CN114535593A - AgNPs@SASP基底材料的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种AgNPs@SASP基底材料的制备方法及应用，以环己烷为有机相以乙醇为诱导剂，利用有机/水界面的界面张力进行自组装，使纳米颗粒单层排列。通过添加低介电溶剂作为诱导剂来降低纳米颗粒上的电荷密度结果，范德华力结合库仑斥力的减少致使纳米颗粒在有机/水界面上有重新组装的趋势，形成一个新的平衡，形成一个二维AgNPs阵列的SERS平台。对不同食源性致病菌芽孢进行SERS检测和峰位归属分析，通过多元统计学方法对其进行定性分析，实现芽孢菌的快速识别。

Description

AgNPs@SASP基底材料的制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种AgNPs@SASP基底材料的 制备方法及应用。
背景技术
食源性致病菌是可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌，它 们引起人类的肠胃炎症，如食物中毒，恶心和腹泻等。每年由于食源性致病菌 导致的食源性疾病造成全球约2000万人死亡。食源性致病菌是导致食品安全问 题的重要原因之一，其中食源性芽孢菌，如产气荚膜梭菌、枯草芽孢杆菌和蜡 样芽胞杆菌等，在环境胁迫下可产生休眠体-芽孢，其抗逆性极强，对辐射、热、 干燥、极端pH值、静水压和一些有毒化学物品等有很强的抵抗能力。条件一旦 适宜，芽孢即可萌发产毒，不仅会导致食品腐败变质，不利于食品长期保存， 而且对消费者造成健康危害。因此，芽孢菌对食品安全存在极大的威胁。如果可提前识别出食品中的芽孢，并采取相对应的措施杀死芽孢或控制其萌发等措 施，不仅可延长产品货架期，也可减少食源性安全隐患。然而，由于细菌芽孢 相对偏小，且外观差别不大，用传统方法很难及时识别。因此，开发快速灵敏、 重现性高且及时有效性的检测技术是预防和控制芽孢的关键，也是世界公共卫 生安全亟待解决的难题。
目前，芽孢的主要检测手段是平板培养法，结合营养萌发因子或非营养萌 发因子各种诱导手段促使芽孢萌发为营养细胞，进而通过菌落计数和16S鉴定 来间接识别检测样本中芽孢污染情况。虽然结果较为准确，但是培养、分离和 鉴定过程费时耗力，检测时间及时性差。近年来，随着光谱学检测技术的发展， 方便快捷的光谱检测技术越来越多的应用于食品微生物检测。例如，荧光光谱 技术，通过检测样本所发出的荧光光谱或强度来测定样品中的荧光物质和含量， 具有简便快捷，重现性好，选择性高等优点，但缺乏化学结构信息的特异性， 易受元素相互干扰和重叠峰的影响，难于分析；近红外光谱技术主要是通过使 用含氢基团，有效获取样本光谱中所包含的物理信息、化学信息或生物信息， 快捷无损，易操作和成本低，但不适用于水分含量大的样本检测，灵敏度低。 这些方法对食源性致病菌芽孢的检测都存在难以避免的局限性。
拉曼光谱检测技术，可以通过谱图中不同的拉曼光谱特征峰分析不同类型 细胞包含的不同生化组份。针对微生物细胞拉曼信号弱这一缺点，结合贵金属 粗糙表面或者纳米颗粒为基底(例如金、银)，开发表面增强拉曼光谱技术 (SERS)，通过金银纳米颗粒(热点hotpot)等离子体共振现象引发的电磁增强 可实现拉曼信号的显著增强，从而获得更多的微生物结构组成信号。SERS作为 一种生物“指纹”图谱识别技术，可以提供丰富的生物分子结构组成信息，具 有无需标记、操作简便、检测时间短且无损等优势，可以满足食品质量与安全 领域快速检测的需求。
