CN114534308B - 一种智能的高压液相分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离纯化技术领域，特别涉及一种智能的高压液相分离纯化方法，步骤如下：通过分析待测样品的LCMS，得到B值；将B值在整个5‑95％范围内，分成三大类：(1)41<＝B<＝95，(2)B<41(3)B>95，判断S1中的B值属于前述的哪一类，并进入相应类别对应的第二层逻辑判断；再进一步将S2中的三类B值进行细化，分为以下11种小类：(1)①41<＝B<46、②46<＝B<55、③55<＝B<64④64<＝B<73、⑤73<＝B<82、⑥82<＝B<91、⑦91<＝B<95，(2)⑧5<＝B<19、⑨19<＝B<28、⑩28<＝B<41，(3)B>95，每种情况对应一条Prep‑HPLC方法梯度曲线，再继续判断S2中的B值属于本层逻辑中哪一小类，并根据所属小类对应的Prep‑HPLC方法梯度曲线进行分离。本发明通过从反相LCMS分析数据向反相制备分离方法自动化迁移，将经验数字化，降低对高级分离工程师经验依赖度。
Description
技术领域
本发明涉及分离纯化技术领域，特别涉及一种智能的高压液相分离纯化方法。
背景技术
分离纯化是有机合成中非常耗时耗力的工序。若将分离纯化进行自动化，可大大降低人工成本，提升合成效率和通量。最近几年，制备色谱设备在合成实验室中普及，但仍然需要研发人员根据化合物结构，对比分析谱图，初步选用适合的色谱柱和流动相体系。然后根据小试分离效果，再次进行调整，平衡纯度和回收率二者的关系，进行后续的大量分离制备。整个过程需要纯人工判断、操作将样品分离完成。
中国专利CN110398559A，公开了一种自动化智能化的高效液相色谱分离纯化工艺方法及系统。主要通过正相LCMS的分析方法向正相制备分离色谱方法迁移。所述方法需要LCMS运行多针进样，找到调整流动相A/B的比例直到LCMS给出较合理的保留时间TR和分离度R。
然而，对于正相自动化分离来说，有以下几个因素制约了有机合成实验室中正相分离的自动化：第一，实验室产品进行正相分离的自动化，要达到较好的分离效果，需要预先进行固体拌样，预先排好数根一次性硅胶柱，可通过切换阀切换正相柱，正相柱用完，设备即停止，需要人工更换掉正相柱再进行下一轮分离；第二，使用流动相为有机溶剂，如乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷等，暂存区蒸汽压力大，若不及时将溶剂去除，具有非常大的安全隐患；第三，当前新药研发分子越来越复杂，大多含有极性基团，在正相分离体系中，极性大的产物，往往达不到较好的分离效果；第四，产物峰与杂质峰分离度较小，使用正相分离，往往纯度达不到要求。
合成实验室中产品非常繁杂，结构各种各样，对于分离工程师来说，往往需要长达数年的经验积累，才能达到对大多数产品有比较好的分离结果。更重要的是，高端分离工程师非常少，在制药行业对新药分子需求如此快速的行业背景下，企业要培养一个高级分离工程师需要花费很多心血。对于在研分子来说，经验不足的分离工程师在分离过程中损失较多样品，造成反复累计物料，会降低分子合成效率。
分离工程师经验比较分散，没有一个比较好的系统方法来指导分离工程师，因此，需要将经验和算法进行汇总，得到一种智能的反相分离方法，将经验数字化。而专注于从反相LCMS分析数据向反相制备分离方法自动化迁移的算法也未见报道。
发明内容
本发明解决了相关技术中分离工程师经验比较分散，没有一个比较好的系统方法来指导分离工程师的问题，提出一种智能的高压液相分离纯化方法，通过分析待测样品的LCMS，得到B值，并进行两层逻辑判断，从而确定待测样品的B值属于哪一小类，并根据所属小类对应的Prep-HPLC方法梯度曲线进行分离，将分析、分离工程师的经验与算法结合，专注于从反相LCMS分析数据向反相制备分离方法自动化迁移，得到一种智能的反相分析到分离方法，将经验数字化，降低对高级分离工程师的经验依赖度。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种智能的高压液相分离纯化方法，步骤如下：
S1、通过分析待测样品的LCMS，得到B值，其中B值是流动相为水相/有机相中有机相的百分比；
S2、第一层逻辑判断：将LCMS中B值数据在整个5-95％范围内，分成三大类：(1)41<＝B<＝95，(2)B<41(3)B>95，判断S1中的B值属于前述的哪一类，并进入相应类别对应的第二层逻辑判断；
S3、第二层逻辑判断：再进一步将S2中的三类B值进行细化，分为以下11种小类：(1)①41<＝B<46、②46<＝B<55、③55<＝B<64④64<＝B<73、⑤73<＝B<82、⑥82<＝B<91、⑦91<＝B<95，(2)⑧5<＝B<19、⑨19<＝B<28、⑩28<＝B<41，(3)B>95，每种情况对应一条Prep-HPLC方法梯度曲线，再继续判断S2中的B值属于本层逻辑中哪一小类，并根据所属小类对应的Prep-HPLC方法梯度曲线进行分离。
