CN116622603A - 一种表面展示氨肽酶的重组芽孢及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种表面展示氨肽酶的重组芽孢及其制备方法和应用，本发明将来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶基因Aps与锚定蛋白芽孢衣壳蛋白基因cot G连接融合至PHY‑P43环形质粒，并转化至bacillus subtilis WB800N中，构建表面展示工程菌bacillus subtilisWB800N‑PHY‑P43‑cot G‑Aps，经培养形成重组芽孢。而且本发明测定了展示在芽孢表面的氨肽酶在最适反应温度60℃、pH 9.0时酶活力达到75.61U/g芽孢；将制得的重组芽孢协同碱性蛋白酶复配水解大豆蛋白不仅可以提升水解度，对水解液的脱苦提鲜也具有明显的作用。采用本发明方法制备得到的表面展示氨肽酶的重组芽孢可直接用于酶促反应，酶活力高，催化性能效果好，水解效果强，而且抗逆性强、安全稳定。

Description

一种表面展示氨肽酶的重组芽孢及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表面展示氨肽酶的重组芽孢及其制备方法和应用。
背景技术
氨肽酶（aminopeptidase）是一类能够水解蛋白质和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶，氨肽酶根据最易反应底物的不同可以分为亮氨酸氨肽酶、赖氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶等。氨肽酶在蛋白水解液脱苦和蛋白质的深度水解中有着重要作用，目前主要用于食品工业中。氨肽酶是蛋白质深度水解的重要协同酶，但游离酶的使用成本高及稳定性差成为限制其工业化应用的主要因素。
氨肽酶的来源非常广泛，在动植物人体各组织微生物中普遍存在，但由于动植物体内氨肽酶含量低且成分复杂，提取成本较高，故微生物产氨肽酶成为其主要来源。目前已有多种不同微生物来源的氨肽酶被发现且大部分研究集中在高产氨肽酶的微生物菌株的改造筛选及氨肽酶的克隆异源表达。如张艳芳等人以米曲霉CICC2066为氨肽酶的来源菌株，采用ARTP诱变技术获得高产量突变的产氨肽酶菌株米曲霉M5，酶活性提高1.21倍[张艳芳，孟广超，王选年. 中国调味品, 2021, 46(12):31-34.]。林晓彤等人将米曲霉中的亮氨酸氨肽酶Lap A在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达，获得了高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株Lap A-C，较原始菌株酶活力提高约3.7倍[林晓彤，董良波，郑俊威，王斌，潘力. 食品科学,2021, 42(02):90-96.]。然而，产氨肽酶的菌株筛选及改造以及克隆异源表达氨肽酶都存在游离酶的分离纯化问题，且游离酶在实际的工业应用中还存在稳定性差的问题。
芽孢表面展示技术是一种新兴的生物固定化技术，芽胞表面展示技术是将外源目的蛋白编码基因与含有自身启动子的芽胞外衣壳蛋白基因融合，构建融合基因表达载体，然后将这种载体转化产芽胞的宿主菌株，得到的重组菌株在生孢培养基中培养时，外源目的基因就会在外衣壳蛋白基因启动子的启动下表达，并通过与外衣壳蛋白融合展示在芽胞的表面。枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 为环境友好菌，其芽孢具有独特的抗逆性、容易培养、芽孢比重大易分离、以芽孢表面展示技术制备的重组酶，不需要分离纯化；由于酶被展示在芽孢表面，可克服全细胞生物催化剂的细胞壁和细胞膜屏障；芽孢具有抗有机溶剂、高温等不利因素，能显著提高酶的催化活性和稳定性。基于上述优点，以枯草芽孢杆菌芽孢为载体，通过芽孢表面展示技术将催化活性的酶展示于芽孢表面，制备具有催化活性的重组芽孢成为工业化酶制剂研究和生产关注的焦点。