随着SERS技术在微生物快检方面应用日益广泛，SERS基底材料的开发应 用成为研究焦点。SERS基底目前主要分为两类，一类是金属纳米溶胶的液相基 底材料，另一类是包括粗糙的金属表面、自组装金属纳米液膜、和光刻技术固 定在表面的纳米金属颗粒的固相基底材料。液相基底材料的金属溶胶制备简单、 易操作且成本低，但纳米粒子尺寸和形状不一，易发生不可控聚集稳定性低， 且SERS检测时纳米“热点”与待测样品的结合难以控制导致重现性较差。需要 通过不断的优化纳米粒子的尺寸和形状，去改善SERS检测的灵敏度和重现性。 固相基底中粗糙的金属表面材料在使用和储存中稳定性较好，但粗糙化的表面 往往有均匀性问题，这直接影响SERS检测结果的稳定性和重现性。通过光刻技 术高有序的基底可以非常均匀，但制备成本昂贵。而自组装技术的优点在应用 研究逐渐显现出来，大量的且高密度的“热点”均匀聚集在界面之间，该过程 在十几秒之内自发完成且促进剂，转移后可直接进行拉曼检测。如何合成可控 制的尺寸并且形状均匀的AgNPs一直是目前研究者热衷的。因此，SERS基底 材料的性能主要取决于是否有稳定的且排列均匀的基底，开发尺寸可控且排列 稳定SERS基底材料对SERS检测至关重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种AgNPs@SASP基底材料的 制备方法和应用，将种子介导二次生长法制备的AgNPs，采用液-液自组装技术， 获得致密均匀AgNPs膜，对不同食源性致病菌芽孢进行SERS检测和峰位归属 分析，通过多元统计学方法对其进行定性分析，实现芽孢菌的快速识别。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种AgNPs@SASP基底材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子介导二次生长法制备AgNPs：
(2)种子介导二次生长的AgNPs自组装制备固相基底材料AgNPs@SASP： 在水-环己烷液液界面一步法制备自组装银纳米颗粒金属膜即AgNPs@SASP基 底材料。
进一步，所述步骤(1)种子介导二次生长法制备AgNPs包括以下步骤：
a、在柠檬酸三钠水溶液中加入超纯水并加热，然后加入AgNO3溶液和 NaBH4溶液，搅拌后冷却到室温，加超纯水后得到AgNPs起始种子液；
b、在一个圆底烧瓶中加入超纯水与柠檬酸三钠水溶液，然后匀速加入制备 好的起始种子液和AgNO3溶液，并不断地使混合液保持剧烈的搅拌1h，冷却至 室温后继续加入柠檬酸三钠水溶液和AgNO3溶液，加热并保持剧烈搅拌1h，加 超纯水后冷却至室温，4℃避光保存。
进一步，所述步骤(2)种子介导二次生长的AgNPs自组装制备固相基底材 料AgNPs@SASP的制备方法如下：将步骤(1)种子介导二次生长法制备的 AgNPs通过离心法富集，再超声分散使其悬浮于无水乙醇中，用移液枪注射于 水和环己烷的油-水界面之间，纳米银被表面张力牵引至液液界面之间，环己烷 挥发后纳米银形成了单分子排列基础上的薄膜漂浮于液面，将玻片或硅片深入 液面以下，用斜插提拉法使纳米银薄膜附着在硅片上，氮气干燥。
进一步，所述步骤a中柠檬酸三钠溶液的质量分数为1％，AgNO3溶液的质 量分数为1％，NaBH4溶液的质量分数为0.1％，柠檬酸三钠溶液、超纯水、AgNO3溶液和NaBH4溶液的体积比为20:75:1.7:2。
进一步，所述步骤a中的加热温度为70℃，加热时间为15min，搅拌是在 70℃下搅拌然后冷却到室温。
进一步，所述步骤b中超纯水、AgNPs起始种子液、第一次加入的AgNO3溶液、第一次加入的柠檬酸三钠水溶液的体积比为75:10:1.7:2，其中AgNO3溶 液的质量分数为1％，柠檬酸三钠水溶液的质量分数为1％。
进一步，所述步骤b中第二次加入的AgNO3溶液与柠檬酸三钠水溶液的量 与第一次相同，加热温度为70℃。
利用本发明所述的制备方法制得的AgNPs@SASP基底材料作为SERS基底 的应用。
进一步，对不同食源性致病菌芽孢进行SERS检测，实现芽孢菌的快速识别。
进一步，所述食源性致病菌芽孢包括产气荚膜梭菌芽孢、枯草芽孢杆菌芽 孢、蜡样芽孢杆菌芽孢。
本发明的有益效果：本发明以环己烷为有机相以乙醇为诱导剂，利用有机/ 水界面的界面张力进行自组装，使纳米颗粒单层排列。通过添加低介电溶剂作 为诱导剂来降低纳米颗粒上的电荷密度结果，范德华力结合库仑斥力的减少致 使纳米颗粒在有机/水界面上有重新组装的趋势，制备一个二维AgNPs阵列的 SERS平台。
