CN114539335A - 青梅酵素中苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的分离方法及应用 - Google Patents

青梅酵素中苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的分离方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了青梅酵素中苯甲基‑葡萄糖6→1来苏糖的分离方法及应用，属于医药技术领域。本发明首次发现青梅酵素包含苯甲基‑葡萄糖6→1来苏糖，并依次使用大孔树脂AB‑8层析柱、MCI层析柱、ODS‑A层析柱进行柱层析提取分离到苯甲基‑葡萄糖6→1来苏糖，发现其能促进人体肠道运动，具有改善便秘的功效，确定该化合物为青梅酵素中改善便秘作用的主要功效成分。

Description

青梅酵素中苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的分离方法及应用
技术领域
本发明涉及青梅酵素中苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的分离方法及应用，属于医药技术领域。
背景技术
青梅(Prunusmume Sieb.et Zucc.)是蔷薇科李属植物，主要分布于长江流域及华南、西南地区一带。青梅果实不仅营养丰富，还具有许多保健功能，青梅果汁经天然或人工发酵可以产生酵素，青梅酵素能提高免疫力人；改善睡眠质量；促进人体肠道运动，可改善便秘；改善牙龈炎，缓解牙龈肿痛；酒前服用可预防醉酒；有祛斑的功效色，使皮肤细腻，面色红润。
目前已知青梅酵素含有丰富的SOD(超氧化物歧化酶)，具有延缓人体衰老，消除局部炎症等方面功效，我们在对青梅酵素的研究中发现了新的氨基酸—二氨基柠檬酸，并明确了二氨基柠檬酸是青梅酵素中解酒的功能成分，首次从青梅酵素中分离到γ-氨基丁烯酸，确定其为青梅酵素中改善睡眠的功效成分。有关青梅酵素其他的功效成分还在逐步揭示中。
发明内容
本发明首次从青梅酵素中提取分离到一种苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖，并发现其能促进人体肠道运动，具有改善便秘的功效，确定该化合物为青梅酵素中改善便秘作用的主要功效成分。
本发明的第一个目的是提供一种苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的分离方法包括以下步骤：
(1)提取：将青梅酵素过滤，取清液，减压浓缩到20-25％体积即得青梅酵素浓缩物。
(2)分离：将步骤(1)所得青梅酵素浓缩物依次使用大孔树脂AB-8层析柱、MCI层析柱、ODS-A层析柱进行柱层析，用水和不同浓度乙醇溶液洗脱，得苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖。
在本发明一种实施方式中，所述苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的结构式为：
Figure BDA0003515876280000011
在本发明一种实施方式中，青梅酵素通过如下方法制得：
(a)青梅清洗、压榨、过滤，获得青梅压榨汁；
(b)向所得青梅压榨汁加入蔗糖，溶解后得到青梅汁糖液；
(c)向所得青梅汁糖液中加入大豆蛋白粉、植物乳杆菌进行发酵，发酵结束后，即得青梅酵素。
在本发明一种实施方式中，蔗糖与青梅压榨汁的质量比为1：2。
在本发明一种实施方式中，大豆蛋白粉相对青梅汁糖液的质量分数为5％-8％。
在本发明一种实施方式中，植物乳杆菌的酶活为100亿CFU/g。植物乳杆菌购于山东中科嘉亿生物工程公司，批号20210417。
在本发明一种实施方式中，植物乳杆菌相对青梅汁糖液的质量分数为2％-5％；具体可选2％。
在本发明一种实施方式中，发酵是指在30±2℃温度下发酵30，然后温度降至20±2℃继续发酵30日。
在本发明一种实施方式中，步骤(2)括如下过程：
将青梅酵素浓缩物上大孔树脂AB-8层析柱，先用去离子水洗脱至无色，再用体积分数为10％、30％、50％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％的乙醇洗脱部分；
减压浓缩后上样到MCI层析柱，依次用体积分数为10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液进行洗脱，收集20％乙醇洗脱部分；
脱乙醇后上样到ODS-A层析柱，依次用体积分数为10％、20％的乙醇洗脱，收集20％的收集乙醇洗脱部分；浓缩、干燥，即得苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖产物。
在本发明一种实施方式中，步骤(2)具体包括如下过程：
将青梅酵素浓缩物上大孔树脂AB-8层析柱，先用去离子水洗脱至无色，再用体积分数为10％、30％、50％的乙醇进行梯度洗脱，每梯度洗脱2个柱体积，收集30％的乙醇洗脱部分；
减压浓缩后上样到MCI层析柱，依次用10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液进行洗脱，每梯度洗脱2个柱体积，收集20％乙醇洗脱部分；
脱乙醇后上样到ODS-A层析柱，先用体积分数为10％乙醇洗脱2个柱体积，再用20％的乙醇洗脱3个柱体积，收集20％的乙醇洗脱部分，减压浓缩后得到化合物——苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖产物。
本发明的第二个目的是提供一种含有上述分离方法在制备用于促进人体肠道运动，改善便秘的药物方面的应用。
附图说明
图1为甲基-葡萄糖6→1来苏糖的13C-NMR图；
图2为甲基-葡萄糖6→1来苏糖的135DEPT-NMR图。
具体实施方式
实施例1：
青梅酵素的获取：
青梅清洗、压榨、过滤，得到青梅压榨汁；取10kg青梅压榨汁加入5kg蔗糖，充分溶解得到青梅汁糖液15kg，加入大豆蛋白粉(购于武汉秉和食品配料有限公司生产)0.8kg，搅拌均匀后再加入活化的植物乳杆菌(酶活为100亿CFU/g，购于山东中科嘉亿生物工程公司，批号20210417)0.32kg，控制温度30±2℃，发酵30日；将发酵温度降至20±2℃，继续发酵30日结束，即得青梅酵素。
从青梅酵素中提取纯化苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖方法，其步骤如下：
将青梅酵素过滤，取清液，减压浓缩到20％体积，即得青梅酵素浓缩物。
将青梅酵素浓缩物上大孔树脂AB-8层析柱，先用去离子水洗脱至无色，再用体积分数为10％、30％、50％的乙醇进行梯度洗脱，每梯度洗脱2个柱体积，收集30％的乙醇洗脱部分；减压浓缩后上样到MCI层析柱，依次用10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液进行洗脱，每梯度洗脱2个柱体积，收集20％乙醇洗脱部分；脱乙醇后上样到ODS-A层析柱，先用体积分数为10％乙醇洗脱2个柱体积，再用20％的乙醇洗脱3个柱体积，收集20％的乙醇洗脱部分，减压浓缩后得一个单体化合物—甲基-葡萄糖6→1来苏糖，该化合物产物为白色无定形粉末，易溶于含水甲醇、乙醇，可溶于水。
利用HPLC测定所得的苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的收率为83.43％，纯度为98.67％。
利用核磁共振对所得产物的结构进行鉴定：
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ3.13(1H),3.15(1H),3.17(1H),3.20(1H),3.30(1H),3.36(1H),3.38(1H),3.61-3.63(6H),3.70(2H),3.72(1H),3.90(1H),3.95(1H),3.97(1H),4.59(1H,d,J＝7.2),4.81(1H,d,J＝7.8),7.29(1H),7.36(2H),7.40(2H).
13C-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ65.0,67.4,68.2,69.6,70.2,70.6,72.6,73.4,75.8,76.6,101.9,103.6,127.4,127.8,128.2,138.0.
Figure BDA0003515876280000031
表1产物苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的1H和13C核磁共振数据
Figure BDA0003515876280000041
化合物为无色无定形粉末，易溶于含水甲醇、乙醇，可溶于水。
1H-NMR中在苯环区有5个H信号，可得化合物存在一个单取代苯；δ4.81(1H,d,J＝7.8)，4.59(1H,d,J＝7.2)处的二个H，应为糖的端基信号，从偶合常数来看为β构型。其余氢主要是糖上氢，3.61-3.63(6H)有6个H信号，应为羟基上有活泼氢。13C-NMR呈现18个碳信号，其中δ苯环上6个碳信号，δ101.9，103.6的碳为糖的端基碳，其余12个疑似糖上信号。135DEPT谱中δ69.6，68.2，65.0为-CH2-碳信号，从苯环的C1信号为138.0的化学位移值可知，糖链并没有与苯环直接相连，而是经-CH2再与苯环连接。从糖信号可见一个为葡萄糖，另一个为五碳糖，其化学位移值与来苏糖一致，δ69.6的信号表明来苏糖连接在葡萄糖的C6位，综上所述该化合物为苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖，这是首次从青梅和青梅酵中发现的化合物。
实施例2：性能应用
利用动物实验对苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖通便功效进行检测，购入四周龄SPF级雄性小白鼠40只，体重16±2.0g。适应性喂养一周后，随机分成四组，每组10只。分为空白对照组，阳性对照组(1.0g/kg低聚果糖)，苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖低剂量0.50g/kg组(A)、高剂量1.0g/kg组(B)，空白对照组灌胃1.0mL/10g生理盐水，连续灌胃7d。第7天观察记录每组小鼠粪便粒数，粪便重。采用Hungate厌氧培养，PLM选择性平板计数法检测双歧杆菌量。结果如表2所示。
表2苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖对小鼠排便情况的影响(n＝10，
Figure BDA0003515876280000042
)
Figure BDA0003515876280000043
与空白组相比*P<0.05
从表2可见，苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖高剂量组有很好的通便效果，与市场常用的低聚果糖具有相似的通便效果，并有促进双歧杆菌的生长作用。