枯草芽孢表面展示技术作为将活性酶固定在微生物细胞表面的一种手段，不仅可以将培养收获的芽孢直接用于酶促反应，展示在芽孢表面的活性酶还具有与芽孢同等的强抗逆性，提高其在实际应用中的稳定性。且枯草芽孢杆菌作为食品级安全菌株，展示氨肽酶用于食品行业中无致病性问题。然而，目前利用表面展示技术对氨肽酶进行异源表达获得氨肽酶且进行实际应用的研究还十分有限，相关的研究报道很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表面展示氨肽酶的重组芽孢及其制备方法和应用。该方法利用表面展示技术将来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶Aps展示到Bacillussubtilis WB800N芽孢表面，构建了一种新的全细胞生物催化剂，采用本发明方法制备得到的表面展示氨肽酶的重组芽孢，具有氨肽酶的催化活性，可直接用于酶促反应，酶活力高，催化性能效果好，水解效果强，而且安全稳定。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种表面展示氨肽酶的重组芽孢，将来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶基因Aps与锚定蛋白芽孢衣壳蛋白基因cotG连接融合至PHY-P43环形质粒，并转化至bacillus subtilisWB800N中，构建表面展示工程菌bacillus subtilisWB800N- PHY-P43-cotG-Aps，经培养得到表面展示氨肽酶的重组芽孢。
所述的表面展示氨肽酶的重组芽孢的制备方法，包括如下步骤：
（1）Bacillus subtilisWB800N-PHY-P43-cotG-Aps表面展示工程菌的构建：
①PHY-P43-cotG-Aps质粒载体的构建
以Bacillus subtilisWB800N基因为模板，
上游引物5’-GCACATGGGCCATTATAGCCATAGCG-3’（SEQ ID NO:1） ，
下游引物5’-CGGCCTTATATTTCTTTTTCACAACCCAGC-3’（SEQ ID NO:2） ，
PCR扩增（反应体系和循环条件见下表1）获得芽孢衣壳蛋白cotG编码基因；来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶Aps作为目的基因，其全长序列编码基因GenBank登录号为KF432838；经密码子优化及添加保护碱基、PHY-P43 经添加EcoRI和BamHI酶切位点后进行基因合成，构建氨肽酶表面展示载体PHY-P43-cotG-Aps；PHY-P43-cotG-Aps重组质粒构建流程图见附图1；
重组质粒PHY-P43-cotG-Aps经EcoRI和BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳验证，分别在2142 bp和5156 bp处有明显条带，证明双酶切验证成功；
②表面展示工程菌的构建
将构建好的重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中复制扩增并进行菌落PCR验证，挑选阳性克隆子；对PCR验证正确的菌株进行基因测序，测序正确的菌株培养保藏至-80℃并提取质粒
-20℃保存；将重组质粒转化至Bacillus subtilisWB800N感受态并涂布于带四环素抗性的LB固体平板上，37℃培养12-14h进行PCR验证；将PCR验证正确的重组菌命名为Bacillus subtilisWB800N-PHY-P43-cotG-Aps；
以目的基因Aps片段中的400bp进行引物设计，
上游引物设计为5’-TAAGGTTAGATTTGCGTGGTGGG-3’（SEQ ID NO:3）；
下游引物设计为5’-AAGTGCATCCTGGTTAATGTTTGTA-3’（SEQ ID NO:4）；
挑取抗性筛选平板上的单个菌落进行菌落PCR，在400bp处出现明显条带的为阳性转化子；
所述的菌落PCR的条件如下表2所示：
（2）重组芽孢的培养：
挑取Bacillus subtilis WB800N-PHY-P43-cotG-Aps单菌落至LB液体培养基中培养12h，次日按1.0%的接种量接种至DSM产孢培养基中37℃、220rpm•min-1培养72h；将收获的发酵液8000rpm•min-1离心20 min收集芽孢体，并用Tris-HCl缓冲液清洗并重悬获得重组芽孢悬液，将重组芽孢悬液冻干保存，即得表面展示氨肽酶的重组芽孢。
上述的表面展示氨肽酶的重组芽孢的制备方法，步骤（2）中所述的DSM产孢培养基的配制方法为：分别称取营养肉汤8 g，KCl 1g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MnCl2·4H2O 0.002g，溶解定容至1 L去离子水中，调节pH至7.0；121℃高压蒸汽灭菌20 min，再分别加入过滤除菌的0.1M CaCl2及0.01M FeSO4溶液至终浓度为5×10-4M和1×10-6M。