本发明通过种子介导二次生长法优化纳米粒子的尺寸和形状，并结合液/液 界面自组装技术开发了一种基于SERS技术的AgNPs自组装固相(AgNPs Self-assembled solid-phase，记为AgNPs@SASP)基底材料。通过激光粒度仪表 征可以计算出平均粒径约为90.62nm，扫描电镜结果显示，液/液界面自组装二 维阵列的AgNPs呈圆球形均匀分布，呈均匀分布的二维阵列，具有良好的SERS 重现性和增强效应，增强效应高达1.79×104。
基于AgNPs自组装固相基底材料的SERS技术对3种不同食源性致病菌芽 孢进行SERS检测和峰位归属分析。可以观察到Ca2+-DPA的拉曼振动峰数量和 出峰强度在3种芽孢SERS光谱中占主要地位，且在不同芽孢的SERS图谱中可 以观察到Ca2+-DPA的拉曼振动峰强度存在差异。不同的芽孢在不同的波段可以 显示出独有的拉曼振动峰，不同的拉曼振动峰归属于芽孢的不同组成成分和化 学键振动式形式。HCA分析结果不仅有效实现了3种芽孢之间的区分，也实现 了梭菌属芽孢和杆菌芽孢属芽孢的区分。LDA完全区分了3种食源性致病菌芽 孢的SERS光谱，具有很好的灵敏性和特异性，均为100％。可以实现不同食源 性致病菌芽孢的快速、准确鉴别。
本发明以AgNPs@SASP为基底材料的SERS技术可快速识别食源性微生物 及其芽孢，为保障食品安全提供了有效手段。
附图说明
图1为AgNPs@SASP基底材料的制备及SERS检测流程示意图。
图2为种子介导二次生长法制备的AgNPs的表征结果。(A-1)实施例1步骤(1) a制备的AgNPs种子液的UV-Vis光谱，(A-2)实施例1步骤(1)a制备的AgNPs 种子液的粒径分布，(A-3)实施例1步骤(1)a制备的AgNPs种子液的SEM 表征；(B-1)步骤(1)a经种子介导二次生长处理后的AgNPs种子液的UV-Vis 光谱，(B-2)步骤(1)a经种子介导二次生长处理后的AgNPs种子液的粒径分 布，(B-3)步骤(1)a经种子介导二次生长处理后的AgNPs种子液的SEM表 征。
图3为实施例1制得的AgNPs@SASP基底材料的SEM图。
图4为实施例1制得的AgNPs@SASP基底材料的增强效应对比结果。
图5为基于AgNPs@SASP基底材料对3种芽孢SERS检测的重现性结果。
图6为三种食源性致病菌芽孢的SERS平均图谱。
图7为三种不同芽孢Ca2+-DPA的SERS出峰强度对比结果。
图8为3种食源性致病菌芽孢SERS图谱的HCA结果树状图。A1-A10， C.perfringensspores；B1-B10，B.subtilis spores，C1-C10，B.cereus spores。
图9为LDA分析3种食源性致病菌芽孢SERS光谱的分类散点图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用 于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上 述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
本实施例AgNPs@SASP基底材料的制备方法如下：
(1)种子介导二次生长法制备AgNPs
a、在20ml质量分数为1％的柠檬酸三钠中加入75ml的超纯水在圆底烧瓶 中加热15min70℃，在混合物中加入1.7ml质量分数为1％的AgNO3溶液.然后 快速加入2ml质量分数为0.1％的NaBH4溶液反应液在70℃下搅拌然后冷却到 室温，加水到体积100ml，得到AgNPs起始种子液。
