CN114540241A - 枯草芽孢杆菌js-1的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了枯草芽孢杆菌JS‑1的发酵方法，涉及微生物发酵领域，通过单因素梯度优化和多因素正交实验发现四种培养条件因素中对JS‑1菌株的抑菌率的影响从大到小分别为：发酵温度>初始pH值>培养时间>接种量，在此基础上优化后的培养条件组合为发酵温度37℃，培养时间40h，初始pH值7.3，接种量7％。在优化后的培养条件下，JS‑1菌株发酵液的液体抑菌率高达63.1％，比优化前提高21％。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，特别涉及枯草芽孢杆菌JS-1的发酵方法。
背景技术
加强植物病害的生物防治是推动我国绿色农业的可持续发展的重要举措，生防微生物及其代谢产物能够有效降低农业生产中对化学农药的依赖。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)可以产生多种抑菌活性物质，对此国内外研究人员开展了大量研究，如黄华毅等[1]验证了枯草芽孢杆菌STO-12分泌的蛋白类和脂肽类抑菌物质对杨树炭疽病、杨树腐烂病及枣缩果病菌的抑制效果；乔俊卿等[2]通过组培试验、温室盆栽试验等证明了枯草芽孢杆菌Bs916对番茄青枯病的防治效果可达55.6％，同时对番茄植株具有促生效果；Khedher等[3]研究发现枯草芽孢杆菌V26产生的抑菌物质对番茄灰霉病等病菌具有较好的防治效果；Anastasios[4]等发现枯草芽孢杆菌MBI600产丰原素和表面活性剂等抑菌活性物质对黄瓜枯萎病致病菌尖孢镰刀菌和黄瓜根腐病菌具有较高防效。因而，枯草芽孢杆菌在植物病害的防治过程中具有广泛的应用前景。
除具有广谱抑菌效果外，枯草芽孢杆菌抑菌活性物质还具有低毒、易降解的特性，可作为一种生物安全性高的抑菌剂应用于食源性致病菌和食品腐败菌的有效控制。如张雯等[5]针对其实验室筛选出的枯草芽孢杆菌BS08菌株进行研究发现，该菌株对假单胞菌等多种鱼源腐败细菌具有拮抗作用抑制效果显著，所产抑菌活性物质可用来进行水产保鲜剂的开发。李颖等[6]研究的另一株枯草芽孢杆菌SH-1菌株，其产物可显著抑制多种植物致病菌和食品腐败菌的生长，为天然食品防腐剂的开发提供了有益参考。
枯草芽孢杆菌作为一种广泛存在于自然界中的微生物，在逆境环境中可形成抗逆性强的芽孢，因而具有繁殖力强、适应力强等优势，在应用过程中能够保持高活性，固适合于工业开发生产[7]。然而现阶段，制约枯草芽孢杆菌生物制剂广泛应用的关键因素是抑菌活性物质产量低，进而导致的产品成本高、超出农户投资预算等问题。
另外，相同培养基进行同一菌株培养时，发酵条件对于抑菌物质的产出至关重要，优化的发酵条件能够促进细菌在单位时间内产出更多的目的产物，因而本申请对枯草芽孢杆菌JS-1菌株进行发酵培养基的优化和培养条件的两个部分进行优化，以获得发酵时间段、抑菌活性高的枯草芽孢杆菌JS-1菌株的最优发酵条件，以期为后续相关生物制剂的研发提供参考。
但是，发酵条件包括温度、pH、接种时间、接种量等诸多相互关联的参数，这些不同的单个参数对于同一菌株的影响程度不尽相同，如何抓住主要影响参数成为优化的关键。即使同为枯草芽孢杆菌，同一发酵参数对于不同菌株发酵结果的影响也不尽相同，例如接种量对于上述SH-1菌株的发酵结果影响较大，但接种量对JS-1菌株的发酵结果影响却较小。上述发酵结果不仅包含抑菌物质的产量还包括抑菌物质的活性，可综合以抑菌率或抑菌圈直径来评价。现有的发酵参数优化中很少比较不同参数对发酵结果的影响力大小，通过查阅文献很难推知何种参数在JS-1的发酵过程中是主要影响参数。而主要影响参数对于JS-1的抑菌率影响最为关键，因此如何针对JS-1的发酵特性寻找主要影响参数是本申请中要解决的技术问题之一。
参考文献
[1]黄华毅,王佳琳,马荣,梁英梅,田呈明.枯草芽孢杆菌STO-12抑菌活性及其抑菌物质分析[J].浙江农业学报,2017,29(01):81-88.
[2]乔俊卿,陈志谊,梁雪杰,刘永锋,刘邮洲.枯草芽孢杆菌Bs916防治番茄青枯病[J].中国生物防治学报,2016,32(02):229-234.