作为优选方案，当41<＝B<46时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从1％升到21％，2～18min内，B值从21％升到41％，18～20min，B值从41％升到51％，20～20.1min，B值迅速从51％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当46<＝B<55时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从10％升到30％，2～18min内，B值从30％升到50％，18～20min，B值从50％升到60％，20～20.1min，B值迅速从60％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当55<＝B<64时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从19％升到39％，2～18min内，B值从39％升到59％，18～20min，B值从59％升到69％，20～20.1min，B值迅速从69％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当64<＝B<73时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从28％升到48％，2～18min内，B值从48％升到68％，18～20min，B值从68％升到78％，20～20.1min，B值迅速从78％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当73<＝B<82时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从37％升到57％，2～18min内，B值从57％升到77％，18～20min，B值从77％升到87％，20～20.1min，B值迅速从87％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当82<＝B<91时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从46％升到66％，2～18min内，B值从66％升到86％，18～20min，B值从86％升到96％，并一直保持96％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当91<＝B<95时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从55％升到75％，2～18min内，B值从75％升到95％，18～20min，B值从95％升到99％，并一直保持99％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当5<＝B<19时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～4min内，B值保持1％不变，4～18min内，B值从1％升到15％，18～20min，B值从15％升到25％，20～20.1min，B值迅速从25％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当19<＝B<28时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从1％到3％，2～18min内，B值从3％升到23％，18～20min，B值从23％升到35％，20～20.1min，B值迅速从35％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当28<＝B<41时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从1％到10％，2～18min内，B值从10％升到30％，18～20min，B值从30％升到40％，20～20.1min，B值迅速从40％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
作为优选方案，当B＞95时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从55％到75％，2～18min内，B值从75％升到95％，18～20min，B值从95％升到99％，20min后B值一直保持99％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明将实验室有机合成中，最耗时耗力的分离纯化工序给出智能化解决方案，将分析、分离工程师的经验与算法结合，专注于从反相LCMS分析数据向反相制备分离方法自动化迁移，得到一种智能的反相分析到分离方法，将经验数字化，降低对高级分离工程师的经验依赖度。
附图说明
图1是本发明从分析到分离方法智能迁移流程图；
图2是本发明中LCMS方法梯度曲线；
图3是本发明中LCMS根据B值分类逻辑图；
图4是本发明41＜＝B＜＝95时的Prep-HPLC方法梯度曲线(曲线从下至上分别对应①～⑦)；
图5是本发明B＜41、B>95时的Prep-HPLC方法梯度曲线(曲线从下至上分别对应)；
图6是本发明实施例1中目标化合物R1分离纯化前LCMS谱图；
图7是本发明实施例1制备色谱分离谱图；
图8是本发明实施例2中目标化合物R2分离纯化前LCMS谱图；
图9是本发明实施例2制备色谱分离谱图；
图10是本发明实施例3中目标化合物R3分离纯化前LCMS谱图；
图11是本发明实施例3制备色谱分离谱图；
图12是本发明实施例4中目标化合物R4分离纯化前LCMS谱图；
图13是本发明实施例4制备色谱分离谱图；
图14是本发明实施例5中目标化合物R5分离纯化前LCMS谱图；
图15是本发明实施例5制备色谱分离谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制；方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。
为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。
此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