b、在一个100mL的圆底烧瓶中加入75ml水与2ml质量分数为1％的柠檬 酸三钠溶液，然后匀速加入10mL制备好的AgNPs起始种子液和1.7ml质量分 数为1％的AgNO3溶液，并不断地使混合液保持剧烈的搅拌1h，此步骤重复两 次(即冷却至室温后继续加入2ml的1％柠檬酸三钠水溶液和1.7ml的1％AgNO3溶液，70℃加热保持剧烈搅拌1h)。加超纯水至100ml，冷却至室温，4℃避光 保存。
(2)种子介导二次生长的AgNPs自组装固相基底材料的制备
本发明提出了一种在水-环己烷液液界面一步法制备自组装金纳米颗粒金属 膜的方法，该法在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的表面活性剂作用下。利用 乙醇来调节银纳米颗粒表面的电荷密度从而在水和环己烷表面创造一个平衡状 态。并且能够在一个简单的环己烷相蒸发过程后获得柔性银纳米颗粒金属膜。
将玻璃容器和硅片用王水(浓盐酸:浓硝酸v/v＝3:1)浸泡清洗，去除表面杂 质，用去离子水洗涤数遍，氮气吹干备用。在1个10ml的小烧杯中加入去离子 水2.5ml作为水相，将1ml环己烷作为油相沿杯壁不断加入，将油水两相液体混 合，静置数秒后，形成清晰可见分层的油-水界面。取上一步制备的二次生长后 的银纳米10ml，通过离心法富集，再超声分散使其悬浮于无水乙醇中。用移液 枪注射于两相之间。可以肉眼观察到分散于乙醇的纳米银会被表面张力牵引至 液液界面之间，不断运动的自组装在一起。整个自组装过程非常迅速，通过环 己烷挥发。可观察到纳米银形成了单分子排列基础上的薄膜漂浮于液面。用镊 子夹住洗净的玻片或硅片深入液面以下，找到品相好完整的一块银膜，用斜插 提拉法使银膜附着在硅片上，氮气干燥得到AgNPs@SASP基底材料即SERS 基底。
一、SERS基底的表征
1、种子介导二次生长法制备AgNPs
制备AgNPs采用种子介导二次生长法，在第一阶段制备的AgNPs种子液呈 灰绿色，经种子介导二次生长处理后的AgNPs为黄褐色。第一阶段制备的AgNPs 种子液UV-Vis紫外吸收光谱最强的吸收峰位于416nm处(图2A-1)，经种子 介导二次生长处理后的AgNPs的UV-Vis紫外吸收光谱最强的吸收峰位于435 nm处((图2B-1)，其紫外吸收峰发生了红移且谱峰更加圆滑尖锐，表明AgNPs 粒径均一性和形状得到优化。结合激光粒度分析仪对AgNPs溶胶进行粒径分析， 计算得到第一阶段制备的AgNPs种子液的平均粒径约为70.86nm，经种子介导 二次生长处理后的AgNPs的平均粒径约为90.62nm，且经过种子介导二次生长 处理后的AgNPs的粒径范围更加集中80-100nm之间。通过SEM表征(图2A-3 和图2B-3)结果可以直观观察到，经种子介导二次生长处理后的AgNPs的粒径 均匀度和形状完整度得到良好改善。结果表明，经种子介导二次生长法制备的 AgNPs通过可以制备粒径均一性良好的纳米材料，有效避免了AgNPs合成时不 能保持相对均匀的形状和尺寸导致SERS检测信号不稳定的问题。
2、AgNPs@SASP基底材料的表征
按照本发明方法制备种子介导二次生长的AgNPs自组装固相(AgNPs Self-assembled solid-phase，记为AgNPs@SASP)基底材料，以环己烷为有机相 以乙醇为诱导剂，利用有机/水界面的界面张力进行自组装，使纳米颗粒单层排 列。通过添加低介电溶剂作为诱导剂来降低纳米颗粒上的电荷密度结果，范德 华力结合库仑斥力的减少致使纳米颗粒在有机/水界面上有重新组装的趋势，形 成一个新的平衡，形成一个二维AgNPs阵列的SERS平台。AgNPs@SASP的 SEM表征如图3所示。结果表明，AgNPs成功紧密自组装一层具有大面积的 AgNPs点阵列，自组装二维阵列的AgNPs均匀分布在硅片上。二维纳米银的热 点阵列的AgNPs@SASP作为新型的SERS平台具有更高灵敏度和重现性，更适 用于实际检测应用。
二、AgNPs@SASP基底材料的增强效应和重现性