[3]Khedher,S.,Boukedi,H.,Laarif,A.et al.Biosurfactant produced byBacillus subtilis V26:a potential biological control approach for sustainableagriculture development.Organic Agriculture.2020,10:1-8.
[4]Anastasios,S.,Marios,N.,Luisa,A.et al.Whole Genome Sequencing andRoot Colonization Studies Reveal Novel Insights in the Biocontrol Potentialand Growth Promotion by Bacillus subtilis MBI 600on Cucumber.Frontiers inMicrobiology.2021,11:600393-600393.
[5]张雯,卞丹,沈燕秋,王文思,刘志彬,倪莉.枯草芽孢杆菌抑菌活性物质鉴定、抑菌特性及发酵条件优化[J].中国食品学报,2017,17(12):105-115.
[6]李颖,金鑫,沙海天,范正玉,孙会刚.枯草芽孢杆菌SH-1发酵条件优化及抑菌活性物质稳定性研究[J].食品科技,2016,41(09):25-29.
[7]杜晓雨,赵恺,赵志敏,赵吉.枯草芽孢杆菌微生态制剂发酵研究进展[J].微生物学通报,2020,47(03):903-914.
附图说明
图1菌株JS-1优化前后的抑菌效果(左图：优化后；右图：优化前)；
图2不同碳源对菌株JS-1生物量的影响；
图3不同氮源对菌株JS-1生物量的影响；
图4不同无机盐对菌株JS-1生物量的影响；
图5葡萄糖含量对菌株JS-1生物量的影响；
图6酵母浸粉含量对菌株JS-1生物量的影响；
图7硫酸镁含量对菌株JS-1生物量的影响；
图8接种量对抑菌活性的影响；
图9培养时间对抑菌活性的影响；
图10培养温度对抑菌活性的影响；
图11初始pH值对抑菌活性的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：寻找JS-1菌株在发酵过程中的主要影响参数并获得最佳发酵条件。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
枯草芽孢杆菌JS-1的发酵方法，所述培养条件组合为发酵温度37℃，培养时间40h，初始pH值7.3，接种量7％，所述发酵用培养基中葡萄糖含量11g/L、酵母浸粉含量14g/L和硫酸镁1.0g/L。
优选地，培养条件因素中对JS-1菌株的抑菌率的影响从大到小分别为：发酵温度>初始pH值>培养时间>接种量；发酵培养基各组分含量对JS-1菌株菌体生长的影响从大到小为：硫酸镁>酵母浸粉>葡萄糖。
本发明获得的有益效果：
通过实验发现四种培养条件因素中对JS-1菌株的抑菌率的影响从大到小分别为：发酵温度>初始pH值>培养时间>接种量，在此基础上优化后的培养条件组合为发酵温度37℃，培养时间40h，初始pH值7.3，接种量7％。在优化后的培养条件下，JS-1菌株发酵液的液体抑菌率高达63.1％，比优化前提高21％。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1：按照如下方法优化JS-1菌株的发酵条件：
1材料与方法
1.1供试菌株
指示菌：嗜冷芽孢杆菌(Psychro bacillus sp.)ES-1菌株，购于北海生物科技有限公司。
拮抗菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JS-1菌株，购于上海鲁微科技有限公司。
1.2培养基
基础培养液(牛肉膏蛋白胨培养液)：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH7.0±0.2。
基础发酵培养液(酵母膏葡萄糖培养液)：酵母浸粉14g/L，无水葡萄糖14g/L，硫酸镁1g/L，pH7.0±0.2。
1.3菌种种子液的制备
枯草芽孢杆菌JS-1菌株种子液：使用接种环从斜面菌种上剐取一环菌体，接于基础培养液中，在37℃、150r/min的恒温震荡培养箱中震荡培养24小时，以作为种子液使用。
