z-十八碳二烯酸、溶血磷脂酰胆碱17:2、13-羟基十八烷基-9,11-二烯酸、溶血磷脂酰胆碱16:1、二十碳烯酸、甘磷酸胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺18:3、溶血磷脂酰胆碱18:2(2n异构)、2-亚油酰甘油酯、溶血磷脂酰乙醇胺16:1和4-羟基鞘氨醇。

4.权利要求1～3任意一项所述枇杷叶提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述醇水溶液包括甲醇水溶液；

所述甲醇水溶液的体积浓度为68％～72％。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述分离的方法包括离心和滤膜过滤；

所述离心的转速为10000～15000rpm；所述离心的时间为5～12min。

7.权利要求1～3任意一项所述枇杷叶提取物或权利要求4～6任意一项所述制备方法制备的枇杷叶提取物在制备促进机体生物节律基因震荡表达的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述生物节律基因包括以下一种或几种：Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Rorα、Dbp和Npas2。

9.权利要求1～3任意一项所述枇杷叶提取物或权利要求4～6任意一项所述制备方法制备的枇杷叶提取物在制备预防和/或治疗生物节律基因震荡衰弱导致的疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述生物节律基因震荡衰弱导致的疾病包括以下一种或几种疾病：肥胖、失眠、炎症反应、胰岛素抵抗和神经退行性疾病。