如图1至3所示，一种智能的高压液相分离纯化方法，步骤如下：
S1、通过分析待测样品的LCMS，得到B值，其中B值是流动相为水相/有机相中有机相的百分比，具体的计算过程如下：
待测样品采用分析LCMS 5-95％in 5min的方法，在水/乙腈流动相体系中，B值为乙腈百分比，B值在5-95范围内是一条直线(如图2所示)，该直线方程为B＝kTR+5，斜率k＝(95-5)/5＝18，即B＝18TR+5，TR为保留时间。
目标化合物R的分子量MR是已知的，从LCMS谱图中可获知分子量为MR的目标化合物的保留时间为TR，根据TR从方程B＝18TR+5即可推算出该目标化合物在其出峰这一时刻(即TR)对应的乙腈百分比B。
根据图2，列出每0.5min对应的B值如下表：
表一
| Time(min) | B(％) |
| 0 | 5 |
| 0.5 | 14 |
| 1 | 23 |
| 1.5 | 32 |
| 2 | 41 |
| 2.5 | 50 |
| 3 | 59 |
| 3.5 | 68 |
| 4 | 77 |
| 4.5 | 86 |
| 5 | 95 |
| 6 | 95 |
| 6.1 | 5 |
| 6.5 | 5 |
S2、第一层逻辑判断：根据上表，将LCMS中B值数据在整个5-95％范围内，分成三大类：(1)41<＝B<＝95，(2)B<41(3)B>95，判断S1中的B值属于前述的哪一类，并进入相应类别对应的第二层逻辑判断；
S3、第二层逻辑判断：根据上表，再进一步将S2中的三类B值进行细化，分为以下11种小类：①B＝41[41<＝B<46]，②B＝50[46<＝B<55]，③B＝59[55<＝B<64]，④B＝68[64<＝B<73]，⑤B＝77[73<＝B<82]，⑥B＝86[82<＝B<91]，⑦B＝95[91<＝B<95]，⑧B＝14[5<＝B<19]，⑨B＝23[19<＝B<28]，⑩B＝32[28<＝B<41]，B>95，每种情况对应一条Prep-HPLC方法梯度曲线，再继续判断S2中的B值属于本层逻辑中哪一小类，并根据所属小类对应的Prep-HPLC方法梯度曲线进行分离。
本申请以每0.5min为最小单位作为一个标准，即各个情况的R.T.相差0.5min，当B值不处于所列11种情况时，取其最接近的所列11种情况的B值，例如，情况①B＝41[41<＝B<46]，可以理解为计算得到的B值范围为41<＝B<46，都落入情况①之内，如果计算得到B值为42.2，根据前述第二层逻辑判断，42.2与B＝41最接近，落入上述情况①。
其中，各所属小类对应的Prep-HPLC方法梯度曲线如下：
①当41<＝B<46时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从1％升到21％，2～18min内，B值从21％升到41％，18～20min，B值从41％升到51％，20～20.1min，B值迅速从51％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
②当46<＝B<55时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从10％升到30％，2～18min内，B值从30％升到50％，18～20min，B值从50％升到60％，20～20.1min，B值迅速从60％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
③当55<＝B<64时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从19％升到39％，2～18min内，B值从39％升到59％，18～20min，B值从59％升到69％，20～20.1min，B值迅速从69％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
④当64<＝B<73时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从28％升到48％，2～18min内，B值从48％升到68％，18～20min，B值从68％升到78％，20～20.1min，B值迅速从78％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
⑤当73<＝B<82时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从37％升到57％，2～18min内，B值从57％升到77％，18～20min，B值从77％升到87％，20～20.1min，B值迅速从87％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
⑥当82<＝B<91时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从46％升到66％，2～18min内，B值从66％升到86％，18～20min，B值从86％升到96％，并一直保持96％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
⑦当91<＝B<95时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从55％升到75％，2～18min内，B值从75％升到95％，18～20min，B值从95％升到99％，并一直保持99％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
