CN114540417A - 一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源ripk3基因缺失细胞株的构建方法及其产品和应用 - Google Patents

一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源ripk3基因缺失细胞株的构建方法及其产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株的构建方法及其产品和应用，涉及生物技术领域。构建该细胞株的载体的构建方法包括：gRNA1‑F和gRNA1‑R退火形成双链1，双链1再与经BbsⅠ酶切的CRISPR/Cas9载体连接，得到pX459‑gRNA1；gRNA2‑F和gRNA2‑R退火形成双链2，双链2再与经BbsⅠ酶切的辅助载体连接，得到EZ‑gRNA2；以HindIII和XhoI对获得的pX459‑gRNA1和EZ‑gRNA2分别进行双酶切，回收线性化酶切产物后连接，得到所述载体。利用本发明的载体构建的猪源RIPK3基因缺失细胞株能够促进伪狂犬病毒的增殖。

Description

一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株的 构建方法及其产品和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株的构建方法及其产品和应用。
背景技术
猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，具有143kb的双链线性DNA，编码70多种蛋白质。PRV的自然宿主是猪，但它可以感染大多数哺乳动物，包括猪、牛、马、啮齿动物和狗，对养殖业危害巨大。近年来，多次发现人类感染PRV的情况发生。PRV在猪外周神经系统的三叉神经节中可建立终身潜伏感染。在某些情况下，PRV可重新激活，继而导致PRV在猪场的反复流行，难以控制和根除。目前，猪伪狂犬病的防控以疫苗接种为重要手段，其中以PRV Bartha-K61为代表。因此，提高PRVBartha-K61病毒产量对疫苗生产具有重要意义。
传统意义上，细胞死亡分为调控型(凋亡，apoptosis)和非调控型(坏死，necrosis)两种，前者能维持天然免疫沉默，而后者会引发炎症。越来越多的研究发现细胞坏死也可以是受调控的、炎症性的，即一种新型的细胞死亡机制，称为程序性细胞坏死。程序性细胞坏死的发生依赖于受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting proteinkinase 3，RIPK3)和混合谱系激酶结构域样(Mixed Lineage Kinase domain-like，MLKL)的信号级联反应。研究表明，病原体和宿主组织的性质决定了RIPK3是否对宿主有益。缺乏RIPK3的动物虽可以正常发育，但容易感染某些病毒。在RIPK3缺陷的环境中，坏死性小体可能触发caspase-8依赖性凋亡，而不是细胞程序性坏死。目前，尚不清楚RIPK3介导的病毒清除机制，这是因为RIPK3除了参与细胞程序性细胞坏死之外，还与细胞代谢、氧化应激的调控过程密切相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株的构建方法及其产品和应用，以解决上述现有技术存在的问题，为了构建可促进PRV Bartha-K61增殖的细胞株，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对PK15细胞的RIPK3基因对应的染色体序列进行双gRNA剪切，通过单克隆纯化获得了RIPK3基因缺失的PK15细胞株(RIPK3KO-PK)，本发明为PRVBartha-K61等疫苗株的培养滴度提高提供了新的策略。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)gRNA1-F和gRNA1-R退火形成双链1，双链1再与经BbsⅠ酶切的CRISPR/Cas9载体pX459 pSpCas9-2Apuro-MCS连接，得到pX459-gRNA1；
(2)gRNA2-F和gRNA2-R退火形成双链2，双链2再与经BbsⅠ酶切的辅助载体EZ-GuideXH连接，得到EZ-gRNA2；
(3)以HindIII和XhoI对获得的pX459-gRNA1和EZ-gRNA2分别进行双酶切，回收线性化酶切产物后连接，得到pX459-gRNA1-gRNA2，即为所述可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体；
所述gRNA1-F的序列为SEQ ID NO：1所示序列，所述gRNA1-R的序列为SEQ ID NO：2所示序列，所述gRNA2-F的序列为SEQ ID NO：3所示序列，所述gRNA2-R的序列为SEQ ID NO：4所示序列。
本发明还提供根据上述的构建方法构建得到的可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体。
本发明还提供一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株的构建方法，包括以下步骤：上述构建的可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体转染至PK15细胞中，再经筛选即可得到所述可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株。
本发明还提供根据上述的构建方法构建得到的可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株。
本发明还提供上述的可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体或可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株在促进伪狂犬病毒增殖中的应用。
进一步地，所述伪狂犬病毒为PRV GD-WH株或Bartha-K61株。
本发明公开了以下技术效果：
1.本发明构建的针对猪源RIPK3基因的CRISPR/Cas9双gRNA载体可用于猪源RIPK3基因缺失细胞株的构建；
2.经过本发明构建和筛选的猪源RIPK3基因缺失细胞株的能够促进伪狂犬病毒的增殖；
3.本发明为伪狂犬病毒Bartha-K61等疫苗株的培养滴度提高提供了新的策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为猪源RIPK3基因缺失PK15细胞染色体DNA的PCR扩增产物电泳图，其中，M为DNA分子量标准(DL2000)，1为PK15细胞染色体DNA的PCR产物，2为猪源RIPK3基因缺失PK15细胞染色体DNA的PCR产物；
图2为猪源RIPK3基因缺失PK15细胞RIPK3蛋白表达的Westernblot鉴定；
图3为荧光显微镜观察RIPK3蛋白在正常PK15细胞和源RIPK3基因缺失的RIPK3KO-PK细胞株的细胞质的分布；
图4为PRV GD-WH株在猪源RIPK3基因缺失PK15细胞的病毒滴度；
图5为PRVBartha-K61在猪源RIPK3基因缺失PK15细胞的病毒滴度；
图6为pX459-gRNA1-gRNA2的构建过程示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