Claims (10)

1.一种青梅酵素中分离制备苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取：将青梅酵素过滤，取清液，减压浓缩到20-25％体积即得青梅酵素浓缩物。
(2)分离：将步骤(1)所得青梅酵素浓缩物依次使用大孔树脂AB-8层析柱、MCI层析柱、ODS-A层析柱进行柱层析，用水和不同浓度乙醇溶液洗脱，得苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖的结构式为：
Figure FDA0003515876270000011
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，青梅酵素通过如下方法制得：
(a)青梅清洗、压榨、过滤，获得青梅压榨汁；
(b)向所得青梅压榨汁加入蔗糖，溶解后得到青梅汁糖液；
(c)向所得青梅汁糖液中加入大豆蛋白粉、植物乳杆菌进行发酵，发酵结束后，即得青梅酵素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，蔗糖与青梅压榨汁的质量比为1：2。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，大豆蛋白粉相对青梅汁糖液的质量分数为5％-8％。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，植物乳杆菌的酶活为100亿CFU/g。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，植物乳杆菌相对青梅汁糖液的质量分数为2％-5％。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵是指在30±2℃温度下发酵30，然后温度降至20±2℃继续发酵30日。
9.根据权利要求3-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)括如下过程：
将青梅酵素浓缩物上大孔树脂AB-8层析柱，先用去离子水洗脱至无色，再用体积分数为10％、30％、50％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％的乙醇洗脱部分；
减压浓缩后上样到MCI层析柱，依次用体积分数为10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液进行洗脱，收集20％乙醇洗脱部分；
脱乙醇后上样到ODS-A层析柱，依次用体积分数为10％、20％的乙醇洗脱，收集20％的收集乙醇洗脱部分；浓缩、干燥，即得苯甲基-葡萄糖6→1来苏糖产物。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在制备用于促进人体肠道运动，改善便秘的药物方面的应用。
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