CN114540263A

CN114540263A - 一种耐高温羧肽酶在枯草芽孢杆菌中的构建方法及其在低苦味植物低聚肽中的应用

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Publication number: CN114540263A
Application number: CN202210320142.0A
Authority: CN
Inventors: 诸葛斌; 丁沈利; 宗红; 陆信曜
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2042-03-29
Also published as: CN114540263B

Abstract

本发明公开了一种耐高温羧肽酶在枯草芽孢杆菌中的构建方法及其在低苦味植物低聚肽中的应用，属于蛋白质加工技术领域。本发明提供了一种重组羧肽酶M32联合碱性蛋白酶对植物蛋白进行水解，能够显著的降低植物蛋白低聚肽的苦味，脱苦效果显著。通过感官评价分析，在0.01显著水平上，大豆分离蛋白双酶解水解液苦味最低。在豌豆分离蛋白中，辅助添加羧肽酶M32，在得到的总游离氨基酸中，疏水性氨基酸占比显著，在味觉丰富度几乎不变的情况下，苦味值降低了25.3％，鲜味值提高了22.6％，起到了抑苦增鲜的效果。综上所述，利用羧肽酶辅助碱性蛋白酶酶解植物分离蛋白制备植物低聚肽可以显著降低其苦味值。

Description

一种耐高温羧肽酶在枯草芽孢杆菌中的构建方法及其在低苦味植物低聚肽中的应用

技术领域

本发明公开了一种耐高温羧肽酶在枯草芽孢杆菌中的构建方法及其在低苦味植物低聚肽中的应用，属于蛋白质加工技术领域。

背景技术

植物低聚肽是由植物蛋白经酶法改性得到的产物，有增强体能、免疫调节、血糖调节、降血脂、减肥等多种生理功能，是极具营养价值的功能食品，但在其制备过程中，往往会产生苦味，严重影响其口感品质。苦味的产生往往是在因为水解过程中产生肽链末端是疏水性氨基酸的苦肽，且多数苦肽是由2-10个氨基酸组成的小分子肽，利用羧肽酶就可以有效针对苦味短肽，而不影响其他功能多肽，提高大豆多肽的风味。同时酶的性质可以决定大豆多肽的性能，羧肽酶也可以提高大豆多肽的功能。利用羧肽酶解决大豆多肽的苦味问题、改善大豆多肽的功能对大豆多肽的应用也具有十分重要的意义。

羧肽酶(carboxypeptidases)是一类外切蛋白酶，能够从蛋白质或多肽链的C端特异性切割产生游离羧基酸。现阶段，羧肽酶在蛋白水解产品的脱苦及风味改善，生物活性肽的制备等方面均有应用。目前关于羧肽酶的报道主要集中在异源表达、分离纯化、性质表征及应用其水解富含多肽的蛋白质等方面。由于羧肽酶的低产量、低回收率，所以制备羧肽酶的成本很高，这也很大程度上限制了其应用研究。然而现有的羧肽酶种类较少，但食品、医药等领域对羧肽酶的需求日益增长，现有可供选择的羧肽酶种类仍有待扩展，有必要探索研究新型羧肽酶来满足各行各业的需求。

发明内容

本发明基于食品安全菌株枯草芽孢杆菌WB600进行表达筛选。同时通过双酶法，即碱性蛋白酶结合羧肽酶的方法加工植物蛋白，降低植物低聚肽的苦味，提高植物多肽的功能性质和营养价值，为植物蛋白精加工提供具有应用潜力的羧肽酶。

本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧肽酶。

在本发明的一种实施方式中，编码所述羧肽酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述羧肽酶来源于巨大芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌采用核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的信号肽AmyQ或核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的信号肽AprE过表达所述羧肽酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB600为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pMA5、pMA5-SP_amyQ或pMA5-SP_aprE为表达载体。

本发明的第二个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，主要包括以下步骤：

(1)设计引物PCR扩增羧肽酶基因；

(2)将PCR产物连接到表达载体上，获得重组质粒；

(3)将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述转化包括化学转化法。

在本发明的一种实施方式中，所述表达为，将步骤(3)得到的培养液，加入至基础发酵TB培养基中，添加量为1％(v/v)，在37℃、200rpm条件下培养20～24h。

本发明的第三个目的是提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧肽酶或上述重组枯草芽孢杆菌表达的羧肽酶在改善植物蛋白苦味中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述植物蛋白包括但不限于大豆蛋白，豌豆蛋白，大米蛋白，小麦蛋白。

本发明的第四个目的是提供了一种苦味降低的植物低聚肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)向含有植物蛋白的反应体系中添加碱性蛋白酶进行酶解后灭酶，得到碱性蛋白酶酶解液；

(2)向步骤(1)得到的碱性蛋白酶酶解液中添加氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧肽酶或采用上述重组枯草芽孢杆菌表达的羧肽酶，进行酶解后灭酶，过滤后得到植物低聚肽。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)为：将底物浓度为：4％(w/w)～8％(w/w)的反应体系的pH调节至9.0～10.0后，向反应体系中添加酶活为：2000U/ml～3000U/ml的碱性蛋白酶，在45℃～50℃的条件下进行反应，反应时间为：30min～60min，反应结束后高温灭酶，并冷却至室温。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)为，向步骤(1)得到的碱性蛋白酶酶解液中添加酶活为2000U/ml～3000U/ml的羧肽酶后，在55℃～60℃的条件下进行反应，反应时间为：30min～60min，反应结束后高温灭酶，并冷却至室温后，离心取上清液，将上清液过滤后制备得到植物低聚肽。

本发明还提供了一种大豆低聚肽的制备方法，所述方法为：

(1)对底物浓度100mg/mL的大豆分离蛋白进行碱性蛋白酶酶解，酶解pH 9.0～10.0；酶解时间30～60min；酶解温度45-50℃；酶底物比[E/S]4:100(w/w)；然后95℃水浴灭酶，等冷却室温后，得到碱性蛋白酶酶解液；

(2)向步骤(1)得到的碱性蛋白酶酶解液中加入羧肽酶M32进行二次酶解，酶解时间30-60min；酶解温度55-60℃；酶底物比[E/S]4:100(w/w)，得到的样品冻干保存得到大豆低聚肽。