细胞、病毒与质粒：猪肾上皮细胞(Porcine kidney epithelial cells,PK15)购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)、PRVBartha-K61疫苗株(PRVBartha-K61)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，PRV GD-WH株(PRV GD-WH)广东省农业科学院动物卫生研究所猪病研究室分离并保存。大肠杆菌Trans10感受态细胞购自全式金公司。CRISPR/Cas9载体质粒pX459 pSpCas9-2Apuro-MCS和辅助载体质粒EZ-GuideXH均购自addgene公司。
试剂和抗体：限制性核酸内切酶BbsⅠ、HindIII、XhoI均购自New England Biolabs公司。T4 DNA Ligase、T4 DNALigase buffer购自Takara Bio公司。Lipofectamine 3000转染试剂购自Thermo Fisher Scientific公司。本发明使用的商业抗体包括：HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体、兔抗RIPK3多克隆抗体、小鼠抗GAPH单克隆抗体购自Beyotime Biotechnology公司。
猪源RIPK3基因的CRISPR/Cas9双gRNA载体的构建：
根据猪源RIPK3基因对应的染色体序列(Gene ID:100153263)，设计两对特异性gRNA1和gRNA2，gRNA1的引物序列为gRNA1-F：5′-CACCGGCACCTACCAACTTGATGTC-3′(SEQ IDNO：1)和gRNA1-R：5′-AAACGACATCAAGTTGGTAGGTGCC-3′(SEQ ID NO：2)；gRNA2的引物序列为gRNA2-F：5′-CACCGGAAGCCTGGAGTGGGCCACA-3′(SEQ ID NO：3)和gRNA2-R：5′-AAACTGTGGCCCACTCCAGGCTTCC-3′(SEQ ID NO：4)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将合成后gRNA引物退火形成双链，分别与经BbsⅠ酶切的CRISPR/Cas9载体pX459pSpCas9-2Apuro-MCS和辅助载体EZ-GuideXH通过T4 DNALigase(16℃)连接过夜，获得pX459-gRNA1和EZ-gRNA2质粒。以HindIII、XhoI对获得的两个重组质粒进行双酶切。回收后将线性化酶切产物16℃连接过夜，随后转化至Trans10感受态细胞中，通过氨苄抗性平板筛选挑取单克隆，进行菌落PCR筛选，获得携带双gRNA的CRISPR/Cas9质粒pX459-gRNA1-gRNA2(构建过程参见图6)，并测序鉴定。
猪源RIPK3基因的缺失和单克隆细胞株的筛选：
转染前将生长状态良好的PK15细胞接种至6孔细胞培养板中培养，当细胞密度达到70％～80％时，按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书将5μg上述构建好的pX459-gRNA1-gRNA2质粒转染至PK15细胞中。转染24h后，更换含有0.7μg/mL嘌呤霉素、10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM培养基中进行加压筛选。连续筛选5d，观察到阴性对照组细胞全部死亡。将得到的阳性细胞(编号为RIPK3 KO-PK)继续培养一周后消化成单个细胞，使用有限稀释法将药物筛选得到的阳性细胞稀释至96孔板中继续培养，约两周后挑选出生长状态良好的单克隆细胞进行鉴定。
猪源RIPK3基因缺失的鉴定：
从96孔板中挑选出生长状态良好的单克隆细胞进行扩大培养，连续传代到P10代后进行PCR、测序和Western blot对猪源RIPK3基因的稳定敲除效果进行鉴定。取部分细胞提取细胞DNA，使用针对敲除靶点设计的特异性引物对猪源RIPK3基因对应的染色体序列进行PCR扩增，引物序列为RIPK3-F：5′-GCCATCTCTTACCTCCCCTGA-3′(SEQ ID NO：5)和RIPK3-R：5′-AAACTAAGGCTGGAAGGGAGCA-3′(SEQ ID NO：6)。
凝胶电泳检测PCR扩增结果，结果如图1所示：M为DNA分子量标准(DL2000)，1为PK15细胞染色体DNA的PCR产物，2为猪源RIPK3基因缺失PK15细胞染色体DNA的PCR产物。正常细胞染色体DNA的扩增片段长度为4090bp，而RIPK3基因缺失细胞株染色体DNA的扩增片段长度为1075bp。PCR扩增产物送至生工生物科技有限责任公司进行测序，RIPK3基因缺失细胞株染色体DNA有3015bp的碱基缺失。
通过Western blot检测RIPK3蛋白水平的表达，结果如图2所示，猪源RIPK3基因缺失的RIPK3 KO-PK细胞株不存在RIPK3的蛋白表达。利用间接免疫荧光技术进一步验证RIPK3 KO-PK细胞株RIPK3蛋白的缺失情况，结果如图3所示，在荧光显微镜下可观察到RIPK3蛋白在正常PK15细胞的细胞质的分布，而在猪源RIPK3基因缺失的RIPK3 KO-PK细胞株的细胞质则不能观察到RIPK3蛋白的分布。
猪源RIPK3基因缺失细胞株对PRV增殖的促进作用分析：
以MOI＝10的PRV GD-WH和PRV Bartha-K61分别感染PK15和RIPK3 KO-PK细胞，并置于37℃、5％CO2培养箱吸附1h。吸附结束后弃去接种物，用PBS清洗细胞3次，更换为维持培养基进行培养。按照12h、24h、36h不同时间点收取细胞上清病毒液，将病毒液反复冻融三次，离心取上清液，将上清液分别10倍梯度稀释，感染96孔板中的PK15细胞，病毒感染后共观察4d，记录各孔的病变情况。按照Reed-Muench法测定各上清液的PRV GD-WH株和PRVBartha-K61株滴度。结果如图4和图5所示，猪源RIPK3基因缺失的RIPK3 KO-PK细胞株可明显促进PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的增殖滴度。
从实施例1可以看出，成功获得了猪源RIPK3基因缺失的PK15细胞株，该细胞株对PRV GD-WH株和Bartha-K61株的增殖具有明显的促进作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株的构建方法及其产品和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccggcacc taccaacttg atgtc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacgacatc aagttggtag gtgcc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccggaagc ctggagtggg ccaca 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaactgtggc ccactccagg cttcc 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccatctctt acctcccctg a 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaactaaggc tggaagggag ca 22

