CN114540345A - 一种发夹结构的标签荧光探针和荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发夹结构的标签荧光探针和荧光检测方法，属于荧光检测技术领域。标签荧光探针包括空间子、标签序列和两段互补的信号序列，两段信号序列配对形成发夹结构且其分别被相互作用的荧光报告基团和淬灭基团所修饰；一条信号序列的3’端与标签序列的5’端连接，其上修饰有淬灭基团或荧光报告基团，其5’端通过空间子与另一条信号序列的3’端连接；另一条信号序列的5’端修饰有荧光报告基团或淬灭基团，标签序列的3’端封闭或不封闭。方法包括：让扩增后的DNA序列的3’端连接有与标签序列互补的标签互补序列，标签荧光探针对标签互补序列进行捕获并在taq DNA聚合酶的作用下进行荧光检测。
Description
技术领域
本发明属于荧光检测技术领域，特别涉及一种发夹结构的标签荧光探针和荧光检测方法。
背景技术
光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET) 是依赖于供体和受体分子间距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子。LAKOWICZ J R． Energy Transfer: InPrinciples of Fluorescence Spectroscopy［M］ ． New York: Plenum Press，1983．CLEGG R． Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy［M］ ． New York:Wiley， 1996． 当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子） 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
供体和受体之间的 FRET 效率(E) 与分子间的空间距离(r) 满足6次方的关系：E=1/1+(R/R0)exp6其中R0 为 F rster 半径，是指 E为 50% 时供体与受体间的距离。FRSTER T．Intermolecular energy migration and fluorescence［J］．Ann Phys， 1948，2: 55－75．由于FRET 信号来自于两种基团的相互作用且对距离大小极度敏感，所以 FRET技术是一种高灵敏、高特异性的荧光分析方法，现今已经被广泛应用于分析传感及生物医学等研究领域。Conway J R W, Carragher N O, Timpson P. Developments inpreclinical cancer imaging：innovating the discovery of therapeutics. NatureReviews Cancer, 2014, 14(5): 314-328。
如申请号为US 7615620 B2的专利利用了前述原理对核苷酸进行荧光检测，通过分别具有能相互作用的淬灭标记基团与荧光标记基团的两种互补序列实现，淬灭标记基团与荧光标记基团的距离变化会使特定频率荧光强度发生变化，通过荧光检测即可检测相应序列是否存在或其浓度。
但是前述专利存在需要将两种互补序列以特定的比例配置才能达到效果，另外，在反应体系中，两种互补序列的相互作用存在随机性，导致检测结果并不精确。
发明内容
一方面，本发明实施例提供了一种发夹结构的标签荧光探针，包括空间子、标签序列和两段互补的信号序列，两段信号序列配对形成发夹结构且其分别被相互作用的荧光报告基团和淬灭基团所修饰；一条信号序列的3’端与标签序列的5’端连接，其上修饰有淬灭基团或荧光报告基团，其5’端通过空间子与另一条信号序列的3’端连接；另一条信号序列的5’端修饰有荧光报告基团或淬灭基团且其上的荧光报告基团或淬灭基团能在taq DNA聚合酶的作用下切除，所述标签序列的3’端封闭或不封闭。
其中，本发明实施例中的信号序列的长度为6-30bp。
其中，本发明实施例中的标签序列为与待检测DNA具有特异性的DNA序列，其来自自然核苷酸或非自然核苷酸，其进行或不进行硫代修饰，其长度为6-40bp。
其中，本发明实施例中的空间子选自C18、C12、C9、C6或C3。
其中，本发明实施例中的荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、Cy5、Cy3或JOE，所述淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。
具体地，本发明实施例中的标签序列的3’端通过ddNTP、空间子修饰或3端磷酸化修饰进行封闭。
优选地，本发明实施例中的另一条信号序列的5’端还连有一个T碱基，所述荧光报告基团或淬灭基团位于该T碱基上。
具体地，本发明实施例中的一条信号序列被BHQ1所修饰，其5’端通过C18与另一条信号序列的3’端连接；另一条信号序列的5’端还连有一个被FAM或VIC所修饰的T碱基，所述标签序列的3’端通过ddNTP封闭。
另一方面，本发明实施例还提供了一种荧光检测方法，所述方法包括：让扩增后的DNA序列的3’端连接有与标签序列互补的标签互补序列，前述标签荧光探针对标签互补序列进行捕获并在taq DNA聚合酶的作用下进行荧光检测。
具体地，本发明提供的荧光检测方法包括：