本发明还提供了一种豌豆低聚肽的制备方法，所述方法为：

(1)对底物浓度100mg/mL的豌豆蛋白进行碱性蛋白酶酶解，酶解pH 9.0～10.0；酶解时间30～60min；酶解温度45-50℃；酶底物比[E/S]4:100(w/w)；然后95℃水浴灭酶，等冷却室温后，得到碱性蛋白酶酶解液；

(2)向步骤(1)得到的碱性蛋白酶酶解液中加入羧肽酶M32进行二次酶解，酶解时间30-60min；酶解温度55-60℃；酶底物比[E/S]4:100(w/w)，得到的样品冻干保存得到豌豆低聚肽。

本发明还提供了一种采用上述方法制备得到的低苦味的植物低聚肽。

有益效果

(1)本发明提供的羧肽酶M32最适温度60℃，可以适应较高的工艺温度，从而加快反应的进行。该羧肽酶M32最适pH为7.0-9.0，可以复配碱性蛋白酶直接在碱性环境中进行酶解，不需要再调pH，简化工艺。同时，该羧肽酶M32偏好水解疏水性较强的氨基酸残基，对C末端氨基酸具有更高的广谱活性。

(2)采用本发明的方法，将羧肽酶M32结合碱性蛋白酶制备的植物低聚肽溶解性和水解度显著提升(p<0.05)，与碱性蛋白酶单酶制备的植物低聚肽相比，分别提高了37.4％和33.4％。并且，羧肽酶M32结合碱性蛋白酶制备的植物低聚肽能有效增加0.2～1kDa之间的短肽含量(p<0.05)。

(3)采用本发明的方法，将羧肽酶M32结合碱性蛋白酶制备的植物低聚肽鲜味氨基酸提高了3.8％，苦味氨基酸His，Arg，Val，Leu含量显著增加(p<0.05)，增加了17.4％，苦味氨基酸的增加侧面反应苦味肽的减少。同时，羧肽酶M32结合碱性蛋白酶制备的植物低聚肽苦味值显著降低，降低了22.8％；鲜味由显著提高，提高了20.9％。

附图说明

图1：B.subtilis cpm32基因的凝胶电泳分析；其中，泳道M：DNA Marker 2503；泳道1：羧肽酶M32基因cpm32。

图2：质粒pMA5-CPM32构建图。

图3：重组菌WB600-pMA5-CPM32的生长曲线图。

图4：羧肽酶粗酶液电泳图；其中，泳道M：Marker；泳道1：羧肽酶M32；泳道2：羧肽酶K；泳道3：羧肽酶J；泳道4：羧肽酶L。

图5：重组菌WB600-pMA5-CPM32发酵上清及羧肽酶M32的纯化SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白标准maker；1：WB600-pMA5胞外上清；2：WB600-pMA5-CPM32胞外上清；3：WB600-pMA5-CPM32亲和层析。

图6：羧肽酶M32的最适温度。

图7：羧肽酶M32的最适pH。

图8：不同来源的羧肽酶的生长曲线和羧肽酶酶活比较。

图9：信号肽构构建图。

图10：不同信号肽添加对表达的影响，其中A为对酶活和相对灰度的影响，B为电泳图谱，泳道1为对照，泳道2位AprE信号肽，泳道3为AmyQ信号肽，泳道4为NprE信号肽。

图11：重组菌BL21-pET20b(+)-CPM32的SDS-PAGE电泳图；其中，M泳道：蛋白maker，泳道1：BL21-pET-20b(+)胞内沉淀，泳道2：BL21-pET-20b(+)-CPM32胞内沉淀，泳道3：BL21-pET-20b(+)-CPM32胞内上清。

图12：豌豆低聚肽水解物的分子量分布。

图13：豌豆低聚肽水解物的溶解性和水解度。

图14：大豆分离蛋白水解物风味雷达图。

图15：豌豆分离蛋白风味雷达。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的大豆分离蛋白购自江苏全盈生物技术有限公司，豌豆分离蛋白购自上海源叶生物科技有限公司，碱性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基：酵母粉10g·L^-1，蛋白胨20g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1，固体培养基中添加2％的琼脂粉。

TB培养基：酵母粉24g·L^-1，蛋白胨12g·L^-1，甘油5mL·L^-1，KH₂PO₄ 2.3g·L^-1，K₂HPO₄·3H₂O 16.4g·L^-1。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

羧肽酶酶活的测定方法

以900μL Z-Glu-Tyr(1mM)为底物，加入100μL的酶液，在37℃，150r/min摇床震荡1h，再加入1mL铬-茚三酮显色液，在84℃下显色5分钟，对照100℃水浴灭活。

酶活定义：37℃、pH＝8.0条件下，每小时每毫升粗酶液使底物Z-Glu-Tyr降解产生酪氨酸的微摩尔数作为一个酶活力单位(U)。

游离氨基酸测定

采用氨基酸专用高效液相色谱仪测定。

电子舌测定

采用电子舌测定大豆多肽的风味，以蒸馏水用作清洁溶剂。采样时间约为180s，测量后的清洁时间为2-3min。每1s收集一次样品数据，并将测量值的平均值用作每个样品一次测量的数据。为减小测量误差，重复测量4次，取后三次的每个传感器的平均值作为一个样本数据，用于随后的数据分析。

感官评定

采用排序检验法对样品的苦味鲜味进行排序，将样品按照苦味鲜味最强到最弱排序。感官评定小组由9位20-30岁的小组成员组成，并对苦味和鲜味有很好的辨别能力。室温控制在25℃±2℃，不同样品间用清水漱口以恢复原感觉能力。

对样品进行统计分析，使用Friedman检验法计算出统计量F来分析样品之间的显著性差异，利用Kramer检定法对样品进行分组。根据公式计算样品的统计量F：

式中：

j—评价员数；

p—样品数量；

R₁、R₂、···、R_p—各样品的秩和。

相对灰度的检测

以羧肽酶M32在SDS-PAGE中的蛋白条带为内参，与携带不同信号肽，包括信号肽AprE信号肽AmyQ，信号肽为NprE的羧肽酶M32在SDS-PAGE中的蛋白条带做比较，通过ImageJ-win64软件计算相对内参灰度比值。