Claims (6)

1.一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)gRNA1-F和gRNA1-R退火形成双链1，双链1再与经BbsⅠ酶切的CRISPR/Cas9载体pX459 pSpCas9-2Apuro-MCS连接，得到pX459-gRNA1；
(2)gRNA2-F和gRNA2-R退火形成双链2，双链2再与经BbsⅠ酶切的辅助载体EZ-GuideXH连接，得到EZ-gRNA2；
(3)以HindIII和XhoI对获得的pX459-gRNA1和EZ-gRNA2分别进行双酶切，回收线性化酶切产物后连接，得到pX459-gRNA1-gRNA2，即为所述可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体；
所述gRNA1-F的序列为SEQ ID NO：1所示序列，所述gRNA1-R的序列为SEQ ID NO：2所示序列，所述gRNA2-F的序列为SEQ ID NO：3所示序列，所述gRNA2-R的序列为SEQ ID NO：4所示序列。
2.根据权利要求1所述的构建方法构建得到的可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体。
3.一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2构建的可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体转染至PK15细胞中，再经筛选即可得到所述可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株。
4.根据权利要求3所述的构建方法构建得到的可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株。
5.根据权利要求2所述的可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失的CRISPR/Cas9双gRNA载体或权利要求4所述的可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株在促进伪狂犬病毒增殖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述伪狂犬病毒为PRV GD-WH株或Bartha-K61株。
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