(1)制备退火引物F：在包含检测位点的上游引物的5’端连接标签序列得到退火引物F；
(2)制备模板N+：退火引物F与待检测DNA序列在聚合酶的作用下延伸生成模板N+，升温解链让模板N+与待检测DNA序列分离；
(3)制备模板N-：以模板N+为模板，下游引物R在聚合酶的作用下延伸生成模板N-，升温解链让模板N+与模板N-分离，所述模板N-的3’端为标签互补序列；
(4)荧光检测：标签荧光探针的标签序列对模板N-的3’端进行捕获，模板N-的3’端被捕获时在taq DNA聚合酶的作用下标签荧光探针的5’端释放淬灭基团或荧光报告基团，进行荧光检测。
本发明提供的发夹结构的标签荧光探针和荧光检测方法具有如下有益效果：
1、设计一段核苷酸序列作为标签序列，该核苷酸标签序列在待检测的靶标基因序列中不存在同源序列，将目的靶标的引物核苷酸序列的5’端加上该标签序列，所增加的核苷酸序列与发夹结构的标签荧光探针的标签序列相同，制备加标签的靶核苷酸引物F，引物F在pcr反应退火时与模板匹配延伸后生成含有标签序列的模板N+。引物R在pcr反应退火时与模板N+互补配对延伸生成模板N-。
2、发夹结构的标签荧光探针由荧光报告基团修饰的核苷酸序列、淬灭基团修饰的核苷酸序列和3’端封闭的标签核苷酸序列组成，荧光报告基团修饰的核苷酸序列和淬灭基团修饰的核苷酸序列为一对碱基互补配对的核苷酸序列且其通过空间子（spacer）连接，标签核苷酸序列与荧光报告基团修饰的核苷酸序列或淬灭基团修饰的核苷酸序列通过核苷酸间的磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接。荧光报告基团修饰的核苷酸序列、淬灭基团修饰的核苷酸序列为一对碱基互补配对的核苷酸序列，其在退火温度（55℃-68℃）下为稳定的双链结构。
3、标签核苷酸序列与N-在退火温度（55℃-68℃）下结合形成成双链结构，在TaqDNA聚合酶 5´ →3´ 聚合酶活性下延伸，5´端的荧光报告基团或淬灭基团修饰的核苷酸在Taq DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性下被酶切降解，发夹结构的标签荧光探针的荧光报告基团或淬灭基团被分离开，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
4、含有标签的靶标核苷酸序列引物F，与另一条靶标基因引物R对靶标基因进行pcr扩增。所得PCR产物指数扩增，标签序列互补序列数量也指数扩增。发夹结构的标签荧光探针捕获PCR产物3’端的标签序列互补序列，在taq酶5’到3’外切酶作用下将发夹结构的标签荧光探针5’端修饰的荧光报告基团或淬灭基团的核苷酸酶切，使得荧光报告基团和淬灭基团分离。荧光监测系统通过是否接收到指数增涨的荧光信号来判断是否含有靶标基因序列。
5、本发明可通过改变引物F序列和引物R序列用于检测不同的靶标序列。
6、可用于聚合酶链式反应的荧光pcr检测单核苷酸多态性、基因芯片检测单核苷酸多态性和荧光pcr检测靶标基因，尤其适用于基因的多态性位点检测。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种发夹结构的标签荧光探针的结构示意图；
图2是本发明实施例提供的另一种发夹结构的标签荧光探针的结构示意图；
图3是采用一种发夹结构的标签荧光探针的荧光检测方法的过程图；
图4是采用另一种发夹结构的标签荧光探针的荧光检测方法的过程图；
图5是本发明实施例提供的荧光检测方法的流程图；
图6是实施例3中 rs1801131 质粒 T T 纯合的阳性对照图；
图7是实施例3中 rs1801131 质粒 G G纯合的阳性对照图；
图8是实施例3中 rs1801131 质粒 T G 杂合的阳性对照图；
图9是实施例3中样本1的检测结果的荧光检测图；
图10是实施例3中样本2的检测结果的荧光检测图；
图11是实施例3中水的阴性对照图；
图12是实施例4中rs1801133 质粒 A A 纯合的阳性对照图；
图13是实施例4中 rs1801133 质粒 G G纯合的阳性对照图；
图14是实施例4中 rs1801133 质粒G A 杂合的阳性对照图；
图15是实施例4中样本1的检测结果的荧光检测图；
图16是实施例4中样本2的检测结果的荧光检测图；
图17是实施例4中水的阴性对照图。
图中：1标签序列、2信号序列、3空间子、4淬灭基团、5荧光报告基团、6封闭端。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
参见图1和2，实施例1提供了一种发夹结构的标签荧光探针，包括空间子3、标签序列1和两段互补的信号序列2，两段信号序列2配对形成发夹结构（双螺旋结构）且其分别被相互作用的荧光报告基团5和淬灭基团4所修饰。一条信号序列2的3’端与标签序列1的5’端连接，其上修饰有淬灭基团4或荧光报告基团5，其5’端通过空间子3与另一条信号序列2的3’端连接。另一条信号序列2的5’端修饰有荧光报告基团5或淬灭基团4且其上的荧光报告基团5或淬灭基团4能在taq DNA聚合酶的作用下切除，标签序列1的3’端封闭或不封闭（优选封闭，形成封闭端6）。淬灭基团4和荧光报告基团5通常设于T碱基上。
其中，本发明实施例中的信号序列2的长度为6-30bp。
其中，本发明实施例中的标签序列1为与待检测DNA具有特异性的DNA序列，其来自自然核苷酸或非自然核苷酸，其进行或不进行硫代修饰，其长度为6-40bp。