嗜冷芽孢杆菌ES-1菌株种子液：使用接种环从斜面菌种上剐取一环菌体，接于基础培养液中，在28℃、150r/min的恒温震荡培养箱中震荡培养24小时，以作为种子液使用。
1.4枯草芽孢杆菌菌液菌体浓度的测定
JS-1菌株菌体培养液的浊度(吸光度值)与菌体浓度之间存在着较强的正比关系(R2＝0.9893)，所以可以在菌液培养完成后，使用分光光度计进行吸光度值的测定，即以600nm下的吸光度值来表示培养液中菌体的浓度。
1.5枯草芽孢杆菌发酵液抑菌活性的测定
以嗜冷芽孢杆菌ES-1为指示菌，在接种了ES-1的平板上接种JS-1，于28℃恒温培养48h。培养结束后，以十字交叉法计算抑菌率。
1.6枯草芽孢杆菌发酵培养基优化
1.6.1发酵培养基组分成分优化
(1)碳源：将基础发酵培养基中的碳源(葡萄糖)分别替换为糊精、蔗糖和可溶性淀粉，进行单因素试验；
(2)氮源：将基础发酵培养基中的氮源(酵母浸膏)分别替换为牛肉膏、蛋白胨和硫酸铵，进行单因素试验；
(3)无机盐：将基础发酵培养基中的无机盐(硫酸镁)分别替换为氯化钠、氯化镁和硫酸钙，进行单因素实验。
其他培养条件一致，每组设三个重复。
1.6.2发酵培养基组分含量优化
单因素梯度优化试验：根据1.6.1节试验结果，进行单因素梯度优化试验，为正交试验确定发酵培养基各组分的最佳单因素水平。
多因素正交试验：以单因素梯度优化试验所得出的结果，在每个最佳单因素水平的左右再各取一个水平，进行一个三因素与三水平的正交试验优化。
1.7枯草芽孢杆菌发酵条件优化
1.7.1单因素梯度优化试验
使用优化后的发酵培养基对不同的发酵条件进行单因素梯度优化。
(1)接种量：2％、4％、6％、8％、10％；
(2)培养时间：16h、24h、32h、40h、48h；
(3)发酵温度：27℃、32℃、37℃、42℃、47℃；
(4)初始pH值：5.8、6.4、7.0、7.6、8.4。
依次对发酵条件进行上述因素的优化，将上一因素的优化结果用于下一因素，均设3次重复。
1.7.2多因素正交试验
在上述单因素优化结果的基础上，进行四因素与三水平的正交试验优化。
2结果与分析
2.1枯草芽孢杆菌发酵培养基优化试验结果
2.1.1发酵培养基组分成分优化试验结果
(1)碳源：由图2可以得出，在不同的碳源作用下，以葡萄糖为碳源时JS-1菌株菌体浓度最高，所以可以确定葡萄糖为枯草芽孢杆菌的最适碳源。
(2)氮源：由图3可以得出，在四种氮源的作用下，当酵母浸粉作为氮源时，发酵液中JS-1菌株菌体浓度最高，因此，酵母浸粉为枯草芽孢杆菌的最佳氮源。
(3)无机盐：由图4可以得出，在不同无机盐的作用下，当硫酸镁作为无机盐源时，发酵液中JS-1菌株菌体浓度最高，所以以硫酸镁为枯草芽孢杆菌的最佳无机盐源。
2.1.2发酵培养基组分含量优化试验结果
(1)单因素梯度优化试验
碳源：由图5可得，葡萄糖在发酵培养基中的含量为10g/L～12g/L时，JS-1菌株菌体浓度随葡萄糖含量的增加而逐渐增大；葡萄糖含量为10g/L时，JS-1菌株菌体浓度达到最大值；当葡萄糖含量大于12g/L时，JS-1菌株菌体浓度会随着葡萄糖含量的增加而下降。所以，可以得出JS-1菌株发酵培养基最适的葡萄糖含量为12g/L。
氮源：由图6可得，在发酵培养基中，当酵母浸粉含量在14g/L以下时，JS-1菌株菌体浓度会随酵母浸粉含量的增加而逐渐增大；酵母浸粉含量大于14g/L时，当发酵培养基中的酵母浸粉含量增大，JS-1菌株菌体浓度反而会降低；当酵母浸粉的含量在发酵培养基中为14g/L时，JS-1菌株菌体浓度达到最大值，所以发酵培养基最适的酵母浸粉含量为14g/L。
无机盐：由图7可得，硫酸镁含量在0.6g/L～0.8g/L时，随着硫酸镁含量的增加，JS-1菌株菌体浓度呈显出下降态势；硫酸镁含量为0.8g/L～1.0g/L时，随着硫酸镁含量的增加，JS-1菌株菌体浓度呈显出上升态势；硫酸镁含量大于1.0g/L时，随着发酵培养基中硫酸镁含量的增加，JS-1菌株菌体浓度又呈现出下降态势；硫酸镁含量为1.0g/L时，JS-1菌株菌体浓度达到最高。所以，1.0g/L是JS-1菌株发酵培养基最适合的硫酸镁含量。
(2)多因素正交试验
正交试验：由单因素梯度优化试验结果可得，发酵培养基各组分的最佳含量为葡萄糖含量12g/L、酵母浸粉含量14g/L和硫酸镁含量1.0g/L。在此基础上进行三因素与三水平的正交试验，结果如表2-1所示。