为了解AgNPs@SASP作为SERS基底材料的拉曼检测信号增强效果，使用 激光拉曼仪分别对三种芽孢单一样品和三种芽孢在AgNPs@SASP上的SERS 光谱进行采集。AgNPs@SASP基底材料的增强效应对比结果如图4和表1所示。 由图4可知，芽孢单一样本的拉曼光谱强度很低，特征峰出峰位置较少，很难 对不同芽孢进行定性识别；使用AgNPs@SASP基底材料进行增强信号增强， 三种芽孢的拉曼信号明显增强，原本信号较弱的的特征峰也可以在SERS图谱中 显示出来，拉曼特征峰的增加更加有利于对不同芽孢进行区分识别，AgNPs@SASP作为基底材料有良好的拉曼光谱信号增强能力。
为了量化AgNPs@SASP对三种芽孢的SERS增强效果，本研究分别以三种 芽孢的共同最强出峰波段1570-1577cm-1(CaDPA)为例，计算了AgNPs@SASP 作为基底材料的增强因子，计算公式如公式(1)所示。其中CSERS和ISERS分别 是使用基底材料时检测样本的浓度和同上单一峰位光谱强度值；CRS和IRS分 别是未使用基底材料时检测样本的浓度和单一峰位的光谱强度值。为了更好的 获得单纯样本生物样本的拉曼光谱，并且更好的凸显基底材料的增强效果，在 本研究检测中，单纯样本的浓度为增强检测时的100倍，即CRS＝100CSERS。AgNPs @SASPS对三种芽孢的SERS增强因子计算结果如表1所示，结果显示的AgNPs @SASP对三种芽孢均有较好SERS增强效果，增强因子高达1.79×104，具有良 好的SERS增强作用。
Figure BDA0003377513320000101
表1AgNPs@SASPS对三种芽孢的SERS增强因子计算结果
Figure BDA0003377513320000102
为了检验基于AgNPs@SASP基底材料对3种芽孢SERS检测的重现性，将 3种芽孢分别附着在AgNPs@SASP固相基底上，氮气干燥后，采用激光共聚焦 拉曼光谱仪随机扫描10次，扫描范围为400-3200cm-1。基于AgNPs@SASP基 底材料对3种芽孢SERS检测的重现性结果如图5。每种芽孢的10次SERS光 谱具有良好的的一致性。结果表明，基于液液界面自组装法制备AgNPs@SASP 作为基底材料的SERS增强方法稳定性高且重现性较好，为基于SERS技术对食 源性致病菌的快速检测提供了强有力的技术支持。
三、基于AgNPs@SASP为基底材料的三种芽孢SERS光谱分析
使用基于AgNPs@SASP为基底材料的SERS技术对C.perfringens Spores、B.subtilis Spores和B.cereus spores进行10次随机SERS扫描，经基线校正、归 一化和平滑处理后的三种食源性致病菌芽孢的SERS平均图谱和SERS光谱峰位 的暂定归属如图6和表2所示。图6中右侧为产气荚膜梭菌芽孢(C.perfringens spores)、枯草芽孢杆菌芽孢(B.subtilis spores)和蜡样芽孢杆菌芽孢(B.cereus spores)在100倍油镜的相差显微镜下的观察结果，由图6可以观察到三者拉曼 振动峰数量明显不同(C.perfringens spores＞B.subtilis spores＞B.cereus spores)。芽孢中Ca2+-DPA浓度较高(估计为芽孢干重的5％～15％)，在3种 食源性致病菌芽孢SERS光谱中可以看出Ca2+-DPA的拉曼振动峰数量和出峰强 度占主要地位，其拉曼振动峰位置大约在670-677cm-1、1016-1021cm-1和 1571-1578cm-1的波段，与前人研究相似。不同芽孢的Ca2+-DPA含量差异导致 了出峰数量与强度不同也可以作为判断不同芽孢的依据，三种不同芽孢 Ca2+-DPA的SERS出峰强度对比结果如图7所示，其中3种芽孢的Ca2+-DPA在 1571-1578cm-1波段出峰强度均大于同种芽孢中Ca2+-DPA的其他两个出峰强度， B.cereus spores在670-677cm-1、1016-1021cm-1和1571-1578cm-1波段的出峰强 度均大于B.subtilis spores和C.perfringens spores。3种芽孢的Ca2+-DPA的SERS 光谱出峰强度差异明显，是Ca2+-DPA的主要特征峰，也是区别三种芽孢的主要特征峰。