下述实施例中所涉及的胞内物质提取方法：

发酵液离心收集菌体，用50mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液，pH 7.4)洗涤菌体三次，加入PBS溶液使菌体浓度调到相同浓度，冰水浴下超声破碎20-25min(400W，间隔2s)。将细胞破碎液于4℃离心机，10000r/min转速下离心20min，使胞内可溶物质和不溶物质分离，上清即为胞内可溶物质。

下述实施例中将本发明的羧肽酶命名为羧肽酶M32(carboxypeptidase M32，CPM32)，表达羧肽酶M32的基因命名为cpm32，同时，将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的羧肽酶命名为羧肽酶K；将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的羧肽酶命名为羧肽酶J；将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的羧肽酶命名为羧肽酶L；下面通过实施例，对本发明进一步说明。

实施例1：表达羧肽酶的重组枯草芽孢杆菌的构建

具体实施方法步骤如下：

(1)羧肽酶基因的扩增

根据NCBI上公开的巨大芽孢杆菌(GenBank:CP026736.1)推定的羧肽酶基因序列，设计一对引物，引物设计如下：

上游引物F：5’-tgcaaaaagtgaaatcagggatgagagaagacatacagaaaattgagaa-3’；

下游引物R：5’-aggtgaatttcgacctctagtcagtggtgatggtgatgatgtacgtgataaatttctccatatttcttttctaga-3’。

以基因组为模板，利用PCR技术，得到羧肽酶基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，PCR体系为：(10μL)：mix酶5μL，水4.4μL，模板0.2μL，上游引物F 0.2μL，下游引物R0.2μL。

PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火2min，72℃延伸90s；25℃保温5min；30个循环。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，证明目的片段扩增成功。

(2)重组表达载体的构建

将质粒pMA5和目的基因分别用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，双酶切体系(50μL)：目的基因或质粒30μL，限制性核酸内切酶各0.5μL，ddH₂O 14μL，buffer 5μL。37℃水浴保温2h，琼脂糖凝胶电泳15min后，柱回收目的条带。将双酶切后表达载体片段按照pmol为1：3的比例进行同源重组，同源重组连接体系(20μL)：DNA总量6μL，2×MultiF SeamLess Assembly Mix10μL，ddH₂O 4μL。然后转化至E.coli JM109中。菌落PCR验证为阳性菌株的，提取质粒，进行测序验证，测序正确的即为重组表达载体pMA5-CPM32，其构建过程如图2所示。

(3)重组枯草芽孢杆菌的构建

将制备好的枯草芽孢杆菌宿主WB600感受态细胞(500μl分装)置于冰上冻融后，加入(2)中测序验证正确的质粒pMA5-CPM32 5μl，轻轻吹吸混匀，于冰上静置30min。于37℃，200rpm恒温摇床恢复培养1h。于6000rpm离心2min收集菌体。

在超净工作台中，留上清约50μl重悬菌体，并涂布至加有50μg·ml^-1Kan抗生素的固体LB平板上。涂好的平板置于37℃恒温培养箱，培养8-12h。挑取单菌进行PCR验证，验证为阳性的即为表达羧肽酶基因的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pMA5-CPM32。

(4)生长曲线

以加入空白质粒的重组菌B.subtilis WB600/pMA5为对照菌，分别将上述重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pMA5-CPM32和对照菌株B.subtilis WB600/pMA5在37℃，200r·min^-1的条件下发酵24h，每3h测定一次菌体OD₆₀₀，然后绘制生长曲线，结果如图3所示。

结果表明，重组菌WB600-pMA5-CPM32与对照菌无明显生长差异，CPM32的异源表达不会对菌体生长产生显著影响。

(5)具体实施方式同步骤(1)～(3)，区别在于，将羧肽酶分别替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的羧肽酶K、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的羧肽酶J、核苷酸序列如SEQID NO.5所示的羧肽酶L，分别制备得到重组枯草芽孢杆菌：B.subtilis WB600/pMA5-CPK、B.subtilis WB600/pMA5-CPJ、B.subtilis WB600/pMA5-CPL。

实施例2：利用枯草芽孢杆菌表达不同来源的羧肽酶

具体步骤如下：

1、羧肽酶的制备

(1)羧肽酶粗酶液的制备

分别将实施例1制备得到的B.subtilis WB600/pMA5-CPM32、B.subtilis WB600/pMA5-CPK、B.subtilis WB600/pMA5-CPJ、B.subtilis WB600/pMA5-CPL，划线50μg·ml^-1Kan抗生素的固体LB平板上，在37℃培养箱中过夜培养，第二天，挑取单菌落至10mL LB培养基，加入50μg·ml^-1的Kan抗生素，在37℃，150r·min^-1条件下培养12h，制备得到种子液；

将制备得到的种子液在37℃，200r·min^-1的条件下发酵24h，制备得到发酵液；

分别将上述发酵液于4℃，10000r·min^-1离心15min，收集上清(重复两次)；分别制备得到：含有羧肽酶M32的粗酶液，含有羧肽酶K的粗酶液，含有羧肽酶J的粗酶液，含有羧肽酶L的粗酶液。

分别将上述粗酶液进行蛋白电泳，结果如图4所示，结果显示，羧肽酶M32、羧肽酶K、羧肽酶J和羧肽酶L均能在胞外实现分泌表达。

(2)羧肽酶的纯化

分别将步骤(1)得到的粗酶液经70％浓度的硫酸铵盐析，沉淀用50mmol/L Tris-HCl缓冲液进行重悬，将其置于透析袋中于Buffer A缓冲液(20mmol/L磷酸缓冲液pH 7.4，500mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑)中4℃透析过夜。样品再进0.22μm微孔滤膜过滤后，使用AKTA蛋白纯化系统，使用His Trip FF crude Ni²⁺柱进行分离纯化。条件如下：先用5倍柱体积的Buffer A缓冲液平衡柱子，流速设置为1mL/min上样；上样结束用10倍柱体积的BufferA缓冲液洗去杂蛋白，然后以2倍柱体积20％的Buffer B洗脱液(20mmol/L磷酸缓冲液pH7.4，500mmol/L Nacl，500mmol/L咪唑)、5倍柱体积60％的Buffer B洗脱液和5倍柱体积100％的Buffer B洗脱液进行梯度洗脱。收集梯度洗脱阶段主要的紫外吸收峰区间的样品进行SDS-PAGE电泳分析和酶活的测定。