本发明还公开了所述的表面展示氨肽酶的重组芽孢在水解蛋白中的应用。本发明测定了展示在芽孢表面的氨肽酶在最适反应温度60℃、pH 9.0时酶活力达到75.61U/g芽孢。本发明将培养后的重组芽孢冻干，直接用于与内切蛋白酶协同水解大豆蛋白，测定其水解度及游离氨基酸含量，检验水解效果。实验结果显示：将重组芽孢协同碱性蛋白酶水解大豆蛋白，在60℃，碱性蛋白酶与重组芽孢加入比例为2:1，初始水解pH值先为10.0再为9.0的条件下，水解5.0%的大豆蛋白8h，水解度最高可达55.50%，是重组芽孢及碱性蛋白酶单独水解时的3.3倍、1.5倍；Leu、Phe、Glu、Tyr、Val、Lys、Ser、Asp等游离氨基酸含量得到显著提升，其中疏水性氨基酸 Leu、Tyr和Phe含量分别增加19.21 mg/L、8.59 mg/L 和 16.77 mg/L，鲜味氨基酸Glu也提升了13.98 mg/L。说明重组芽孢协同碱性蛋白酶复配水解大豆蛋白不仅可以提升水解度，协同水解在降低蛋白水解液苦味及增鲜方面也具有显著的作用。
本发明的有益效果为：
1、本发明首次利用枯草芽孢表面展示系统展示耐热性氨肽酶构建全细胞生物催化剂。本发明利用表面展示技术将来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶Aps展示到Bacillus subtilisWB800N芽孢表面，构建了一种新的全细胞生物催化剂，制备得到的重组芽孢具氨肽酶的催化活性，而且安全稳定，经测定，表面展示氨肽酶在最适反应温度60℃、pH 9.0时酶活力达到75.61 U/g芽孢；展示的氨肽酶能耐60℃高温，能直接应用于食品加工行业。
2、将本发明制备得到的表面展示氨肽酶的重组芽孢协同碱性蛋白酶水解大豆蛋白，结果显示，双酶复配水解大豆蛋白不仅可以提升水解度，在降低蛋白水解液苦味及增鲜方面也具有显著的作用。
3、枯草芽孢表面展示技术是利用基因克隆，将目的基因与作为锚定蛋白的芽孢衣壳蛋白基因融合。在枯草芽孢杆菌形成芽孢时，在芽孢衣壳蛋白的作用下，目的基因随着芽孢衣壳蛋白转运至芽孢表面，实现活性酶直接展示在重组芽孢表面，重组芽孢直接作为反应体跨过跨膜障碍直接与底物接触，同时芽孢的强抗逆性也赋予展示在其表面活性酶更强的稳定性。
本发明公开了一种表面展示氨肽酶的重组芽孢及其制备方法和应用，将来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶基因Aps与锚定蛋白芽孢衣壳蛋白基因cot G连接融合至PHY-P43环形质粒，并转化至bacillus subtilisWB800N中，构建表面展示工程菌bacillus subtilisWB800N- PHY-P43-cot G-Aps，经培养形成重组芽孢；将培养后的重组芽孢冻干，可直接用于水解蛋白。本发明制备得到的重组芽孢具有氨肽酶的催化活性，可直接用于酶促反应，酶活力高，耐高温，催化性能效果好，水解效果强，而且展示在芽孢表面的氨肽酶还具有与芽孢同等的强抗逆性，稳定性好，本发明制备得到的展示氨肽酶用于食品行业中水解大豆蛋白无致病性问题，符合食品行业水解蛋白的工业应用要求。
附图说明
图1 PHY-P43-cotG-Aps重组质粒构建流程图；
图2 PHY-P43-cotG-Aps重组质粒双酶切验证；
图3抗性筛选平板上的单个菌落的菌落PCR；
图4重组芽孢与碱性蛋白酶复配pH值（A）、复配比例（B）的优化及与单酶水解效果对比（C）；
图5 4组实验组的大豆蛋白水解液中游离氨基酸含量的变化。
具体实施方式
实施例1
一种表面展示氨肽酶的重组芽孢的制备方法，包括如下步骤：
（1）Bacillus subtilisWB800N-PHY-P43-cotG-Aps表面展示工程菌的构建：
①PHY-P43-cotG-Aps质粒载体的构建
以Bacillus subtilisWB800N基因为模板，
上游引物5’-GCACATGGGCCATTATAGCCATAGCG-3’（SEQ ID NO:1）,
下游引物5’-CGGCCTTATATTTCTTTTTCACAACCCAGC-3’（SEQ ID NO:2），