⑧当5<＝B<19时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～4min内，B值保持1％不变，4～18min内，B值从1％升到15％，18～20min，B值从15％升到25％，20～20.1min，B值迅速从25％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
⑨当19<＝B<28时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从1％到3％，2～18min内，B值从3％升到23％，18～20min，B值从23％升到35％，20～20.1min，B值迅速从35％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
⑩当28<＝B<41时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从1％到10％，2～18min内，B值从10％升到30％，18～20min，B值从30％升到40％，20～20.1min，B值迅速从40％升到95％，并一直保持95％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
当B＞95时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0～2min内，B值从55％到75％，2～18min内，B值从75％升到95％，18～20min，B值从95％升到99％，20min后B值一直保持99％不变至23min，23min后B值迅速降到1。
实施例1
调用10-80_2.5min的分析方法，从图6中可知，目标化合物R1在对应的保留时间TR1＝1.15min，总时长为2.5min，所以B＝[(80-10)/2.5]*1.15+10＝42.2，对应所属小类①，即选用①对应的Prep-HPLC方法梯度曲线对样品进行分离纯化，具体的梯度变化见表二，最终得到图7制备色谱分离谱图，证明能够将目标化合物R1分离开来。
表二
| Time(min) | B(％) |
| 0.1 | 1 |
| 2 | 21 |
| 18 | 41 |
| 20 | 51 |
| 20.1 | 95 |
| 23 | 95 |
| 23.1 | 1 |
| 25 | 1 |
实施例2
调用分析方法5-95_3min，从图8中可知，目标化合物R2对应的保留时间TR2＝1.56min，总时长为3min，根据B＝[(95-5)/3]*1.56+5，计算出R2在出峰时乙腈百分比B＝51.8，对应所属小类②，即选用②对应的Prep-HPLC方法梯度曲线对样品进行分离纯化，具体的梯度变化见表三，最终得到图9制备色谱分离谱图，证明能够将目标化合物R2分离开来。
表三
| Time(min) | B(％) |
| 0.1 | 10 |
| 2 | 30 |
| 18 | 50 |
| 20 | 60 |
| 20.1 | 95 |
| 23 | 95 |
| 23.1 | 1 |
| 25 | 1 |
实施例3
调用分析方法5-95_3.5min，从图10中可知，总时长为3.5min，目标化合物R3对应的保留时间TR3＝2.54min，根据B＝[(95-5)/3.5]*2.54+5，计算出R3在出峰时乙腈百分比B＝70.3，对应所属小类④，即选用④对应的Prep-HPLC方法梯度曲线对样品进行分离纯化，具体的梯度变化见表四，最终得到图11制备色谱分离谱图，证明能够将目标化合物R3分离开来。
表四
| Time(min) | B(％) |
| 0.1 | 28 |
| 2 | 48 |
| 18 | 68 |
| 20 | 78 |
| 20.1 | 95 |
| 23 | 95 |
| 23.1 | 1 |
| 25 | 1 |
实施例4
调用分析方法5-95_2min，从图12中可知，目标化合物R4对应的保留时间TR4＝1.70min，总时长为2min，根据B＝[(95-5)/2]*1.70+5，计算出R4在出峰时乙腈百分比B＝81.5，对应所属小类⑤，即选用⑤对应的Prep-HPLC方法梯度曲线对样品进行分离纯化，具体的梯度变化见表五，最终得到图13制备色谱分离谱图，证明能够将目标化合物R4分离开来。
表五
实施例5
调用分析方法0-60_2.5min，从图14中可知，目标化合物R5对应的保留时间TR5＝1.70min，总时长为2.5min，根据B＝[(60-0)/2.5]*0.59＝14.2，计算出R5在出峰时乙腈百分比B＝14.2，对应所属小类⑧，即选用⑧对应的Prep-HPLC方法梯度曲线对样品进行分离纯化，具体的梯度变化见表六，最终得到图15制备色谱分离谱图，证明能够将目标化合物R5分离开来。
表六
| Time(min) | B(％) |
| 0.1 | 1 |
| 2 | 1 |
| 18 | 15 |
| 20 | 25 |
| 20.1 | 95 |
| 23 | 95 |
| 23.1 | 1 |
| 25 | 1 |
通过上述5个实施例可见，化合物种类繁多，分析方法各有不同。而分析方法不同，梯度不同，分析时长不同，得到的目标产物的保留时间均可使用分析方法到分离方法的迁移公式，充分说明了方法的普适性。
以上为本发明较佳的实施方式，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改，因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种智能的高压液相分离纯化方法，其特征在于，步骤如下：
S1、通过分析待测样品的LCMS，得到B值，其中B值是流动相为水相/有机相中有机相的百分比；