不同的拉曼振动峰归属于芽孢的不同组成成分和化学键振动式形式。C.perfringens spores在455cm-1(Polysaccharides)、534cm-1(Protein disulfidestretch)、1159cm-1(C-C/C-N stretch of proteins)、1250cm-1 (C-H2strstchingvibration)和1450cm-1(CH2CH3 deformation)波段显示特有拉 曼振动峰；B.subtilis spores在793cm-1(Cytosine or uracil of nucleic acids)显示 特有拉曼振动峰；B.cereus spores在1416cm-1(CH2 sciss of lipids)显示特有拉 曼振动峰。948-954cm-1(Phospholipid N-C stretch)和1299-1301cm-1(-CH2 deformation of Lipid)在B.subtilisspores和B.cereus spores都存在，但在 C.perfringens spores中未观察到。由此可见，在SERS光谱图谱中，3种食源性 致病菌芽孢可以观察到拉曼振动峰出峰位置和出峰强度的差异，表明基于 AgNPs@SASP为基底材料的SERS技术具有区分不同类型食源性致病菌芽孢的 能力。
表2 3种食源性致病菌芽孢SERS光谱拉曼位移的暂定归属
Figure BDA0003377513320000121
四、多元统计分析
为了更好的实现不同食源性致病菌芽孢的定性识别，避免相似的拉曼振动 光谱对微生物分类和鉴定的干扰。结合多元统计分析方法中的聚类分析法(HCA) 和线性判别分析法(Linear Discriminant Analysis，LDA)，从统计学角度对基于 AgNPs@SASP作为基底材料的SERS检测3种食源性致病菌芽孢的分类和对比 分析，HCA可以将3种芽孢的SERS光谱进行先聚类再判断分析并构建树状图， 判断研究对象种群之间的相似性与差异性。LDA是一种简单的线性模式识别算 法和一种监督学习的降维技术，可以将得到数据集的每个样本有类别输出。采 用LDA方法区分评估不同细菌群体的区分度。结果如图8、图9和表3所示。
HCA分析结果可以看出(图8)，30条SERS光谱被分为3个簇，每簇之 间各自聚类无交叉干扰。3种致病菌在聚类距离7处可以清晰地被分为3个聚类， B.subtilis spores和B.cereus spores在聚类距离为15处被聚为一类。在聚类距离 为15处聚为一类的B.subtilis spores和B.cereus spores的SERS特征拉曼光谱较 相似，是由于B.subtilisspores和B.cereus spores同属于芽孢杆菌菌属芽孢，生 化结构和组成相似性较高，与属于梭菌芽孢属的C.perfringens spores在结构和组 成成分上与其存在区分，与Peter等研究相似。通过HCA分析不仅有效实现了 3种芽孢之间的区分，也实现了梭菌属芽孢和杆菌芽孢属芽孢的区分。由图9和 表3表可知，建立的LDA模型准确率为100％，完全区分了3种食源性致病菌 芽孢的SERS光谱，3种食源性致病菌聚集成3个独立的簇，每种食源性致病菌 的所有样本都集中在质心点附近的一个相对较小区域内，且没有任何的重叠区 域，具有很好的灵敏性和特异性，均为100％。上述结果表明，结合HCA和LDA 的多元统计分析方法，可以实现不同食源性致病菌芽孢的快速、准确鉴别。
表3采用LDA方法区分评估不同细菌群体的区分度
Figure BDA0003377513320000131