PCR扩增（反应体系和循环条件见表1）获得芽孢衣壳蛋白cotG编码基因；来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶Aps作为目的基因，其全长序列编码基因GenBank登录号为KF432838；经密码子优化及添加保护碱基、PHY-P43 经添加EcoRI和BamHI酶切位点后交由湖南丰晖生物公司进行基因合成，构建氨肽酶表面展示载体PHY-P43-cotG-Aps； PHY-P43-cotG-Aps重组质粒构建流程图见附图1；
重组质粒PHY-P43-cotG-Aps经EcoRI和BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳验证如附图2所示，分别在2142 bp和5156 bp处有明显条带，证明双酶切验证成功。
②表面展示工程菌的构建
将构建好的重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中复制扩增并进行菌落PCR验证，挑选阳性克隆子；对PCR验证正确的菌株进行基因测序，测序正确的菌株培养保藏至-80℃并提取质粒-20℃保存；将重组质粒转化至Bacillus subtilisWB800N感受态并涂布于带四环素抗性的LB固体平板上，37℃培养12-14h进行PCR验证；将PCR验证正确的重组菌命名为Bacillus subtilisWB800N-PHY-P43-cotG-Aps；
以目的基因Aps片段中的400bp进行引物设计，
上游引物设计为5’-TAAGGTTAGATTTGCGTGGTGGG-3’（SEQ ID NO:3）；
下游引物设计为5’-AAGTGCATCCTGGTTAATGTTTGTA-3’（SEQ ID NO:4）；
挑取抗性筛选平板上的单个菌落进行菌落PCR，结果如附图3所示，在400bp处出现明显条带的为阳性转化子。
所述的菌落PCR的条件如下表2所示：
（2）重组芽孢的培养：
挑取Bacillus subtilis WB800N-PHY-P43-cotG-Aps单菌落至LB液体培养基中培养12h，次日按1.0%的接种量接种至DSM产孢培养基（DSM产孢培养基：分别称取营养肉汤8g，KCl 1g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MnCl2·4H2O 0.002 g，溶解定容至1 L去离子水中，调节pH至7.0；121℃高压蒸汽灭菌20 min，再分别加入过滤除菌的0.1M CaCl2及0.01M FeSO4溶液至终浓度为5×10-4M和1×10-6M）中37℃、220rpm•min-1培养72h；将收获的发酵液8000rpm•min-1离心20 min收集芽孢体，并用Tris-HCl缓冲液清洗并重悬获得芽孢悬液，将重组芽孢悬液冻干保存，即得表面展示氨肽酶的重组芽孢。
实施例2 酶活测定
将实施例1制备得到的表面展示氨肽酶的重组芽孢进行酶活测定，具体方法如下：取3.9mL含500mg/L L-亮氨酸-对硝基苯胺的Tris-HCl缓冲液，加入0.1mL芽孢悬液，于60℃、150r/min条件下反应。10min后冰浴终止反应，取样离心后在波长405nm下测定吸光度。每组实验设立三个平行样品进行数据分析，以未导入质粒的Bacillus subtilisWB800N芽孢作为对照。
酶活U定义为在60℃，pH=9.0的条件下，每分钟水解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1 µmol 对硝基苯胺所需的酶量。将芽孢悬液冻干称重，表面展示氨肽酶的活力以U/g芽孢干重进行计算。
结果：展示在芽孢表面的氨肽酶在最适反应温度60℃、pH 9.0时酶活力达到75.61U/g芽孢。
实施例3
将实施例1制备得到的重组芽孢协同水解大豆蛋白：
①水解度的测定方法：
水解度测定采取OPA法，取蛋白水解液10ul沸水浴5min后在10000rpm•min-1的条件下离心3min，吸取上清液用去离子水稀释100倍，随后取0.4mL稀释液与3mL OPA工作液混匀2min 后于340nm条件下测定吸光度。
α、β分别取值0.970，0.342。ODstand约为0.8，ODblank约为0.07。大豆蛋白的htot取值7.8 mmol/g。公式中：DH为水解度，h为水解的肽键数，htot为蛋白的总肽键数，SerineNH2为水解液的氨基的含量，X为样品质量，P为样品中蛋白含量，此处为85%。
②游离氨基酸含量的测定方法：