分别制备得到羧肽酶M32纯酶、羧肽酶K纯酶、羧肽酶J纯酶、羧肽酶L纯酶。其中，重组菌WB600-pMA5-CPM32发酵上清羧肽酶M32的纯化如图5所示。结果显示：粗酶液纯化后，呈现单一蛋白条带，分子大小约为59kDa，与理论大小一致。

2、羧肽酶酶学性质

(1)羧肽酶M32的最适温度

分别将纯化得到的羧肽酶M32纯酶、羧肽酶K纯酶、羧肽酶J纯酶、羧肽酶L纯酶置于不同的温度(30-80℃)条件下反应，定义最高酶活为100％，其中，羧肽酶M32的最适温度如图6所示。各重组酶最适温度如表1所示。

表1各重组酶最适温度

结果显示：与来源于枯草芽孢杆菌的羧肽酶K，来源于解淀粉芽孢杆菌的羧肽酶J，来源于蜡状芽孢杆菌的羧肽酶L相比，来源于巨大芽孢杆菌的羧肽酶M32具有最高的最适温度，与来源于其他菌株的羧肽酶的最适温度存在显著性差异(P<0.05)。

羧肽酶M32的最适pH

在不同pH条件的缓冲液中：50mmol·L^-1柠檬酸缓冲液(pH 3.0-6.0)、50mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)和50mmol·L^-1甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.0-10.0)，60℃条件下测定纯酶羧肽酶M32酶活，定义最高酶活为100％，结果如图7所示。

结果显示：羧肽酶M32最适pH为7.0～9.0，可以复配碱性蛋白酶直接在碱性环境中进行酶解，不需要再调pH，简化工艺。

(2)酶活的检测

生长曲线的测定：挑取重组菌WB600-pMA5-CPM32，WB600-pMA5-CPK，WB600-pMA5-CPJ，WB600-pMA5-CPL单菌落至10mL LB培养基，在37℃，150r·min^-1条件下培养12h得到一级种子。取1mL一级种子液至50mL LB培养基，在37℃，200r·min^-1条件下培养24h，期间每3h取样1mL，测定在600nm处的吸光度值。

酶活检测方法：以900μL Z-Glu-Tyr(1mM)为底物，加入100μL的酶液，在37℃，150r/min摇床震荡1h，再加入1mL铬-茚三酮显色液，在84℃下显色5分钟，对照100℃水浴灭活。测定反应物在507nm处的吸光度。配制不同浓度的酪氨酸标准溶液，绘制酪氨酸标准曲线。酶活定义：在37℃、条件下，每小时每毫升粗酶液使底物Z-Glu-Tyr降解产生酪氨酸的微摩尔数作为一个酶活力单位(U)。

按照酶活检测方法，分别检测羧肽酶M32纯酶、羧肽酶K纯酶、羧肽酶J纯酶、羧肽酶L纯酶的酶活，结果如表2及图8所示：

表2不同来源重组酶酶活

结果显示：与重组菌B.subtilis WB600/pMA5-CPM32相比，重组菌B.subtilisWB600/pMA5-CPK、B.subtilis WB600/pMA5-CPJ、B.subtilis WB600/pMA5-CPL在生长曲线上并没有表现出明显差异，但是在羧肽酶酶活上，来源于巨大芽孢杆菌的羧肽酶M32表现出最大的羧肽酶酶活，与来源于其他菌株的羧肽酶酶活存在显著性差异(P<0.05)。

可见，羧肽酶M32具有较高的酶活，因此，选择羧肽酶M32做后续的研究。

(3)羧肽酶M32的动力学参数

不同底物下，羧肽酶M32的动力学参数如表3所示。

表3羧肽酶M32的动力学参数

结果表明：羧肽酶M32能水解大部分底物，广谱活性高，其中Z-Phe-Tyr为其最适底物，具有最高的催化效率。

实施例3：不同信号肽对于羧肽酶M32酶活的影响

具体步骤如下：

通过添加Sec途径中的其他3种信号肽AprE，AmyQ(信号肽AmyQ的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，信号肽AprE的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，NprB(核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示)，添加方法如图9所示，具体步骤为：

(1)根据NCBI上公开的信号肽序列，重新设计引物，引物设计如表4所示：

表4信号肽引物

注：下划线表示同源臂，加粗表示6×His标签，斜体表示信号肽

(2)以实验室保藏的巨大芽孢杆菌基因组为模板，直接在上游引物中分别合成信号肽核苷酸序列包括信号肽AmyQ，信号肽AprE，信号肽NprB和同源臂，在下游引物中合成6×His标签和同源臂。利用PCR技术，得到带有不同信号肽的羧肽酶基因片段。

将质粒pMA5进行BamH I和Miu I双酶切，获得双酶切质粒片段。通过同源重组，分别将带有信号肽的羧肽酶基因片段和双酶切质粒片段进行连接，得到启动子P_Hpa _II(质粒自带)+信号肽AmyQ/信号肽AprE/信号肽NprB+CPM32的重组质粒：pMA5-SP_amyQ-CPM32、pMA5-SP_aprE-CPM32、pMA5-SP_nprB-CPM32。

参照实施例1中的方法，分别制备得到带有信号肽AmyQ的重组菌B.subtilisWB600/pMA5-SP_amyQ-CPM32，带有信号肽AprE的重组菌B.subtilis WB600/pMA5-SP_aprE-CPM32,带有信号肽NprB的重组菌B.subtilis WB600/pMA5-SP_nprB-CPM32。

(3)计算相对内参灰度比值。结果如图10及表5所示，图中泳道1表示羧肽酶M32，泳道2表示携带信号肽AprE的羧肽酶M32，泳道3表示携带信号肽AmyQ的羧肽酶M32，泳道4表示携带信号肽NprE的羧肽酶M32。