其中，本发明实施例中的空间子3选自C18、C12、C9、C6或C3等，具体可以为C18。
其中，本发明实施例中的荧光报告基团5选自FAM、VIC、HEX、ROX、Cy5、Cy3或JOE等，具体可以为FAM或VIC；淬灭基团4选自BHQ1或BHQ2等，具体可以为BHQ1。
具体地，本发明实施例中的标签序列1的3’端可以通过ddNTP、空间子修饰或3端磷酸化修饰等进行封闭，具体可以为ddNTP。
优选地，本发明实施例中的另一条信号序列2的5’端还连有一个T碱基（相对于一条信号序列2多一个T碱基），荧光报告基团5或淬灭基团4位于该T碱基上。
具体地，本发明实施例中的一条信号序列2被BHQ1所修饰，其5’端通过C18与另一条信号序列2的3’端连接。另一条信号序列2的5’端还连有一个被FAM或VIC所修饰的T碱基，标签序列1的3’端通过ddNTP封闭。
实施例2
实施例2提供了一种荧光检测方法，该方法包括：让扩增（具体采用ARMS法）后的DNA序列的3’端连接有与标签序列互补的标签互补序列，实施例1公开的标签荧光探针对标签互补序列进行捕获并在taq DNA聚合酶的作用下进行荧光检测。
具体地，参见图3-5，本发明提供的荧光检测方法包括：
(1)制备退火引物F：在包含检测位点的上游引物（与常规技术一致）的5’端连接标签序列得到退火引物F。其中，退火引物F的长度为6-40bp，其上游引物的5’端可设置错配位点或其与标签序列之间添加碱基来优化引物二级结构的或/和为了平衡两个位点引物F的Tm值。
(2)制备模板N+：退火引物F与待检测DNA序列在聚合酶的作用下延伸生成模板N+，升温解链让模板N+与待检测DNA序列分离。
(3)制备模板N-：以模板N+为模板，下游引物R（与常规技术一致）在聚合酶的作用下延伸生成模板N-，升温解链让模板N+与模板N-分离。其中，模板N-的3’端为标签互补序列。
(4)荧光检测：在退火温度（56℃-68℃）下，标签荧光探针的标签序列对模板N-的3’端进行捕获，模板N-的3’端被捕获时在taq DNA聚合酶的作用下标签荧光探针的5’端释放淬灭基团或荧光报告基团以发出荧光，进行荧光检测。
其中，在本实施例中，标签荧光探针可以在步骤(1)-(4)中的某一个步骤中加入，如在步骤(1)中加入，或在步骤(4)中加入（荧光探针制成检测芯片）。
实施例3
本实施例将本发明发夹标签探针与ARMS技术结合使用用于检测点突变。
突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)，是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测。
实施例3为本专利的标签荧光探针用于基因分型的具体实例，过程如下：
MTHFR A1298C rs1801131 T>G 分型验证
1、合成含有MTHFR A1298C rs1801131 T>G质粒序列
MTHFR T 序列：
CCAACTTACCCTTCTCCCTTTGCCATGTCCACAGCATGGAGGGGAGGGCACAGGATGGGGAAGTCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTGGGGTCAGGCCAGGGGCAGGGGATGAACCAGGGTCCCCACTCCAGCATCACTCACTTTGTGACCATTCCGGTTTGGTTCTCCCGAGAGGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACTTTCTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCACATCTTCAGCAGCTCCTCCTTGGGGGACTTGCTCTTCAGGTAGAAGAGGTAGTAGTCCTTCAGCTCCCCAAAGGCAGGGGAAGAGGAATTGCCCCTGGCAGAGGGGTGCCCAGAGGTCAGGGCACACTCCTGACAGAGGGCAGTGCCACCACATGCCCAGGAGGCCAGACGGTGCGGTGAGAGTGGGGTGGAGGGAGCTTATGGGCTCTCCTGGGCCCCTCACCTGGATGGGAAAGATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAACCTGCCAATAGGGATGACAGTCAGGAGAGGCTGGCCTCCACCTGTTCAAGGCGAGGGATGAAGAGACCACAGGGACTGGGCAGAGAGAGTCCTCTGCTTTGGGGGCTCTGATCTTGCACCTTCCAACAGCACAGCACAGCCTGAACT。
MTHFR G 序列：