以未经酶解的大豆蛋白为空白，经表面展示氨肽酶（重组芽孢）、碱性蛋白酶及双酶复配水解的大豆蛋白为实验组。未经酶解的大豆蛋白水解条件即：浓度为5%（w/v）的大豆蛋白溶液50ml，60℃，pH 10.0水解8h；表面展示氨肽酶单独水解大豆蛋白条件：浓度为5%（w/v）的大豆蛋白溶液50ml，60℃，pH9.0，先加1.0g水解4h，再加0.5g水解4h；碱性蛋白酶水解大豆蛋白条件：浓度为5%（w/v）的大豆蛋白溶液50ml，60℃，pH10.0，先加1.0g水解4h，再加0.5g水解4h；双酶协同水解大豆蛋白水解条件：浓度为5%（w/v）的大豆蛋白溶液50ml，60℃，前4h加碱性蛋白酶1g，pH10.0，后4h加表面展示氨肽酶0.5g，pH9.0。
取离心后的水解液上清1mL，加入1mL 10%的磺基水杨酸沉淀大分子蛋白质。随后在冷冻高速离心机中10000rpm•min-1离心5min，取上清液1mL采用0.02M的HCl溶液稀释至适当的倍数备用。游离氨基酸的测定采用日立高速全自动氨基酸分析仪L-8900，以茚三酮法进行柱后衍生测定16种游离氨基酸的含量。
③重组芽孢与碱性蛋白酶协同水解大豆蛋白的条件优化
已知碱性蛋白酶与重组芽孢的最适反应温度均为60℃，因此设置协同水解反应的温度为60℃。由于碱性蛋白酶的最适反应pH值为10.0，而重组芽孢为9.0，故需要对协同水解pH值进行分段优化。协同水解反应过程如下：配置浓度为5%（w/v）的大豆蛋白溶液50ml，设置初始pH值分别为9.0或10.0，加入1g的碱性蛋白酶， 60℃、150rpm.min-1反应4h，取出煮沸5min失活碱性蛋白酶，再次调整pH值分别为9.0或10.0，加入0.5g的重组芽孢继续反应4h，每隔1h取样进行水解度的测定。
将碱性蛋白酶-表面展示氨肽酶（重组芽孢）协同水解的初始水解pH值分别设置为9.0-9.0、9.0-10.0和10.0-10.0，探究不同初始pH值搭配对整体水解度的影响。
固定3%（w/v）的总加酶量对大豆蛋白进行水解，考察碱性蛋白酶和重组芽孢的加入比例对整体水解度的影响，将加入比例分别设置为2:1、1:1及1:2。如附图4中A所示，前4h碱性蛋白酶水解大豆蛋白时，在pH10.0条件下的水解度优于pH9.0，这与碱性蛋白酶的最适反应pH为10.0相符。后4h氨肽酶进一步水解，虽然氨肽酶的最适反应pH9.0，但结合前4h的水解度，复配pH为10.0-9.0时，水解度最高；复配pH为9.0-9.0次之；复配pH为10.0-10.0水解效果最差。
碱性蛋白酶与重组芽孢的加入比例对水解度的影响如附图4中B所示，在最佳酶添加总量为3%的条件下，重组芽孢及碱性蛋白酶的加入比例为2:1时复配水解度最高，达55.50 %；1:1时次之，1:2时水解效果最差。大量碱性蛋白酶的加入可先将肽链内部肽键水解，暴露出更多疏水性氨基酸，利于后续氨肽酶对大豆蛋白的继续水解。重组芽孢与碱性蛋白酶复配与单酶水解效果对比见如附图4中C所示。综上所述，碱性蛋白酶与重组芽孢在复配pH为10.0-9.0，加入比例为2:1时，对大豆蛋白水解效果最好，水解度达55.50 %。相较于重组芽孢、碱性蛋白酶单独水解的水解度16.89 %、36.32 %，分别提升约3.3倍及1.5倍。
④16种游离氨基酸含量
采用全自动氨基酸分析仪对4组实验组的水解样品中的16种游离氨基酸含量进行分析。结果如附图5所示，未经酶解的空白样品中16种游离氨基酸的含量都较低，仅Ala和Arg的含量稍高。加入氨肽酶进行单酶水解后仅Arg、Ala、Asp三种氨基酸含量略有上升，整体水解效果较差；加入碱性蛋白酶进行单酶水解后，水解液中Glu、Gly、Ala、Cys、Val、Leu、Tyr、Phe、His九种氨基酸含量大幅度提升，主要因为大豆蛋白中存在较多碱性蛋白酶的酶切位点（Ala、Leu、Val、Tyr、Phe等）。用氨肽酶复配碱性蛋白酶水解大豆蛋白后，Leu、Phe、Glu、Tyr、Val、Lys、Ser、Asp等游离氨基酸含量得到显著提升，推测作为内切蛋白酶的碱性蛋白酶先对肽链内部的肽键进行水解，暴露出新的肽链端头，为外切氨肽酶提供更多的酶切位点，利于其对水解液中苦味来源的疏水性肽链末端进行水解。其中疏水性氨基酸 Leu、Tyr和Phe含量分别增加19.21 mg/L、8.59 mg/L 和 16.77 mg/L，鲜味氨基酸Glu也提升了13.98 mg/L，证明双酶复配水解大豆蛋白不仅可以提升水解度，对水解液的脱苦提鲜也具有明显的作用。

Claims (6)