按照实施例2的方法制备得到羧肽酶M32纯酶，并计算羧肽酶的酶活，结果如表5及图10所示：

表5带有不同信号肽的羧肽酶M32酶活

结果显示，通过添加信号肽AmyQ后，羧肽酶M32酶活提高了3.3倍，达到5320.3U/mL，相对灰度比值3.4；添加信号肽AprE，羧肽酶M32酶活提高了1.2倍，达到1823.5U/mL，相对灰度比值1.1；添加信号肽NprB几乎没有使CPM32羧肽酶酶活提高，相对灰度比值0.9。所有酶活提高倍数与相对灰度比值一致，证明结果的可靠性。

对比例1：利用大肠杆菌表达巨大芽孢杆菌来源的羧肽酶M32

具体步骤同实施例1～2，区别在于：将载体更换为pET-20b(+)；分别将空质粒pET-20b(+)和表达质粒pET-20b(+)-CPM32转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到对照菌株E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)和重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-CPM32。

分别将上述对照菌株和重组菌在基础TB培养基中进行发酵，在37℃、200r/min条件下培养至菌体密度(OD₆₀₀)到1.0，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L，并降低温度至20℃后发酵20h，得到发酵液。

结果如图11所示，利用SDS-PAGE蛋白电泳分析目的基因的表达情况，并测定发酵液和胞内的羧肽酶酶活，分别为：0.0U/mL和156.2U/mL。

结果显示：

与在枯草芽孢杆菌中相比，CPM32在大肠杆菌中并不能分离表达，且大肠杆菌并不全是食品安全菌株。

通过大肠杆菌表达的羧肽酶M32在细胞内形成的大多是包涵体，包涵体复性后，羧肽酶酶活也很低，通过大肠杆菌表达的羧肽酶需要进行分离提取才可以添加到食品中，这限制了它在食品行业中的应用。

实施例4：利用不同的检测方法分析羧肽酶M32水解大豆分离蛋白水解物的苦味

具体步骤如下：

(1)蛋白酶酶解：加去离子水配成浓度为100mg/mL大豆分离蛋白溶液，用1mol/L的NaOH调节pH＝9，然后先加入0.01g的碱性蛋白酶，在50℃下反应1h，反应结束后，在95℃水浴中灭酶15min，并迅速冷却至室温，得到蛋白酶酶解液，样品冻干保存；

(2)羧肽酶M32酶解：向步骤(1)得到的蛋白酶酶解液中加2000U·g^-1的实施例2制备得到的羧肽酶M32纯酶，在60℃下反应1h，最后再在沸水浴中彻底灭酶15min，冷却至室温，得到羧肽酶M32酶解液。

(3)离心：将步骤(2)制备得到的酶解液，在10000r·min^-1条件下离心10min取上清液，将上清液过滤，得到大豆低聚肽溶液，样品冻干保存，测定大豆低聚肽溶液中游离疏水氨基酸，以大豆分离蛋白，及仅添加碱性蛋白酶(其他步骤同上)的大豆分离蛋白水解物作为对照，结果如表6所示。

表6大豆分离蛋白游离疏水氨基酸(g/L)

结果显示，羧肽酶M32偏好水解疏水性较强的氨基酸残基，对C末端氨基酸具有更高的广谱活性。疏水性氨基酸(丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)含量显著提升(P<0.05)，苦味氨基酸(丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)占总游离氨基酸比例由37.9％提高至58.4％，提高了54.1％。总氨基酸含量由初始的0.683mg/mL，提高至11.572mg/mL，提高了1594.2％。

(4)利用电子舌技术测定大豆低聚肽溶液的苦味数据，结果如表7及图14所示。

表7电子舌味觉值

结果表明：在大豆分离蛋白中只加碱性蛋白酶得到的大豆分离蛋白水解物苦味值是9.56，在大豆分离蛋白中加如碱性蛋白酶和羧肽酶M32得到的大豆分离蛋白水解物苦味值是5.01，苦味值降低47.6％，苦味显著改善(P<0.05)。

(5)感官评定

通过感官评定对大豆低聚肽溶液的苦味进行排序，表8～9是9位评价人员对三种样品的苦味排序，然后通过表8～9的样品苦味的秩和R，使用Friedman检验计算出统计量F＝10.1，远大于检验近似临界值8.66(显著性水平＝0.01)，说明样品之间存在非常显著差异。

表8苦味排序和秩次

注：A代表大豆分离蛋白，B代表大豆分离蛋白加碱性蛋白酶得到的大豆分离蛋白水解物，C代表大豆分离蛋白中加如碱性蛋白酶和羧肽酶M32得到的大豆分离蛋白水解物

表9秩次和秩和

用Kramer检定法对三个样品分组，根据评价人数9和样品数3，查阅张水华主编的食品感官鉴评书中附表，得到秩和临界值为12-24(＝0.01)，大豆分离蛋白中的秩和是12.5和大豆分离蛋白中只加碱性蛋白酶得到的大豆分离蛋白水解物的秩和是16都在临界值区间内被划分为一组，同组内无显著性差别，大豆分离蛋白中加如碱性蛋白酶和羧肽酶M32得到的大豆分离蛋白水解物秩和是25.5大于临界最大值24，大豆分离蛋白中加入碱性蛋白酶和羧肽酶M32得到的大豆分离蛋白水解物单独划分一组，与其他样品存在显著性差异由此得到结论。

结果表明：在0.01显著水平上，大豆分离蛋白中加入碱性蛋白酶和羧肽酶M32得到的大豆分离蛋白水解物苦味最低。

实施例5：利用不同的检测方法分析羧肽酶M32水解豌豆分离蛋白水解物的苦味

具体步骤如下：

(1)蛋白酶酶解：加去离子水配成浓度为100mg/mL豌豆分离蛋白溶液，用1mol/L的NaOH调节pH＝9，然后先加0.01g的碱性蛋白酶，在50℃下反应3h，反应结束后，在95℃水浴中灭酶15min，并迅速冷却至室温，得到蛋白酶酶解液，样品冻干保存；

(2)羧肽酶M32酶解：向步骤(1)得到的蛋白酶酶解液中加入2000U/g的羧肽酶M32纯酶，在60℃下反应3h，最后再在沸水浴中彻底灭酶15min，冷却至室温，得到羧肽酶M32酶解液。