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行 业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书 中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发 明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种AgNPs @SASP基底材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）种子介导二次生长法制备AgNPs：
（2）种子介导二次生长的AgNPs自组装制备固相基底材料AgNPs @SASP：在水-环己烷液液界面一步法制备自组装银纳米颗粒金属膜即AgNPs @SASP基底材料。
2.根据权利要求1所述的AgNPs @SASP基底材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）种子介导二次生长法制备AgNPs包括以下步骤：
a、在柠檬酸三钠水溶液中加入超纯水并加热，然后加入AgNO3溶液和NaBH4溶液，搅拌后冷却到室温，加超纯水后得到AgNPs起始种子液；
b、将柠檬酸三钠水溶液加入超纯水中，然后匀速加入AgNO3溶液和制备好的AgNPs起始种子液，并不断地使混合液保持剧烈搅拌1h，冷却至室温后继续加入柠檬酸三钠水溶液和AgNO3溶液，加热并保持剧烈搅拌1h，加超纯水后冷却至室温，4℃避光保存。
3.根据权利要求1所述的AgNPs @SASP基底材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）种子介导二次生长的AgNPs自组装制备固相基底材料AgNPs @SASP的制备方法如下：将步骤（1）种子介导二次生长法制备的AgNPs通过离心法富集，再超声分散使其悬浮于无水乙醇中，用移液枪注射于水和环己烷的油-水界面之间，纳米银被表面张力牵引至液液界面之间，环己烷挥发后纳米银形成了单分子排列基础上的薄膜漂浮于液面，将玻片或硅片深入液面以下，用斜插提拉法使纳米银薄膜附着在硅片上，氮气干燥。
4.根据权利要求2所述的AgNPs @SASP基底材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤a中柠檬酸三钠溶液的质量分数为1%，AgNO3溶液的质量分数为1%，NaBH4溶液的质量分数为0.1%，柠檬酸三钠溶液、超纯水、AgNO3溶液和NaBH4溶液的体积比为20:75:1.7:2。
5.根据权利要求2所述的AgNPs @SASP基底材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤a中的加热温度为70℃，加热时间为15min，搅拌是在70℃下搅拌然后冷却到室温。
6.根据权利要求2所述的AgNPs @SASP基底材料的制备方法，其特征在于：所述步骤b中超纯水、AgNPs起始种子液、第一次加入的AgNO3溶液、第一次加入的柠檬酸三钠水溶液的体积比为75:10:1.7:2，其中AgNO3溶液的质量分数为1%，柠檬酸三钠水溶液的质量分数为1%。
7.根据权利要求2所述的AgNPs @SASP基底材料的制备方法，其特征在于：所述步骤b中第二次加入的AgNO3溶液与柠檬酸三钠水溶液的量与第一次相同，加热温度为70℃。
8.根据权利要求1-7任一所述的制备方法制得的AgNPs @SASP基底材料作为SERS基底的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：对不同食源性致病菌芽孢进行SERS检测，实现芽孢菌的快速识别。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述食源性致病菌芽孢包括产气荚膜梭菌芽孢、枯草芽孢杆菌芽孢、蜡样芽孢杆菌芽孢。
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