1.一种表面展示氨肽酶的重组芽孢，其特征在于，将来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶基因Aps与锚定蛋白芽孢衣壳蛋白基因cotG连接融合至PHY-P43环形质粒，并转化至bacillus subtilis WB800N中，构建表面展示工程菌bacillus subtilisWB800N- PHY-P43-cotG-Aps，经培养得到表面展示氨肽酶的重组芽孢。
2.一种表面展示氨肽酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）Bacillus subtilis WB800N-PHY-P43-cotG-Aps表面展示工程菌的构建：
①PHY-P43-cotG-Aps质粒载体的构建
以Bacillus subtilisWB800N基因为模板，
上游引物5’-GCACATGGGCCATTATAGCCATAGCG-3’，
下游引物5’-CGGCCTTATATTTCTTTTTCACAACCCAGC-3’，
PCR扩增获得芽孢衣壳蛋白cotG编码基因；来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶Aps作为目的基因，其全长序列编码基因GenBank登录号为KF432838；经密码子优化及添加保护碱基、PHY-P43 经添加EcoRI和BamHI酶切位点后进行基因合成，构建氨肽酶表面展示载体PHY-P43-cotG-Aps；
重组质粒PHY-P43-cotG-Aps经EcoRI和BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳验证，分别在2142 bp和5156 bp处有明显条带，证明双酶切验证成功；
②表面展示工程菌的构建
将构建好的重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中复制扩增并进行菌落PCR验证，挑选阳性克隆子；对PCR验证正确的菌株进行基因测序，测序正确的菌株培养保藏至-80℃并提取质粒
-20℃保存；将重组质粒转化至Bacillus subtilisWB800N感受态并涂布于带四环素抗性的LB固体平板上，37℃培养12-14h进行PCR验证；将PCR验证正确的重组菌命名为Bacillus subtilis WB800N-PHY-P43-cotG-Aps；
以目的基因Aps片段中的400bp进行引物设计，上游引物设计为5’-TAAGGTTAGATTTGCGTGGTGGG-3’；下游引物设计为5’-AAGTGCATCCTGGTTAATGTTTGTA-3’；挑取抗性筛选平板上的单个菌落进行菌落PCR，在400bp处出现明显条带的为阳性转化子；
（2）重组芽孢的培养：
挑取Bacillus subtilis WB800N-PHY-P43-cotG-Aps单菌落至LB液体培养基中培养12h，次日按1.0%的接种量接种至DSM产孢培养基中37℃、220rpm•min-1培养72h；将收获的发酵液8000rpm•min-1离心20 min收集芽孢体，并用Tris-HCl缓冲液清洗并重悬获得重组芽孢悬液，将重组芽孢悬液冻干保存，即得表面展示氨肽酶的重组芽孢。
3.根据权利要求2所述的表面展示氨肽酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于，步骤①PHY-P43-cotG-Aps质粒载体的构建中，所述的PCR扩增的反应体系和循环条件如下表所示：
。
4.根据权利要求2所述的表面展示氨肽酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于，步骤②表面展示工程菌的构建中，所述的菌落PCR的反应体系和循环条件下表所示：
。
5.根据权利要求2所述的表面展示氨肽酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的DSM产孢培养基的配制方法为：分别称取营养肉汤8 g，KCl 1g，MgSO4·7H2O0.25 g，MnCl2·4H2O 0.002 g，溶解定容至1 L去离子水中，调节pH至7.0；121℃高压蒸汽灭菌20 min，再分别加入过滤除菌的0.1M CaCl2及0.01M FeSO4溶液至终浓度为5×10-4 M和1×10-6 M。
6.如权利要求1所述的表面展示氨肽酶的重组芽孢在水解蛋白中的应用。
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