(3)离心：将步骤(2)制备得到的酶解液，在10000r·min^-1条件下离心10min取上清液，将上清液过滤，得到豌豆低聚肽溶液，样品冻干保存。

(4)以豌豆分离蛋白，及仅添加碱性蛋白酶(其他步骤同上)的豌豆分离蛋白水解物作为对照，测定羧肽酶M32结合碱性蛋白酶制备的豌豆低聚肽水解物的分子量分布，结果如图12所示。

结果表明：PPI中90％以上是大于5kDa的大分子量多肽，小分子量多肽组分很低。PPIA水解液中0.2～1kDa之间的短肽显著增加(p<0.05),大于5kDa的多肽含量大大降低。羧肽酶M32属于外切蛋白酶，可特异性的从蛋白质的C端切割氨基酸，经羧肽酶M32水解后的PPIACP，大于1kDa的多肽进一步水解成更短的短肽，分子量在0.2～1kDa之间的短肽，与PPIA相比显著增加(p<0.05)，增加了36.2％。小于200Da的部分主要是游离氨基酸，PPIA是7.6％，PPIACP占比是13.8％，提高了6.2％。

羧肽酶M32将水解得到的豌豆低聚肽水解物进一步水解，让肽链从外部展开，降低分子量，增加了极性基团的数目，得到分子量更小的多肽和氨基酸，小分子肽水解度提高的同时也更容易溶解。

(5)以豌豆分离蛋白，及仅添加碱性蛋白酶(其他步骤同上)的豌豆分离蛋白水解物作为对照，测定溶解性和水解度，结果如图13所示(图中PPI为豌豆分离蛋白，碱性蛋白酶单酶制备的豌豆低聚肽为PPIA，羧肽酶M32结合碱性蛋白酶制备的豌豆低聚肽为PPIACP)。

结果表明：羧肽酶M32结合碱性蛋白酶制备的植物低聚肽溶解性和水解度显著提升(p<0.05)，与碱性蛋白酶单酶制备的植物低聚肽相比，分别提高了37.4％和33.4％。

(6)以豌豆分离蛋白，及仅添加碱性蛋白酶(其他步骤同上)的豌豆分离蛋白水解物作为对照，测定豌豆低聚肽溶液中游离疏水氨基酸，结果如表10所示。

表10豌豆低聚肽中游离疏水氨基酸(g/L)

结果显示，经碱性蛋白酶和羧肽酶的双酶解，经羧肽酶M32水解过后，显著增加的氨基酸为组氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸。其中，疏水性氨基酸占总增加氨基酸的65.6％。总氨基酸含量由初始的0.25mg/mL，提高至1.99mg/mL，提高了696％。

(7)利用电子舌分析豌豆低聚肽溶液的苦味，测定步骤上述豌豆低聚肽溶液中苦味值。结果如表11和图15所示。

表11电子舌苦味数据，

结果表明，豌豆分离蛋白只加入碱性蛋白酶得到的豌豆分离蛋白水解物的苦味值是6.02，豌豆分离蛋白加入碱性蛋白酶和羧肽酶M32纯酶得到的豌豆分离蛋白水解物苦味值是3.93，苦味值降低34.7％，苦味显著改善(P<0.05)；鲜味值由16.7提高至21.6，提高了29.3％，鲜味的提高有利于苦味的掩盖。

对比例1：

采用实施例5的方法制备大豆低聚肽，区别在于，省略碱性蛋白酶酶解步骤，即调整步骤(1)为：加去离子水配成浓度为100mg/mL大豆分离蛋白溶液；

步骤(2)为：向步骤(1)得到的蛋白酶酶解液中加2000U·g^-1的实施例2制备得到的羧肽酶M32纯酶，在60℃下反应1h，最后再在沸水浴中彻底灭酶15min，冷却至室温，得到羧肽酶M32酶解液，其他步骤相同，制备得到大豆低聚肽溶液。

测定大豆低聚肽中游离疏水性氨基酸。与实施例5相比，疏水性氨基酸含量由76.1％下降为40.7％，说明碱性蛋白酶对苦味氨基酸含量有很大影响。

对比例2：

采用实施例4的方法制备大豆低聚肽，区别在于，省略步骤(2)羧肽酶M32酶解步骤。其他步骤相同，制备得到大豆低聚肽溶液。

测定大豆低聚肽溶液中游离鲜味氨基酸。与实施例3相比，鲜味氨基酸含量由45.7％下降为17.1％，说明羧肽酶M32对鲜味氨基酸和苦味氨基酸含量有很大影响。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种耐高温羧肽酶在枯草芽孢杆菌中的构建方法及其在低苦味植物低聚肽中

的应用

<130> BAA220239A

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 505

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Glu Asp Ile Gln Lys Ile Glu Lys Gln Phe Tyr Glu Tyr Met