表2-1发酵培养基组分含量的正交试验结果
正交试验结果与分析：从表2-1可知，发酵培养基各组分含量对JS-1菌株菌体生长的影响从大到小为：硫酸镁>酵母浸粉>葡萄糖。各组分含量最优的组合为葡萄糖12g/L，酵母浸粉15g/L，硫酸镁1.0g/L。由正交试验结果可知，JS-1菌株菌体生长状况最好的培养基组合为葡萄糖含量11g/L、酵母浸粉含量14g/L和硫酸镁1.0g/L，在此种发酵培养基中JS-1菌株的生长情况最为良好。
2.2枯草芽孢杆菌发酵条件优化试验结果
2.2.1单因素梯度优化试验结果
(1)接种量：从图8可知，JS-1菌株在接种量为2％～10％的区间内均可以正常生长并具有抑菌活性。当接种量在6％以下时，随着接种量的增加，JS-1菌株的抑菌活性逐渐提高，接种量2％、4％时抑菌率为45.3％、47.9％；当接种量为6％时，JS-1菌株发酵液的抑菌活性达到最高，抑菌率为53.8％；之后，随着接种量的提高，JS-1菌株发酵液的抑菌活性反而逐渐下降，接种量为8％、10％时，抑菌率为51.2％和50.7％。此结果显示出当接种量为6％时，JS-1菌株发酵液的抑菌活性最佳。
(2)培养时间：从图9可知，培养时间在40h以下时，当培养时间增加，JS-1菌株的抑菌活性也会随培养时间而提高，16h、24h、32h时的抑菌率分别为42.6％、47.8％、52.8％；培养时间为40h时，JS-1菌株发酵液的抑菌活性达到最大，抑菌率为54.2％；40h以后，增加培养时间，发酵液抑菌活性开始下降，48h时的抑菌活性下降为53.6％。此结果表明，40h是JS-1菌株产抑菌活性物质的最佳培养时间。
(3)培养温度：枯草芽孢杆菌在培养过程中由于温度的不同，会影响到菌体中酶的活性，进而影响到枯草芽孢杆菌的生长和抑菌活性物质的产生量。从图10可知，当JS-1菌株的培养温度为37℃时，JS-1菌株发酵液的抑菌活性达到最大值，抑菌率达到了57.2％。培养温度的升高或降低，都对抑菌活性有着影响。JS-1菌株的培养温度为27℃和32℃时，抑菌率为46.7％和50.9％；JS-1菌株的培养温度为42℃和47℃时，抑菌率为49.1％和43.5％。从图10中线段的倾斜度可知，相较于低温，高温对抑菌活性的影响更大。此项结果也表明，37℃是JS-1菌株的最适培养温度。
(4)初始pH值：从图11可知，枯草芽孢杆菌在弱碱性环境中抑菌活性更好，说明弱碱性环境对枯草芽孢杆菌的生长和产生抑菌活性物质都更为有利。pH5.8、pH6.4、pH7.0、pH7.6时的抑菌率分别为48.7％、52.7％、56.5％、59.3％，可以看出，发酵液的抑菌活性随着pH的升高而逐渐增强，最终在pH7.6时达到最大值。之后，随着pH值的升高，JS-1菌株发酵液的抑菌活性开始下降，pH值为8.2时抑菌率为56.9％。此结果表明，7.6是JS-1菌株产抑菌活性物质的最佳初始pH值。
2.2.2多因素正交试验
以上述单因素梯度优化试验结果，进行四因素和三水平的正交试验，结果如表2-3所示。
表2-3培养条件组合的正交试验结果
正交试验的结果与分析：四种培养条件因素中对抑菌率的影响从大到小分别为：发酵温度>初始pH值>培养时间>接种量。JS-1菌株产抑菌物质的最优培养条件组合为发酵温度为37℃，初始pH值为7.3，培养时间为40h，接种量为7％。由正交试验结果可知，最高抑菌率所对应的培养条件组合与最优组合相一致，所以，上述培养条件组合即为最佳培养条件组合。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
Claims (2)
1.枯草芽孢杆菌JS-1的发酵方法，其特征在于，所述培养条件组合为发酵温度37℃，培养时间40h，初始pH值7.3，接种量7％，所述发酵用培养基中葡萄糖含量11g/L、酵母浸粉含量14g/L和硫酸镁1.0g/L。
2.根据权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌JS-1的发酵方法，其特征在于：培养条件因素中对JS-1菌株的抑菌率的影响从大到小分别为：发酵温度>初始pH值>培养时间>接种量；发酵培养基各组分含量对JS-1菌株菌体生长的影响从大到小为：硫酸镁>酵母浸粉>葡萄糖。
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