S2、第一层逻辑判断：将LCMS中B值数据在整个5-95%范围内，分成三大类：（1）41<=B<=95，（2）B<41（3）B>95，判断S1中的B值属于前述的哪一类，并进入相应类别对应的第二层逻辑判断；
S3、第二层逻辑判断：再进一步将S2中的三类B值进行细化，分为以下11种小类：（1）①41<=B<46 、②46<=B<55 、③55<=B<64 ④64<=B<73、⑤73<=B<82、⑥82<=B<91、⑦91<=B<95，（2） ⑧5<=B<19、⑨19<=B<28、⑩28<=B<41，（3）⑪ B>95，每种情况对应一条Prep-HPLC方法梯度曲线，再继续判断S2中的B值属于本层逻辑中哪一小类，并根据所属小类对应的Prep-HPLC方法梯度曲线进行分离，其中各小类对应的Prep-HPLC方法梯度曲线如下：
当41<=B<46时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从 1%升到21%，2~18min内，B值从 21%升到41%，18~20min，B值从41%升到51%，20~20.1min，B值迅速从51%升到95%，并一直保持95%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当46<=B<55时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从 10%升到30%，2~18min内，B值从 30%升到50%，18~20min，B值从50%升到60%，20~20.1min，B值迅速从60%升到95%，并一直保持95%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当55<=B<64时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从 19%升到39%，2~18min内，B值从 39%升到59%，18~20min，B值从59%升到69%，20~20.1min，B值迅速从69%升到95%，并一直保持95%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当64<=B<73时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从 28%升到48%，2~18min内，B值从48%升到68%，18~20min，B值从68%升到78%，20~20.1min，B值迅速从78%升到95%，并一直保持95%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当73<=B<82时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从37%升到57%，2~18min内，B值从57%升到77%，18~20min，B值从77%升到87%，20~20.1min，B值迅速从87%升到95%，并一直保持95%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当82<=B<91时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从46%升到66%，2~18min内，B值从66%升到86%，18~20min，B值从86%升到96%，并一直保持96%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当91<=B<95时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从55%升到75%，2~18min内，B值从75%升到95%，18~20min，B值从95%升到99%，并一直保持99%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当5<=B<19时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~4min内，B值保持1%不变，4~18 min内，B值从1%升到15%，18~20min，B值从15%升到25%，20~20.1min，B值迅速从25%升到95%，并一直保持95%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当19<=B<28时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从1%到3%，2~18 min内，B值从3%升到23%，18~20min，B值从23%升到35%，20~20.1min，B值迅速从35%升到95%，并一直保持95%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当28<=B<41时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从1%到10%，2~18 min内，B值从10%升到30%，18~20min，B值从30%升到40%，20~20.1min，B值迅速从40%升到95%，并一直保持95%不变至23min，23min后B值迅速降到1；
当B＞95时，Prep-HPLC方法梯度曲线如下：在0~2min内，B值从55%到75%，2~18 min内，B值从75%升到95%，18~20min，B值从95%升到99%，20min后B值一直保持99%不变至23min，23min后B值迅速降到1。
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