1 5 10 15

Asn Lys Ile Lys Ser Tyr His Glu Ala Ile Gly Val Met Tyr Trp Asp

20 25 30

Leu Arg Thr Gly Ala Pro Lys Lys Gly Ala Asp Gln Arg Ser Glu Val

35 40 45

Ile Gly Met Met Ser Ser Glu Ala Phe Asn Leu Ser Val Ser Asp Glu

50 55 60

Met Ala Gly Phe Ile Glu Lys Leu Thr Asn Ser Glu Ser Gln Pro Tyr

65 70 75 80

Ile Asn Asp Ile Thr Lys Lys Ala Val Glu Glu Cys Lys Lys Glu Tyr

85 90 95

Asp Leu Asn Lys Lys Ile Pro Pro His Glu Tyr Lys Glu Tyr Val Thr

100 105 110

Leu Thr Ser Lys Ala Glu Ser Val Trp Glu Asp Ala Lys Glu Lys Ala

115 120 125

Asp Phe Ala Leu Phe Gln Pro Tyr Leu Glu Lys Ile Val Ala Phe Asn

130 135 140

Gln Lys Phe Val Asp Tyr Trp Gly Tyr Glu Gly Asn Lys Tyr Asn Arg

145 150 155 160

Leu Leu Asp Leu Phe Glu Pro Gly Met Thr Val Glu Ile Leu Asp Glu

165 170 175

Val Phe Gly Lys Leu Arg Glu His Ile Val Pro Leu Val Gln Arg Ile

180 185 190

Ala Gly Ser Asn Thr Lys Pro Asn Thr Glu Phe Leu Phe Arg Thr Phe

195 200 205

Pro Lys Glu Ala Gln Lys Gln Phe Ser Leu Asp Val Leu Lys Thr Leu

210 215 220

Gly Tyr Asp Phe Glu Ala Gly Arg Leu Asp Glu Thr Val His Pro Phe

225 230 235 240

Ala Thr Gly Leu Asn Pro Gly Asp Val Arg Ile Thr Thr Lys Tyr Ala

245 250 255

Glu Asn Asp Phe Arg Thr Ala Ile Phe Gly Thr Ile His Glu Cys Gly

260 265 270

His Ala Leu Tyr Glu Gln Asn Ile Ser Lys Asp Leu Val Gly Thr Val

275 280 285

Leu Cys Glu Gly Thr Ser Met Gly Ile His Glu Ser Gln Ser Leu Phe

290 295 300

Cys Glu Gln Phe Val Gly Lys Asn Lys Ala Phe Trp Gln His Asn Tyr

305 310 315 320

Asp Val Leu Lys Gln His Ala Pro Gly Gln Phe Asp Asp Val Gly Leu

325 330 335

Glu Asp Phe Tyr Arg Gly Val Asn Glu Ala Lys Pro Ser Leu Ile Arg

340 345 350

Ile Glu Ala Asp Glu Leu Thr Tyr Pro Leu His Ile Met Ile Arg Tyr

355 360 365

Glu Ile Glu Lys Gly Leu Ile Asn Gly Glu Tyr Lys Val Glu Asp Leu

370 375 380

Pro Glu Ile Trp Asn Glu Lys Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Val Arg Pro

385 390 395 400

Ser His Asp Gly Glu Gly Val Leu Gln Asp Val His Trp Ala Gly Gly

405 410 415

Ser Phe Gly Tyr Phe Pro Ser Tyr Ala Leu Gly Tyr Met Tyr Ala Ala

420 425 430

Gln Phe Lys His Thr Met Leu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asp Glu Leu

435 440 445

Leu Glu Lys Gly Glu Ile Ser Pro Ile Thr Asn Trp Leu Thr Glu His

450 455 460

Ile His Gln Tyr Gly Lys Met Lys Lys Pro Leu Glu Ile Leu Asn Asp

465 470 475 480

Val Thr Gly Glu Gly Leu Asn Val Asp Tyr Leu Ile Gln Tyr Leu Glu

485 490 495

Lys Lys Tyr Gly Glu Ile Tyr His Val

500 505

<210> 2

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagagaag acatacagaa aattgagaaa cagttttatg aatacatgaa taaaattaaa 60

agttatcacg aggcaatcgg agtgatgtac tgggatttga ggacgggtgc tccaaaaaaa 120

ggggcggatc agcgttctga agtgattggc atgatgtcat cagaagcgtt caatctttct 180

gtttctgatg aaatggcagg ttttattgag aaattaacga actctgagtc gcagccttac 240

ataaacgata ttacgaaaaa agcagtggaa gaatgtaaaa aagaatatga cttaaataaa 300

aaaattcctc cacatgaata taaagaatac gttacattaa cttcaaaagc tgagtcggtt 360

tgggaagacg caaaagaaaa agcagatttt gctttatttc aaccgtacct cgaaaaaatt 420

gtagcgttca atcagaagtt tgtggattat tgggggtatg aagggaacaa atataaccgt 480

ttactggatc tttttgaacc ggggatgacg gttgaaattt tagacgaggt gtttggaaag 540

ctacgggagc atattgtgcc tcttgttcag cgaatcgccg ggtcaaatac aaagccaaat 600

acggaatttt tattccgtac tttcccaaaa gaagcgcaga agcaatttag tctagacgtg 660

ttaaaaacac ttggctatga ttttgaagcg gggcgccttg atgaaacagt tcatcctttt 720

gctactggct taaacccggg agatgtgcgc atcacgacta aatatgccga aaacgatttt 780

cgaacggcta tttttggaac aattcacgaa tgcggccatg ctttatatga gcagaatatt 840

tcaaaggatc ttgtcggtac agttctatgt gaaggtactt caatgggaat tcacgaatca 900

cagtcgctgt tttgtgagca gtttgtcggt aaaaataagg cattttggca gcataattac 960

gacgtactaa aacagcatgc gccggggcaa tttgacgatg taggtttaga agatttttac 1020

cgaggagtaa atgaggcaaa accgtcgctt attcgtattg aagcagatga gttaacgtac 1080

cctcttcata ttatgattcg ttacgaaatt gaaaaaggat tgataaacgg ggagtataaa 1140

gttgaggatt taccggaaat ttggaatgag aaatacgaag aatatttagg agttcgtcca 1200

agtcacgacg gagaaggcgt gcttcaggac gtacactggg ccggaggaag ctttgggtac 1260

ttcccttcct acgctcttgg ctatatgtac gcagcgcagt ttaagcatac catgttaaaa 1320

gatctgccta attatgatga actcctcgaa aaaggagaaa tttcgccgat cacaaattgg 1380

ctaacagaac acattcatca gtacggaaaa atgaaaaagc ctcttgaaat tttaaacgat 1440

gtaacgggag aaggcttaaa tgtagattat ttaattcagt atctagaaaa gaaatatgga 1500

gaaatttatc acgtataa 1518

<210> 3

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggagatac atacatatga aaaagaattt tttgatcttt taaaaagaat ctcacattac 60