CCAACTTACCCTTCTCCCTTTGCCATGTCCACAGCATGGAGGGGAGGGCACAGGATGGGGAAGTCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTGGGGTCAGGCCAGGGGCAGGGGATGAACCAGGGTCCCCACTCCAGCATCACTCACTTTGTGACCATTCCGGTTTGGTTCTCCCGAGAGGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACTTGCTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCACATCTTCAGCAGCTCCTCCTTGGGGGACTTGCTCTTCAGGTAGAAGAGGTAGTAGTCCTTCAGCTCCCCAAAGGCAGGGGAAGAGGAATTGCCCCTGGCAGAGGGGTGCCCAGAGGTCAGGGCACACTCCTGACAGAGGGCAGTGCCACCACATGCCCAGGAGGCCAGACGGTGCGGTGAGAGTGGGGTGGAGGGAGCTTATGGGCTCTCCTGGGCCCCTCACCTGGATGGGAAAGATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAACCTGCCAATAGGGATGACAGTCAGGAGAGGCTGGCCTCCACCTGTTCAAGGCGAGGGATGAAGAGACCACAGGGACTGGGCAGAGAGAGTCCTCTGCTTTGGGGGCTCTGATCTTGCACCTTCCAACAGCACAGCACAGCCTGAACT。
载体为 pUC57 抗性 Ampicillin 序列：
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC。
2、人全基因组样本MTHFR A1298C rs1801131 T>G位点测序
样本1测序结果
rs1801131 1 11854476 GT；
样本2测序结果
rs1801131 1 11854476 TT。
3、合成引物序列：
rs1801131 AF9： AGCATCGACCTCCACTCTCAGGAGCTGACCAGTGAAGA；
rs1801131 BF10： ACCACCTCGTAGCAGTGACTGGAGCTGACCAGTGAAGC；
rs1801131 R1： TCACTTTGTGACCATTCCGGT。
AF9和BF10分别为用于检测两种基因型的引物F；对于AF9：序列AGCATCGACCTCCACTCT为标签序列（探针SUPC）相同的序列，序列CAGGAGCTGACCAGTGAAGA为上游引物序列（对应MTHFR T 序列第3行的TCTTCACTGGTCAGCTCCT）；对于BF10：序列ACCACCTCGTAGCAGTGA为标签序列（探针SUPB）相同的序列，序列CTGGAGCTGACCAGTGAAGC为上游引物序列（对应MTHFR G 序列第3行的GCTTCACTGGTCAGCTCCT）；对于R1：TCACTTTGTGACCATTCCGGT为对应MTHFR T 序列和MTHFR G 序列第2行和第3行的TCACTTTGTGACCATTCCGGT。两条上游引物序列除了变异位点，还有一个错配位点以保证扩增正常进行（是用来优化引物二级结构的或/和为了平衡两个位点引物F的Tm值）。
4、探针合成序列
对于SUPB：TGCAGCCGCC为一条信号序列，GGCGGCTGCA为另一条信号序列，ACCACCTCGTAGCAGTGA为标签序列；
对于SUPC：CCGAGGCCGC为一条信号序列，GCGGCCTCGG为另一条信号序列，AGCATCGACCTCCACTCT为标签序列。
5、PCR反应体系如表1所述：
表1
6、实时荧光定量PCR仪反应程序设置如表2所示：
表2
从图6-11可以看出，采用本专利检测的样品结果与对应的阳性对照的结果基本相同，结果准确。
实施例4：
实施例4为本专利的标签荧光探针用于基因分型的具体实例，过程如下：
MTHFR C677T rs1801133 G>A 分型验证
1、合成含有MTHFR C677T rs1801133 G>A质粒序列
MTHFR G 序列：
CCAACTTACCCTTCTCCCTTTGCCATGTCCACAGCATGGAGGGGAGGGCACAGGATGGGGAAGTCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTGGGGTCAGGCCAGGGGCAGGGGATGAACCAGGGTCCCCACTCCAGCATCACTCACTTTGTGACCATTCCGGTTTGGTTCTCCCGAGAGGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACTTTCTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCACATCTTCAGCAGCTCCTCCTTGGGGGACTTGCTCTTCAGGTAGAAGAGGTAGTAGTCCTTCAGCTCCCCAAAGGCAGGGGAAGAGGAATTGCCCCTGGCAGAGGGGTGCCCAGAGGTCAGGGCACACTCCTGACAGAGGGCAGTGCCACCACATGCCCAGGAGGCCAGACGGTGCGGTGAGAGTGGGGTGGAGGGAGCTTATGGGCTCTCCTGGGCCCCTCACCTGGATGGGAAAGATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAACCTGCCAATAGGGATGACAGTCAGGAGAGGCTGGCCTCCACCTGTTCAAGGCGAGGGATGAAGAGACCACAGGGACTGGGCAGAGAGAGTCCTCTGCTTTGGGGGCTCTGATCTTGCACCTTCCAACAGCACAGCACAGCCTGAACT。