agcgaagcag ttgcgttaat gcactgggac tccagaacag gcgcgccgaa aaatggctca 120

gaggatcgtg ccgaaagtat cggccagctt tcaacagata tattcaatat ccaaacatca 180

gatcgaatga aggagcttat cgatgtcctg tatgaacgat ttgatgactt gtcggaagat 240

acgaaaaaag cagtggaact ggcgaaaaaa gagtatgaag agaataagaa aatccctgag 300

gctgaataca aagaatacgt gattctgtgt tcaaaggcag aaacagcgtg ggaggaagcg 360

aaaggaaaat ctgatttcag cttgttttct ccttatttag aacagctgat tgaattcaat 420

aaacgtttta ttacgtattg gggatatcaa gagcatcctt atgatgcatt gcttgatttg 480

tttgagcccg gcgtcacggt aaaggtgctt gatcagttgt ttgctgagct gaaggaagcg 540

attatccctc ttgttaaaca ggtgacagct tccggaaata aaccagatac aagctttatt 600

acaaaagcgt tcccgaaaga aaagcaaaaa gagctcagtc tgtatttttt acaggagctt 660

ggctacgatt ttgatggcgg aagacttgat gaaaccgttc atccgtttgc aactacgctg 720

aatcggggag acgttcgggt cacgacgaga tatgatgaaa aagatttccg gacggcgatc 780

tttgggacca ttcatgagtg cgggcacgcg atttacgagc aaaatattga tgaagcactc 840

agtggcacga acttgtcaga cggcgcatcg atgggaattc atgaatcgca atcattattt 900

tacgagaatt ttatcggccg caacaagcat ttttggactc cgtactataa gaagattcaa 960

gaggcatcac ctgtacagtt caaggacatc tccctggatg attttgtccg ggcaatcaat 1020

gaatcaaaac cttcatttat cagggtcgaa gcggatgaat tgacgtatcc tcttcatatc 1080

atcatccgtt atgaaattga aaaagcgatt ttcagcaatg aagtgtctgt ggaagatctg 1140

ccgtcgcttt ggaatcaaaa ataccaggat tatttaggga ttacaccgca gaccgacgca 1200

gaggggattt tacaggacgt ccattgggca ggtggagatt tcggctactt cccatcctat 1260

gcgctcggct acatgtatgc ggctcagctg aaacaaaaaa tgcttgagga tctccctgaa 1320

tttgacgctc tcttggaaag aggagagttc catccgataa agcaatggct gacggaaaag 1380

gtgcacattc acggaaaacg gaaaaagccg ttagacatta ttaaagatgc aacaggagaa 1440

gagctgaatg ttcgctattt aattgattat ttatcaaaca aatattcaaa tctctatctg 1500

ttataa 1506

<210> 4

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggatttac atacatatga aaaagaattt tttgatctgt taaaaagagt atcccactat 60

gtcgaagcca ttgcacttat gcattgggac ttaagaacgg gagccccgaa aaaaggctct 120

gatgatcggg cggaaagcat cggacagctt tcggctgacg tttttcaaat ccagacatcc 180

gaccggatga aagagctgat cgacatcctt ctcgcgcatg cagaagagct ctctgaagat 240

acagtgaaag cggcggaact tgcgaaaaaa gattatgatc ataataaaaa aattcctgaa 300

gatgagtata aagaatatgt cattttaaca tcaaaagctg aaacggcttg ggaggatgca 360

aaggctgcct ctgatttctc tatgtttgct ccgtaccttg agaagctgat tgattttaat 420

aagcggttta tttcgtattg gggctatgaa gatcatccgt acaacgcatt gctcgatatt 480

ttcgaaccgg gtgctacggt aaaggtgctg gatcagctgt tttctgaatt gaaggaagcg 540

atcattccgc ttatcacaaa agtgacggaa tccggcaata aaccggacac ttcctttata 600

acgaaaacgt ttccgaaaga acaacaaaga gacctctcct tgtatttctt aaaagagttc 660

gggtatgatt ttgacggcgg ccgcctggac gagacggtgc atccgtttgc gacgacaatc 720

aaccggggcg atgtgcgggt gacgaccaga tatgacgaaa acgatttccg cacggcaatt 780

ttcggaacga ttcatgaatg cgggcatgcg atctacgagc agaatattga cgaagcgctg 840

agcggaacga acttatctga cggtgcatcc atgggaattc atgaatccca atcgttattt 900

tatgaaaact ttatcgccag aaatcaacat ttctggaccg cctattatga aaaaatggtt 960

gaggcttcgc ctgatcaatt tcaagatgtg aaaagagaag attttgtacg cgctgtcaac 1020

gaggcgaaac cgacctttat ccgaattgaa gccgatgagc tgacatatcc gcttcatatt 1080

attatccgtt atgaaattga aaaagcgatc ttcagtaatg aagtgacagt ggaagaactg 1140

cctgcattgt ggaatcaaaa atatcatgat tatttaggca ttacgccgcc atctgacgca 1200

aaaggcattt tgcaggacgt acattgggcg ggcggcgatt tcggctattt cccttcctat 1260

gcgctcggat atatgtatgc ggcacagctg aagcatacca tgcttgagga tctgcctgaa 1320

tttgaccaat taatagaacg gggcgatttt gagccgatca aacaatggct gacagaaaag 1380

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gagctgaacg ttcaatatct cattgagtat ctcgtcggca aatattcaaa tttatattac 1500

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gaaattacat taaatagagg ggatgttcgt attacgacac gctatgatga aaaagatttc 780

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gagatttatg agtcatct 1518

<210> 6

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<400> 6

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<212> DNA

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<400> 8

atgagaaacc tcacgaaaac tagcttatta cttgcaggat tgtgtacagc ggcacaaatg 60

gtgtttgtaa cccatgcctc agcg 84

Claims

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧肽酶。

2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述羧肽酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，采用核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的信号肽AmyQ或核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的信号肽AprE过表达所述羧肽酶。

4.如权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以B.subtilis WB600为宿主细胞。

5.如权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以pMA5、pMA5-SP_amyQ或pMA5-SP_aprE为表达载体。

6.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧肽酶或权利要求1～5任一所述的重组枯草芽孢杆菌表达的羧肽酶在改善植物蛋白苦味中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物蛋白包括但不限于大豆蛋白，豌豆蛋白，大米蛋白，小麦蛋白。

8.一种苦味降低的植物低聚肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(2)向步骤(1)得到的碱性蛋白酶酶解液中添加氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧肽酶或采用权利要求1～5任一所述的重组枯草芽孢杆菌表达的羧肽酶，进行酶解后灭酶，过滤后得到植物低聚肽。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物蛋白包括但不限于大豆蛋白，豌豆蛋白，大米蛋白，小麦蛋白。

10.权利要求8或9所述的方法制备得到的低苦味的植物低聚肽。