MTHFR A 序列：
CCAACTTACCCTTCTCCCTTTGCCATGTCCACAGCATGGAGGGGAGGGCACAGGATGGGGAAGTCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTGGGGTCAGGCCAGGGGCAGGGGATGAACCAGGGTCCCCACTCCAGCATCACTCACTTTGTGACCATTCCGGTTTGGTTCTCCCGAGAGGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACTTGCTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCACATCTTCAGCAGCTCCTCCTTGGGGGACTTGCTCTTCAGGTAGAAGAGGTAGTAGTCCTTCAGCTCCCCAAAGGCAGGGGAAGAGGAATTGCCCCTGGCAGAGGGGTGCCCAGAGGTCAGGGCACACTCCTGACAGAGGGCAGTGCCACCACATGCCCAGGAGGCCAGACGGTGCGGTGAGAGTGGGGTGGAGGGAGCTTATGGGCTCTCCTGGGCCCCTCACCTGGATGGGAAAGATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAACCTGCCAATAGGGATGACAGTCAGGAGAGGCTGGCCTCCACCTGTTCAAGGCGAGGGATGAAGAGACCACAGGGACTGGGCAGAGAGAGTCCTCTGCTTTGGGGGCTCTGATCTTGCACCTTCCAACAGCACAGCACAGCCTGAACT。
载体为 pUC57 抗性 Ampicillin 序列：
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC。
2、人全基因组样本MTHFR C677T rs1801133 G>A位点测序
样本1测序结果
rs1801133 1 11856378 GG；
样本2测序结果
rs1801133 1 11856378 AA。
3、合成引物序列：
rs1801133 AF11：AGCATCGACCTCCACTCTCAAGGTGTCTGCGGGAGT；
rs1801133 BF12：ACCACCTCGTAGCAGTGACAGGTGTCTGCGGGAGC；
rs1801133 R3：CGGTGCATGCCTTCACAAAG。
AF11和BF12分别为用于检测两种基因型的引物F；对于AF11：序列AGCATCGACCTCCACTCT为标签序列（探针SUPC）相同的序列，序列CAAGGTGTCTGCGGGAGT为上游引物序列（对应MTHFR A 序列第8行的ACTCCCGCAGACACCTT），相对于BF12的上游引物序列多了一个A碱基，以平衡两个位点引物F的Tm值；对于BF12：序列ACCACCTCGTAGCAGTGA为标签序列（探针SUPB）相同的序列，序列CAGGTGTCTGCGGGAGC为上游引物序列（对应MTHFR G 序列第8行的GCTCCCGCAGACACCTT）；对于R3：CGGTGCATGCCTTCACAAAG为对应MTHFR A 序列和MTHFRG 序列第7行的CGGTGCATGCCTTCACAAAG。
3、探针合成序列
对于SUPB：TGCAGCCGCC为一条信号序列，GGCGGCTGCA为另一条信号序列，ACCACCTCGTAGCAGTGA为标签序列；
对于SUPC：CCGAGGCCGC为一条信号序列，GCGGCCTCGG为另一条信号序列，AGCATCGACCTCCACTCT为标签序列。
4、PCR反应体系如表3所示：
表3
5、实时荧光定量PCR仪反应程序设置如表4所示：
表4
从图12-17可以看出，采用本专利检测的样品结果与对应的阳性对照的结果基本相同，结果准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉蓝沙医学检验实验室有限公司
<120> 一种发夹结构的标签荧光探针和荧光检测方法
<130> 2021.11.3
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 796
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccaacttacc cttctccctt tgccatgtcc acagcatgga ggggagggca caggatgggg 60
aagtcacagc cccgcagcct ggcctgcagc tggggtcagg ccaggggcag gggatgaacc 120
agggtcccca ctccagcatc actcactttg tgaccattcc ggtttggttc tcccgagagg 180
taaagaacga agacttcaaa gacactttct tcactggtca gctcctcccc ccacatcttc 240
agcagctcct ccttggggga cttgctcttc aggtagaaga ggtagtagtc cttcagctcc 300
ccaaaggcag gggaagagga attgcccctg gcagaggggt gcccagaggt cagggcacac 360
tcctgacaga gggcagtgcc accacatgcc caggaggcca gacggtgcgg tgagagtggg 420
gtggagggag cttatgggct ctcctgggcc cctcacctgg atgggaaaga tcccggggac 480
gatggggcaa gtgatgccca tgtcggtgca tgccttcaca aagcggaaga atgtgtcagc 540
ctcaaagaaa agctgcgtga tgatgaaatc ggctcccgca gacaccttct ccttcaagtg 600
cttcaggtca gcctcaaagc tccctgcttc ggggtggcct ttggggtaac ctgccaatag 660
ggatgacagt caggagaggc tggcctccac ctgttcaagg cgagggatga agagaccaca 720
gggactgggc agagagagtc ctctgctttg ggggctctga tcttgcacct tccaacagca 780
cagcacagcc tgaact 796
<210> 2
<211> 796
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccaacttacc cttctccctt tgccatgtcc acagcatgga ggggagggca caggatgggg 60
aagtcacagc cccgcagcct ggcctgcagc tggggtcagg ccaggggcag gggatgaacc 120
agggtcccca ctccagcatc actcactttg tgaccattcc ggtttggttc tcccgagagg 180
taaagaacga agacttcaaa gacacttgct tcactggtca gctcctcccc ccacatcttc 240
agcagctcct ccttggggga cttgctcttc aggtagaaga ggtagtagtc cttcagctcc 300
ccaaaggcag gggaagagga attgcccctg gcagaggggt gcccagaggt cagggcacac 360
tcctgacaga gggcagtgcc accacatgcc caggaggcca gacggtgcgg tgagagtggg 420
gtggagggag cttatgggct ctcctgggcc cctcacctgg atgggaaaga tcccggggac 480
gatggggcaa gtgatgccca tgtcggtgca tgccttcaca aagcggaaga atgtgtcagc 540
ctcaaagaaa agctgcgtga tgatgaaatc gactcccgca gacaccttct ccttcaagtg 600
cttcaggtca gcctcaaagc tccctgcttc ggggtggcct ttggggtaac ctgccaatag 660
ggatgacagt caggagaggc tggcctccac ctgttcaagg cgagggatga agagaccaca 720
gggactgggc agagagagtc ctctgctttg ggggctctga tcttgcacct tccaacagca 780
cagcacagcc tgaact 796
<210> 3
<211> 2710
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg 480
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 540
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 600
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 660
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 720
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 780
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 840
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 900
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 960
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 1020
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 1080
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1140
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1200
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 1260
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1320
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1380
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1440
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1500
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1560
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1620
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1680
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1740
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1800
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1860
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1920
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1980
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2040
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2100
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2160
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2220
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2280
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2340
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2400
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2460
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2520
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2580
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2640
gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2700
ccctttcgtc 2710
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<212> DNA
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<400> 4
agcatcgacc tccactctca ggagctgacc agtgaaga 38
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
accacctcgt agcagtgact ggagctgacc agtgaagc 38
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<212> DNA
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<400> 6
tcactttgtg accattccgg t 21
<210> 7
<211> 796
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ccaacttacc cttctccctt tgccatgtcc acagcatgga ggggagggca caggatgggg 60
aagtcacagc cccgcagcct ggcctgcagc tggggtcagg ccaggggcag gggatgaacc 120
agggtcccca ctccagcatc actcactttg tgaccattcc ggtttggttc tcccgagagg 180
taaagaacga agacttcaaa gacactttct tcactggtca gctcctcccc ccacatcttc 240
agcagctcct ccttggggga cttgctcttc aggtagaaga ggtagtagtc cttcagctcc 300
ccaaaggcag gggaagagga attgcccctg gcagaggggt gcccagaggt cagggcacac 360
tcctgacaga gggcagtgcc accacatgcc caggaggcca gacggtgcgg tgagagtggg 420
gtggagggag cttatgggct ctcctgggcc cctcacctgg atgggaaaga tcccggggac 480
gatggggcaa gtgatgccca tgtcggtgca tgccttcaca aagcggaaga atgtgtcagc 540
ctcaaagaaa agctgcgtga tgatgaaatc ggctcccgca gacaccttct ccttcaagtg 600
cttcaggtca gcctcaaagc tccctgcttc ggggtggcct ttggggtaac ctgccaatag 660
ggatgacagt caggagaggc tggcctccac ctgttcaagg cgagggatga agagaccaca 720
gggactgggc agagagagtc ctctgctttg ggggctctga tcttgcacct tccaacagca 780
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<210> 8
<211> 796
<212> DNA
<213> 人工合成
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ccaacttacc cttctccctt tgccatgtcc acagcatgga ggggagggca caggatgggg 60
aagtcacagc cccgcagcct ggcctgcagc tggggtcagg ccaggggcag gggatgaacc 120
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<211> 2710
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
cggtgcatgc cttcacaaag 20
Claims (10)
1.一种发夹结构的标签荧光探针，其特征在于，包括空间子、标签序列和两段互补的信号序列，两段信号序列配对形成发夹结构且其分别被相互作用的荧光报告基团和淬灭基团所修饰；一条信号序列的3’端与标签序列的5’端连接，其上修饰有淬灭基团或荧光报告基团，其5’端通过空间子与另一条信号序列的3’端连接；另一条信号序列的5’端修饰有荧光报告基团或淬灭基团且其上的荧光报告基团或淬灭基团能在taq DNA聚合酶的作用下切除，所述标签序列的3’端封闭或不封闭。
2.根据权利要求1所述的发夹结构的标签荧光探针，其特征在于，所述信号序列的长度为6-30bp。
3.根据权利要求1所述的发夹结构的标签荧光探针，其特征在于，所述标签序列为与待检测DNA具有特异性的DNA序列，其来自自然核苷酸或非自然核苷酸，其进行或不进行硫代修饰，其长度为6-40bp。
4.根据权利要求1所述的发夹结构的标签荧光探针，其特征在于，所述空间子选自C18、C12、C9、C6或C3。
5.根据权利要求1所述的发夹结构的标签荧光探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、Cy5、Cy3或JOE，所述淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。
6.根据权利要求1所述的发夹结构的标签荧光探针，其特征在于，所述标签序列的3’端通过ddNTP、空间子修饰或3端磷酸化修饰进行封闭。
7.根据权利要求1所述的发夹结构的标签荧光探针，其特征在于，另一条信号序列的5’端还连有一个T碱基，所述荧光报告基团或淬灭基团位于该T碱基上。
8.根据权利要求1所述的发夹结构的标签荧光探针，其特征在于，一条信号序列被BHQ1所修饰，其5’端通过C18与另一条信号序列的3’端连接；另一条信号序列的5’端还连有一个被FAM或VIC所修饰的T碱基，所述标签序列的3’端通过ddNTP封闭。
9.一种荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括：让扩增后的DNA序列的3’端连接有与标签序列互补的标签互补序列，如权利要求1-8任一项所述的标签荧光探针对标签互补序列进行捕获并在taq DNA聚合酶的作用下进行荧光检测。
10.根据权利要求9所述的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)制备退火引物F：在包含检测位点的上游引物的5’端连接标签序列得到退火引物F；
(2)制备模板N+：退火引物F与待检测DNA序列在聚合酶的作用下延伸生成模板N+，升温解链让模板N+与待检测DNA序列分离；
(3)制备模板N-：以模板N+为模板，下游引物R在聚合酶的作用下延伸生成模板N-，升温解链让模板N+与模板N-分离，所述模板N-的3’端为标签互补序列；
(4)荧光检测：标签荧光探针的标签序列对模板N-的3’端进行捕获，模板N-的3’端被捕获时在taq DNA聚合酶的作用下标签荧光探针的5’端释放淬灭基团或荧光报告基团，进行荧光检测。
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